CN106137957A - 一种齐墩果酸型皂苷脂微乳及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种齐墩果酸型皂苷脂微乳及其制备方法，该制剂配方包括以下质量百分比的各组分：齐墩果酸型皂苷0.05～5％，油相5～20％，乳化剂1.0～5.0％，助乳化剂0.4～1.6％，稳定剂0.02～0.12％，等渗剂1.0～3.0％，其中乳化剂优选卵磷脂，助乳化剂选用泊洛沙姆188，稳定剂选用油酸，等渗剂选用甘油。本发明通过适当增大乳化剂磷脂用量，可有效消除该类物质溶血性或刺激性，因而可以作为静脉注射剂或者口服制剂使用。本发明所述齐墩果酸型皂苷脂微乳可作为药物或药用组合物用于治疗恶性肿瘤。

Description

一种齐墩果酸型皂苷脂微乳及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种齐墩果酸型皂苷脂微乳及其制备方法，同时涉及其在治疗肿瘤相关疾病方面的应用，属生物医药领域。

技术背景

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一种严重疾病，从天然产物中寻找有效的抗肿瘤药物及其先导物是一种行之有效的方法。齐墩果酸型皂苷(苷元上含有28-羧基或13，28-内酯)是一类在植物中广泛分布的三萜皂苷类成分，例如毛茛科白头翁属和银莲花属、败酱科、黄连花属、远志科等多种传统中药中均含有该类成分或其前体化合物。发明人研究发现该类成分普遍具有抗肿瘤(参见：一种具有抗肿瘤作用的三萜皂苷类化合物，专利申请号CN201210073605.4)以及抗炎、杀虫等药理活性，但口服生物利用度低、刺激性强，同时具有溶血性、难以采用常规静脉注射剂给药，因而成为进一步新药研发的难点。

脂微乳(脂质乳剂)，又称亚微乳，是指将脂溶性强的药物溶于油中作为油相，辅以磷脂等乳化剂，经乳化制得的粒径在100～1000nm的微粒给药系统，可静脉注射或口服使用。梅兴国等(三萜皂苷及其衍生物的脂微球制剂及其制备方法，专利申请号CN200510117289.6)以七叶树皂苷为活性成分，加以药学上可接受的注射或口服用油、乳化剂、水相等制备成脂微乳制剂，可避免该药物刺激性。金向群等(银莲花素A的提取方法及其脂微球制剂的制备方法，专利申请号CN200910066605.X)以银莲花素A为活性成分，试制成可供静脉注射的脂微球制剂，可避免该皂苷的溶血性。吴春福等(拟人参皂苷F11磷脂复合物及制备方法和用途，专利申请号CN201310027916.1)试制拟人参皂苷F11的磷脂复合物及其速释微丸，使药物脂溶性增加，对细胞膜的通透性增加，从而提高拟人参皂苷F11的生物利用度。何军等(一种人参皂苷Rh1自微乳组合物及其制备方法和用途，专利申请号CN201210136790.7)公开了一种含人参皂苷Rh1的自微乳组合物，可增加药物在胃肠道中的分散性和稳定性，显著提高该难溶性药物的生物利用度，适用于制备微乳、固体胶囊等口服制剂。上述研究表明，皂苷脂微乳制剂具有降低溶血性和刺激性、提高生物利用度等优势。

发明人研究发现，齐墩果酸型皂苷溶血性较强，已有脂微乳的常规配方难以完全消除其溶血性。经进一步探索研究，发现通过适当增大乳化剂磷脂用量，可完全消除其溶血性或刺激性，可作为静脉注射剂或者口服制剂使用。通过优化配方，最终成功制备出可供注射或口服使用的该类成分脂微乳制剂，从而完成了本发明。

发明内容

本发明提供一种齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂，及其制备方法和用途。

本发明所述齐墩果酸型皂苷为至少一种如式(I)或(II)所示的三萜皂苷类化合物：

其药学上可接受的盐，其水合物，或其药物前体，特征在于其中：R任选自H、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖基中的2-4个。任选地，齐墩果酸苷元上除3位和28位外，其余位置上可有-OH、酯基等取代基修饰。

本发明所述齐墩果酸型皂苷及其前体皂苷广泛存在于高等植物中，例如毛茛科白头翁属和银莲花属、败酱科、远志科、毛茛科等植物，其制备方法可参考已知文献从植物中分离或通过合成方法进行，例如参考杨世林等《天然产物化学研究》(北京：科学出版社，2010)、王黎明《齐墩果酸型三糖皂苷的制备、合成及抗肿瘤构效关系研究》(苏州大学硕士研究生论文，2013)等进行制备。

具体地，该类化合物可选自：3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸，3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-[4-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)]-β-D-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸，3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸3-O-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷，3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃木糖齐墩果酸，3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-β-D-吡喃木糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸，3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-11α，12α-环氧齐墩果烷-28，13β-交酯，及其药学上可接受的盐。

本发明所述齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂配方包括以下质量百分比的各组分：齐墩果酸型皂苷0.05～5％，油相5～20％，乳化剂1.0～5.0％，助乳化剂0.4～1.6％，稳定剂0.02～0.12％，等渗剂1.0～3.0％。所述配方辅料可根据产品剂型选用相应药用规格。

所述油相为常规药用辅料，例如：大豆油、鸦胆子油、莪术油、薏苡油、芝麻油、橄榄油、玉米油、紫苏子油、苏合香油、鱼肝油、长链脂肪酸甘油三酯、碳原子数为8～10的中链脂肪酸甘油三酯中的任意一种或者二种以上的混合物。

所述乳化剂选用磷脂，可为卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂中的一种或者几种。其中优选蛋黄卵磷脂。所述乳化剂质量百分比不低于1.0％，优选范围1.5～5.0％。

所述助乳化剂可选自：硬脂酸、硬脂酸钠、硬脂酸钾、油酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸化蓖麻油、泊洛沙姆188、单硬脂酸甘油酯、单甘油脂肪酸酯、三甘油脂肪酸酯、聚甘油硬脂酸酯、蔗糖单月桂酸酯、脂肪酸山梨酯、阿拉伯胶、西黄芪胶、明胶、杏树胶、氢氧化镁、氢氧化铝、二氧化硅、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧丙基纤维素、海藻酸钠、琼脂、果胶、蜂蜡中的任意一种或者几种。其中优选泊洛沙姆188。

所述稳定剂为：油酸、油酸钠、胆甾醇、磷脂酸中的任意一种或者二种以上的混合物。其中优选油酸。

所述等渗剂为：甘油、甘露醇、葡萄糖、木糖醇、麦芽糖、任意一种或二种以上的混合物。其中优选甘油。

本发明所述齐墩果酸型皂苷脂微乳的制备方法包括以下步骤：

(1)油相的制备：将处方量的齐墩果酸型皂苷、乳化剂完全溶解于适量的无水乙醇中，减压蒸馏除去乙醇，再加入长链脂肪酸甘油三酯和碳原子数为8～10的中链脂肪酸甘油三酯的混合油相；

(2)水相的制备：将处方量的助乳化剂、稳定剂、等渗剂分散于适量水中，搅拌使溶解；

(3)初乳的制备：将油相(1)缓慢加入水相(2)中，采用高速剪切搅拌，加入适量水使达到处方量，得到初乳；

(4)脂微乳的制备：用碱调节初乳(3)pH至7.5-8.5，转移至高压均质机中进行均质6-12次，得到脂微乳；

(5)分装：根据具体剂型需要，在适宜洁净级别环境下，将脂微乳(4)分装，高压湿热灭菌，制备为静脉注射液；或者将脂微乳(4)加入冻干保护剂后均质混匀，分装、冻干、冲氮、密封，制备成冻干粉针剂；或者将脂微乳(4)分装，高压湿热灭菌，制备为口服液。

本发明在研究中发现，该类齐墩果酸型皂苷溶血性、刺激性较强，常规的脂微乳配方难以完全消除其溶血性等不良反应。经进一步探索研究，意外发现通过适当增大乳化剂磷脂用量，可完全消除其溶血性或刺激性，因而可以作为静脉注射剂或者口服制剂使用。通过优化配方，最终成功制备出可供注射或口服使用的该类成分脂微乳制剂，从而完成了本发明。

体外抗肿瘤活性试验表明，本发明所述齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂对A549人非小细胞肺癌细胞、SMMC-7721人肝癌细胞、SGC-7901人胃腺癌细胞等3种人肿瘤细胞株有明显的抑制作用，其作用与原料药相近，具备抗肿瘤作用。

本发明内容是通过系统研究和大量创造性实验完成的，以下述具体实施例进行说明。

具体实施例

本发明所述的齐墩果酸型皂苷脂微乳是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。

实施例1：PSH-1脂微乳注射剂的制备

以下实施例分别选用败酱皂苷原料药，其中PSH-1为齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷，PSH-2为齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→4)-O-βD-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷，PSH-3为齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃阿拉伯糖苷，PSH-4为3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-11α，12α-环氧齐墩果烷-28，13β-交酯。

选用脂微乳注射剂处方为：PSH-1皂苷10mg，长链脂肪酸甘油三酯5.0g，碳原子数为8～10的中链脂肪酸甘油三酯5.0g，蛋黄卵磷脂E80 2.4g，泊洛沙姆188 0.8g，油酸0.02g，注射用甘油2.5g，加注射用水至100mL。

所述PSH-1脂微乳注射剂的制备方法包括以下步骤：

(1)油相的制备：将处方量的齐墩果酸型皂苷、注射用乳化剂蛋黄卵磷脂E80完全溶解于适量的无水乙醇中，减压蒸馏除去乙醇，再加入长链脂肪酸甘油三酯和碳原子数为8～10的中链脂肪酸甘油三酯的混合油相，搅拌混匀。

(2)水相的制备：将注射用泊洛沙姆188、油酸、甘油分散于适量水中，搅拌使其完全溶解。

(3)初乳的制备：将(1)缓慢加入高速组织捣碎机的水相(2)中，搅拌，加入适量水使达到处方量，得到初乳。

(4)脂微乳的制备：用0.2mol·L^-1的氢氧化钠溶液调节pH至8.0调，转移至高压均质机中，在800bar压强的条件下均质8～10次，即得脂微乳。

(5)分装：在无菌环境下，将脂微乳(4)分装，高压湿热灭菌，即得PSH-1脂微乳注射剂。

对PSH-1脂微乳注射剂进行如下制剂指标的检测，结果均符合脂微乳注射剂规定：

(1)离心稳定性常数(Ke)：取适量PSH-1脂微乳于离心管中，4000rpm离心15分钟，取下层10uL于10mL的离心管中，在500nm处利用紫外分光光度计测定吸光度值，Ke＝(A₀-A)/A₀(其中，A₀为离心前乳剂的吸光度，A为离心后乳剂的吸光度)。一般亚微乳的Ke小于1，测定PSH-1脂微乳Ke值为0.77。

(2)粒径及其分布：取5uL的PSH-1脂微乳，加入10mL的离心管中，用水稀释至刻度，采用NICOMP380ZLS型粒度测定仪测定粒径。测定PSH-1脂微乳平均粒径为193.3nm，多分散指数PI为0.066。

(3)动电势电位(zeta值)：动电势电位较低，可使乳滴间有较大的斥力，有利于乳剂的稳定。取适量PSH-1脂微乳经适当稀释后，采用NICOMP380ZLS型zeta电位测定zeta值。测得PSH-1脂微乳zeta值为-28.3。

(4)溶血性实验：将制备的PSH-1脂微乳进行溶血性试验(中国药典二部XI L溶血与凝聚检查法)，测定PSH-1脂微乳溶血试验为阴性。用生理盐水制备的PSH-1注射液对照品在0.4μg·mL^-1时即发生溶血。

实施例2：PSH-1脂微乳注射剂的配方考察优化

参考实施例1配方及其制法，对制备败酱皂苷PSH-1脂微乳注射剂过程中油相、蛋黄卵磷脂、泊洛沙姆188、油酸等辅料用量及载药量的配方进行考察优化。

(1)油相用量的考察

采用长链脂肪酸甘油三酯和碳原子数为8～10的中链脂肪酸甘油三酯的混合油相(体积比为1∶1)，混合油相的总质量为处方质量的5％-20％之间进行考察，以离心稳定性常数和粒径为指标，结果表明：油相在5％-20％均可制备脂微乳，其中优选比例为10％时离心稳定性常数和粒径较小。

(2)蛋黄卵磷脂用量考察

选用蛋黄卵磷脂作为乳化剂，研究发现蛋黄卵磷脂的用量和PSH-1脂微乳溶血性直接相关。首先考察药物浓度在100μg·mL^-1时蛋黄卵磷脂用量对PSH-1脂微乳的影响。结果见表。

表1 蛋黄卵磷脂用量对PSH-1脂微乳注射剂(100μg·mL^-1)的影响(n＝3，)

由以上结果可知，对该乳剂，当蛋黄卵磷脂用量在1.2g时具有溶血性，在1.5g及以上时不溶血。因此确定蛋黄卵磷脂用量范围1.5-3.0％。

(3)泊洛沙姆188用量的考察

选用泊洛沙姆188助乳化剂，用量为处方质量的0.4％-1.6％之间进行考察，实验结果表明该范围内泊洛沙姆188均有助于产品稳定性，优选其用量为0.8％。

(4)油酸用量的考察

选用油酸稳定剂，考察油酸在0.02、0.04、0.08、0.12％范围内效果，结果表明油酸在该范围内均有助于产品稳定性，优选其用量为0.04％。

(5)载药量的考察

由于蛋黄磷脂用量对PSH-1脂微乳注射剂溶血性有显著影响。因此，固定蛋黄磷脂2.5％，其他辅料采用上述优化配方，按实施例1进行制备，考察PSH-1载药量。结果见表2。

表2 蛋黄磷脂(2.5％)对PSH-1脂微乳注射剂载药量的影响(n＝3，)

从表中可以看出，载药量在150μg·mL^-1及以下时，PSH-1脂微乳注射剂无溶血性，在200μg·mL^-1之间时具有溶血性。实验研究中发现，增大蛋黄磷脂用量，可相对增加配方中载药量，这与该类皂苷的具体种类、原料溶血性有关，一般蛋黄磷脂均需大于1.5％；对于脂微乳注射剂，蛋黄磷脂以小于5％为宜。

实施例3：PSH-1脂微乳注射剂(冻干)的制备

参照实施例1配方和工艺制备PSH-1脂微乳(4)，再加入适量的冻干保护剂后均质混匀，分装、冻干、冲氮、密封，即得到PSH-1脂微乳注射剂(冻干)。

冻干保护剂的考察：选用葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、甘露醇、乳糖、氯化钠及其中任意一种或二元混合物(质量比1∶1)作为冻干保护剂，固定冻干保护剂浓度为8、10、15％进行试制，实验结果表明二元冻干剂效果较好，进一步筛选结果见表3。结果表明，当选用适宜比例的二元冻干剂粒径均较稳定，容易复溶，其中甘露醇-蔗糖(10、15％)较优。

表3 PSH-1脂微乳注射剂二元冻干保护剂的筛选

实施例4：PSH-1脂微乳(口服)的制备

PSH-1脂微乳(口服)选用相应口服级别的药用辅料，参照实施例1配方和工艺制备PSH-1脂微乳(4)，分装，高压湿热灭菌，即得PSH-1脂微乳(口服)制剂。

实施例5：其他败酱皂苷脂微乳注射剂的制备

分别选用PSH-2、PSH-3、PSH-4原料10mg，其余参照实施例1配方和工艺制备，分别制得PSH-2、PSH-3、PSH-4脂微乳注射剂。

选用败酱总皂苷原料30mg，其中主要含有PSH-1(54％)、PSH-2(37％)，其余参照实施例1配方和工艺制备，即得败酱总皂苷脂微乳注射剂。

实施例7：体外抗肿瘤试验

采用体外MTT抗肿瘤试验，测试本发明所述实施例1和4制备的脂微乳注射剂的抗肿瘤作用，结果表明所制备的PSH-1～PSH-4脂微乳注射剂、PSH-3脂微乳注射剂、败酱总皂苷脂微乳注射剂对A549人非小细胞肺癌细胞、SMMC-7721人肝癌细胞、SGC-7901人胃腺癌细胞等3种人肿瘤细胞株均具有体外细胞毒作用，其给药48h的IC₅₀值范围在5-20μM，与相应原料药相近。

Claims (10)

1.一种齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂，特征在于，其包括以下质量百分比的各组分：齐墩果酸型皂苷0.05～5％，油相5～20％，乳化剂1.0～5.0％，助乳化剂0.4～1.6％，稳定剂0.02～0.12％，等渗剂1.0～3.0％。

2.根据权利要求1所述的齐墩果酸型皂苷脂微乳，特征在于，所述齐墩果酸型皂苷为至少一种如式(I)或(II)所示的三萜皂苷类化合物：

其药学上可接受的盐，其水合物，或其药物前体，特征在于其中：R任选自H、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖基中的2-4个。

3.根据权利要求1所述的齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂，特征在于，其中乳化剂选自卵磷脂。

4.根据权利要求3所述的齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂，特征在于，其中乳化剂质量百分比为1.5～5.0％。

5.根据权利要求1所述的齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂，特征在于，其中助乳化剂选用泊洛沙姆188，稳定剂选用油酸，等渗剂选用甘油。

6.一种齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂的制备方法，特征在于其包含以下步骤：

(1)油相的制备：将处方量的齐墩果酸型皂苷、乳化剂完全溶解于适量的无水乙醇中，减压蒸馏除去乙醇，再加入长链脂肪酸甘油三酯和碳原子数为8～10的中链脂肪酸甘油三酯的混合油相；

(2)水相的制备：将处方量的助乳化剂、稳定剂、等渗剂分散于适量水中，搅拌使溶解；

(3)初乳的制备：将油相(1)缓慢加入水相(2)中，采用高速剪切搅拌，加入适量水使达到处方量，得到初乳；

(4)脂微乳的制备：用碱调节初乳(3)pH至7.5-8.5，转移至高压均质机中进行均质6-12次，得到脂微乳；

(5)分装：根据具体剂型需要，在适宜洁净级别环境下，将脂微乳(4)分装，高压湿热灭菌，制备为静脉注射液；或者将脂微乳(4)加入冻干保护剂后均质混匀，分装、冻干、冲氮、密封，制备成冻干粉针剂；或者将脂微乳(4)分装，高压湿热灭菌，制备为口服液。

7.如权利要求1所述齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂在药物制造工艺中的用途。

8.如权利要求7所述齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂在药物制造工艺中的用途，特征在于所述齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂为静脉注射用制剂。

9.如权利要求7所述齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂在药物制造工艺中的用途，特征在于所述齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂为口服制剂。

10.如权利要求7所述齐墩果酸型皂苷脂微乳制剂在药物制造工艺中的用途，特征在于所述药物应用于治疗肿瘤相关疾病。