CN116440079A - 经鼻给药脑靶向主动载药的布美他尼脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种靶向特定组织，尤其是脑组织的布美他尼脂质体处方组成和制备方法。用该处方组成和制备方法获得的脂质体制剂，结合鼻腔给药途径，能够显著增加布美他尼在脑组织的分布。另外，本发明涉及的载体能通过主动包封技术实现布美他尼的高效装载，包封效率高，工艺操作方便、包封率高。

Description

经鼻给药脑靶向主动载药的布美他尼脂质体
技术领域
本发明涉及药物递送领域，具体涉及脂质体递送系统经鼻给药实现脑靶向，提高药物在脑组织的分布。本发明也涉及所述脂质体递送系统的制备方法和用途，特别是利用主动载药技术提高载药效率、改善难溶性药物溶解性的方法和用途。
背景技术
靶向递药系统(targeting drug delivery system,TDDS)系指根据生物体的生理学和分子生物学特性，借助载体、配体或抗体的作用，通过血液循环或胃肠道等途径将药物选择性地浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞器的一种递药系统。由于靶向递药系统能够使药物浓集于病灶组织，相应降低非病灶组织的药物浓度，因此能够提高药物的治疗效果，降低全身性的毒副作用，是药剂学的热点研究领域。近年来，肿瘤靶向的研究日趋成熟，紫杉醇、阿霉素等多个微粒靶向制剂，抗体偶联药物如ADC、细胞疗法药物如CAR-T均有上市产品，并且取得了良好的治疗效果。但是，脑靶向研究目前尚处于实验室研究阶段。
脑是人体的重要器官，很多疾病的发生都与脑组织的病变有关，例如中枢神经系统疾病(帕金森病、老年性痴呆、神经衰弱和癫痛)、脑血管病变、脑肿瘤、脑部细菌感染和病毒感染等。据美国1999年统计，脑部疾病的发生率已经相当于癌症和心血管疾病的总和。2007年，联合国的一份报告表明全世界患有不同程度神经系统疾病的人数几乎占全球总人数的1/6。脑瘤如神经胶质细胞瘤(neurogliocytoma)，神经性退行疾病如阿尔茨海默病(AD)和帕金森综合征(PD)仍缺乏有效的治疗药物和方法。
众所周知，血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的存在大大阻碍了药物进入CNS病灶部位发挥治疗作用。具体地说，BBB主要由极化的脑毛细血管内皮细胞(braincapillary endothelial cells,BCEC)通过复杂的细胞间紧密连接而构成，它为脑组织营造了一个相对稳定的内环境，保障中枢神经系统(central nervous system,CNS)的正常生理功能，但同时也限制了绝大多数药物的脑内转运。据统计，目前临床使用的药物中，约有98％的小分子化学药物和几乎100％的大分子药物，包括蛋白多肽和基因药物都难以入脑，给脑部疾病的治疗造成很大困难。
为克服血脑屏障，使药物能够进入CNS内发挥药效作用。目前临床上应用较多的方法是通过可逆性开启血脑屏障，鞘内注射以及颈动脉注射给药，使药物透过并进入CNS。这些方法在操作技术上要求高、安全风险大：它们可能破坏BBB的完整性且在开放紧密连接的过程中，伴随药物分子的进入，血液中的其他分子及毒素有可能进入中枢神经系统。相比上述侵入式治疗手段，研究人员开发了一系列脑靶向递送系统。根据药物透过血脑屏障的机制不同，可分为两大类：1.以化学为基础的脑靶向递药系统(chemistry-based braindelivery system),如制备脂溶性较高的前体药物和化学药物传递系统，药物主要以被动扩散的方式透过血脑屏障；2.以生物学为基础的脑靶向递药系统(biology-based braindelivery system),药物主要以受体、吸附或转运体介导的方式实现跨血脑屏障转运；此外，经鼻给药也是一条有效的入脑途径。
药物经鼻黏膜吸收进入脑内主要有3条通路：嗅黏膜上皮通路、嗅神经通路和血液循环通路。前两条通路均与嗅黏膜吸收直接入脑有关。另外，近年来的研究发现，鼻腔给药后还有部分药物能够通过三叉神经途径人脑。与其他脑靶向策略相比，鼻腔给药为血管外给药，安全、便捷、无痛，是较理想的脑靶向给药途径。
目前，研究较多的鼻腔给药剂型主要有：滴鼻剂、气雾剂、喷雾剂、凝胶剂、微球、脂质体、固体脂质体纳米粒、乳剂等。其中，由于纳米载体递药系统具有增加难溶药物溶解度，保护药物避免被各种酶等化学因素破坏，有一定的促渗透作用，促进药物在鼻黏膜的释放，提高药物的安全性、有效性甚至靶向性等优点，已作为鼻腔给药新剂型被大量研究。
脂质体(liposome)是一种类似生物膜结构的脂质双分子层微小囊泡，1961英国血液学家Alec D Bangham首次发现，于1964年被正式报导。脂质体具有靶向性、缓释性、提高药物稳定性、增加难溶性药物溶解度、降低药物毒性等特点，是良好的药物载体。根据载药机理不同，脂质体载药技术可分为两大类：被动载药法(passive loading)和主动载药法(active/remote loading)。传统上，研究者采用较多的是被动载药法，该法主要适于脂溶性强或水溶性强的药物。对于两亲，如弱酸性或弱碱性药物，其油水分配系数受介质pH和离子强度的影响较大，用被动载药法制得的脂质体包封率低。而主动载药法通过内外水相的不同离子或化合物梯度进行载药，对两亲性药物脂质体的包封率高、渗漏少，克服了被包裹药物的早期突释和泄露现象，特别具有临床价值。
布美他尼是间氨基苯磺酰胺的衍生物，属强效利尿药，于1983年首次被FDA批准。利尿作用机制与抑制Na-K-ATP酶的活性有关。主要是通过抑制髓袢升支粗段对Cl-的主动重吸收和Na+的被动重吸收而影响尿的浓缩和稀释过程起到利尿作用。近期研究表明：布美他尼治疗明显提高了阿尔茨海默模型小鼠在多种认知和空间记忆测试中的表现，并能够缩小β淀粉样蛋白斑块。还有研究认为：布美他尼通过阻断让盐分穿梭于细胞膜的蛋白来减少水滞留。这些蛋白也存在于神经元中，如果这些神经元过度兴奋(如发生在癫痫等情况下)，那么阻断它们就可以恢复平衡。但是，布美他尼的使用也很棘手，因为它可能会让患者脱水，并且电解质失调。而局部靶向给药能够很好的解决这一问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向脑部的布美他尼脂质体，该脂质体经鼻腔给药，可以提高布美他尼的中枢浓度，从而增强疗效，同时降低药物在外周器官的分布，减少其毒副作用。本发明的另一个目的是通过主动载药技术实现布美他尼脂质体的高效制备。本发明通过一下技术方案实现上述发明目的：
方面1.一种布美他尼脂质体，包括脂质膜和布美他尼。
方面2.方面1所述的布美他尼脂质体，特征在于以重量计算，药脂比≤1:1；优选药脂比≤1:5；优选药脂比≤1:7；更优选药脂比≤1:10；更优选药脂比≤1:12；更优选药脂比≤1:15；更优选药脂比≤1:20；更优选1:5≤药脂比≤1:1，1:7≤药脂比≤1:5，1:10≤药脂比≤1:7，1:12≤药脂比≤1:10，1:15≤药脂比≤1:7，1:20≤药脂比≤1:5，1：40≤药脂比≤1:5或1:100≤药脂比≤1:5。
方面3.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于脂质体中任选地还包括pH依赖的可离子化的阴离子。
方面4.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于脂质体的布美他尼以纳米固体颗粒或溶液形式存在。
方面5.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于构成脂质体脂质膜的脂质包括磷脂、胆固醇和阳离子脂质中的一种或多种。
方面6.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于构成脂质体脂质膜的磷脂包括蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇；优选蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和磷脂酰甘油中的一种或多种。
方面7.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于胆固醇和磷脂的质量比为1:0.5～1:10；优选1：1～1：8；更优选1：2～1：6；更优选1：3～1：5；更优选约为1：4。
方面8.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于阳离子脂质包括2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(DOTMA)中的一种或多种。
方面9.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于pH依赖的可离子化的阴离子为醋酸根或柠檬酸根。
方面10.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸、柠檬酸、醋酸钙、醋酸铜、醋酸锌、醋酸镁、柠檬酸钙、柠檬酸铜中的一种或多种提供；优选醋酸钙、醋酸铜、醋酸锌、醋酸镁中的一种或多种提供；优选醋酸钙。
方面11.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述pH依赖的可离子化的阴离子的投料浓度为0.1-0.5mol/L；优选0.15-0.45mol/L；更优选0.2-0.4mol/L；更优选0.2-0.3mol/L。方面12.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体还任选地包括表面修饰材料，所述表面修饰材料包括PEG化脂质、壳聚糖及其衍生物、海藻酸盐、细胞穿透肽中的一种或多种；优选地，PEG化脂质选自甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、甲氧基聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DOPE)、甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DPPE)、聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、硬脂酰聚乙二醇酯、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)中的一种或多种；优选地，细胞穿透肽选自多聚精氨酸或多聚赖氨酸的一种或两种。
方面13.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体还任选地包括等渗调节剂、pH调节剂、缓冲剂、增稠剂、防腐剂、矫味剂、吸收促进剂、表面活性剂中的一种或多种；优选地，所述等渗调节剂选自蔗糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、NaCl中的一种或多种，等渗调节剂优选蔗糖、NaCl中的一种或两种；优选地，pH调节剂选自盐酸、硫酸、磷酸、NaOH、KOH、磷酸钠、磷酸钾中的一种或多种，pH调节剂优选盐酸、NaOH；优选地，所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、Hepes缓冲剂、Tris缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂中的一种或几种，所述缓冲剂优选为磷酸盐缓冲剂；优选地，所述增稠剂选自透明质酸钠、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、PVP、PVPP、PLGA、海藻酸钠中的一种或多种；优选地，所述防腐剂选自山梨酸、山梨酯、尼泊金酯、苯扎氯铵、苯扎溴铵中的一种或多种。
方面14.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体药物包封率为＞50％；优选＞60％；优选＞70％；优选大于＞80％；优选＞90％；更优选＞95％；更优选＞97％；更优选＞98％。
方面15.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体的布美他尼药物含量为>0.5mg/mL；优选>1.0mg/mL；优选>1.5mg/mL；优选>1.9mg/mL；优选>2.2mg/mL；优选>2.5mg/mL。
方面16.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体粒径为25～1000nm；优选地，脂质体的粒径是25～500nm或500～1000nm；更优选地，脂质体的粒径是25～75nm、75～125nm、125～175nm、175～225nm、225～275nm、275～350nm、350nm～500nm、500～800nm或800～1000nm；更优选地，脂质体的粒径是100±10nm，110±10nm，120±10nm，125±10nm，130±10nm，140±10nm，150±10nm，160±10nm，170±10nm，180±10nm，190±10nm，200±10nm，210±10nm，220±10nm或250±10nm。
方面17.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体相对于口服制剂能够提高布美他尼在脑部药物浓度。
方面18.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述布美他尼脂质体以液体药物组合物形式存在，优选为注射剂、鼻喷雾剂、滴鼻剂、口服液、滴眼液、气雾剂、洗鼻剂、洗耳剂、喷雾剂、凝胶剂、微球、固体脂质体纳米粒、乳剂中的一种。
方面19.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述布美他尼脂质体为阳离子脂质体、中性脂质体或负电性脂质体。
方面20.前述任一方面所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述布美他尼脂质体选自：脂质体1：布美他尼含量约2.9mg/mL、包封率约99.4％、投料药脂比约1:3、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-1)；
脂质体2：布美他尼含量约3.1mg/mL、包封率约99.6％、投料药脂比约1:4、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-2)；
脂质体3：布美他尼含量约2.3mg/mL、包封率约99.3％、投料药脂比约1:6、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-3)；
脂质体4：布美他尼含量约2.9mg/mL、包封率约100％、投料药脂比约1:8、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-4)；
脂质体5：布美他尼含量约2.4mg/mL、包封率约100％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-5)；
脂质体6：布美他尼含量约1.9mg/mL、包封率约99.4％、投料药脂比约1:12、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-6)；
脂质体7：布美他尼含量约2.4mg/mL、包封率约99％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由乙酸钡提供、乙酸钡投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例2)；
脂质体8：布美他尼含量约2.5mg/mL、包封率约99％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由乙酸镁提供、乙酸镁投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例3)；
脂质体9：投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由乙酸铜提供、乙酸铜投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例4)；
脂质体10：布美他尼含量约0.8mg/mL、包封率约98％、投料药脂比约1:10、脂质为氢化大豆卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约3：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例5)；脂质体11：布美他尼含量约9.5mg/mL、包封率约99％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例6)；
脂质体12：布美他尼含量约3.75mg/mL、包封率约98.8％、投料药脂比约1:1、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-1-1)；
脂质体13：布美他尼含量约3.64mg/mL、包封率约98.3％、投料药脂比约1:2、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-1-2)；
脂质体14：布美他尼含量约3.45mg/mL、包封率约99.2％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-1-3)；
脂质体15：布美他尼含量约3.41mg/mL、包封率约97.7％、投料药脂比约1:1、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-2-1)；
脂质体16：布美他尼含量约4.03mg/mL、包封率约98.2％、投料药脂比约1:2、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-2-2)；
脂质体17：布美他尼含量约3.67mg/mL、包封率约99.1％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-2-3)；
脂质体18：布美他尼含量约4.56mg/mL、包封率约99.0％、投料药脂比约1:5、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-2-4)；
脂质体19：布美他尼含量约5.04mg/mL、包封率约98.7％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为NaCl的脂质体(实施例8-1)；
脂质体20：布美他尼含量约4.76mg/mL、包封率约98.3％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为NaCl的脂质体(实施例8-2)；
脂质体20：布美他尼含量约1.74mg/mL、包封率约98.5％、投料药脂比约1:12.5、脂质为氢化大豆卵磷脂以及DSPG钠盐和胆固醇、氢化大豆卵磷脂：DSPG钠盐：胆固醇的质量比＝约7.08：3.93：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例9A)；
脂质体21：布美他尼含量约0.59mg/mL、包封率约95.9％、投料药脂比约1:12.5、脂质为氢化大豆卵磷脂以及DSPG钠盐和胆固醇、氢化大豆卵磷脂：DSPG钠盐：胆固醇的质量比＝约7.08：3.93：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖、表面覆盖壳聚糖的脂质体(实施例9B)；
脂质体22：布美他尼含量约1.18mg/mL、包封率约97.2％、投料药脂比约1:12、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖、表面覆盖壳聚糖的脂质体(实施例10)中的一种。
方面21.一种使用方面1-20任一项所述的脂质体制备治疗脑部疾病中的用途。
方面22.一种如方面21所述的脂质体或药物组合物制备治疗脑部疾病中的用途，所述脑部疾病为阿尔茨海默、癫痫、帕金森、瑞氏综合征或孤独症。
具体实施方式
以下术语在整个说明书中具有所指示的含义：
除非在本文件的别处具体定义，否则本文所使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。
以下术语在整个说明书中具有所指示的含义：
除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，包括权利要求书，单数形式的词如“一个/种”和“所述”包括其相应的复数代指物。
除非上下文另有明确规定，否则术语“或”用于表示术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
除非上下文另有明确规定，否则术语“约”是指所述数值的±10％范围内的浮动。
术语“脂质体”是指将药物包封于脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。脂质体的粒径包括但不限于25～1000nm；优选地，脂质体的粒径可以是25～500nm或500～1000nm；更优选地，脂质体的粒径可以是25～75nm、75～125nm、125～175nm、175～225nm、225～275nm、275～350nm、350nm～500nm、500～800nm或800～1000nm。本文中脂质体可以是单室脂质体，多室脂质体或多囊脂质体。本文中脂质体可以是中性脂质体、负电荷脂质体或正电荷脂质体。
术语“粒径”或“平均粒径”是指脂质体单个囊泡或颗粒的直径、尺寸或平均直径、平均尺寸。“粒径”或“平均粒径”的测量方法包括但不限于动态光散射法、显微镜测量法等。通常测量方法使用动态光散射法。本发明制备的脂质体载药系统均用马尔文粒径仪平均粒径。操作时用纯化水将待测液稀释20倍后，置于粒径仪中进行测定。
术语“包封率”指被包裹药物占制剂中总药物的百分比。可利用下式计算出包封率：包封率(％)＝(X-Y)/X*100％
X为制剂中布美他尼总含量
Y为制剂中游离布美他尼的含量
术语“脂质”是指脂肪酸甘油三酯(triacylglycerol)、磷脂(phospholipids)、糖脂(glycolipid)、胆固醇及其酯(cholesterol and cholesterol ester)、阳离子脂质、可电离阳离子脂质中的一种或多种。脂质可以是单一种类，也可以是多种不同脂质的组合。
术语“磷脂”是指含有磷的脂类，通常由疏水的脂肪酸尾巴和亲水的磷酸头部组成，是细胞膜的重要组成成分。本文中磷脂包括但不限于蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇；优选蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和磷脂酰甘油中的一种或多种。
术语“药脂比”是指制备脂质体所用药物与脂质的质量比。具体地，药脂比＝质量布美他尼/质量脂质。其中脂质的质量包括所有所使用的脂质的质量。
术语“脂质膜”指脂质体所形成的微型泡囊体的由脂质所构成的外层膜。通常为脂质双分子层结构。
术语“内水相”是指脂质体所形成的微型泡囊体中脂质膜所包裹的空腔中的水相。内水相可以是溶液，也可以是含水的固液混合物或含水固体微粒。
术语“pH依赖的可离子化的阴离子”是指在pH较低的情况下为分子状态，在pH较高的情况下为离子状态的物质所电离出的阴离子。在一些实施例中“pH较低的情况”为pH<7，在一些实施例中“pH较低的情况”为pH<5，在一些实施例中“pH较低的情况”为pH<3，在一些实施例中“pH较低的情况”为pH<2。在一些实施例中“pH较高的情况”为pH>7，在一些实施例中“pH较高的情况”为pH>9，在一些实施例中“pH较高的情况”为pH>11，在一些实施例中“pH较高的情况”为pH>2。在一些实施例中“pH依赖的可离子化的阴离子”为醋酸根、柠檬酸根、磷酸根中的一种或几种。在一些实施例中“pH依赖的可离子化的阴离子”为醋酸根。
术语“PEG化脂质”系指将不同聚合度的聚乙二醇连接在亲脂性分子上，利用亲脂性分子的脂溶性，插入在脂质体脂膜上，以实现脂质体表面连接PEG的作用。PEG化脂质包括但不限于甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、甲氧基聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DOPE)、甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DPPE)、聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、硬脂酰聚乙二醇酯、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)。
术语“细胞穿透肽”是指一类能携带物质进入细胞的短肽。在一些实施例中“细胞穿透肽”是指具有多聚精氨酸或多聚赖氨酸结构的多肽。
术语“药学上可接受的辅料”是与药物制剂的其他成分相容并且适用于受药者(例如人或动物)的组织或器官的接触。在使用时并无或很小的毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或其他问题的并发症。
本发明所述主动载药脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1-1)有机相溶解：称取脂质(磷脂，任选的胆固醇)、任选的PEG化脂质，加入有机溶剂，加热溶解即为有机相。
(1-2)水相溶解：称取包括pH依赖的可离子化的阴离子的梯度试剂，加入水溶解，即为水相。
(1-3)水化：水相保持加热搅拌状态，将有机相注入水相中，水化形成粗脂质体；或将有机相蒸干，加入水相，水化形成粗脂质体。
(1-4)降低粒度：用聚碳酸酯膜挤压法或均质机均质，控制脂质体粒径。
(1-5)建立跨膜梯度：用透析法(优选切向流过滤透析法)，除去脂质体膜外的有机溶剂和梯度试剂，建立梯度试剂在脂质体膜内外的浓度梯度差。
(1-6)载药：活性剂与已建立跨膜梯度的脂质体共孵育，实现主动载药。
优选的步骤(1-1)中的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇；优选蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和磷脂酰甘油中的一种或多种。PEG化脂质为甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、甲氧基聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DOPE)、甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DPPE)、聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、硬脂酰聚乙二醇酯、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)。膜材质量比磷脂：胆固醇为(1～10)：(0～3)；优选(1～5)：(0.5～2)；更优选4:1。
优选地，步骤(1-1)中的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种；优选为乙醇。有机溶剂用量按重量百分数计算，占膜材的100％～500％；优选110％～300％；更优选160％。
优选地，步骤(1-1)中的有机相加热温度为30℃-80℃，优选为40℃-70℃，进一步优选为50℃或60℃。
优选地，步骤(1-2)中的梯度试剂为柠檬酸、醋酸钙、醋酸铜、醋酸锌、醋酸镁中的一种或多种；优选为醋酸钙。梯度试剂的摩尔浓度为0.1～0.5mol/L；优选为0.15～0.4mol/L；更优选为0.2mol/L。
优选地，步骤(1-2)中的水优选为纯化水；有机溶剂与水的体积比为1:(5～15)；优选为1：(8～12)；更优选为1:9。
优选地，步骤(1-3)中水化温度为30℃-80℃，优选为40℃-70℃，进一步优选为50℃或60℃。
优选地，步骤(1-4)中所使用的聚碳酸酯膜孔径为50nm-1000nm，优选为100nm-800nm，更优选为200nm-500nm，更优选为200nm、300nm、400nm。
优选地，步骤(1-4)中控制脂质体粒径为25～1000nm；优选地，脂质体的粒径是25～500nm或500～1000nm；更优选地，脂质体的粒径是25～75nm、75～125nm、125～175nm、175～225nm、225～275nm、275～350nm、350nm～500nm、500～800nm或800～1000nm；更优选地，脂质体的粒径是100±10nm，110±10nm，120±10nm，125±10nm，130±10nm，140±10nm，150±10nm，160±10nm，170±10nm，180±10nm，190±10nm，200±10nm，210±10nm，220±10nm或250±10nm。
优选地，步骤(1-5)中所使用的透析膜孔径为1KDa-1000KDa(优选为50KDa-800KDa，更优选为100KDa-500KDa，进一步优选为100KDa-300KDa，进一步优选为100KDa、200KDa或300KDa)，换液倍数为10-20倍体积。
优选地，步骤(1-6)中的活性剂为布美他尼，布美他尼质量：膜材质量为1：(5～50)；优选为1：(8～30)；更优选为1:10。
本发明对主动载药脂质体给药系统的制备工艺进行优化，考察投药量，梯度试剂量，水化、挤出、载药温度、切向流透析体积等对处方包封率(简称EE％)载药量(简称DL％)以及粒径的影响。得到较优处方，并进行了多次验证，说明本发明确定的经表面修饰的主动载药脂质体给药系统的制备工艺可行。
将上述优化的处方工艺，运用到所述的主动载药脂质体的制备，得到包封率、含量、粒度合格且稳定的主动载药脂质体。
本发明所构建的主动载布美他尼脂质体给药系统通过SD大鼠鼻腔给药，考察体内脑靶向效率。1小时脑组织分布结果显示，主动载布美他尼脂质体组(给药0.5mg/kg)，脑内布美他尼的分布比口服游离药组(给药1mg/kg)高9倍。
缩略语表
TDDS 靶向递药系统,targeting drug delivery system
AD 阿尔茨海默病
PD 帕金森综合征
BBB 血脑屏障,blood brain barrier
CNS 保障中枢神经系统,central nervous system
PC 磷脂酰胆碱，Phosphatidyl cholines
EPC or EPCS 氢化大豆卵磷脂
PE 磷脂酰乙醇胺，Phosphatidyl ethanolamines
PI 磷脂酰肌醇,Phosphatidyl inositols
PA 甘油磷脂酸,phosphatidic acid
HSPC 氢化大豆卵磷脂
PEG 聚乙二醇
mPEG-DSPE 甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
mPEG-DOPE 甲氧基聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺
mPEG-DPPE 甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺
PEG-DMG 聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油
EE％ 包封率
DL％ 载药量
MPEG2000-DSPE 甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
DSPG 二硬脂酰磷脂酰甘油
Chol 胆固醇
附图说明
为了使本发明的内容得到更充分的理解，下面通过本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细地说明:
图1为本发明实施例1-1-6布美他尼脂质体粒度粒度分布图
图2为本发明实施例1-1-6布美他尼脂质体冷冻电镜图
具体实施例
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明的具体实施方案进行详细描述。需强调的是，这些描述的目的只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不构成对本发明的权利要求的任何限制。
实施例1.采用乙醇注入法，乙酸钙作为梯度试剂，制备布美他尼脂质体
称取4g蛋黄卵磷脂(Lipoid GmbH,型号为EPCS)，1g胆固醇于圆底烧瓶中，加入10.26g无水乙醇，60℃条件下搅拌溶解，即为有机相。取适量醋酸钙，用纯化水配制成浓度为0.2mol/L的溶液，称取72.43g该醋酸钙溶液，即为水相。水相保持60℃水浴，800rpm磁力搅拌，将有机相注入其中，得到粗脂质体。47mm直径挤出盘垫1层200nm尺寸的聚碳酸酯膜，60℃水浴条件，将得到的粗脂质体挤出至挤出压力基本保持不变。使用300KDa切向流膜包透析去除脂质体溶液中的无水乙醇和脂质体外相液中游离的醋酸钙，建立脂质体膜内外醋酸钙浓度梯度，透析完成后定容，得到100mL醋酸钙梯度的脂质体溶液A。
用上述醋酸钙梯度的脂质体溶液作为载体，投入不同量的布美他尼共孵育，蔗糖调节溶液至等渗。按表1投料，60℃，500rpm磁力搅拌1小时，过滤0.22μm滤器，即得布美他尼：膜材质量比(药脂比)为1:3、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12的载布美他尼脂质体。
表1制备不同药脂比的布美他尼脂质体投料方案
脂质体制剂代号 1-1-1 1-1-2 1-1-3 1-1-4 1-1-5 1-1-6
药脂比 1:3 1:4 1:6 1:8 1:10 1:12
脂质体溶液A投料量 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL 10mL
布美他尼投料量 166mg 124mg 83mg 63mg 50mg 42mg
蔗糖投料量 1.60g 1.60g 1.60g 1.61g 1.61g 1.61g
加纯化水至 20mL 20mL 20mL 20mL 20mL 20mL
药物含量的测定
布美他尼具有很强的紫外吸收特性，通过采用UV法利用朗伯比尔定律(A＝εlc)测定布美他尼的含量。取布美他尼对照品适量，精密称定，用甲醇稀释至一定浓度(C对照)，置于UV中在254nm波长下检测。另精密量取制剂适量，用甲醇稀释一定倍数(n)，置于UV中在254nm波长下检测。采用外标法计算制剂中布美他尼的含量(X)。计算公式如下：
布美他尼含量(X)＝A测定/A对照*C对照*n
粒径的测定
本发明制备的脂质体载药系统均用马尔文粒径仪，型号Nano-ZS测试平均粒径。操作时用纯化水将待测液稀释20倍后，置于粒径仪中进行测定。
包封率的测定
通过超滤离心的方式得到游离药物的测定溶液，按照“药物含量的测定”方法测定游离药物浓度。
取制剂适量置于15ml超滤离心管(100KDa)中，4000g，离心10min，取下层清液，用甲醇稀释一定倍数，置于UV中在254nm波长下检测。采用外标法计算制剂中游离布美他尼的含量(Y)。通过以下公式计算包封率。
包封率(％)＝(X-Y)/X*100％
X为制剂中布美他尼含量
实施例1中各脂质体制剂的测定数据见表2.
表2.各脂质体制剂的测定数据
脂质体制剂代号 1-1-1 1-1-2 1-1-3 1-1-4 1-1-5 1-1-6
布美他尼含量 2.9mg/mL 3.1mg/mL 3.3mg/mL 2.9mg/mL 2.4mg/mL 1.9mg/mL
包封率(％) 99.4 99.6 99.3 100 100 100
平均粒径(nm) 125 124 122 122 125 122
实施例2.采用乙醇注入法，乙酸钡作为梯度试剂，制备布美他尼脂质体
称取0.4g蛋黄卵磷脂(Lipoid GmbH,型号为EPCS)，0.1g胆固醇于圆底烧瓶中，加入1.6g无水乙醇，60℃条件下搅拌溶解，即为有机相。取适量乙酸钡，用纯化水配制成浓度为0.2mol/L的溶液，称取18.1g该乙酸钡溶液，即为水相。水相保持60℃水浴，800rpm磁力搅拌，将有机相注入其中，得到粗脂质体。47mm直径挤出盘垫1层200nm尺寸的聚碳酸酯膜，60℃水浴条件，将得到的粗脂质体进行循环挤出3分钟，至挤出压力基本保持不变。使用300KDa切向流膜包透析去除脂质体溶液中的无水乙醇和脂质体外相液中游离的乙酸钡，建立脂质体膜内外乙酸钡浓度梯度，透析完成后定容，得到10mL乙酸钡梯度的脂质体溶液。称取50mg布美他尼、1.6g蔗糖加入上述10mL乙酸钡梯度的脂质体溶液中，加纯化水至20mL，60℃，500rpm磁力搅拌1小时，过滤即得布美他尼：膜材质量比为1:10，梯度试剂为乙酸钡的布美他尼脂质体。测试其主要特征参数为：含量2.4mg/ml，包封率＞99％。
实施例3.采用乙醇注入法，乙酸镁作为梯度试剂，制备布美他尼脂质体
称取0.4g蛋黄卵磷脂(Lipoid GmbH,型号为EPCS)，0.1g胆固醇于圆底烧瓶中，加入1.6g无水乙醇，60℃条件下搅拌溶解，即为有机相。取适量乙酸镁，用纯化水配制成浓度为0.2mol/L的溶液，称取该乙酸镁溶液18.0g，即为水相。水相保持60℃水浴，800rpm磁力搅拌，将有机相注入其中，得到粗脂质体。47mm直径挤出盘垫1层200nm尺寸的聚碳酸酯膜，60℃水浴条件，将得到的粗脂质体进行循环挤出3分钟，至挤出压力基本保持不变。使用300KDa切向流膜包透析去除脂质体溶液中的无水乙醇和脂质体外相液中游离的乙酸镁，建立脂质体膜内外乙酸镁浓度梯度，透析完成后定容，得到10mL乙酸镁梯度的脂质体溶液。称取50mg布美他尼、1.6g蔗糖加入上述10mL乙酸镁梯度的脂质体溶液中，加纯化水至20mL，60℃，500rpm磁力搅拌1小时，过滤即得布美他尼：膜材质量比为1:10，梯度试剂为乙酸镁的布美他尼脂质体。测试其主要特征参数为：含量2.5mg/ml，包封率＞99％。
实施例4.采用乙醇注入法，乙酸铜作为梯度试剂，制备布美他尼脂质体
称取0.4g蛋黄卵磷脂(Lipoid GmbH,型号为EPCS)，0.1g胆固醇于圆底烧瓶中，加入1.6g无水乙醇，60℃条件下搅拌溶解，即为有机相。取适量乙酸铜，用纯化水配制成浓度为0.2mol/L的溶液，称取该乙酸铜溶液18.0g，即为水相。水相保持60℃水浴，800rpm磁力搅拌，将有机相注入其中，得到粗脂质体。47mm直径挤出盘垫1层200nm尺寸的聚碳酸酯膜，60℃水浴条件，将得到的粗脂质体进行循环挤出3分钟，至挤出压力基本保持不变。使用300KDa切向流膜包透析去除脂质体溶液中的无水乙醇和脂质体外相液中游离的乙酸铜，建立脂质体膜内外乙酸铜浓度梯度，透析完成后定容，得到10mL乙酸铜梯度的脂质体溶液。称取50mg布美他尼、1.6g蔗糖加入上述10mL乙酸铜梯度的脂质体溶液中，加纯化水至20mL，60℃，500rpm磁力搅拌1小时，过滤即得布美他尼：膜材质量比为1:10，梯度试剂为乙酸铜的布美他尼脂质体。呈翠绿色半透明体系。
实施例5.制备表面PEG化的载布美他尼脂质体
称取0.3g氢化大豆卵磷脂(HSPC)，0.1g胆固醇，0.1g MPEG2000-DSPE于圆底烧瓶中，加入1.6g无水乙醇，60℃条件下搅拌溶解，即为有机相。取适量醋酸钙，用纯化水配制成浓度为0.2mol/L的溶液，称取该醋酸钙溶液18.0g，即为水相。水相保持60℃水浴，800rpm磁力搅拌，将有机相注入其中，得到粗脂质体。47mm直径挤出盘垫1层200nm尺寸的聚碳酸酯膜，60℃水浴条件，将得到的粗脂质体进行循环挤出3分钟，至挤出压力基本保持不变。使用300KDa切向流膜包透析去除脂质体溶液中的无水乙醇和脂质体外相液中游离的醋酸钙，建立脂质体膜内外醋酸钙浓度梯度，透析完成后定容，得到20mL醋酸钙梯度的脂质体溶液。称取10mg布美他尼、0.6g蔗糖加入上述醋酸钙梯度的脂质体溶液4ml中，加纯化水至8mL，60℃，500rpm磁力搅拌1小时，过滤即得布美他尼：膜材质量比为1:10，梯度试剂为醋酸钙的布美他尼脂质体。含量0.8mg/ml，包封率98％，粒径149nm。
称取0.3g氢化大豆卵磷脂(HSPC)，0.1g胆固醇，0.1g MPEG2000-DSPE于圆底烧瓶中，加入2.5g无水乙醇，加入布美他尼38.7mg，60℃条件下搅拌溶解，即为有机相。用纯化水28ml作为水相。水相保持68℃水浴，1000rpm磁力搅拌，将有机相注入其中，得到粗脂质体。循环挤出3分钟。含量0.2mg/ml，包封率52％，粒度114.4nm。
实施例6.用乙醇注入法，醋酸钙作为梯度试剂，制备布美他尼脂质体含量～10mg/ml的脂质体制剂
称取4g蛋黄卵磷脂(Lipoid GmbH,EPCS)，1g胆固醇于圆底烧瓶中，加入8g无水乙醇，60℃条件下搅拌溶解，即为有机相。取适量醋酸钙，用纯化水配制成浓度为0.2mol/L的溶液，取该醋酸钙溶液90ml，即为水相。水相保持60℃水浴，500rpm磁力搅拌，将有机相注入其中，得到粗脂质体。47mm直径挤出盘垫双层100nm尺寸的聚碳酸酯膜，60℃水浴条件，将得到的粗脂质体挤出10次，至挤出压力基本保持不变。使用300KDa切向流膜包透析去除脂质体溶液中的无水乙醇和脂质体外相液中游离的醋酸钙，收集外水相共约500ml，建立脂质体膜内外醋酸钙浓度梯度，透析完成后定容，得到40mL醋酸钙梯度的脂质体溶液。
加入2.0g蔗糖和0.5g布美他尼，然后加纯化水至25mL，60℃，500rpm磁力搅拌1小时，过滤即得布美他尼：膜材质量比为1:10，梯度试剂为醋酸钙的布美他尼脂质体。测定含量为9.5mg/mL，包封率＞99％。
实施例7.采用薄膜蒸发法，醋酸钙作为梯度试剂，制备布美他尼脂质体制剂
称取1g蛋黄卵磷脂(含磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇胺，Lipoid GmbH,型号为E80)，0.25g胆固醇于圆底烧瓶中，加入5ml氯仿，60℃条件下搅拌溶解后蒸发至干。取适量醋酸钙，用纯化水配制成浓度为0.4mol/L的溶液，取该醋酸钙溶液37.5ml，即为水相。水相加至蒸干后的脂相中，保持60℃水浴，500rpm磁力搅拌，30min，得到粗脂质体7A。47mm直径挤出盘垫400nm尺寸的聚碳酸酯膜，将得到的粗脂质体循环挤出3min，得到脂质体7B。使用300KDa切向流膜包透析去除脂质体外相液中游离的醋酸钙，建立脂质体膜内外醋酸钙浓度梯度，透析完成后定容到透析前液量，对应原编号得到醋酸钙梯度的脂质体溶液。分别加入蔗糖和布美他尼，孵育30min后过滤得到对应制剂。具体加入量见表3.
表3.制备不同药脂比的布美他尼脂质体投料方案
检测结果见表4.
表4.各脂质体制剂的测定数据
脂质体制剂代号 7-1-1 7-1-2 7-1-3 7-2-1 7-2-2 7-2-3 7-2-4
布美他尼含量(mg/ml) 3.75 3.64 3.45 3.41 4.03 3.67 4.56
包封率(％) 98.8 98.3 99.2 97.7 98.2 99.1 99.0
平均粒径(nm) 178.9 182.5 172.1 182.6 187.6 186.3 203.6
实施例8.制备不含胆固醇的布美他尼脂质体制剂
称取1g蛋黄卵磷脂(Lipoid GmbH,EPCS)于圆底烧瓶中，加入2.5ml乙醇，60℃条件下搅拌溶解作为有机相。取适量醋酸钙，用纯化水配制成浓度为0.2mol/L的溶液，取25ml，即为水相。水相保持60℃水浴，500rpm磁力搅拌，将有机相加入水相中，得到粗脂质体。47mm直径挤出盘垫400nm尺寸的聚碳酸酯膜，将得到的粗脂质体循环挤出3min，得到脂质体8A，取出一部分，剩余以200nm尺寸聚碳酸酯膜循环挤出3min，得到脂质体8B。使用300KDa切向流膜包透析去除乙醇和脂质体外相液中游离的醋酸钙，建立脂质体膜内外醋酸钙浓度梯度，透析完成后定容，对应原编号得到醋酸钙梯度的脂质体溶液。分别加入氯化钠和布美他尼，具体加入量见表5.
表5.制备不同药脂比的布美他尼脂质体投料方案
检测结果见表6.
表6.各脂质体制剂的测定数据
实施例9A.采用乙醇注入法，醋酸钙为梯度试剂，制备含负电磷脂DSPG的载布美他尼脂质体
称取1.77g氢化大豆卵磷脂(HSPC)，0.59g胆固醇，0.15g DSPG(钠盐)于圆底烧瓶中，加入4.0g无水乙醇，60℃条件下搅拌溶解，即为有机相。取适量醋酸钙，用纯化水配制成浓度为0.2mol/L的溶液，量取该醋酸钙溶液45mL，即为水相。水相保持60℃水浴，800rpm磁力搅拌，将有机相注入其中，得到粗脂质体。47mm直径挤出盘垫1层200nm尺寸的聚碳酸酯膜，60℃水浴条件，将得到的粗脂质体进行循环挤出5分钟，至挤出压力基本保持不变；再换100nm尺寸聚碳酸酯膜，60℃水浴条件，循环挤出5分钟，至挤出压力基本保持不变。降至室温后，取30mL挤出后的脂质体，使用300KDa切向流膜包透析去除脂质体溶液中的无水乙醇和脂质体外相液中游离的醋酸钙，建立脂质体膜内外醋酸钙浓度梯度，透析完成后定容，得到30mL醋酸钙梯度的脂质体溶液。取10mL该脂质体溶液，称取40mg布美他尼、1.6g蔗糖加入上述10mL醋酸钙梯度的脂质体溶液中，加纯化水至20mL，60℃，500rpm磁力搅拌1小时，过滤即得布美他尼：膜材质量比为1:12.5，梯度试剂为醋酸钙，含负电磷脂DSPG的载布美他尼脂质体递送系统。含量1.74mg/ml，包封率98.5％，粒径为535.2nm。
实施例9B.取5mL实施例9A中制备的载布美他尼脂质体，加入到5mL配制好的壳聚糖稀醋酸溶液中(称取1g壳聚糖，加入到50ml，1.2％的醋酸水溶液中，室温、800rpm磁力搅拌至溶解，用稀氢氧化钠溶液调节pH至4.21，为壳聚糖稀醋酸溶液)，室温条件，800rpm磁力搅拌40min。即得含负电磷脂DSPG，载布美他尼脂质表面覆盖壳聚糖的递送系统。含量0.59mg/ml，包封率95.9％，粒径1322nm。
实施例10.制备EPCS/Chol处方，表面覆盖壳聚糖的载布美他尼脂质
取5mL实施例1中1-1-6的载布美他尼脂质体，加入到5mL配制好的壳聚糖稀醋酸溶液中(见实施例9)，室温条件，800rpm磁力搅拌40min。即得EPCS/Chol处方，覆盖壳聚糖的载布美他尼脂质。含量1.18mg/ml，包封率97.2％，粒径为520nm。
实施例11.脑内富集研究
为了评价所述脂质体递送系统的脑内富集，选择实施例1中的代号“1-5”的脂质体制剂进行了大鼠脑中药物浓度的测定。
取SD大鼠8只，雄性，体重190-200g,随机分2组，每组4只。一组鼻腔给代号“1-1-5”的脂质体制剂(T组)，给药剂量为0.5mpk。另一组灌胃游离布美他尼(C组)，给药剂量1mpk。于给药60min后大鼠颈椎脱臼处死，分离得到脑组织。将所取全部脑组织样品称重后加0.5ml生理盐水匀浆后，取匀浆液约0.5g，加甲醇1ml，涡旋混匀提取后，10000g离心5min后，取上清1ml置于1.5ml离心管中，氮气吹干后，加200μl甲醇溶解后，10000g离心10min，取上清50μl，加水50μl，混匀后用LC-MS进行分析。
LC-MS检测条件：
正离子模式；质谱条件：DP＝25、CE＝22、EP＝10、CXP＝15、IS＝5500、TEM＝550、CUR＝30、CAD＝9、GS1/GS2＝45/50；液相条件：MPA＝水溶液、MPB＝CAN；BMTN：365.1→240.1。
检测结果见表7.
表7.脂质体鼻腔给药(T组)及游离药灌胃给药(C组)1小时后脑内药物浓度
T组脑内平均药物浓度为17.21ng/g，C组为0.68ng/g。表明相比于布美他尼游离药物口服，鼻腔给药布美他尼脂质体制剂明显增加布美他尼的脑内药物浓度。
实施例12.大鼠3h脑内富集研究
选择实施例6中的脂质体制剂进行了大鼠脑中药物浓度的测定。
取SD大鼠8只，雄性，体重190-200g,随机分2组，每组4只。一组鼻腔给实施例6中的脂质体制剂(T组)，给药剂量为2.5mpk。另一组灌胃游离布美他尼(C组)，给药剂量5mpk。于给药180min后，分离得到脑组织。将所取全部脑组织样品称重后加0.5ml生理盐水匀浆后，取匀浆液约0.5g，加甲醇1ml，涡旋混匀提取后，10000g离心5min后，取上清1ml置于1.5ml离心管中，氮气吹干后，加200μl甲醇溶解后，10000g离心10min，取上清50μl，加水50μl，混匀后用LC-MS进行分析。
LC-MS检测条件：
正离子模式；质谱条件：DP＝25、CE＝22、EP＝10、CXP＝15、IS＝5500、TEM＝550、CUR＝30、CAD＝9、GS1/GS2＝45/50；液相条件：MPA＝水溶液、MPB＝CAN；BMTN：365.1→240.1。
检测结果见表8.
表8.布美他尼脂质体鼻腔给药(T组)及游离布美他尼灌胃给药(C组)3小时后脑内药物浓度情况
T组脑内平均药物浓度为3.10ng/g，C组为0.89ng/g，显示相比于布美他尼游离药物口服，鼻腔给药布美他尼脂质体制剂3h后脑内布美他尼浓度仍明显更高。

Claims (22)

1.一种布美他尼脂质体，包括脂质膜和布美他尼。
2.权利要求1所述的布美他尼脂质体，特征在于以重量计算，药脂比≤1:1；优选药脂比≤1:5；优选药脂比≤1:7；更优选药脂比≤1:10；更优选药脂比≤1:12；更优选药脂比≤1:15；更优选药脂比≤1:20；更优选1:5≤药脂比≤1:1，1:7≤药脂比≤1:5，1:10≤药脂比≤1:7，1:12≤药脂比≤1:10，1:15≤药脂比≤1:7，1:20≤药脂比≤1:5，1：40≤药脂比≤1:5或1:100≤药脂比≤1:5。
3.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于脂质体中任选地还包括pH依赖的可离子化的阴离子。
4.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于脂质体的布美他尼以纳米固体颗粒或溶液形式存在。
5.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于构成脂质体脂质膜的脂质包括磷脂、胆固醇和阳离子脂质中的一种或多种。
6.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于构成脂质体脂质膜的磷脂包括蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇；优选蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和磷脂酰甘油中的一种或多种。
7.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于胆固醇和磷脂的质量比为1:0.5～1:10；优选1：1～1：8；更优选1：2～1：6；更优选1：3～1：5；更优选约为1：4。
8.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于阳离子脂质包括2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(DOTMA)中的一种或多种。
9.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于pH依赖的可离子化的阴离子为醋酸根或柠檬酸根。
10.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸、柠檬酸、醋酸钙、醋酸铜、醋酸锌、醋酸镁、柠檬酸钙、柠檬酸铜中的一种或多种提供；优选醋酸钙、醋酸铜、醋酸锌、醋酸镁中的一种或多种提供；优选醋酸钙。
11.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述pH依赖的可离子化的阴离子的投料浓度为0.1-0.5mol/L；优选0.15-0.45mol/L；更优选0.2-0.4mol/L；更优选0.2-0.3mol/L。
12.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体还任选地包括表面修饰材料，所述表面修饰材料包括PEG化脂质、壳聚糖及其衍生物、海藻酸盐、细胞穿透肽中的一种或多种；优选地，PEG化脂质选自甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、甲氧基聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DOPE)、甲氧基聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DPPE)、聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、硬脂酰聚乙二醇酯、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)中的一种或多种；优选地，细胞穿透肽选自多聚精氨酸或多聚赖氨酸的一种或两种。
13.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体还任选地包括等渗调节剂、pH调节剂、缓冲剂、增稠剂、防腐剂、矫味剂、吸收促进剂、表面活性剂中的一种或多种；优选地，所述等渗调节剂选自蔗糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、NaCl中的一种或多种，等渗调节剂优选蔗糖、NaCl中的一种或两种；优选地，pH调节剂选自盐酸、硫酸、磷酸、NaOH、KOH、磷酸钠、磷酸钾中的一种或多种，pH调节剂优选盐酸、NaOH；优选地，所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、Hepes缓冲剂、Tris缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂中的一种或几种，所述缓冲剂优选为磷酸盐缓冲剂；优选地，所述增稠剂选自透明质酸钠、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、PVP、PVPP、PLGA、海藻酸钠中的一种或多种；优选地，所述防腐剂选自山梨酸、山梨酯、尼泊金酯、苯扎氯铵、苯扎溴铵中的一种或多种。
14.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体药物包封率为＞50％；优选＞60％；优选＞70％；优选大于＞80％；优选＞90％；更优选＞95％；更优选＞97％；更优选＞98％。
15.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体的布美他尼药物含量为>0.5mg/mL；优选>1.0mg/mL；优选>1.5mg/mL；优选>1.9mg/mL；优选>2.2mg/mL；优选>2.5mg/mL。
16.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体粒径为25～1000nm；优选地，脂质体的粒径是25～500nm或500～1000nm；更优选地，脂质体的粒径是25～75nm、75～125nm、125～175nm、175～225nm、225～275nm、275～350nm、350nm～500nm、500～800nm或800～1000nm；更优选地，脂质体的粒径是100±10nm，110±10nm，120±10nm，125±10nm，130±10nm，140±10nm，150±10nm，160±10nm，170±10nm，180±10nm，190±10nm，200±10nm，210±10nm，220±10nm或250±10nm。
17.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述脂质体相对于口服制剂能够提高布美他尼在脑部药物浓度。
18.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述布美他尼脂质体以液体药物组合物形式存在，优选为注射剂、鼻喷雾剂、滴鼻剂、口服液、滴眼液、气雾剂、洗鼻剂、洗耳剂、喷雾剂、凝胶剂、微球、固体脂质体纳米粒、乳剂中的一种。
19.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述布美他尼脂质体为阳离子脂质体、中性脂质体或负电性脂质体。
20.前述任一权利要求所述的布美他尼脂质体，其特征在于所述布美他尼脂质体选自：
脂质体1：布美他尼含量约2.9mg/mL、包封率约99.4％、投料药脂比约1:3、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-1)；
脂质体2：布美他尼含量约3.1mg/mL、包封率约99.6％、投料药脂比约1:4、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-2)；
脂质体3：布美他尼含量约2.3mg/mL、包封率约99.3％、投料药脂比约1:6、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-3)；
脂质体4：布美他尼含量约2.9mg/mL、包封率约100％、投料药脂比约1:8、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-4)；脂质体5：布美他尼含量约2.4mg/mL、包封率约100％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-5)；
脂质体6：布美他尼含量约1.9mg/mL、包封率约99.4％、投料药脂比约1:12、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例1-1-6)；
脂质体7：布美他尼含量约2.4mg/mL、包封率约99％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由乙酸钡提供、乙酸钡投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例2)；
脂质体8：布美他尼含量约2.5mg/mL、包封率约99％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由乙酸镁提供、乙酸镁投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例3)；
脂质体9：投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由乙酸铜提供、乙酸铜投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例4)；
脂质体10：布美他尼含量约0.8mg/mL、包封率约98％、投料药脂比约1:10、脂质为氢化大豆卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约3：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例5)；脂质体11：布美他尼含量约9.5mg/mL、包封率约99％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例6)；
脂质体12：布美他尼含量约3.75mg/mL、包封率约98.8％、投料药脂比约1:1、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-1-1)；脂质体13：布美他尼含量约3.64mg/mL、包封率约98.3％、投料药脂比约1:2、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-1-2)；脂质体14：布美他尼含量约3.45mg/mL、包封率约99.2％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-1-3)；脂质体15：布美他尼含量约3.41mg/mL、包封率约97.7％、投料药脂比约1:1、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-2-1)；脂质体16：布美他尼含量约4.03mg/mL、包封率约98.2％、投料药脂比约1:2、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-2-2)；脂质体17：布美他尼含量约3.67mg/mL、包封率约99.1％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-2-3)；脂质体18：布美他尼含量约4.56mg/mL、包封率约99.0％、投料药脂比约1:5、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.4mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例7-2-4)；脂质体19：布美他尼含量约5.04mg/mL、包封率约98.7％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为NaCl的脂质体(实施例8-1)；
脂质体20：布美他尼含量约4.76mg/mL、包封率约98.3％、投料药脂比约1:10、脂质为卵磷脂、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为NaCl的脂质体(实施例8-2)；
脂质体20：布美他尼含量约1.74mg/mL、包封率约98.5％、投料药脂比约1:12.5、脂质为氢化大豆卵磷脂以及DSPG钠盐和胆固醇、氢化大豆卵磷脂：DSPG钠盐：胆固醇的质量比＝约7.08：3.93：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖的脂质体(实施例9A)；
脂质体21：布美他尼含量约0.59mg/mL、包封率约95.9％、投料药脂比约1:12.5、脂质为氢化大豆卵磷脂以及DSPG钠盐和胆固醇、氢化大豆卵磷脂：DSPG钠盐：胆固醇的质量比＝约7.08：3.93：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖、表面覆盖壳聚糖的脂质体(实施例9B)；
脂质体22：布美他尼含量约1.18mg/mL、包封率约97.2％、投料药脂比约1:12、脂质为卵磷脂和胆固醇、磷脂胆固醇投料质量比为磷脂：胆固醇＝约4：1、pH依赖的可离子化的阴离子由醋酸钙提供、醋酸钙投料浓度为约0.2mol/L、等渗剂为蔗糖、表面覆盖壳聚糖的脂质体(实施例10)
中的一种。
21.一种使用权利要求1-20任一项所述的脂质体制备治疗脑部疾病中的用途。
22.一种如权利要求21所述的脂质体或药物组合物制备治疗脑部疾病中的用途，所述脑部疾病为阿尔茨海默、癫痫、帕金森、瑞氏综合征或孤独症。
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