CN104161745A - 一种制备纳米柠檬酸铁脂质体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备纳米柠檬酸铁脂质体的方法。(1)按照一定质量比称取大豆卵磷脂和胆固醇，将其溶于无水乙醇中；用PBS缓冲液配制柠檬酸铁溶液；(2)取一定体积柠檬酸铁溶液于烧杯中，置于40~60℃水浴中，边搅拌边滴加卵磷脂和胆固醇的混悬液，滴加完毕，继续搅拌，至乙醇完全挥发出去，将脂质体悬浮液水浴超声处理5~30min，得到乳黄色半透明脂质体悬浮液，避光透析4-5h，用滤膜过滤，置于棕色瓶中，4℃保存。本发明得到的纳米柠檬酸铁脂质体粒径规整、均一，稳定性好、包封率高，具有长效缓释性，滴鼻给药用于大鼠脑补铁，效果明显优于未经脂质体包封的柠檬酸铁。

Description

一种制备纳米柠檬酸铁脂质体的方法

技术领域

本发明涉及一种制备纳米柠檬酸铁脂质体的方法，属于生物医药技术领域。 

背景技术

铁是人体必需的微量元素之一，人体铁缺乏会导致贫血，据世界卫生组织统计，全球缺铁性贫血患者已达10亿人。婴幼儿铁缺乏，会导致神经系统发育障碍，产生认知、行为障碍；铁缺乏与儿童多动症、注意力不集中、智商低、热性惊厥也有密切关系。研究表明，对患铁缺乏的儿童进行有效的铁补充，可纠正贫血，缓解症状。目前，常用补铁剂主要是小分子有机酸铁盐，如葡萄糖酸亚铁、柠檬酸亚铁、乙二胺四乙酸铁钠等，一般通过口服方式进行补铁，但存在口感差、副作用大，补铁效果差等缺点。同时，由于血脑屏障（Blood-brain barrier, BBB）的存在，补铁剂通过口服给药很难进入脑内，此外，婴幼儿在治疗中依从性差。 

脂质体是近年来出现的一种新型药物载体，具有类细胞的双分子层结构，无毒、无免疫原，可作为亲水性、疏水性或是两性物质的载体，用于药物、质粒、多肽、蛋白、病毒、细菌等多种物质的载运，还具有靶向性、长效缓释性、低毒性等突出特点，在纳米药物载体中脱颖而出。纳米脂质体（20~100nm），稳定性高，体外不易聚集，体内不易被巨噬细胞吞噬。文献指出，对纳米脂质体进行粒径、电荷、表面特性的修饰，就可以跨越BBB，成为治疗中枢神经系统疾病的药物载体。我们在前期工作中，采用薄膜-旋转蒸发法，制备得到了柠檬酸铁脂质体，但该方法所得产物粒径大（0.43微米），不易跨越BBB。本发明我们预期采用乙醇注入法，得到粒径<100纳米、易跨越BBB、脑靶向性好的铁脂质体。 

发明内容

本发明的目的是提供一种制备纳米柠檬酸铁脂质体的方法，该方法所得到的柠檬酸铁脂质体粒径小，稳定性好，具有长效缓释的特点，通过鼻腔给药，易于跨越血脑屏障，解决了目前常规补铁制剂脑靶向性差的缺陷。 

本发明解决其技术问题采取的技术方案是这样的： 

本发明利用乙醇注入法制备纳米柠檬酸铁脂质体，在不同反应条件如：原料配比、超声时间、pH值下，均得到了包封率高、粒径小、稳定性好、具有长效缓释作用的产物。滴鼻给药用于大鼠脑补铁，结果表明，纳米柠檬酸铁脂质体的脑补铁效果明显优于未经脂质体包封的柠檬酸铁。

具体的，本发明的制备方法如下： 

(1) 按照质量比（4 ~ 10）：1分别称取大豆卵磷脂和胆固醇，将其溶于无水乙醇，为防止有机溶剂挥发，在烧杯口上盖一层铝箔纸，得到大豆卵磷脂和胆固醇的混悬液，待用；

(2) 按柠檬酸铁与大豆卵磷脂的质量比为1：（4 ~ 10）称取柠檬酸铁，用pH= 5.0 ~ 10.0的PBS缓冲液溶解，备用；

(3) 将步骤(2)配制好的柠檬酸铁溶液放入烧杯，置于40~60℃水浴中，然后边搅拌边将步骤(1)制备的大豆卵磷脂和胆固醇的混悬液匀速滴入烧杯，滴加完毕，继续搅拌，直至乙醇完全挥发，将所得到的脂质体悬浮液水浴超声处理5~30 min，得到乳黄色半透明脂质体悬浮液，再将其置于透析袋中，透析液为PBS缓冲液，避光透析4-5h，将透析后的悬浮液用0.22um的微孔滤膜过滤除去大颗粒杂质，置于棕色瓶中，密闭，放入冰箱4℃保存。

本发明取得的有益效果如下： 

本发明采用乙醇注入法，得到了纳米柠檬酸铁脂质体，粒径大小为25~80nm；透射电镜表明粒子规整、均一；其zeta电位值为-48.1mV，说明稳定性好；同时包封率高，具有长效缓释性；滴鼻给药用于大鼠脑补铁，并与对照组（PBS组）、空脂质体组（未包裹柠檬酸铁的脂质体）、及柠檬酸铁组（未包被脂质体的柠檬酸铁）作比较，ICP-MS脑铁含量测定表明，柠檬酸铁经脂质体包裹后，脑部吸收增强，纳米柠檬酸铁脂质体的补铁效果明显优于未经脂质体包封的柠檬酸铁。

附图说明

图1：纳米柠檬酸铁脂质体负染电镜图（TEM照片）。 

从图1中可以看出，采用乙醇注入法制备的纳米柠檬酸铁脂质体形貌为规整的球形囊泡，粒径大小均匀，均在100nm以下。 

图2：纳米柠檬酸铁脂质体粒径分布。 

纳米柠檬酸铁脂质体的粒径分布采用动态光散射(DLS) 技术测定，如图2所示。从图2中可以看出，柠檬酸铁纳米脂质体的粒径大小主要分布在25-80nm 之间。 

图3：纳米柠檬酸铁脂质体zeta电位。 

Zeta电位是表征分散系稳定性的重要指标。当zeta电位的绝对值>30mV，表明脂质体的稳定性较好。从图3可以看出，脂质体的Zeta电位为-48.1mV，表明采用乙醇注入法制备的纳米柠檬酸铁脂质体的稳定性较好。 

图4：纳米柠檬酸铁脂质体的体外药物释放曲线。 

模拟胃肠液生理条件，制备了人工胃肠液。取新制备的纳米柠檬酸铁脂质体分别与等体积的人工胃肠液混合，将混合液置于100 ml小烧杯中，放入37℃恒温摇床，特定时间从烧杯取出0.5ml样品测定药物释放量，进行纳米柠檬酸铁脂质体的体外药物释放实验，见图4。从图中可以看出，纳米柠檬酸铁脂质体在人工胃肠液中均具有缓释的特点，其在人工胃液的释放速度较人工肠液中稍快，35 h后在人工胃液中的累积释放率达到97%，而在人工肠液中为72%，这可能是胃肠液不同的pH(人工胃液pH=1.3，人工肠液pH=7.5)值造成的。 

图5：大鼠脑组织铁含量测定。 

将大鼠分为四组，通过滴鼻方式给药，PBS组为对照组，其他三组分别滴入柠檬酸铁溶液、空白脂质体及纳米柠檬酸铁脂质体。每天上午和下午各滴鼻给药一次，周期为7天，给药结束后，取材，做ICP-MS测定脑组织铁含量。 

从图5可以看出，鼻腔给予大鼠纳米柠檬酸铁脂质体，大鼠脑组织铁含量比对照组（PBS组）、空脂质体组（未包裹柠檬酸铁的脂质体）、及柠檬酸铁组（未包被脂质体的柠檬酸铁）均有明显的提高，这说明柠檬酸铁经脂质体包裹后可促进其在脑部的吸收，补铁效果较单纯的柠檬酸铁明显增强。 

具体实施方式

以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。 

实施例1   一种制备纳米柠檬酸铁脂质体的方法（包封率为92.33%） 

按照质量比 = 8:1称取大豆卵磷脂和胆固醇，溶于无水乙醇中；按照质量比柠檬酸铁：大豆卵磷脂 = 1:6称取柠檬酸铁，用PBS(pH =8.0)溶解。取一定体积柠檬酸铁溶液于100ml烧杯中，置于40~60℃水浴中，边搅拌边滴加卵磷脂和胆固醇的混悬液，滴加完后，继续搅拌，至乙醇完全挥发出去。将脂质体悬浮液水浴超声处理10 min，得到乳黄色半透明脂质体悬浮液，避光透析4-5h，用滤膜过滤，包封率为92.33%，然后置于棕色瓶中，密闭，放入冰箱4℃保存，备用。

实施例2   一种制备纳米柠檬酸铁脂质体的方法（包封率为82.16%） 

按照质量比 = 4:1称取大豆卵磷脂和胆固醇，溶于无水乙醇中；按照柠檬酸铁：大豆卵磷脂 = 1:8称取柠檬酸铁，用PBS(pH =8.0)溶解。取一定体积柠檬酸铁溶液于100ml烧杯中，置于40~60℃水浴中，边搅拌边滴加卵磷脂和胆固醇的混悬液，滴加完后，继续搅拌，至乙醇完全挥发出去。将脂质体悬浮液水浴超声处理30 min，得到乳黄色半透明脂质体悬浮液，避光透析4-5h，用滤膜过滤，包封率为82.16%，然后置于棕色瓶中，密闭，放入冰箱4℃保存，备用。

实施例3   一种制备纳米柠檬酸铁脂质体的方法（包封率为80.80%） 

按照质量比 = 8:1称取大豆卵磷脂和胆固醇，溶于无水乙醇中；按照柠檬酸铁：大豆卵磷脂 = 1:8，称取柠檬酸铁，用PBS(pH =6.5)溶解。取一定体积柠檬酸铁溶液于100ml烧杯中，置于40~60℃水浴中，边搅拌边滴加卵磷脂和胆固醇的混悬液，滴加完后，继续搅拌，至乙醇完全挥发出去。将脂质体悬浮液水浴超声处理15 min，得到乳黄色半透明脂质体悬浮液，避光透析4-5h，用滤膜过滤，包封率为80.80%，然后置于棕色瓶中，密闭，放入冰箱4℃保存，备用。

实施例4   纳米柠檬酸铁脂质体包封率的计算方法 

配制0.5mg/ml的柠檬酸铁标准溶液，用PBS缓冲液分别稀释4倍、5倍、10倍、15倍、20倍，用紫外分光光度计测其在260nm波长处的吸光度，绘制浓度(x)与吸光度(y)的标准曲线，线性关系式为y=17.008x-0.0488，R²=0.9998，线性关系良好。

取适量制备好的纳米柠檬酸铁脂质体于10ml离心管中，加入二甲苯，充分混匀后用超速离心机进行离心，然后弃去上清，取下层溶液，用紫外-可见分光光度计测定柠檬酸铁溶液在260nm波长处的吸光度值。将吸光度值带入y=17.008x-0.0488中，得到脂质体中包封的药物浓度。再根据下面包封率计算公式，即可得到纳米柠檬酸铁脂质体的包封率。 

包封率（EE%）=脂质体中包封的柠檬酸铁的质量/反应时所加入的柠檬酸铁的质量 × 100% 。 

Claims (1)

1.一种制备纳米柠檬酸铁脂质体的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1) 按照质量比（4 ~ 10）：1分别称取大豆卵磷脂和胆固醇，将其溶于无水乙醇，得到大豆卵磷脂和胆固醇的混悬液，待用；

(2) 按柠檬酸铁与大豆卵磷脂的质量比为1：（4 ~ 10）称取柠檬酸铁，用pH= 5.0 ~ 10.0的PBS缓冲液溶解，备用；

(3) 将步骤(2)配制好的柠檬酸铁溶液放入烧杯，置于40~60℃水浴中，然后边搅拌边将步骤(1)制备的大豆卵磷脂和胆固醇的混悬液匀速滴入烧杯，滴加完毕，继续搅拌，直至乙醇完全挥发，将所得到的脂质体悬浮液水浴超声处理5~30 min，得到乳黄色半透明脂质体悬浮液，再将其置于透析袋中，透析液为PBS缓冲液，避光透析4-5h，将透析后的悬浮液用0.22um的微孔滤膜过滤除去大颗粒杂质，置于棕色瓶中，密闭，放入冰箱4℃保存。