CN101492489B - 银莲花素a的提取方法及其脂微球制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种银莲花素A的提取方法及其脂微球制剂的制备方法，它是以两头尖药材为原料，经高浓度醇浸泡，加水，提取，浓缩，过大孔树脂，选择性水解，硅胶柱层析，重结晶纯化精制而得；并以银莲花素A为活性成分，加上药学上常用的注射或口服用油、乳化剂、辅助乳化剂、稳定剂、等渗剂、抗氧化剂、注射用水或制药用水制备而成的脂微球制剂。本方法最大限度降低了酶的活性，通过选择性水解含三糖以上的皂苷的方法增大了银莲花素A的收率，得到的是具有较强抗癌活性的单体成分银莲花素A，本工艺操作简单，适用于工业化生产；而且本方法研制的脂微球制剂，稳定性好，经热压灭菌后理化性质无明显改变，安全性试验结果表明，本发明制备的脂微球制剂符合临床用药的有关要求。

Description

银莲花素A的提取方法及其脂微球制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种皂苷的提取和制备方法及其脂微球制剂制备工艺，更具体地说，本发明涉及一种从中药两头尖中提取一种皂苷，银莲花素A的提取和制备方法及其脂微球制剂及其制备方法，属于药物领域。

背景技术

银莲花素A(化学名为3-O-[α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]齐墩果酸)是中药两头尖中的一种主要有效成分。银莲花素A结构式如下：

银莲花素A为无色粉末，熔点：242～244℃(分解)；分子式C₄₇H₇₆O₁₆·H₂O；[α]_D ²-8(c，0.8，CH₃OH)

两头尖又名竹节香附、多被银莲花，是毛茛科莲花属植物红被银莲花的根状茎，具有祛风利湿、消肿止痹的功效，用于癌症及风湿性关节炎、痹症、腰腿疼痛的治疗，其中抗肿瘤活性尤为显著。两头尖中主要是三萜皂苷类成分，研究发现，其中的一种三萜皂苷银莲花素A有很强的抗肿瘤活性，对实体瘤的尘长具有明显的抑制作用。

银莲花素A为皂苷类化合物，在胃肠道中易水解，进入血液又有严重的溶血现象，限制该药的应用。因此，如何根据其理化性质，开发成不溶血的注射剂或能防止银莲花素A在胃肠道水解的特殊口服制剂，是保证该药应用的前提。

随着药物发展需要，医药学家尝试利用一种特定的载体，将药物直接运送到体内的病变部位，也就是具有药物导弹性的“靶向治疗”。经过不屑的努力，20世纪70年代，美国临床药物学家首先在实验室实现了这一设想。随之，80年代世界制药业出现了药物转运系统(DDS)的概念。在这一理念下，将药物溶于脂肪油中经磷脂乳化分散于水相制成脂微球制剂，粒子平均粒径在200nm左右形成一种微粒体分散系，称为脂微球。

脂微球是新型靶向药物，可选择性在病变部位积聚，将治疗药物最大限度的运送到靶区，使药物在靶区浓度超出传统制剂的数倍至数百倍，治疗效果明显提高；同时药物在正常组织分布量极少，药物的毒副作用和不良反应会明显减轻，达到高效低毒的效果。此外，脂微球靶向制剂具有药物包封率高，安全性及稳定性好，给药方便等特点。日本的水岛裕教授发明的前列地尔脂微球注射液(商品名：凯时)，该制剂具有以下特性：(1)靶向性：脂微球易于聚集于病变部位。(2)持续性：在脂微球的屏障保护作用下，药物的肺部灭活明显降低。(3)高效性：仅需传统剂型十分之一的给药量，疗效更好。(4)副作用低：明显减少了血管的刺激和炎性反应。(5)使用简便：直接静脉注射，可以在门诊治疗。但是，脂微球靶向制剂的使用决定于原料的理化特性及原料的临床适应症，并非任何原料均适用于制成脂微球靶向制剂。目前，已有一些相关的脂微球制剂在国内外上市。迄今为止，国内外尚未见任何关于银莲花素A及其衍生物的脂微球制剂的文献和专利报道。

中国专利公开号CN1210289C，授权公告日2005年7月13日、中国专利公开号CN1199983C，授权公告日2005年5月4日、中国专利公开号CN1446818A，公开日2003年10月8日及中国专利公开号CN1994379A，公开日2007年7月11日对两头尖总皂苷的提取方法进行了研究，但由于皂苷具有易被酶破坏、易水解等特点，银莲花素A收率均不高，且没有提供高效专一得到银莲花素A单体的方法。

发明内容

本发明提供一种银莲花素A的提取工艺及其脂微球制剂的制备工艺，以解决现有技术中银莲花素A的收率较低的缺点，未见任何关于银莲花素A及其衍生物的脂微球制剂的问题。本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：

(1)取两头尖或粉碎后的两头尖，加高浓度乙醇浸泡；

(2)再加水，回流提取，过滤得提取液，与药渣的醇提液或水煎液合并，回收乙醇，经大孔树脂柱，用水洗脱，弃去水洗液，在分别以0％～30％的乙醇及30％～80％梯度洗脱，分别收集洗脱液，回收乙醇，浓缩；

(3)将0％～30％的浓缩液，加0.5～2倍体积碱液，调节pH值至8～14，煮沸1～24小时，加酸液中和至pH值为6～8，浓缩，与30％～80％的浓缩液合并；

(4)将合并后的浓缩液脱色，回收乙醇，浓缩，干燥；

(5)将干燥物溶于甲醇，经硅胶柱层析分离，分离用洗脱剂为氯仿∶甲醇∶水＝75～55∶45～25∶20～1，重结晶，获得银莲花素A。

本发明一种实施方式是，其中步骤(1)中乙醇浓度为50％～100％，乙醇的量为药材2～5倍，乙醇浸泡时间为12～48小时。

本发明一种实施方式是，其中步骤(2)中加水的量为药材1～4倍；大孔树脂柱是D101、AP8、D21、D3520大孔树脂柱。

本发明一种实施方式是，其中步骤(3)中碱液是NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃、Na₂S或K₂S的水溶液；酸液是HCl或H₂SO₄的水溶液。

本发明一种实施方式是，其中步骤(4)中脱色方法为活性炭或D152或ZTC树脂柱。

本发明一种实施方式是，其中步骤(5)中硅胶柱用30～400目硅胶作填料；重结晶可用甲醇、乙醇、丙酮或乙醚。

本发明银莲花素A脂微球制剂的制备方法，包括下列配方和步骤：

①配方：

每1000ml脂微球制剂含银莲花素A0.1～10g、注射用油或口服用油为10～500g、乳化剂为1～50g、辅助乳化剂为0.1～20g、稳定剂为0～50g、等渗剂为0.1～80g、抗氧化剂为0～30g、其余为注射用水或制药用水；

②制备方法包括如下步骤：

a.称取处方量的药物、辅料；

b.将药物加入注射用油中，混合均匀，再加入乳化剂，混合均匀，制成油相；

c.将乳化剂、其他附加剂及注射用水用高速混合器混合均匀，制成水相；

d.将上述水相或油相转入组织捣碎机，于6000～10000转/秒下搅拌，滴加油相入水相或滴加水相入油相，至两相均匀分散，得初乳；

e.将上述初乳转入高压匀质机，10000～20000转/秒进行细乳化；

f.所得脂微球制剂灌封于安瓿或输液瓶中，充氮气，100～130℃灭菌10～60分。

本发明中所述的注射或口服用油选自大豆油、芝麻油、橄榄油、玉米油、麻油、棉籽油、蓖麻油、茶油、红花油、中长链脂肪酸酯中的一种或两种或两种以上的混合物，其中优先选择大豆油、芝麻油。

本发明中所述的乳化剂选自天然磷脂、合成磷脂、胆固醇、泊洛沙姆、聚氧乙烯脂肪醇醚类、聚氧乙烯脂肪酸酯类、蔗糖脂肪酸酯类、单硬脂酸甘油酯中一种或两种或两种以上的混合物，其中优先选择天然磷脂、泊洛沙姆。

本发明中所述的辅助乳化剂选自12～20个碳链的高级脂肪酸及其盐，其盐为生理上可以接受的盐。

本发明中所述的稳定剂选自白蛋白、胶原、环糊精及其衍尘物、PVP、PVA、聚乙二醇、聚氧乙烯蓖麻油衍尘物、吐温、司盘、右旋糖酐、甘露醇中一种或两种或两种以上的混合物。

本发明中所述的等渗剂选自甘油、葡萄糖、氯化钠中一种或两种或两种以上的混合物。

本发明中所述的抗氧剂选自V_C、V_E、安息香酸、枸橼酸及其盐、山梨醇、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠中一种或两种或两种以上的混合物。

本发明将银莲花素A加上药学上常用的注射或口服用油、乳化剂、辅助乳化剂、稳定剂、等渗剂、抗氧剂、注射用水或制药用水制备而成的，取本品经适量稀释后用适宜的仪器测定，平均粒径为50～400nm，另取本品用50％甘油稀释1倍，用500倍的显微镜观察，在随机选定的40个视野(边缘区域除外)内，粒径在5～15μm之间的颗粒数不得过100个，最大粒径不得过40μm。

本发明的一个重要特点是，用高浓度的乙醇浸泡两头尖，以使药材中的酶失活，最大限度降低银莲花素A被酶催化分解的可能。另外在经大孔树脂柱得到梯度洗脱液后，除得到含银莲花素A的部分(包含在30％～80％乙醇洗脱液中)外，还选择性的针对含三糖以上的皂苷(包含在0％～30％乙醇浓度洗脱液中)部分，加碱液使之水解转化为银莲花素A，使产品收率得到提高，而且得到的产品是两头尖中具有抗癌活性的主要有效成分银莲花素A单体，工艺操作简单，使用于工业化生产。

本发明的另一个重要特点是上述工艺制备的脂微球制剂，是根据相似相溶及乳化原理，将银莲花素A溶解分散于油中，再与水及乳化剂制备成脂微球制剂，可显著提高药物的稳定性，解决溶血现象，从而直接将药物制备成可供临床使用的静脉注射或口服脂微球制剂。

将银莲花素A溶于脂肪油中经磷脂乳化分散于水相制成脂微球制剂，不仅能克服药物化学性质不稳定，易水解现象，并克服了药物的溶血的问题，同时可减少给药量，使药物选择性聚集于病变部位，降低药物在正常组织的分布量，达到高效低毒的效果。

本发明制备的银莲花素A的脂微球制剂，经热压灭菌后理化性质稳定，安全性试验结果表明，本发明制备的脂微球制剂无菌、热源检查合格、且无溶血性、无过敏性、无刺激性，符合临床用药对于安全性和稳定性的要求。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前体下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或者变更。

具体实施方式

以下通过具体实例，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但是不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

取两头尖1000g，加入95％乙醇3000ml，浸泡48小时，加入2700ml水，回流提取2小时，过滤，减压蒸馏至无醇味(备用)，药渣再用5700ml水煎煮两次，每次3小时，过滤，滤液与回收乙醇的提取液合并，浓缩至5000ml，过滤，上D101大孔树脂柱，分别用4倍柱体积的水、20％乙醇、40％乙醇洗脱，弃去水洗液，分别收集不同浓度的乙醇洗脱液，分别回收乙醇，并分别浓缩至3000ml，将20％乙醇洗脱液的浓缩液加3000ml pH值为13的NaOH溶液，加热煮沸8小时，加入pH值为1的HCl溶液适量，调节pH为7，与40％乙醇洗脱液的浓缩液合并，加入1％活性炭脱色30分钟，趁热过滤，浓缩，干燥，加入甲醇溶解，上200目硅胶填料的硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶水＝6.5∶3∶1为洗脱剂，用丙酮重结晶，得到银莲花素A17.66g。

实施例2

取两头尖1000g，加入95％乙醇3000ml，浸泡48小时，加入2700ml水，回流提取2小时，过滤，药渣再用50％乙醇提取两次，每次2小时，过滤，滤液与上述乙醇提取液合并，回收乙醇，浓缩至10000ml，过滤，上D101大孔树脂柱，分别用5倍柱体积的水、15％乙醇、35％乙醇洗脱，弃去水洗液，分别收集不同浓度的乙醇洗脱液，分别回收乙醇，并分别浓缩至2000ml，将15％乙醇洗脱液的浓缩液加1000ml pH值为13的NaOH溶液，加热煮沸8小时，加入pH值为1的HCl溶液适量，调节pH为7，与35％乙醇洗脱液的浓缩液合并，经ZTC树脂柱脱色，将脱色后的溶液回收乙醇，浓缩，干燥，加入甲醇溶解，上80目硅胶填料的硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶水＝6.5∶3∶1为洗脱剂，用乙醚重结晶，得到银莲花素A19.71g。

实施例3

取两头尖1000g，加入50％乙醇5000ml，浸泡36小时，加入1000ml水，回流提取3小时，过滤，药渣再用40％乙醇提取两次，每次3小时，过滤，滤液与上述乙醇提取液合并，回收乙醇，浓缩至10000ml，过滤，上AP8大孔树脂柱，分别用4倍柱体积的水、1％乙醇、30％乙醇洗脱，弃去水洗液，分别收集不同浓度的乙醇洗脱液，分别回收乙醇，并分别浓缩至2000ml，将1％乙醇洗脱液的浓缩液加1000ml pH值为8的NaOH溶液，加热煮沸1小时，加入pH值为1的HCl溶液适量，调节pH为6，与30％乙醇洗脱液的浓缩液合并，经ZTC树脂柱脱色，将脱色后的溶液回收乙醇，浓缩，干燥，加入甲醇溶解，上30目硅胶填料的硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶水＝7.5∶2.5∶1为洗脱剂，用甲醇重结晶，得到银莲花素。

实施例4

取两头尖1000g，加入100％乙醇2000ml，浸泡12小时，加入4000ml水，回流提取3小时，过滤，药渣再用60％乙醇提取两次，每次2小时，过滤，滤液与上述乙醇提取液合并，回收乙醇，浓缩至5000ml，过滤，上D21大孔树脂柱，分别用5倍柱体积的水、30％乙醇、80％乙醇洗脱，弃去水洗液，分别收集不同浓度的乙醇洗脱液，分别回收乙醇，并分别浓缩至3000ml，将30％乙醇洗脱液的浓缩液加6000ml pH值为14的NaOH溶液，加热煮沸24小时，加入pH值为1的HCl溶液适量，调节pH为8，与80％乙醇洗脱液的浓缩液合并，经D152树脂柱脱色，将脱色后的溶液回收乙醇，浓缩，干燥，加入甲醇溶解，上400目硅胶填料的硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶水＝5.5∶4.5∶0.1为洗脱剂，用乙醇重结晶，得到银莲花素。

实施例5

取粉碎后的两头尖1000g，加入95％乙醇3000ml，浸泡48小时，加入2700ml水，回流提取2小时，过滤，药渣再用50％乙醇提取两次，每次2小时，过滤，滤液与上述乙醇提取液合并，回收乙醇，浓缩至10000ml，过滤，上D3520大孔树脂柱，分别用5倍柱体积的水、15％乙醇、35％乙醇洗脱，弃去水洗液，分别收集不同浓度的乙醇洗脱液，分别回收乙醇，并分别浓缩至2000ml，将15％乙醇洗脱液的浓缩液加1000ml pH值为13的NaOH溶液，加热煮沸8小时，加入pH值为1的HCl溶液适量，调节pH为7，与35％乙醇洗脱液的浓缩液合并，经ZTC树脂柱脱色，将脱色后的溶液回收乙醇，浓缩，干燥，加入甲醇溶解，上80目硅胶填料的硅胶柱，用氯仿∶甲醇∶水＝5.5∶2.5∶2为洗脱剂，用乙醚重结晶，得到银莲花素。

实施例6：银莲花素A脂微球注射剂

处方

银莲花素A                1.0g

大豆油(供注射用)         100g

大豆磷脂                 8g

泊洛沙姆188              4g

油酸                     1g

甘油                     22.5g

注射用水                 加至1000ml

制成                     100瓶

制备工艺

称取处方量的大豆磷脂加入注射用大豆油中，置磁力搅拌器中加热至80℃搅拌至大豆磷脂全部溶解后，加入处方量的银莲花素A和油酸，搅拌均匀作为油相；另取处方量泊洛沙姆188和甘油80℃下分散于适量注射用水中，作为水相。在磁力搅拌、80℃下将油相滴加入水相，置于高速组织捣碎机中于14000rpm搅拌3次，每次三分钟，制得初乳。以0.1mol/l氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，注射用水定容至处方量，转移至高压均质机中，40～50℃下，以80Mpa压力均质8次，15000转/秒制得终乳。灌装，充氮气，121℃灭菌15min，冰水浴迅速降温即得。

实施例7：银莲花素A脂微球注射剂

处方

银莲花素A              0.1g

大豆油(供注射用)       10g

胆固醇                 1g

亚油酸                 0.1g

葡萄糖                 0.1g

注射用水               加至1000ml

制成                   100瓶

制备工艺

称取处方量的胆固醇加入注射用大豆油中，置磁力搅拌器中加热至90℃搅拌至胆固醇全部溶解后，加入处方量的银莲花素A和亚麻酸，搅拌均匀作为油相；另取处方量葡萄糖80℃下分散于适量注射用水中，作为水相。在磁力搅拌、80℃下将油相滴加入水相，置于高速组织捣碎机中于6000rpm搅拌3次，每次三分钟，制得初乳。以0.1mol/l氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，注射用水定容至处方量，转移至高压均质机中，40～50℃下，以80Mpa压力均质8次，10000转/秒制得终乳。灌装，充氮气，121℃灭菌15min，冰水浴迅速降温即得。

实施例8：银莲花素A脂微球注射剂

处方

银莲花素A             10g

大豆油(供注射用)      500g

大豆磷脂              30g

单硬脂酸甘油脂        20g

γ-亚麻酸             20g

氯化钠                80g

注射用水              加至1000ml

制成                  100瓶

制备工艺

称取处方量的大豆磷脂加入注射用大豆油中，置磁力搅拌器中加热至80℃搅拌至大豆磷脂全部溶解后，加入处方量的银莲花素A和γ-亚麻酸，搅拌均匀作为油相；另取处方量单硬脂酸甘油脂和氯化钠80℃下分散于适量注射用水中，作为水相。在磁力搅拌、80℃下将油相滴加入水相，置于高速组织捣碎机中于20000rpm搅拌3次，每次三分钟，制得初乳。以0.1mol/l氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.0，注射用水定容至处方量，转移至高压均质机中，40～50℃下，以80Mpa压力均质8次，20000转/秒制得终乳。灌装，充氮气，121℃灭菌15min，冰水浴迅速降温即得。

实施例4：实施例6脂微球粒径测定

取本品经适量稀释后用动态光散射粒度测定仪测定，平均粒径不得大于260nm。另取本品用50％甘油稀释1倍，用500倍的显微镜观察，在随机选定的40个视野(边缘区域除外)内，粒径在5～15μm之间的颗粒数不得过50个，最大粒径不得过20μm。

实施例9：实施例6脂微球稳定性检测

将实施例1脂微球制剂分别于4℃、25℃、45℃放置6个月，脂微球制剂的外观、粒径等理化性质及含量均未发生明显的变化，表明该制剂稳定。

实施例6：实施例3脂微球制剂包封率的测定

将实施例1脂微球制剂置于离心管中，10000rpm，离心30min，取上清液，用溶剂溶解，HPLC法测定银莲花素A的含量，确定被包封的银莲花素A的量，按照下列公式计算包封率：

其中：C_total为乳剂中药物的总浓度；

V_total为乳剂总体积(100mL)；

C_water为水相中药物浓度；

V_water为水相的体积(90mL)。

包封率应大于90％。

实施例10：实施例3脂微球制剂无菌检查

取本品10瓶(100ml)，以无菌操作，用全封闭式薄膜滤器，依法检查(中国药典2005年版二部附录XI H薄膜过滤法)，应符合规定。

实施例11：实施例6脂微球制剂热源检查

取本品，加灭菌注射用水稀释成1ml中含1mg的溶液，依法检查(中国药典2005年版二部附录XI D)，剂量按家兔体重每1kg注射2ml，应符合规定。

实施例12：实施例6脂微球制剂溶血检查

取试管7支，1～5管分别加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml的银莲花素A静脉注射用脂微球注射剂，并用10％葡萄糖注射液稀释至2.5ml，6号试管中加入10％葡萄糖注射液2.5ml、7号试管加入蒸馏水2.5ml(完全溶血对照)。最后每管均加入2％兔红细胞悬液2.5ml，轻轻摇匀，置37℃水浴中，分别记录15min、30min、45min、1h、2h、3h、4h各管的溶血和凝集情况，应符合规定。

Claims (5)

1.一种银莲花素A的提取方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)取粉碎后的两头尖，加50％～100％乙醇浸泡，乙醇的量为药材2～5倍，乙醇浸泡时间为12～48小时；

(2)再加水，回流提取，过滤得提取液，与药渣的醇提液或水煎液合并，回收乙醇，经大孔树脂柱，用水洗脱，弃去水洗液，再分别以1％～30％的乙醇及30％～80％乙醇梯度洗脱，分别收集洗脱液，回收乙醇，浓缩；

(3)将1％～30％乙醇的浓缩液，加0.5～2倍体积碱液，调节pH值至8～14，煮沸1～24小时，加酸液中和至pH值为6～8，浓缩，与30％～80％乙醇的浓缩液合并；

(4)将合并后的浓缩液脱色，回收乙醇，浓缩，干燥；

(5)将干燥物溶于甲醇，经硅胶柱层析分离，分离用洗脱剂为氯仿∶甲醇∶水＝75～55∶45～25∶20～1，重结晶，获得银莲花素A。

2.根据权利要求1所述的银莲花素A的提取方法，其中步骤(2)中加水的量为药材1～4倍；大孔树脂柱是D101、AP8、D21、D3520大孔树脂柱。

3.根据权利要求1所述的银莲花素A的提取方法，其中步骤(3)中碱液是NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃、Na₂S或K₂S的水溶液；酸液是HCl或H₂SO₄的水溶液。

4.根据权利要求1所述的银莲花素A的提取方法，其中步骤(4)采用活性炭或D152树脂柱或ZTC树脂柱脱色。

5.根据权利要求1所述的银莲花素A的提取方法，其中步骤(5)中硅胶柱用30～400目硅胶作填料；用甲醇、乙醇、丙酮或乙醚进行重结晶。