CN112367970A - 用于治疗apoe4/4相关病症的方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了通过向对象施用治疗有效量的环‑利尿剂布美他尼来在具有apoE4/4基因型的对象中治疗阿尔茨海默病(AD)和挽救与AD相关的认知缺陷的方法。还公开了用于进行所述方法的药盒，其包含一个或更多个剂量的布美他尼制剂；并且其还可包含通过施用布美他尼治疗具有apoE4/4基因型的患者的说明，和/或针对测试/鉴定具有apoE4/4基因型的对象的说明和试剂。

Description

用于治疗APOE4/4相关病症的方法

交叉引用

本申请要求于2018年4月12日提交的美国临时专利申请No.62/656,898的权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。

关于联邦资助研究的声明

本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权No.AG057683的政府支持下完成。政府在本发明中具有一定的权利。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是与认知衰退相关的一种进行性神经变性病症，并且是在老年人中痴呆的最常见形式。遗传、病理学和功能研究已提供了脑中淀粉样蛋白β(amyloid-β，Aβ)肽的产生与清除之间的不平衡会导致Aβ的积累和聚集的证据。毒性Aβ以可溶性Aβ寡聚体的形式聚集，神经元内Aβ和淀粉样斑损伤突触并最终引起神经变性和痴呆。

存在痴呆的许多遗传风险因素；约25％的阿尔茨海默病患者具有所述疾病的强家族史。然而，仅1％的患有AD的患者直接继承了导致早发性阿尔茨海默病(也称为家族性阿尔茨海默病(familial Alzheimer′s disease，FAD))的基因突变。对于更常见的迟发性AD(late-onset AD，LOAD)，据报道人载脂蛋白E(Apolipoprotein E，APOE)基因是最大的风险因素。(Liu，C.C.，et al.，Apolipoprotein E and Alzheimer disease：risk，mechanismsand therapy.Nat.Rev.Neurol.，2013，9(2)：106-18)。

ApoE蛋白是介导脂质从一种组织或细胞类型向另一种组织或细胞类型的运输，并在脑中支持损伤修复的胆固醇载体。除与多种细胞表面受体结合以递送脂质之外，ApoE脂蛋白还与脑内部的疏水性Aβ肽结合。认为ApoE有助于清除Aβ，即与AD中突触功能障碍和神经变性相关的斑块的组分。

人ApoE是具有299个氨基酸的约34kDa的蛋白质。ApoE具有两个结构结构域-包含受体结合区(第135至150位氨基酸(aa))的氨基端结构域(第1至191位aa)和包含脂质结合区(第241至272位aa)的羧基端结构域(第222至299位aa)-其通过结构上柔性的铰链区(第192至221位aa)连接。

存在APOE基因的三种多态性等位基因：APOEε2、ε3和ε4(亦称E2、E3和E4)；因此，在人中，APOE基因型符号化为：E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4或E4/E4。E3等位基因是最常见的，并且被认为与AD的风险不相关，而携带E4等位基因的个体处于AD的提高风险中，以及具有甚至一个拷贝的E2等位基因(最罕见)的个体的发生阿尔茨海默病的风险降低。相比之下，在正常衰老期间，E4等位基因的存在与脑淀粉样血管病和与年龄有关的认知衰退的风险提高相关(同上)。

尽管AD是全世界痴呆的主要原因，然而尚无可用的有效治疗。因此，在本领域中仍然需要有效治疗ApoE4-基因型相关病症，例如痴呆和/或阿尔茨海默病的治疗剂。

发明概述

本公开内容提供了通过向对象施用治疗有效量的环-利尿剂布美他尼(bumetanide)来在具有apoE4/4基因型的对象中治疗阿尔茨海默病(AD)和挽救与AD相关的认知缺陷的方法，以及进行所述方法的药盒。本文中还提供了药盒，其包含一个或更多个剂量的布美他尼制剂；并且其还可包含通过施用布美他尼治疗具有apoE4/4基因型的患者的电子或纸质说明，和/或针对测试/鉴定具有apoE4/4基因型的对象的说明和试剂。

在一些方面中，提供了通过向对象施用治疗有效量的布美他尼来在具有apoE4/4基因型的对象中治疗阿尔茨海默病(AD)的方法。在所述方法的一些实施方案中，将布美他尼以0.05mg/kg/天或更少的剂量施用于对象。

在一些方面中，本文中提供了通过a)将对象鉴定为具有apoE4/4基因型；以及b)向对象施用治疗有效量的布美他尼来在具有apoE4/4基因型的对象中治疗阿尔茨海默病的方法。在所述方法的一些实施方案中，施用包括以0.05mg/kg/天或更少的剂量向对象施用布美他尼。

在这些方法的一些实施方案中，将布美他尼配制为包含可药用载体的经口剂型，并且所述经口剂型经口施用。在这些方法的一些实施方案中，经口剂型作为胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂每天施用一次。

在这些方法的一些实施方案中，布美他尼静脉内或肠胃外施用，并且任选地与可药用载体一起配制。

在这些方法的一些实施方案中，布美他尼以经皮贴剂提供。

在这些方法的一些实施方案中，对象是哺乳动物。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。在这些方法的一些实施方案中，哺乳动物是人。

在这些方法的一些实施方案中，基于PCR的DNA分析方法用于将对象鉴定为具有apoE4/4基因型。

在一些方面中，提供了包含以下的药盒：a)布美他尼制剂；b)包装；以及c)电子或纸质形式的信息，其包含向具有apoE4/4基因型的对象施用布美他尼的说明。在所述药盒的一些实施方案中，所述说明包含以0.05mg/kg/天或更少的布美他尼的剂量向对象施用制剂的说明。

在所述药盒的一些实施方案中，说明指出了向对象施用布美他尼制剂是基于对象体重以及所施用制剂的重量和/或体积。

在一些实施方案中，所述药盒还包含用于容纳从待针对一种或更多种apoE基因型进行测试的对象分离的生物样品的容器。

在一些实施方案中，所述药盒还包含用于进行PCR或微阵列分析以允许特异性检测生物样品中apoE4等位基因的一种或更多种试剂，以及针对使试剂与生物样品发生反应的电子或纸质说明。在一些实施方案中，所述药盒还包含一个或更多个对照参考样品。

在所述药盒的一些实施方案中，布美他尼制剂为用于经口递送的胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂的形式。在所述药盒的一些实施方案中，布美他尼制剂适用于注射器(syringeable)以进行静脉内或肠胃外递送。在所述药盒的一些实施方案中，布美他尼制剂为经皮贴剂的形式。

在一些方面中，本文中提供了包含以下的药盒：a)具有包含可药用载体和包含布美他尼的活性成分的一个或更多个剂量的制剂的容器；以及b)针对治疗具有apoE4/4基因型的对象的电子或纸质说明。在所述药盒的一些实施方案中，制剂的每个剂量不包含超过2mg的布美他尼。

在所述药盒的一些实施方案中，剂量被配制成用于经口施用。在所述药盒的一些实施方案中，配制成用于经口施用的剂量是每天一次的胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂。

在所述药盒的一些实施方案中，制剂的剂量被配制为静脉内或肠胃外施用。在所述药盒的一些实施方案中，制剂的剂量被配制为通过经皮贴剂施用。

在所述药盒的一些实施方案中，对象是哺乳动物。在所述药盒的一些实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。在所述药盒的一些实施方案中，哺乳动物是人。

在一些实施方案中，所述药盒还包含用于进行PCR或微阵列分析以允许特异性检测来自对象的生物样品中apoE4等位基因的一种或更多种试剂，以及针对使试剂与生物样品发生反应的电子或纸质说明。

在一些实施方案中，所述药盒还包含一个或更多个对照参考样品。

在所述药盒的一些实施方案中，针对治疗对象的说明指出基于对象体重以及所施用制剂的重量和/或体积的剂量。

附图简述

图1(图a至e)示出了在AD与对照数据集中的ApoE基因型特异性差异表达(differential expression，DE)的实验工作流程和分析。

图2(图a至g)示出了针对AD的(a)apoE4/4特异性，(b)apoE3/4特异性和(c)apoE3/3特异性的转录组特征而排序和评分的CMap化合物，并且示出了AD的apoE4/4特异性转录组特征对布美他尼的显著治疗响应。

图3(图a至f)示出了布美他尼对衰老ApoE4-KI小鼠的学习和记忆的作用的体内研究。

图4(图a至f)示出了布美他尼对ApoE4-KI小鼠海马转录组的作用的体内研究。

图5示出了人转录组数据集的协变量测量(ApoE基因型、诊断、平均年龄、SD、对照与AD样品之间年龄差异的基因型内显著性、组大小、男性数目、女性数目、降采样(down-sampled)性别匹配组中男性或女性的数目、男性/女性比率以及降采样的男性/女性比率)。

图6(图a至c)示出了apoE4-KI与apoE3-KI小鼠在隐藏平台试验(a)和可见试验(b)中的表现(performance)，并显示了布美他尼处理不会影响游泳速度，布美他尼处理也不与任何组中的任何运动或视觉损害相关。图(c)示出了方差稳定化变换(variancestabilizing transformation，Vst)在较低值时偏离log2变换。

图7(图a至c)示出了GSE15222数据集的主成分分析(principal componentanalysis，PCA)揭示apoE4基因型、诊断、年龄或性别协变量之间无聚类趋势。

图8(图a至e)示出了Syn3157255-MayoEGWAS数据集的PCA揭示apoE4基因型、诊断、年龄或性别协变量之间无聚类趋势。

图9(图a和b)提供了在ComBat校正之前(a)和之后(b)，Syn3157255-MayoEGWAS和GSE15222数据集的差异表达(DE)的荟萃分析(meta-analysis)。

图10提供了人apoeE3的基因组序列。

图11提供了人apoE4的基因组序列。

图12提供了表明布美他尼处理特别在衰老apoE4-KI小鼠中挽救神经元可塑性缺陷的图。

图13A至13G提供了示出了布美他尼在衰老apoE4-KI小鼠的海马中的转录组扰动特征(transcriptomic perturbation signature)的单一细胞核RNA-seq分析的结果的示意图、绘图(plot)和图(graph)。

图14A至14F提供了示出了布美他尼在apoE4/4-iPSC来源的人神经元中的转录组扰动特征的RNA-seq分析的结果的示意图和图。

定义

在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因为它们当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在进行限制，这是由于本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文中描述的方法和材料的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试中，但是现在描述一些优选的方法和材料。本文中提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。

必须注意，除非上下文另外明确指出，否则本文中和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。因此，例如，提及“多肽”包括多个这样的多肽及其等同物，并且提及“疾病或病症”包括本领域技术人员已知的相关病症的综合征，等等。还应注意，权利要求书可被制定为排除任何任选要素。同样地，该陈述旨在用作与权利要求要素的记载相关联的排他性术语例如“仅仅”、“仅”等的使用，或者“负”限制的使用的先行基础。

本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可包括编码和非编码氨基酸、经化学或经生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有经修饰肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列、具有或不具有N端甲硫氨酸残基的融合物；经免疫标记的蛋白质，等等。NH₂是指存在于多肽氨基端的游离氨基。COOH是指存在于多肽的羧基端的游离羧基。与标准多肽命名保持一致，使用J.Biol.Chem.，243(1969)，3552-59。

本文中使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得期望的药理和/或生理作用。所述作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良作用而言可以是治疗性的。本文中使用的“治疗”涵盖在哺乳动物中，特别在人中对疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的对象中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；以及(c)减轻疾病，即引起疾病的改善和/或消退。例如，对于阿尔茨海默病(AD)，可通过治疗改善的症状包括认知缺陷，例如学习和记忆的问题。类似地，可通过治疗改善的与AD相关的现象包括淀粉样斑、神经炎斑和/或神经原纤维缠结。

“治疗有效量”或“有效量”是指在施用于哺乳动物或其他对象以治疗疾病时足以实现对疾病的这样的治疗的化合物或药剂的量。“治疗有效量”将取决于化合物或药剂、疾病及其严重程度以及待治疗的对象的年龄、体重等而变化。

“生物样品”涵盖从个体获得的多种样品类型，并且可用于诊断或监测测定中。该定义涵盖血液和生物来源的其他液体样品，固体组织样品，例如活检标本或组织培养物，或由其衍生的细胞及其后代。该定义还包括在其获得之后以任何方式，例如通过用试剂的处理、增溶或富集某些组分(例如多核苷酸)处理的样品。术语“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。

本文中可互换使用的术语“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠、小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄类(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

本文中使用的术语“阿尔茨海默病”(在本文中简称为“AD”)是指与主要在海马和大脑皮质中的包含淀粉样蛋白β的神经炎斑的形成以及学习和记忆二者的损害相关的病症。本文中使用的“AD”意在涵盖AD以及AD类型的病理状况二者。

六种可能的apoE基因型如下：E2/E2(亦称“对E2等位基因呈纯合的”)、E2/E3(亦称“杂合E2/E3”)、E2/E4(亦称“杂合E2/E4”)、E3/E3(亦称“对E3等位基因呈纯合的”)、E3/E4(亦称“杂合E3/E4”)以及E4/E4(亦称对E4等位基因呈纯合的”)。所述三种ApoE蛋白同种型仅在其中存在半胱氨酸或精氨酸的两个氨基酸位置(第112位和第158位氨基酸)处不同。具体地，ApoE2蛋白同种型具有Cys112、Cys158；ApoE3蛋白同种型具有Cys112、Arg158；以及ApoE4蛋白同种型具有Arg112、Arg158(相对于无信号肽的成熟多肽进行编号)。这两个位置的氨基酸差异影响三种ApoE同种型的结构，并影响它们结合脂质、受体和Aβ的能力。人apoeE3的基因组序列由NCBI参考序列：NG_007084.2(SEQ ID NO：1)提供。人apoeE4的基因组序列由GenBank登录No.M10065，变体(version)M10065.1(SEQ ID NO：2)提供。

与公开的方法有关的待治疗的对象对于E4等位基因是纯合的(“apoE4/4”)。在一些实施方案中，所治疗的对象不是杂合的E3/E4。在一些实施方案中，所治疗的对象对于E2等位基因不是纯合的。在一些实施方案中，所治疗的对象对于E3等位基因不是纯合的。在一些实施方案中，所治疗的对象不是杂合的E2/E3。

本文中使用的“apoE4/4相关病症”是由apoE4/4基因型和/或产生的表型引起的任何病症；以apoE4/4基因型和/或产生的表型为特征的任何病症；由apoE4/4基因型和/或产生的表型引起的病症的症状；与由apoE4/4基因型和/或产生的表型引起的病症相关的现象；以及由apoE4/4基因型和/或产生的表型引起的任何病症的后遗症。

ApoE4/4相关疾病/病症包括ApoE4/4相关的神经病症。ApoE4/4相关疾病/病症包括但不限于散发性阿尔茨海默病；家族性阿尔茨海默病；卒中之后的不良结局；创伤性头损伤之后的不良结局；以及脑缺血。与ApoE4/4相关神经病症相关的现象包括但不限于与阿尔茨海默病、神经原纤维缠结、淀粉样蛋白沉积、记忆丧失、学习能力降低、以及认知功能降低相关的现象。与高血清脂质水平相关的与ApoE4/4有关的病症包括但不限于动脉粥样硬化和冠状动脉疾病。与这样的ApoE4/4相关病症相关的现象包括高血清胆固醇水平。

本文中使用的术语“与阿尔茨海默病相关的现象”是指与AD相关的结构、分子或功能性事件，包括在动物模型中可容易评估的这样的事件。这样的事件包括但不限于淀粉样蛋白沉积、神经病理发展、学习和记忆缺陷以及其他AD相关的特征。

当提供值的范围时，应理解，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值，直至下限单位的十分之一，以及在该规定范围内的任何其他规定值或中间值，涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受到所规定范围中的任何明确排除的限制。当所规定范围包含一个或两个限制时，排除那些被包含的限制之一或两者的范围也包含在本发明中。

本文中所讨论的出版物仅出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文中的任何内容均不得理解为承认本发明无权先于这样的出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期有所不同，所述实际公布日期可能需要独立确定。

发明详述

现在将在下文中更全面地描述多个方面。然而，这样的方面可以以许多不同的形式来体现，并且不应被理解为限于本文中所述的实施方案；相反，提供了这些实施方案使得本公开内容将是透彻和完整的，并且将其范围完全传达给本领域技术人员。

阿尔茨海默病(AD)是全世界痴呆的主要原因，并且迄今为止，尚无可用的有效治疗。AD的复杂性和多因素病因对传统药物开发提出了独特的挑战，并且在人试验中靶向与AD有关的途径的几乎所有努力均已证明是失败的^1，2。尽管载脂蛋白(apolipoprotein，apo)E4是AD的主要遗传风险因素^1，3-5(60至80％的患者具有至少一个APOE4等位基因，以及约70％的纯合子在85岁之前发展为AD)^6，7，但尚未针对AD药物开发对其进行积极的研究^1，2。

本文中公开了筛选可用于治疗与apoE4有关的阿尔茨海默病(AD)的药物的apoE基因型特异性药物再定位方法。通过对来自公共数据库的人颞叶样品的荟萃分析，建立AD的apoE基因型特异性转录组特征，并将其应用于包含现有药物的转录组扰动特征的经验证的连接性映射(Connectivity Map，CMap)数据库以鉴定能够扰动整个基因表达网络远离apoE基因型驱动的疾病状态趋向正常状态的药物。环-利尿剂布美他尼是用于逆转apoE4/4 AD表型的转录组特征和基因表达模式的最佳预测药物候选物。此外，如本文中提供的实施例中所讨论的，用布美他尼处理衰老的apoE4敲入(apoE4 knock-in，apoE4-KI)小鼠挽救了认知缺陷。因此，发现布美他尼特别可用于治疗具有apoE4/4基因型的对象，挽救与AD相关的认知缺陷。出乎意料地，基于本文中提供的公开内容，认为布美他尼的有效性对apoE4/4基因型具有特异性，其中布美他尼对apoeE3/4基因型的药物预测评分甚至比对apoeE3/3基因型具有更低的效力指示，如本文中更详细描述的。不旨在受任何特定理论的束缚，这可能是由于apoeE3/4与apoE4/4表达特征之间的显著差异引起。

因此，在一些方面中，提供了通过向对象施用治疗有效量的布美他尼来在具有apoE4/4基因型的对象中治疗ApoE4/4相关的神经病症，例如阿尔茨海默病(AD)的方法。有关组合物、制剂和药盒也在下面更详细地描述。

治疗患有apoE4/4相关的神经病症的对象的方法

本公开内容提供了在具有apoE4/4基因型的对象中治疗患有与apoE4/4相关的神经病症，例如AD的对象的方法。所述方法通常涉及向有此需要的个体(例如，患有AD和/或与apoE4/4基因型相关的病症的个体)施用有效量的单独(例如，在单一治疗中)或与一种或更多种另外的治疗剂组合(例如，在组合治疗中)的布美他尼。

本公开内容提供了在具有apoE4/4基因型的对象中治疗AD症状的方法，所述方法通常涉及向有此需要的个体施用治疗有效量的布美他尼。例如，在一些实施方案中，布美他尼的治疗有效量是在以一个或更多个剂量单独(例如，在单一治疗中)或者与一种或更多种另外的治疗剂组合(例如，在组合治疗中)施用时在所治疗的个体中有效改善认知功能的量。例如，与在用布美他尼治疗之前或在不存在用布美他尼治疗的情况下的对象的认知功能相比，布美他尼的有效量可在个体中使认知功能提高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或更多。

在一些实施方案中，布美他尼的有效量是在以一个或更多个剂量单独(例如，在单一治疗中)或者与一种或更多种另外的治疗剂组合(例如，在组合治疗中)施用时，与在不存在用布美他尼治疗的情况下的不良症状的严重程度相比，使AD或与apoE4/4-基因型相关的病症的不良症状有效降低以下的量：至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或更多。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在个体中抑制神经原纤维缠结形成的方法，其包括向个体施用有效量的布美他尼。布美他尼是否会降低神经原纤维缠结和/或Aβ沉积物的形成，可使用任何已知方法在人中确定，所述方法包括但不限于脑活检样品的免疫组织化学染色。

已知处于发生AD风险的个体适合于使用主题方法进行治疗。因此，布美他尼适合于在对apoE4呈纯合但未显示出阿尔茨海默病或其他神经变性病症的明显症状的患者中预防性使用。所述方法还可用于治疗已显示出AD症状的个体，其中所述方法通过降低疾病的进展或降低与AD相关的症状的严重程度来治疗AD。AD的进展是否降低或与AD有关的症状的严重程度是否降低可通过评估与AD相关的任何症状或参数，包括但不限于认知功能和记忆来确定。使用本领域已知的标准方法，这样的确定完全在本领域技术人员的能力之内。

布美他尼(3-(丁基氨基)-4-苯氧基-5-氨磺酰基苯甲酸；MW 364.41)是强效利尿剂，其如果以过量的量给予时可导致极度的利尿伴随有水和电解质耗竭。作为利尿剂，布美他尼通过使肾将不需要的水和盐从身体除去进入尿中来发挥作用。FDA批准的布美他尼(Bumex^TM)是环-利尿剂-即，其作用于肾中Henle环的升支-用于治疗由多种医学病症(包括心、肾和肝病)引起的水肿和/或高血压。Bumex^TM可作为刻痕片剂(scored tablet)商购获得，针对经口施用为0.5mg(浅绿色)、1mg(黄色)和2mg(桃红色)；每个片剂还包含乳糖、硬脂酸镁、微晶纤维素、玉米淀粉和滑石，以及以下染料体系：0.5mg-D&C Yellow No.10和FD&CBlue No.1；1mg-D&C Yellow No.10；2mg-红色氧化铁。

剂量

合适的剂量可由主治医师或其他合格的医学人员基于多种临床因素来确定。如医学领域公知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的尺寸、体重指数(BodyMass Index，BMI)、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、患者的性别、时间、以及施用途径、一般健康以及待同时施用的其他药物。例如，布美他尼可以以以下的量施用：1μg/kg体重至0.5mg/kg体重(含)，例如10μg/kg体重至0.2mg/kg体重(含)，例如20μg/kg体重至0.1mg/kg体重(含)，例如30μg/kg体重至50μg/kg体重(含)，然而，考虑了低于或高于该示例性范围的剂量，尤其是考虑到前述因素。在一些实施方案中，布美他尼可以以以下的量施用：0.01mg/kg体重至0.2mg/kg体重(含)，例如0.02mg/kg体重至0.1mg/kg体重(含)，0.03mg/kg体重至0.09mg/kg体重(含)，0.04mg/kg体重至0.08mg/kg体重(含)或0.05mg/kg体重至0.07mg/kg体重(含)。在一些实施方案中，如果方案是连续输注，则其也可以为0.5至2mg/小时。在一些实施方案中，布美他尼以以下的剂量施用：0.5mg至10mg，例如0.6mg至9mg，0.7mg至8mg，0.8mg至7mg，0.9mg至6mg，1mg至5mg或2mg至4mg。在一些实施方案中，布美他尼以以下的剂量，例如基于每天1次或2次施用：0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg。

因此，在一些实施方案中，提供了在具有apoE4/4基因型的对象中治疗AD的方法，其中所述方法包括以0.05mg/kg/天或更少，例如0.02mg/kg/天或更少的剂量向对象施用布美他尼。技术人员将容易地理解，剂量水平可根据具体组合物、症状的严重程度和对象对副作用的敏感性而变化。给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种手段容易地确定。

施用途径

可使用药物递送的任何合适的方法和途径，包括体内和离体方法，以及全身性和局部性的施用途径将布美他尼施用于个体。常规和可药用的施用途径包括但不必限于鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、表面施加、静脉内、动脉内、经直肠、经鼻、经口和其他肠内和肠胃外或吸入施用途径。如果期望的话，可将施用途径组合，或者取决于组合物和/或期望的效果进行调整。布美他尼组合物可以以单剂量或以多剂量施用。在一些实施方案中，布美他尼组合物经口施用。在一些实施方案中，布美他尼组合物通过吸入途径施用。在一些实施方案中，布美他尼组合物经鼻内施用。在一些实施方案中，布美他尼组合物局部施用。在一些实施方案中，布美他尼组合物颅内施用。在一些实施方案中，布美他尼组合物静脉内施用。

除吸入施用之外的肠胃外施用途径包括但不必限于表面、经皮、皮下、肌内、眶内、囊内、椎管内、胸骨内和静脉内途径，即除通过消化管之外的任何施用途径。可进行肠胃外施用以实现布美他尼的全身性或局部递送。在期望全身性递送的情况下，施用通常涉及药物制剂的侵入性施用或全身性吸收的表面施用或黏膜施用。

也可通过肠内施用将布美他尼递送至对象。肠内施用途径包括但不必限于经口和直肠(例如，使用栓剂)递送。

在一些实施方案中，通过注射和/或递送将布美他尼施用至例如脑动脉中的部位或直接施用到脑组织中。也可例如通过生物射弹(biolistic)递送至靶部位而将布美他尼直接施用于靶部位(例如，包含淀粉样斑的脑区域)。

在一些实施方案中，本文中公开的方法有效改善与ApoE4/4相关神经病症相关的至少一种现象，其中这样的现象包括例如神经原纤维缠结；淀粉样蛋白沉积；记忆丧失；学习或保持习得行为的能力降低；以及认知功能降低。因此，例如，主题方法有效地降低记忆丧失并且至少减慢了认知功能的降低。例如，主题方法有效地提高记忆功能和/或提高认知功能。因此，例如，当在单一治疗中或在组合治疗中以一个或更多个剂量施用时，布美他尼的有效量可降低神经原纤维缠结和/或淀粉样斑，以降低记忆丧失、提高记忆功能、降低认知功能丧失，或提高认知功能。

在一些实施方案中，可针对对布美他尼治疗的响应和/或病症的进展/消退来监测可监测的所述方法的有效性(例如，已经用布美他尼治疗AD或ApoE4/4相关的疾病或病症的个体)。在这样的实施方案中，将布美他尼施用于个体，并且测量认知功能并将其与基线测量进行比较和/或在个体中的脑组织中评估神经原纤维缠结的存在。例如，可进行AD或ApoE4/4相关的疾病或病症的症状的基线测量，并且然后可对个体进行所述方法，并且然后可在个体针对所述病症已开始治疗之后的一个或数个时间点进行治疗后测量。在对象/个体中指示症状改善或者疾病或病症的消退的测量可提供有效治疗的指示，并且可决定是否应继续治疗，是否应修改给药方案，或者是否应更改所施用药物。

在一些实施方案中，可在自针对ApoE4/4相关病症的布美他尼治疗的开始测量的单日或数日内，单周或数周的过程内，单月内，或持续两个月、三个月、六个月或多于六个月对个体进行治疗方法。可对个体多于一次进行主题方法。

组合物

本公开内容提供了包含布美他尼的组合物，包括药物组合物，其用于与所公开的方法和药盒结合使用。一般而言，制剂包含有效量的布美他尼。“有效量”意指足以产生所期望结果的剂量，所述结果例如淀粉样斑降低，ApoE4/4相关病症(例如，散发性或家族性阿尔茨海默病(AD)；阿尔茨海默病；卒中之后不良结局；创伤性头损伤之后的不良结局；脑缺血；神经原纤维缠结；淀粉样蛋白沉积；记忆丧失；学习能力降低；以及认知功能降低；高血清脂质和/胆固醇或水平；动脉粥样硬化；和/或冠状动脉疾病)的症状改善。一般而言，与对照相比，期望的结果至少是ApoE4/4相关病症(例如AD)的症状的降低。认为布美他尼可以以这样的方式递送以避开血脑屏障，如下文更详细地描述。可配制和/或改进主题组合物以使该组合物能够穿过血脑屏障。

制剂

在主题方法中，可使用能够导致期望的治疗效果或诊断效果的任何方便的手段将布美他尼组合物施用于宿主。因此，可将药剂并入到多种制剂中进行治疗性施用。更特别地，布美他尼可通过与合适的可药用载体或稀释剂组合配制成药物组合物，并且可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。

在药物剂型中，布美他尼可以以可药用盐的形式施用，或者也可单独地或与其他药物活性化合物适当联合，以及与其他药物活性化合物组合使用。以下方法和赋形剂仅是示例性的，并且绝不是限制性的。

对于经口制剂，布美他尼可单独地或与合适的添加剂组合使用以制造片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，例如与常规添加剂，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉组合；与黏合剂，例如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶组合；与崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠组合；与润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁组合；并且如果期望的话，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和矫味剂组合。

布美他尼可通过将其溶解、混悬或乳化在水性或非水性溶剂(例如蔬菜油或其他类似的油，合成脂肪酸甘油酯，高碳脂肪酸或丙二醇的酯)中；并且如果期望的话，与常规添加剂，例如增溶剂、等张剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起而配制成用于注射的适用于注射器制剂。在一些实施方案中，布美他尼以片剂的形式(Bumex^TM)经口施用。

包含布美他尼的药物组合物通过将具有所期望纯度的布美他尼与任选的生理上可接受的载体、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张度剂混合来制备。可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸和柠檬酸；防腐剂(例如乙醇、苄醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵，或其组合)；氨基酸，例如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸，及其组合；单糖、二糖和其他碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如明胶或血清白蛋白；螯合剂，例如EDTA；糖，例如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，例如吐温、Brij Pluronics、Triton-X或聚乙二醇(PEG)。

药物组合物可以是液体形式、冻干形式或由冻干形式重构的液体形式，其中冻干制剂在施用之前将用无菌溶液重构。用于重构冻干组合物的标准程序是加回(add back)纯水体积(通常等于冻干期间除去的体积)；然而，包含抗菌剂的溶液可用于产生用于肠胃外施用的药物组合物；还参见Chen(1992)Drug Dev Ind Pharm 18，1311-54。

主题药物制剂中的示例性布美他尼浓度可以为约1mg/mL至约200mg/mL或约50mg/mL至约200mg/mL，或约150mg/mL至约200mg/mL。

布美他尼的水性制剂可在pH缓冲溶液，例如在约4.0至约8.5，或约5.0至约6.0，或作为替代地约5.5的pH下的pH缓冲溶液中制备。适合于该范围内的pH的缓冲液的一些实例包括磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和其他有机酸缓冲液。缓冲液浓度可以为约1mM至约100mM，或约5mM至约50mM，这取决于例如缓冲液以及制剂的所期望张度。

张度剂可包含在布美他尼制剂中以调节制剂的张度。示例性张度剂包括氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸组的任何组分、糖，及其组合。在一些实施方案中，水性制剂是等张的，尽管高张或低张溶液可能是合适的。术语“等张”表示与其所比较的一些其他溶液(例如生理盐溶液或血清)具有相同张度的溶液。张度剂可以以约5mM至约350mM的量，例如以100mM至350nM的量使用。

还可将表面活性剂添加至布美他尼制剂以降低聚集和/或使制剂中颗粒的形成最小化和/或降低吸附。示例性表面活性剂包括聚氧乙烯山梨糖醇(polyoxyethylenesorbitan)脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer，Pluronic)和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)。合适的聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯的一些实例是聚山梨酸酯20(以商标Tween 20^TM出售)和聚山梨酸酯80(以商标Tween 80^TM出售)。合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物的一些实例是以名称

F68或Poloxamer 188^TM出售的那些。合适的聚氧乙烯烷基醚的一些实例是以商标Brij^TM出售的那些。表面活性剂的一些示例性浓度可以为约0.001％至约1％w/v。

还可添加冻干保护剂，以保护不稳定的活性成分(例如，蛋白质)免于冻干过程期间不稳定的条件的影响。例如，已知的冻干保护剂包括糖(包括葡萄糖和蔗糖)；多元醇(包括甘露醇、山梨糖醇和甘油)；以及氨基酸(包括丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸)。冻干保护剂可以以约10mM至500nM的量被包含在内。

在一些实施方案中，主题制剂包含布美他尼和一种或更多种以上确定的药剂(例如，表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、张度剂)，并且基本上不含一种或更多种防腐剂，例如乙醇、苄醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵，及其组合。在另一些实施方案中，防腐剂例如以约0.001％至约2％(w/v)的浓度包含在制剂中。

例如，主题制剂可以是适合于肠胃外施用的液体或冻干制剂，并且可包含：约1mg/mL至约200mg/mL的布美他尼；约0.001％至约1％的至少一种表面活性剂；约1mM至约100mM的缓冲剂；任选地约10mM至约500mM的稳定剂；以及约5mM至约305mM的张度剂；并且具有约4.0至约7.0的pH。

作为另一个实例，主题肠胃外制剂是液体或冻干制剂，其包含：约1mg/mL至约200mg/mL的布美他尼；0.04％吐温20w/v；20mM L-组氨酸；和250mM蔗糖；并且具有5.5的pH。

作为另一个实例，主题肠胃外制剂包含冻干制剂，其包含：1)15mg/mL的布美他尼，0.04％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及250mM蔗糖，并且具有5.5的pH；或者2)75mg/mL的布美他尼，0.04％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及250mM蔗糖，并且具有5.5的pH；或者3)75mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及250mM蔗糖，并且具有5.5的pH；或者4)75mg/mL的布美他尼，0.04％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及250mM海藻糖，并且具有5.5的pH；或者6)75mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及250mM海藻糖，并且具有5.5的pH。

作为另一个实例，主题肠胃外制剂是液体制剂，其包含：1)7.5mg/mL的布美他尼，0.022％吐温20w/v，120mM L-组氨酸，以及250125mM蔗糖，并且具有5.5的pH；或者2)37.5mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，10mM L-组氨酸，以及125mM蔗糖，并且具有5.5的pH；或者3)37.5mg/mL的布美他尼，0.01％吐温20w/v，10mM L-组氨酸，以及125mM蔗糖，并且具有5.5的pH；或者4)37.5mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，10mM L-组氨酸，125mM海藻糖，并且具有5.5的pH；或者5)37.5mg/mL的布美他尼，0.01％吐温20w/v，10mM L-组氨酸，以及125mM海藻糖，并且具有5.5的pH；或者6)5mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及250mM海藻糖，并且具有5.5的pH；或者7)75mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及250mM甘露醇，并且具有5.5的pH；或者8)75mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，20mM L组氨酸，以及140mM氯化钠，并且具有5.5的pH；或者9)150mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及250mM海藻糖，并且具有5.5的pH；或者10)150mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及250mM甘露醇，并且具有5.5的pH；或者11)150mg/mL的布美他尼，0.02％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及140mM氯化钠，并且具有5.5的pH；或者12)10mg/mL的布美他尼，0.01％吐温20w/v，20mM L-组氨酸，以及40mM氯化钠，并且具有5.5的pH。

布美他尼可用于待通过吸入施用的气雾剂制剂中。布美他尼可配制成可加压用(pressurized acceptable)的推进剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮，等。

此外，布美他尼可通过与多种碱例如乳化碱或水溶性碱混合而制成栓剂。布美他尼可通过栓剂经直肠施用。栓剂可包含载剂，例如可可脂、碳蜡和聚乙二醇，它们在体温下熔化，但在室温下固化。

可提供用于经口或直肠施用的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂和混悬剂，其中每个剂量单位，例如一茶匙容量(teaspoonful)、一大汤匙容量(tablespoonful)的片剂或栓剂，均包含含有一种或更多种抑制剂的预定量的组合物。类似地，用于注射或静脉内施用的单位剂型可在组合物中包含布美他尼作为无菌水、生理盐水或另一种可药用载体的溶液。

本文中使用的术语“单位剂型”是指适合作为人和动物对象的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位均包含与可药用稀释剂、载体或载剂缔合的以足以产生所期望效果的量计算的预定量的本发明化合物。布美他尼的规格可取决于所使用组合物中布美他尼的纯度或浓度以及所要达到的效果，以及与组合物在宿主中相关的药效学。

其他施用模式也可用于主题方法。例如，布美他尼可配制在栓剂中，以及在一些情况下，在气雾剂和鼻内组合物中。对于栓剂，载剂组合物将包含传统的黏合剂和载体，例如聚亚烷基二醇或甘油三酯。这样的栓剂可由包含约0.5％至约10％(w/w)，例如约1％至约2％的活性成分的混合物形成。

鼻内制剂通常将包含既不引起对鼻黏膜的刺激也不显著干扰纤毛功能的载剂。稀释剂例如水、水性盐水或其他已知物质可用于本发明。鼻制剂还可包含防腐剂，例如但不限于氯丁醇和苯扎氯铵。可存在表面活性剂以增强鼻黏膜对主题蛋白质的吸收。

布美他尼可作为可注射制剂施用。通常来说，将可注射组合物制备为液体溶液或混悬液；还可制备适合于在注射之前溶解在或混悬在液体载剂中的固体形式。还可将制剂乳化或将布美他尼包封在脂质体载剂中。

合适的赋形剂载剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其组合。另外，如果期望的话，载剂可包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。制备这样的剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或将是显然的。参见，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，17thedition，1985。无论如何，待施用的组合物或制剂将包含足以在所治疗的对象中达到期望状态的布美他尼量。

可药用赋形剂，例如载剂、辅料、载体或稀释剂，是公众可容易获得的。此外，可药用辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、稳定剂、润湿剂等，是公众可容易获得的。

在一些实施方案中，布美他尼配制在控释制剂中。可使用本领域公知的方法来制备缓释制剂。缓释制剂的一些合适实例包括包含布美他尼的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中该基质为成型制品(shaped article)的形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的一些实例包括聚酯、L-谷氨酸与L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、水凝胶、聚丙交酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟丁酸。可通过使用合适的添加剂，通过控制含水量和通过开发特定的聚合物基质组合物来预防缓释制剂中所包含抗体的生物活性的可能的丧失和免疫原性的可能的改变。

在本发明范围内的控释可理解为意指多种延时释放剂型中的任一种。出于本发明的目的，以下术语可被认为基本上等同于控释：连续释放、控释、迟释、长效(depot)、逐步释放、长期释放、程序性释放、延长释放、比例释放、长时间释放(protracted release)、储存库(repository)、延迟、缓慢释放、间隔释放、缓释、定时包衣(time coat)、定时释放、延迟作用、延长作用、分层时间作用(layered-time action)、长效、延长作用、反复作用、缓慢作用、持续作用、持续作用药物，以及延时释放。这些术语的进一步讨论可见于LesczekKrowczynski，Extended-Release Dosage Forms，1987(CRC Press，Inc.)中。

多种控释技术涵盖非常广泛的药物剂型。控释技术包括但不限于物理系统和化学系统。

物理系统包括但不限于具有速率控制膜的贮库型系统(reservoir system)，例如微囊化系统、大囊化系统和膜系统；不具有速率控制膜的贮库型系统，例如中空纤维、超微孔三乙酸纤维素、和多孔聚合物基质和泡沫；整体型系统，包括物理上溶解在非多孔的、聚合物的或弹性体基质中的那些系统(例如，非易蚀(nonerodible)、易蚀、环境物质侵入和可降解的)，以及物理上分散在非多孔的、聚合物的或弹性体基质中的材料(例如，非易蚀、易蚀、环境物质侵入和可降解的)；叠层结构，包括与外部控制层在化学上相似或不相似的贮库型层；以及其他物理方法，例如渗透泵，或吸附到离子交换树脂上。

化学系统包括但不限于聚合物基质的化学侵蚀(例如，非均质或均质侵蚀)，或聚合物基质的生物侵蚀(例如，非均质或均质)。关于控释系统类别的另外讨论可见于AgisF.Kydonieus，Controlled Release Technologies：Methods.Theory and Applications.1980(CRC Press，Inc.)中。

存在针对经口施用而开发的许多控释药物制剂。这些包括但不限于渗透压控制的胃肠道递送系统；动水压力控制的胃肠道递送系统；膜渗透控制的胃肠道递送系统，其包括微孔膜渗透控制的胃肠道递送装置；胃流体抗性肠靶向控释胃肠道递送装置；凝胶扩散控制的胃肠道递送系统；以及离子交换控制的胃肠道递送系统，其包括阳离子和阴离子药物。有关控释药物递送系统的另外信息，可见于Yie W.Chien，Novel Drug Delivery Systems.1992(Marcel Dekker，Inc.)中。现在将更详细地讨论这些制剂中的一些。

组合治疗

在一些实施方案中，主题治疗方法涉及施用布美他尼和一种或更多种另外的治疗剂。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批准两种类型的药物-胆碱酯酶抑制剂(例如Aricept(多奈哌齐(donepezil))、Exelon(卡巴拉汀(rivastigmine))、Razadyne(加兰他敏(galantamine)))以及美金刚(memantine)(盐酸美金刚(Namenda))以治疗AD的认知症状(记忆丧失、意识错乱以及思维和推理的问题)。还存在将一种胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐)与美金刚组合在一起的药物，称为Namzaric。

合适的另外的治疗剂包括但不限于乙酰胆碱酯酶抑制剂，包括但不限于Aricept(多奈哌齐)、Exelon(卡巴拉汀)、美曲磷酯(metrifonate)和他克林(Cognex)；非甾体抗炎剂，包括但不限于布洛芬(ibuprofen)和吲哚美辛(indomethacin)；环氧合酶2(cyclooxygenase-2，Cox2)抑制剂，例如西乐葆(Celebrex)；以及单胺氧化酶抑制剂，例如司来吉兰(Selegiline)(咪多吡(Eldepryl)或丙炔苯丙胺(Deprenyl))。上述药剂中的每一种的剂量是本领域已知的。例如，Aricept通常以每天50mg经口施用，持续6周，并且如果个体很好地耐受，则此后每天以10mg施用。

在一些实施方案中，主题组合治疗包含施用有效量的布美他尼和抑制apoE4蛋白结构域相互作用的药剂(例如，如描述于美国专利公开No.2006/0073104；以及Ye et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：18700中的药剂)。

在一些实施方案中，主题组合治疗包括施用有效量的布美他尼和乙酰胆碱酯酶抑制剂。在一些实施方案中，主题组合治疗包括施用有效量的布美他尼和抗炎剂。

适合于治疗的对象

多种对象适合于用主题方法治疗。合适的对象包括任何个体，尤其是哺乳动物，并且特别是人，其患有AD或ApoE4/4相关病症，其已诊断为患有AD或ApoE4/4相关病症，其处于发生AD或ApoE4/4相关病症的风险中，其曾患有AD或ApoE4/4相关病症并且处于AD或ApoE4/4相关病症的复发的风险中，或者其正在从AD或ApoE4/4相关病症中恢复。

适合于用主题方法治疗的对象包括具有两个apoE4等位基因的个体。换言之，合适的对象包括对apoE4呈纯合的那些。在一些实施方案中，对象已被诊断为患有阿尔茨海默病。

具有apoE4/4基因型的对象的鉴定

如本文中所讨论的，在一些方面中，所公开的方法和/或所公开的药盒的使用涉及对具有apoE4/4基因型的对象的鉴定。可在体外对获自个体的生物样品进行主题鉴定方法。因此，本公开内容提供了在从组织样品，例如血液、毛发或上皮细胞样品(例如，从颊拭子)中提取的DNA生物样品中检测对象的apoE基因型的方法。生物样品可以是，例如，从个体死后(post-mortem)获得的脑样品。

基因型测试的方法是本领域已知的。例如，可通过使用限制性同种型分型(restriction isotyping)和/或基于PCR的方法对外周血样品进行分析来获得对象的apoE基因型。通常来说，抽取用于基因型分型的血液(约6cc)并进行DNA提取进行分析。可根据可从Applied Biosystem获得的TaqMan基因表达测定，使用例如构成apoE基因型的两个SNP的Taqman即用型测定对DNA样品进行基因型分型。或者，已开发用于apoE基因型分型的迅速、半自动化的方法(Guo，et al.，(1993)Genome Res.2：348-350)。AROE-ε4的基因型分型也可根据如先前详细报道的Hixson和Vernier的限制性同种型分型方案进行(Hixson J.，Vernier D.(1990)“Restriction isotyping of human apolipoprotein E by geneamplification and cleavage with HhaI.”J.Lipid Res.31：545-548)。最近，在Huang，etal.(2018)的研究中，通过使用Wizare基因组DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)从2ml静脉外周血(储存于-80℃)中提取DNA。根据Hixson(同上)所述的方法，使用用于ApoE基因型分型的特异性引物(正向，5′-GGCACGGCTGTCCAAGGA-3′；反向，GCCCCGGCCTGGTACACTGCC-3′)，进行PCR扩增和限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)分析。出于品质控制的目的，由不同的操作员再次对20％的DNA样品进行基因型分型。对于ApoE基因型，将具有E2/E2和E2/E3基因型的对象分组为E2携带者；将具有E3/E3的对象分类为E3纯合子；以及将具有E3/E4或E4/E4的对象分组为E4携带者。(Huang，et al.，(2018)Frontiers Endocrinology 9(71))。

药盒

本公开内容提供了包含含有布美他尼的组合物的药盒(例如，受试药盒)。主题药盒可用于进行主题治疗方法。

药盒的另一些任选成分包含：缓冲剂；可检测标签；说明册(instructionleaflet)；等。药盒的多种成分可存在于单独的容器中，或者可将某些相容的成分预组合到单容器中，如果期望的话。

除上述成分之外，主题药盒可包含使用药盒的成分以实践主题方法的说明。通常将用于实践主题方法的说明记录在合适的记录介质上。例如，可将说明印刷在基底，例如纸或塑料等上。同样地，说明可作为包装插入物存在于药盒中，在药盒或其成分的容器的标签中(即，与包装或子包装缔合)等。在另一些实施方案中，说明作为电子存储数据文件存在，所述电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质，例如光盘只读存储器(compactdisc-read only memory，CD-ROM)、数字多用光盘(digital versatile disk，DVD)、软盘等上。在又一些实施方案中，药盒中不存在实际的说明，而是提供了用于从远程源(例如，通过互联网)获得说明的手段。该实施方案的一个实例是包含在该处可查看说明和/或可从其下载说明的网址的药盒。与说明一样，用于获得说明的该手段记录在合适的基底上。

提供了具有布美他尼的单位剂量，例如以经口或可注射剂量的药盒。在这样的药盒中，除包含单位剂量的容器之外，还将有描述该组合物在治疗目的病理状况中的用途和所附带益处的信息性(电子或纸质)插入物。优选的化合物和单位剂量是本文中所述的那些。

在一些特定的实施方案中，根据本公开内容的药盒包含电子或纸质形式的信息，其包含例如以0.05mg/kg/天或更少的布美他尼，例如0.02mg/kg/天或更少的布美他尼的剂量向具有apoE4/4基因型的对象施用布美他尼的说明。

在另一方面中，本公开内容提供了用于鉴定具有apoE4/4基因型的对象和用布美他尼治疗具有apoE4/4基因型的对象的药盒，以及使用说明。在一些实施方案中，药盒包含用于治疗具有apoE4/4基因型的对象的布美他尼制剂。该药盒可包含用于容纳从怀疑患有AD的人对象分离的生物样品的容器；以及任选地，特异性地检测和/或扩增apoE4等位基因并允许鉴定具有apoE4/4基因型的对象的药剂，以及针对使所述药剂与生物样品或部分生物样品发生反应以检测生物样品中apoE4等位基因的存在或量的电子或纸质说明。药盒的成分可包装在单独的容器中。药盒可还包含用于进行PCR或微阵列分析以检测一个或更多个apoE4等位基因的一种或更多种对照参考样品和试剂，如本文中所述。

在某些实施方案中，药盒包含用于检测来自生物样品的apoE4等位基因的多核苷酸的药剂。此外，药盒可包含用于检测一个或更多个另外的等位基因，例如apoE2和/或apoE3等位基因的一种或更多种药剂，所述一种或更多种药剂可单独地或以任何组合一起，和/或与临床参数组合使用以鉴定具有apoE4/4基因型的对象。

在某些实施方案中，药盒包含用于分析多个apoE等位基因或与AD有关的基因型的微阵列。在一个实施方案中，药盒包含含有与apoE多核苷酸杂交的寡核苷酸的微阵列。

在一个方面中，提供了用于鉴定具有apoE4/4基因型的对象的药盒。例如，如本文中所述，药盒可用于从来自健康对象或患有AD的对象的生物样品检测与阿尔茨海默病相关的生物标志物中的任一种或更多种，包括检测对象的apoE4/4基因型，并且特别地，允许鉴定具有apoE4/4基因型的对象。

在某些实施方案中，药盒包含用于分析多个生物标志物多核苷酸，包括允许鉴定对象的apoE基因型的一个或更多个多核苷酸的微阵列。包含在药盒中的一个示例性微阵列包含与apoE2等位基因多核苷酸杂交的寡核苷酸、与apoE3等位基因多核苷酸杂交的寡核苷酸和/或与apoE4等位基因多核苷酸杂交的寡核苷酸，或其任何组合或子组合。

药盒可包含用于包含在药盒中的组合物的一个或更多个容器。组合物可以是液体形式或可以是冻干的。用于组合物的合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料，包括玻璃或塑料制成。该药盒还可包含包装插入物，其包含使用该药盒的方法的电子或纸质书面说明。

本公开内容的一些示例性非限制性方面

上述本发明主题的一些方面，包括实施方案，可在单独的或与一个或更多个其他方面或实施方案组合的情况下是有益的。在不限制前述描述的情况下，下面提供本公开内容的某些非限制性方面。对于本领域普通技术人员而言，在阅读本公开内容之后将显然的是，可使用每个单独编号的方面或将者其与单独编号的方面之前或之后中的任一个组合。这旨在为所有这样的方面组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面的组合。对于本领域普通技术人员将显然的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可进行多种改变和修改。

1.在具有apoE4/4基因型的对象中治疗阿尔茨海默病(AD)的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的布美他尼。

2. 1所述的方法，其中所述施用包括以0.05mg/kg/天或更少的剂量向所述对象施用布美他尼。

3. 2所述的方法，其中所述施用包括以0.02mg/kg/天或更少的剂量向所述对象施用布美他尼。

4. 1至3中任一项所述的方法，其中将所述布美他尼配制为包含可药用载体的经口剂型，并且其中所述经口剂型经口施用。

5. 4所述的方法，其中所述经口剂型作为胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂每天施用一次。

6. 1至3中任一项所述的方法，其中所述布美他尼静脉内或肠胃外施用。

7. 1至3中任一项所述的方法，其中所述布美他尼以经皮贴剂提供。

8. 1至7中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

9. 8所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

10.在具有apoE4/4基因型的对象中治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：

a)将对象鉴定为具有apoE4/4基因型；以及

b)向所述对象施用治疗有效量的布美他尼。

11. 10所述的方法，其中所述鉴定包括对来自所述对象的生物样品进行基于PCR的DNA分析方法。

12. 11所述的方法，其还包括从所述对象分离所述生物样品。

13. 10至12中任一项所述的方法，其中所述施用包括以0.05mg/kg/天或更少的剂量向所述对象施用布美他尼。

14. 13所述的方法，其中所述施用包括以0.02mg/kg/天或更少的剂量向所述对象施用布美他尼。

15. 10至14中任一项所述的方法，其中将所述布美他尼配制为包含可药用载体的经口剂型，并且其中所述经口剂型经口施用。

16. 15所述的方法，其中所述经口剂型作为胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂每天施用一次。

17. 10至14中任一项所述的方法，其中所述布美他尼静脉内或肠胃外施用。

18. 10至14中任一项所述的方法，其中所述布美他尼以经皮贴剂提供。

19. 10至18中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

20. 19所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

21.药盒，其包含：

a)布美他尼制剂；

b)包装；以及

c)电子或纸质形式的信息，其包含向具有apoE4/4基因型的对象施用布美他尼的说明。

22. 21所述的药盒，其中所述说明指出向所述对象施用所述布美他尼制剂是基于对象体重以及所施用所述制剂的重量和或体积。

23. 22所述的药盒，其中所述说明包括以0.05mg/kg/天或更少的布美他尼的剂量向所述对象施用所述制剂的说明。

24. 23所述的药盒，其中所述说明包括以0.02mg/kg/天或更少的布美他尼的剂量向所述对象施用所述制剂的说明。

25. 21至24中任一项所述的药盒，其还包含用于容纳从要针对一种或更多种apoE基因型进行测试的对象分离的生物样品的容器。

26. 25所述的药盒，其还包含用于进行PCR或微阵列分析以允许特异性检测所述生物样品中apoE4等位基因的一种或更多种试剂，以及针对使所述试剂与所述生物样品发生反应的电子或纸质说明。

27. 26所述的药盒，其还包含一个或更多个对照参考样品。

28. 21至27中任一项所述的药盒，其中所述布美他尼制剂为用于经口递送的胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂的形式。

29. 21至27中任一项所述的药盒，其中所述布美他尼制剂适用于注射器以进行静脉内或肠胃外递送。

30. 21至27中任一项所述的药盒，其中所述布美他尼制剂为经皮贴剂的形式。

31.药盒，其包含：

a)包含含有可药用载体和布美他尼的一个或更多个剂量的制剂的容器；以及

b)针对治疗具有apoE4/4基因型的对象的电子或纸质说明。

32. 31所述的药盒，其中所述制剂的每个剂量不包含超过2mg的布美他尼。

33. 32所述的药盒，其中所述制剂的每个剂量不包含超过1mg的布美他尼。

34. 31至33中任一项所述的药盒，其中所述剂量被配制成用于经口施用。

35. 34所述的药盒，其中用于经口施用的所述剂量被配制为每天一次的胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂。

36. 31至33中任一项所述的药盒，其中所述制剂的剂量被配制为静脉内或肠胃外施用。

37. 31所述的药盒，其中所述制剂的剂量被配制为通过经皮贴剂施用。

38. 31至37中任一项所述的药盒，其中所述对象是哺乳动物。

39. 38所述的药盒，其中所述哺乳动物是人。

40. 31至39中任一项所述的药盒，其还包含用于进行PCR或微阵列分析以允许特异性检测来自所述对象的生物样品中apoE4等位基因的一种或更多种试剂，以及针对使所述试剂与所述生物样品发生反应的电子或纸质说明。

41. 40所述的药盒，其还包含一个或更多个对照参考样品。

42. 31至41中任一项所述的药盒，其中：

针对治疗所述对象的所述说明指出基于对象体重以及所施用所述制剂的重量或体积的剂量。

实施例

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开内容和描述，并且并不旨在限制发明人认作其发明的范围，其也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保对于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则部分是按重量计的部分，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，以及压力是在大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内(地)；i.p.，腹膜内(地)；s.c.，皮下(地)；等等。

材料和方法

以下材料和方法适用于以下提供的实施例1至3。

数据整合。检索美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)的基因表达大棚车(Gene Expression Omnibus，GEO)和国家衰老研究所(National Institute of Aging)的加速药物合作-阿尔茨海默病(Accelerating Medicines Partnership-Alzheimer’s Disease，AMP-AD)数据库的来自可获得apoE基因型信息的颞叶组织的转录组AD数据。以可用系列矩阵文件格式从NCBI GEO数据库²⁴直接下载来自Webster et al，2009¹⁷的微阵列实验，登录号GSE15222。数据已如所述^17，25进行秩不变(rank-invariant)归一化。预归一化程序在系列矩阵文件中创建了负值，其可通过在表达矩阵中加常量来消除²⁶。由于在该添加之后计算出的倍数变化(foldchange，FC)是低估的，因此所有后续FC估计相对于所述阈值都是保守的。然后将Log2变换应用于全正值表达矩阵。具有apoE3/3、apoE3/4或apoE4/4基因型的所有样品均用于进一步分析，除未报道性别的一个样品之外。从AMP-AD门户下载Syn3157255-MayoEGWAS数据集。已对数据进行背景校正，并已对其进行方差稳定化变换(Vst)、分位数归一化以及用BioConductor的lumi包进行的探针过滤，如所述的¹⁸。Vst在较高值时与log2变换相同，但在较低值时偏离(图6，图C)²⁷。图6，图(c)示出了方差稳定化变换在较低值下偏离log2变换。下载由lumi包(例如lumi)提供的样品数据。这些数据包括来自Barnes et al.，2005微阵列研究的8,000个随机选择的基因¹。相对于log2变换(基础R包)绘制Vst变换(lumi包)。Vst值在较高数字时等于log2，但在变换值为9的附近开始向上偏离。因此，从Vst变换中小于9的值计算的任何倍数变化均是对实际测量的倍数变化的低估。Vst算法导致在该偏差值下对基于log2比例计算出的Vst变换数据的FC值的低估。因此，该数据集的后续FC估计相对于所述阈值也是保守的。

通过主成分分析(PCA)分析这两个数据集以确定技术伪像(technical artifact)的归一化(图7和8)。图7示出了GSE 15222数据集的主成分分析(PCA)揭示在apoE4基因型、诊断、年龄或性别协变量之间无聚类趋势。图(a)：以可用系列矩阵文件格式从GEO直接下载GSE15222。数据已如所述²进行秩不变归一化。预归一化程序创建了负值，其通过在表达矩阵中加常量来消除³。对数据进行log2变换，并对所得数据进行主成分分析。第一主成分(PC1)与诊断协变量相关(皮尔逊r＝0.4585，P＝1.61×l0^-12)。PC2也与诊断显著相关(皮尔逊r＝-0.1581，P＝0.0207)。PC1也与apoE4状态显著相关(皮尔逊r＝0.1827，P＝0.0074)。PC2与诊断或apoE4状态不相关。图(b)：根据样品的十年年龄显示的数据。PC1与年龄协变量不相关。PC2与年龄相关(皮尔逊r＝-0.1581，P＝0.0206)(c)根据性别显示的数据。PC1和PC2与性别不相关。

图8示出了批量校正之后Syn3157255-MayoEGWAS数据集的PCA揭示在apoE4基因型、诊断、年龄或性别协变量之间无聚类趋势。图(a)：从AMP-AD门户下载Syn3157255-MayoEGWAS数据集。已对数据进行背景校正，并已对其进行方差稳定化变换(Vst)、分位数归一化以及用BioConductor的lumi包进行的探针过滤，如所述的⁴。Vst变换在较高值时与log2变换相同，但在较低值时偏离(参见图6，图c)⁵。通过PCA分析该数据集，以确定技术伪像的归一化。在第一主成分中，对应于“板”协变量的清楚的技术伪像是明显的(PC1，29.0％的解释方差(explained variance))。PC1与板协变量相关(皮尔逊r＝0.7159，P＜2.2×10^-16)，PC2也是如此(皮尔逊r＝0.2049，P＝3.9×10^-5)。图(b)：通过使用sva包的ComBat函数在板协变量上对数据集进行批量校正，并进行PCA以确保已解决技术伪像。在批量校正之后，PC1和PC2与板协变量不相关。图(c)：根据apoE基因型显示的经ComBat校正的数据的PCA。PC1与诊断相关(皮尔逊r＝-0.4126，P＜2.2×10^-16)，PC2也是如此(皮尔逊r＝0.1653，P＝0.0009)。PC1与apoE4等位基因剂量相关(皮尔逊R²＝-0.1727，P＝0.0005)，而PC2则没有。图(d)：根据性别显示的经ComBat校正的数据。PC1与性别相关(皮尔逊r＝-0.2842，P＝8.23×10^-9)，而PC2则没有。图(e)：根据样品的十年年龄显示的经ComBat校正的数据。PC2与年龄相关(皮尔逊r＝0.1224，P＝0.0147)，而PC1与年龄的相关性接近显著性(皮尔逊r＝-0.0943，P＝0.0605)。

由于这样的伪像存在于第一主成分中，因此通过使用sva包的ComBat函数²⁸，在“板”协变量中对Syn3157255-MayoEGWAS数据集进行进一步批量校正。将使用线性模式进行差异表达(DE)分析的Limma R包分别应用于每个数据集，以在不管apoE基因型的情况下估计所有对照和AD样品中基因的DE；对于具有多于一个探针的基因，将AD与对照样品之间差异的最显著P值下的探针用于两个数据集的随后的整合和荟萃分析²⁹。将这两个数据集分为apoE基因型特异性组(apoE3/3、apoE3/4和apoE4/4)；使用ComBat算法(sva包)在每个组的两个数据集中对这两个微阵列平台共享的基因(16477个基因)进行批量校正(图9)。

图9示出了通过探针选择和批量校正的数据整合产生了用于荟萃分析的归一化数据集。图(a)：从AMP-AD门户下载Syn3157255-MayoEGWAS数据集。已对数据进行背景校正，并已对其进行方差稳定化变换(Vst)、分位数归一化以及用BioConductor的lumi包进行的探针过滤，如所述的⁴，然后在“板”协变量中进行批量校正(参见图8)。下载GSE15222，并将常量应用于数据集以消除负值；然后将数据进行log2变换。将Limma包分别应用于两个数据集，以在不管基因型的情况下估计所有对照与AD样品之间的差异表达(DE)；对于具有多于一个探针的基因，将AD与对照样品之间差异的最显著P值下的探针用于后续整合⁶。然后使用这两个数据集中共享的基因将数据组合(n＝16477s)。在vst(MayoEGWAS)或log2变换(GSE15222)之后的基因表达值显示出数据集之间表达水平的明显差异。图(b)示出了ComBat校正之后通过研究得到的整合数据的表达值，其表明整合数据集之间的一致性，其用于所有进一步的DE分析。

差异表达和途径分析。平均年龄在apoE基因型组中没有差异，除在apoE3/4 AD组中之外，其在Syn3157255-MayoEGWAS研究中更高(+3.24岁，ANOVA及Tukey HSD事后检验，P＝0.0153)。为了保持功效，未从Syn3157255-MayoEGWAS中的apoE3/4组中去除样品。为确保年龄不影响DE结果，计算来自apoE3/4对照和AD数据集二者的每个DE基因的Syn3157255-MayoEGWAS数据集中的表达水平与年龄协变量的皮尔逊相关性。没有基因显著地相关(FDR＜0.05)。为了消除与非性别匹配组有关的任何虚假结果，对每个apoE基因型特异性组进行随机降采样，以在诊断中匹配每个基因型中的男与女比率(图5)。图5示出了人转录组数据集的协变量测量。对于单独和组合的每个研究，报道以下协变量：apoE状态、诊断、每组的平均年龄、组内年龄的SD、每种基因型内对照与AD样品之间年龄差异的显著性(基因型内显著性)、组大小(n)、男性数目、女性数目、降采样的性别匹配组中的男性或女性的数目、组内男性与女性比率(男性/女性比率)以及降采样之后组内男性与女性比率(降采样的男性/女性比率)。在MayoEGWAS研究中，ApoE3/4 AD样品比apoE3/4对照样品显著更老(老3.24岁)。如在线方法部分中所述，该差异已在计算流程(pipeline)中得到解决。

为了解释可能的随机性效应，将该过程应用10次。将基于非参数秩的算法RankProd(版本2.42.0)应用于具有双源设计(two origin design)的10个排列中的每一个。双源设计RankProd算法分别计算每个数据集中每个对照和AD样品的成对FC比率，对每个成对比较中每个基因的比率进行排序，并通过从这两个数据集获取所有成对秩比率的积来计算每个基因的秩积(rank product)。P值由1000个排列确定¹⁹。经调整的P值用R中的p.adjust基函数分别确定。ComBat函数改变每个样品的平均值和SD。因此，为避免RankProd包在报道的FC估计中的另一些伪像，在批量校正之前，针对每个数据集分别计算所有后续截止值中使用的FC，并使用算术平均值。由于GSE15222矩阵的归一化变换和Syn3157255-MayoEGWAS的Vst变换，一些FC值被低估，并被称为“估计FC”。在每种基因型的10个性别匹配排列中的每个排列中，对估计FC值和P值求平均，并使用p.adjust包计算FDR值。对具有大于1.3×的估计的平均绝对FC和＜0.05的FDR截止值的DE基因进一步进行分析。用IngenuityPathway Analysis(IPA)软件分析药物特征的DE基因。使用来自包含直接和间接的基因关系的Ingenuity Knowledge Base的参考集进行本体分析(Ontology analysis)；富集P值从IPA软件直接获取。

药物再定位分析。使用可公开获得的CMap数据库(1300种化合物)，将由Sirota等和Dudley等^11，12开发的并从Chen等⁶获取的计算药物再定位算法应用于每个apoE基因型特异性基因特征。尽管LINCS是更加综合性的数据库，但AD中很小比例的DE基因与所测量的1000个基因重叠，并因此其在本研究中未使用。对该算法进行改进，以使用完整的apoE基因型特异性DE特征，而不是前150个上调和下调的基因。经FDR调整的P值用基础R包中的p.adjust函数计算。通过CMap评分对限定为同一药物、浓度、细胞系和处理的技术重复求平均。在对apoE基因型特异性组之间重叠药物预测的分析中，当药物具有多于一个技术重复时，报道来自最显著重复的P值以具有最具包容性的药物集合。针对每种化合物报道具有最低CMap评分的细胞系，以进一步富集信号。提取PC3细胞中布美他尼的原始CMap数据以进行进一步分析。来自Chen等¹⁶详细描述的流程的CMap数据由布美他尼处理之后的FC秩组成。为了显示布美他尼如何“翻转(flip)”AD的apoE4/4特异性转录组特征，通过蒙特卡罗模拟(Monte Carlo simulation)分析图2中的CMap数据，以计算平均FC秩移动的显著性。将由布美他尼引起的下调限定为上调的apoE4/4人基因特征向比所有基因的平均秩更低的秩的移动。将由布美他尼引起的上调限定为apoE4/4特异性AD特征中下调的基因的平均FC秩向比所有基因的平均秩更高的秩的移动。

小鼠。所有方案和程序均遵循加利福尼亚大学旧金山分校(University ofCalifornia，San Francisco，UCSF)的实验动物资源中心的指南。所有的小鼠从出生到死亡均在相同条件下圈养(12小时光/暗周期，5只/笼圈养，PicoLab Rodent Diet 20)。所有小鼠品系均维持在C57B1/6J背景上。ApoE3-KI和apoE4-KI纯合小鼠品系(Taconic)^30，31在正常条件下在格莱斯顿研究所(Gladstone Institutes)/UCSF动物设施出生并衰老。使用雌性apoE-KI小鼠，因为其易患与AD有关的神经元和行为缺陷。小鼠的年龄在在线方法的行为测试部分中指示。

布美他尼处理。布美他尼在0.9％无菌盐水中的2％DMSO中以220μM制备，针对溶解度用NaOH调节至pH 8.5，并从行为评估之前6周开始每天通过i.p.注射给予，并在整个行为评估中持续。布美他尼处理期间每周测量体重；计算注射体积以达到0.02(低)或0.2(高)mg布美他尼/kg体重的剂量(例如，对于20g小鼠每天注射50μl)。用0.9％无菌盐水中的2％DMSO(pH 8.5)的匹配体积注射对照小鼠。注射剂被良好的耐受，并且对健康无不良作用。

行为测试。在测试之前将小鼠单独圈养。每只小鼠均分配随机数，因此研究者对基因型和处理信息不知情。在约14个月龄时，将apoE3-KI和apoE4-KI小鼠随机分配为处理组：apoE3-KI载剂(n＝10，年龄14.01±0.44个月)、apoE3-KI低布美他尼(n＝11，年龄14.30±0.33个月)、apoE3-KI高布美他尼(n＝10，年龄13.74±0.22个月)、apoE4-KI载剂(n＝10，年龄14.10±0.35)、apoE4-KI低布美他尼(n＝10，年龄14.70±0.27个月)、apoE4-KI高布美他尼(n＝9，年龄13.77±0.28个月)。从14天的测试之前6周开始通过i.p.注射每天施用处理，并在莫里斯水迷宫(Morris water maze，MWM)中的整个14天测试中持续；在光周期结束时和当天的测试之后给予注射。

MWM池(直径，122cm)包含不透明的水(22至23℃)，其平台直径为10cm。在隐藏平台阶段期间，将平台浸没1.5cm^20-23，32，并在提示训练阶段期间，将其用黑白条纹的桅杆(15cm高)进行标记。在每天两次的阶段中(间隔3.5小时)对小鼠进行训练，以定位隐藏平台(第1至第5隐藏天)和提示平台(第1至第3可见天)，每次均由两个60秒试验(隐藏和提示训练)与15分钟的试验间间隔组成。在整个测试中，行为测试室壁上的远侧视觉提示保持不变。在训练和记忆探索之后进行可见试验，并且在提示的可见平台下进行60秒长的时间。平台位置在隐藏平台阶段中保持不变，但是对于每个提示(可见)平台阶段均改变。进入点在试验之间半随机地改变。在最近隐藏平台培训之后的24、72和120小时时，进行60秒的探索试验(已去除平台)。探索试验的进入点在西南象限，目标象限在东北象限。用EthoVision视频跟踪系统(Noldus Information Technology)监测表现。对于探索试验，进行以下分析(1)在目标象限中花费的百分比时间与在其他三个象限中花费的平均时间，(2)在目标平台位置上的跨越数目与在其他三个象限中的等同位置上的平均跨越数目，以及(3)在前10秒内到平台的距离。

海马组织的RNA-Seq分析。使12个月龄的apoE3-KI和apoE4-KI小鼠每天i.p.接受载剂或布美他尼(0.2mg/kg体重)的注射，持续60天。用0.9％盐水灌注小鼠，并将海马切开以及在Trizol试剂中均化。用Qiagen RNeasy Micro试剂盒提取并纯化总RNA，其中包括DNA酶处理。用NuGEN RNA-Seq V2试剂盒从全长RNA(每个样品50ng)产生cDNA，所述试剂盒使用单引物等温扩增方法以使核糖体RNA耗竭，并用Covaris剪切以产生均一尺寸的片段。NuGenUltralow系统V2用于添加衔接子以及用于条码化(barcoding)和扩增。用Agencourt XP磁珠对所得RNA文库进行纯化，并在用Agilent Bioanalyzer进行品质控制之后通过qPCR进行定量。将文库合并，并用HiSeq 4000仪器(Illumina)针对单端(SE50)测序进行测序。将序列数据用STAR短读出比对仪进行比对³³，并用来自Subread包的feautureCounts函数获得每个特征的计数³⁴。在比对之后，将在GSE15222和Syn3157255-MayoEGWAS数据库中未共享的转录物丢弃，以及在两个或更多个样品中每百万低于一个计数的基因³⁵。

使用DESeq流程评估剩余的11，877个转录物的DE。低于0.05的P值的基因被认为是DE，用于未来的途径分析。在用DESeq进行计数归一化之后，对数据进行rld变换(vsn包)，并用pheatmap包对DE基因进行聚类。将PCA应用于经rld变换的DE基因。用Ingenuity PathwayAnalysis软件分析药物的DE特征。使用来自包含直接和间接的基因关系的IngenuityKnowledge Base的参考集进行本体分析。为了分析AD的apoE基因型特异性特征基因的秩变化，对来自11，877个转录物的原始计数数据进行秩变换，并且对于每个基因，从经布美他尼处理的样品中的平均秩减去经载剂处理的样品的平均秩。通过蒙特卡罗模拟计算偏离所有基因的秩变化的总体平均值(零)的上调和下调的apoE4-KI人基因特征的秩变化的显著性。

统计学分析。将行为度量表示为平均值±SEM。n的所有值都是小鼠或生物复制品的数目。数据的分布用Shapiro-Wilk正态性检验进行评估；大多数数据是正态分布的。组间的差异性通过未配对或配对的双侧t检验确定。对于多次比较，使用单向ANOVA和图基事后检验(Tukey’s post-test)。P＜0.05被认为是显著的。在实验期间，研究者对基因型和处理信息不知情。

遵守存关的道德规范和动物使用指南。所有实验和动物方案及程序均根据大学和机构的道德规范以及动物使用指南进行。

生命科学报道概述。关于实验设计的另一些信息可见于life SciencesReporting Summary。

以下材料和方法适用于以下提供的实施例4至6。

脑切片电生理记录和数据分析。对于长时程增强(long-term potentiation，LTP)记录研究，将apoE4-KI小鼠随机分配为载剂(n＝6，年龄15.2±0.56个月)和布美他尼(n＝3，年龄15.1±0.06)处理组。将ApoE3-KI小鼠类似地分配为载剂(n＝6，年龄15.5±0.11)和布美他尼(n＝3，年龄15.57±0.19)处理组。对于输入/输出(input/output)记录研究，将apoE4-KI小鼠随机分配为载剂(n＝3，年龄15.1±0.06个月)和布美他尼(n＝3，年龄15.1±0.06)处理组。将ApoE3-KI小鼠类似地分配为载剂(n＝7，年龄15.3±0.06)和布美他尼(n＝3，年龄15.57±0.29)处理组。将所有小鼠给药6至8周，并在组之间随机分配切片记录天和给药时间，以在进行实验的同时允许相等的给药时间。最后布美他尼注射在处死之前一小时进行。在记录时，所有小鼠均为16至17个月龄。

将动物用异氟烷麻醉并斩首。从颅中迅速取出脑，并将其置于冰冷(2至5℃)切片溶液中。切片溶液包含(以mM计)：110氯化胆碱、2.5KCl、26NaHCO₃、10MgCl₂、1.25NaH₂PO₄、0.5CaCl₂、10葡萄糖、3丙酮酸Na、1L抗坏血酸，pH 7.4。

使用振动切片机(VT1200，Leica，USA)从两个半球切下300μm厚的矢状切片，并将其转移至包含人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)的95％O₂-CO₂蒸汽界面保持室(BSK5，Scientific Systems Design Inc.Canada)，在其中使其在34℃下恢复一小时，并然后保持在室温(20至22℃)下。ACSF包含(以mM计)：126NaCl、2.5KCl、1.5CaCl₂、1.5MgCl₂、26NaHCO₃、1.25NaH2PO₄、10葡萄糖和1.5L抗坏血酸，pH 7.4。对于记录，将切片转移至浸没室(RC-27LD，Warner Instruments，USA)中，在其中以10mL/分钟的流量在32℃下用氧合的ACSF在两侧对其连续灌注。

通过与恒定电压隔离刺激器(DS2A-MKII，Digitimer North America)连接并置于CA2辐射层中的同心双极刺激电极(FHC，Inc.，USA)通过对Schaffer侧支的顺向刺激来激发场突触后电位(field post-synaptic potential，fPSP)。用填充有ACSF并置于CA1辐射层中的玻璃硼硅酸盐微电极记录fPSP。通过带有pClamp10软件的MultiClamp 700B放大器和Digidata 1550B1采集系统(Molecular Devices，USA)对信号进行采样和数字化，并使用运行自定义宏的IgorPro6软件(Wavemetrics Inc.，USA)进行分析。将fPSP斜率分析为fPSP峰的10％至90％的线性拟合斜率值。输入-输出关系记录为响应于提高的刺激强度(0.5至1.4mV)的fPSP斜率值。对于长时程增强(LTP)记录，将刺激强度调整为50％的饱和度，并以0.1Hz递送。在10分钟的控制记录之后，使用0.2Hz下的5个100Hz脉冲群(burst)(每个4个脉冲)的两个连续的(5秒)θ-频率脉冲群(HFB)列激发LTP。将LTP结局确定为诱导之后50分钟相对于对照10分钟的10分钟时期的平均fPSP增益。

单一细胞核RNA-Seq文库的制备和测序。使12个月龄的apoE3-KI和apoE4-KI小鼠每天接受载剂或布美他尼(0.2mg/kg体重)的i.p.注射，持续60天。基于10×基因组样品制备表明的方案和用于单一细胞RNA测序的核的分离，对单一细胞核RNA-seq方案进行修改。将小鼠海马于冰上快速切开。将切开的海马置于5mL管中的2mL Hibernate

/

/GlutaMAX^TM(HEB)培养基中。将HEB培养基移至15ml锥形瓶，并将其保持在冰上。向组织添加2mL的经冷冻的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM NaCl、3mM MgCl2以及无核酸酶水中的0.1％Nonidet^TM P40替代品)，并通过21 G针吸移10次对海马进行均化。在均化之后，将组织在冰上裂解15分钟，在该孵育时期中涡旋2至3次。然后将保留的经冷冻的HEB培养基放回至裂解的组织溶液，然后将组织通过1mL移液管进一步磨碎5至7遍。将30μm细胞粗滤器(MACSSmartStrainer；Miltenyi Biotech 130-110-915)用1mL的PBS洗涤，并且将经裂解的组织溶液通过粗滤器过滤，以去除碎片和块。将经过滤的核在4℃下于500rcf下离心5分钟。去除上清液，并将核重悬于1mL的核洗涤和重悬缓冲液(含1.0％BSA和0.2U/μl RNA酶抑制剂的1×PBS)中，然后将其在4℃下于500rcf下第二次离心5分钟，然后将其重悬于400ul的核洗涤和重悬缓冲液中。在格莱斯顿研究所流式细胞术中心(Gladstone institutes’FlowCytometry Core)，添加DAPI至终浓度为0.1ug/mL，并通过35μm细胞粗滤器过滤核溶液，然后将其加载到BD FACSAria-II上。通过在DAPI阳性事件上设门(不包括碎片和双峰)来选择DAPI阳性核。

单一细胞核RNA-Seq比对、聚类和细胞类型鉴定。迹过10×Genomics Cellranger(v.2.2.0)mkref函数创建小鼠参考(mm10-3.0.0，系综97)前mRNA基因组。将来自每个样品的读出与该基因组比对，并在无修饰的情况下使用10×Cellranger流程进行汇总。将原始数据加载到R包Seurate(v.2.3.4)中。保留在至少3个核中检出表达的基因，以及具有至少200个检出基因且最多2400个基因的核用于分析，以保留具有小于0.0025的线粒体百分比的核总数，以用于对共计27,415个细胞进行进一步分析。通过FindVariableGenes函数使用以下参数计算高度可变的基因：对于共计2578个高度可变的基因x.低.截止值＝0.0123，x.高.截止值＝3，y.截止值＝0.5。通过ScaleData函数对核中高度可变的基因的表达水平进行定标和居中，并随后将其输入到RunPCA函数中。将PCAElbow Plot用于绘制每个主成分的累积标准差，通过JackStraw和JackStrawPlot函数评估每个基因与每个主成分的关联的显著性。基于这两个图的结局，我们选择前15PC来输入到FindCluster函数，所述函数使用以下0.6分辨率运行。该方法鉴定了18个独特的簇。然后，我们使用默认设置应用FindMarkers函数以鉴定标志物基因，来鉴定存在于每个簇中的细胞类型。为了更好地可视化不同细胞类型之间的标志物基因表达，将RMagic(基于马尔可夫亲和力的图归因(Markov Affinity-Based Graph Imputation))包的magic函数应用于Suerat客体，以应用数据扩散以在相似细胞之间共享信息，从而在我们的计数矩阵中去噪(de-noice)并填充漏失事件(drop-outevent)。Seurat VlnPlot函数用于可视化标志物基因表达。

单一细胞核RNA-Seq差异表达和途径分析。使用威尔科克森秩和检验(Wilcoxonrank sum test)，通过FindMarkers函数计算每个细胞类型中经布美他尼与经对照处理的细胞之间所有基因的差异表达log倍数变化。为了显示布美他尼如何“翻转”AD的apoE4/4特异性转录组特征，对存在于每个细胞簇中的也与在Cmap数据库中测量的基因重叠的所有基因的log倍数变化进行秩变换，并随后通过蒙特卡罗模拟进行分析来计算平均FC秩移动的显著性。将由布美他尼引起的下调限定为上调apoE4/4人基因特征向比所有基因的平均秩更低的秩的移动。将由布美他尼引起的上调限定为apoE4/4特异性AD特征中下调基因的平均FC秩向比所有基因的平均秩更高的秩的移动。使用limma包的kegga函数从每个簇的所有DE基因(p＜0.05)计算差异表达的途径。将具有富集p＜0.005的途径用于进一步分析。

人apoE4/4-iPSC的神经元分化。人iPS系由具有apoE4/4基因型的对象的皮肤成纤维细胞产生，并在无饲养层(feeder-free)的条件下维持在mTeSR1培养基(STEMCELLTechnologies)中。常规地通过用Accutase(Millipore)进行短暂处理并刮拭将人apoE4/4-iPSC以1∶2至1∶4传代。人iPSC方案通过加利福尼亚大学的人研究的委员会批准。如报道的并加以改进，使apoE4/4-iPSC分化为神经元。将iPSC用胶原酶IV(Stem CellTechnologies)处理，并在无bFGF的hES培养基中悬浮培养为胚状体。每天更换培养基，持续5天。在第5天，将胚状体在包含以下的神经诱导培养基(Neural Induction Medium)中培养：补充有TGF-β受体的抑制剂(SB431542，Stemgent；5μM)和骨形态发生蛋白受体抑制剂(LDN-193189，Stemgent；0.25μM)的Dulbecco改良的Eagle培养基/F12和神经基础培养基(1∶1，Thermo Fisher)，1％N2补充剂(Life Technologies)，1％B27补充剂(LifeTechnologies)，非必需氨基酸，以及0.5％青霉素/链霉素(Life Technologies)。在第7天，将球体转移至包被有Matrigel(BD Biosciences)的孔，并在神经祖细胞培养基(NeuralProgenitor Medium)中培养，所述培养基由无SB和LDN的神经诱导培养基组成，但其包含10ng/ml bFGF(PeproTech)、10ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)(PeproTech)和2μg/ml肝素(Sigma)。每隔一天饲喂贴壁的神经上皮细胞，持续7天。将在约第15天出现的神经莲座状结构(neural rosette structure)从板剥离，并在神经祖细胞培养基中的悬浮液中培养以形成神经球。对于神经元分化，将神经球用Accutase解离，并平板接种在包被有100μg/ml聚-l-鸟氨酸(Sigma)和10μg/ml层黏连蛋白(Sigma)的培养板上。将神经元培养物维持在神经分化培养基(Neural Differentiation Medium)中，所述培养基由神经祖细胞培养基、脑来源神经营养因子(10ng/ml；PeproTech)和胶质细胞来源生长因子(10ng/ml；PeproTech)组成，不含bFGF、EGF或肝素。在数天之后观察到神经元，并使其进一步分化，持续30天或更长时间。大多数实验在分化超过8周的神经元培养物上进行。

这种培养条件产生这样的神经元细胞，其具有75±4％vGLUT⁺总谷氨酸能兴奋性神经元、15±3％GABA⁺GABA能抑制性神经元和5±2％TH⁺多巴胺能神经元。

人ApoE4/4-iPS来源神经元的RNA-Seq分析。使用Qiagen RNeasy Micro试剂盒从apoE4/4-iPSC来源的人神经元中提取并纯化总RNA，其包括DNA酶处理。使用NuGEN RNA-SeqV2试剂盒从全长RNA(每个样品50ng)产生cDNA，所述试剂盒使用单引物等温扩增方法以使核糖体RNA耗竭，并通过Covaris剪切以产生均一尺寸的片段。将NuGen Ultralow系统V2用于添加衔接子以及用于条码化和扩增。将所得RNA文库用Agencourt XP磁珠纯化，并在使用Agilent Bioanalyzer进行品质控制之后通过qPCR进行定量。将文库合并，并针对单端(SE50)测序用HiSeq4000仪器(Illumina)进行测序。将序列数据用STAR短读出比对仪进行比对，并用来自Subread包的feautureCounts函数获得每个特征的计数。

将DESeq流程用于评估所得49,697个特征的差异表达。低于p＜0.05的基因被认为是DE，用于未来的途径分析。在用DESeq进行计数归一化之后，对数据进行rld变换(vsn包)，并将PCA应用于经rld变换的DE基因。将limma包的kegga函数用于所有DE基因(p＜0.05)，以表明富集的本体途径。将富集的途径(p＜0.05)用于进一步分析。

为了显示布美他尼如何“翻转”AD的apoE4/4特异性转录组特征，从每个转录物的ENSEMBL ID生成基因符号，并对对应于多于一个ENSEMBL ID的基因进行平均倍数变化。对也与Cmap数据库中测量的基因重叠的基因的FC进行秩变换，并随后通过蒙特卡罗模拟进行分析，以计算平均FC秩移动的显著性。将由布美他尼引起的下调限定为上调apoE4/4人基因特征向比所有基因的平均秩更低的秩的移动。将由布美他尼引起的上调限定为apoE4/4特异性AD特征中下调基因的平均FC秩向比所有基因的平均秩更高的秩的移动。

实施例1

布美他尼的经计算机筛选和鉴定

描述了研究方案并在此处示出结果。

本文中描述了筛选用于治疗AD和/或与apoE4/4-基因型有关的疾病和病症之药物的apoE基因型特异性药物再定位方法。

通过对从公共数据库获得的610个人颞叶样品的基因表达荟萃分析，建立AD的apoE基因型特异性转录组特征，并将其用于查询包含1300个现有药物的转录组扰动特征的经验证的连接性映射(CMap)数据库来鉴定能够扰动整个基因表达网络远离apoE基因型驱动的疾病状态而趋向正常状态的药物。

首先分析了来自可公开获得的数据库的AD的ApoE基因型特异性转录组特征，并完成使用AD的ApoE基因型特异性特征进行的第一CMap数据库检索。

为了建立AD的apoE基因型特异性转录组特征，对具有apoE基因型信息的两个最大的公共人颞叶转录组数据集GSE15222(n＝213)和Syn3157255-MayoEGWAS(n＝397)进行分析。使用非参数算法RankProd，通过apoE基因型对数据集进行分层以进行荟萃分析。对平均错误发现率(false-discovery rate，FDR)调整的P值＜0.05和平均绝对估计倍数变化(FC)＞1.3×的基因进行进一步分析。与apoE基因型匹配的对照的比较显示在具有apoE4/4、apoE3/4和apoE3/3基因型的AD对象中分别存在314、150和696个基因的上调或下调。引人注目地，在所有3个AD组中，共享仅仅31个DE基因(占所有DE基因的2.7％)，突显了AD发病机制中每种apoE基因型的独特病理学。将针对CMap数据库的AD的apoE基因型特异性转录组特征应用于产生治疗预测。FDA批准的环-利尿剂布美他尼对apoE4/4 AD具有最佳的预测评分，而对apoE3/4和apoE3/3 AD具有较弱的CMap评分。在CMap数据库中经布美他尼处理的细胞中，在apoE4/4 AD中上调的基因向下移动(较高的秩数，通过蒙特卡罗模拟，P＝0.003)，而apoE4/4 AD中下调的基因向上移动(较低的秩数，通过蒙特卡罗模拟，P＝0.002)，证实了布美他尼的转录组扰动特征与apoE4/4 AD的转录组扰动特征负相关。

本文中所述的用于AD的药物再定位方法建立在这样的经充分验证的假设上：扰动或“翻转”疾病状态中的差异表达(DE)基因回到对照水平的药物可能对该疾病有效^9-15。在该流程中，第一步是建立AD的apoE基因型特异性转录组特征。第二步是应用经验证的计算药物再定位算法^{9，11，12，16}来查询CMap数据库，所述数据库包含1300种药物的转录组扰动特征⁸。每种化合物均得到apoE基因型特异性AD中治疗潜能的预测评分^11，12，16；负评分表明化合物可逆转所述疾病的转录组特征。因为将AD的转录组特征与由每种化合物扰动的转录组特征进行比较，因此预测策略由疾病的DE基因特征驱动，而不是由靶向隔离途径的假设驱动的方法驱动。最后，如实施例2和3中所讨论的，在apoE4驱动的AD的小鼠模型中测试最佳预测的药物，以验证效力并探索作用机制。

图1示出了AD的apoE基因型特异性转录组特征。图(a)示出了实验工作流程，其包括数据集选择和整合、apoE基因型分层、基因的DE分析、药物再定位分析以及行为和转录组验证。图(b)示出了AD和对照数据集GSE15222(n＝213)和Syn3157255-MayoEGWAS(n＝397)的apoE基因型组成。在AD组中，ApoE4等位基因表示(apoE3/4和apoE4/4)更多(AD与对照群体中，apoE4携带者与非携带者的x²检验，P＜0.001)。图(c，d)示出了来自apoE基因型特异性、基于秩的荟萃分析的重叠和独特的上调(c)和下调(d)DE基因(估计的绝对FC＞1.3×，FDR＜0.5)的维恩图(Venn diagram)。153个基因在apoE4/4 AD中独特地显著上调，15个在apoE3/4 AD中，以及319个在apoE3/3 AD中独特地显著上调。在这些组中共享仅18个DE基因。69个基因在apoE4/4 AD中独特地显著下调，8个在apoE3/4 AD中，以及193个在apoE3/3AD中独特地显著下调。在所有三组中共享13个DE基因。图(e)示出了apoE基因型特异性组中共享的和独特的显著富集的本体途径的维恩图。19条途径在apoE4/4 AD中独特地显著富集，10条在apoE3/4 AD中，以及28条在apoE3/3 AD中独特地显著富集。在所有三组中共享3条途径。

为了建立AD的apoE基因型特异性转录组特征，使用apoE基因型信息分析两个最大的公共人颞叶转录组数据集GSE15222(n＝213)¹⁷和Syn3157255-MayoEGWAS(n＝397)¹⁸(图1，图a；图5)。如在大多数临床研究中那样⁶，每个数据集中的AD组比对照具有成比例更多的apoE3/4和apoE4/4携带者(图1，图b)。使用非参数算法RankProd¹⁹，通过apoE基因型对数据集进行分层，以进行荟萃分析(图1，图a)。对平均错误发现率(FDR)调整的P值＜0.05和平均绝对估计倍数变化(FC)＞1.3×的基因进行进一步分析。与apoE基因型匹配的对照的比较显示在具有apoE4/4、apoE3/4和apoE3/3基因型的AD对象中分别存在314、150和696个基因的上调或下调(图1，图c和d)。引人注目地，在所有3个AD组中，共享仅仅31个DE基因(占所有DE基因的2.7％)(图1，图c和d)，突显了AD发病机制中每种apoE基因型的独特病理学。

本体分析确定了AD的apoE4/4特异性特征、apoE3/4特异性特征和apoE3/3特异性特征中的28、24和48个扰动的途径(图1，图e)。在所有3个AD组中共享3条(占所有扰动途径的3％)(图1，图e)，进一步突显了每种apoE基因型对AD分子环境的独特作用。

接下来，将AD的apoE基因型特异性转录组特征应用于CMap数据库以产生治疗预测¹⁶。图2示出了确定布美他尼为apoE4/4 AD的最佳预测药物候选物的apoE基因型特异性药物再定位分析。图2的图(a至c)示出了针对AD的(a)apoE4/4特异性、(b)apoE3/4特异性和(c)apoE3/3特异性的转录组特征的通过CMap评分排序的CMap化合物的图。尽管CMap评分对所有三种基因型均为负，但与布美他尼相关的CMap评分的经调整p值(Q)对于apoE4/4(作为最佳预测药物)和apoE3/3 AD是显著的，但对于apoE3/4 AD不显著。图(d)示出了通过apoE4/4 AD中的估计FC进行的秩排序和颜色编码(左)的，并随后通过CMap秩进行的再颜色编码(右)的来自AD的apoE4/4特异性转录组特征的基因热图。布美他尼使AD的apoE4/4特异性转录组特征中的上调和下调基因二者的表达秩翻转。图(e)示出了来自CMap数据的FC秩与apoE4/4 AD中DE基因的估计FC，如通过基于秩的荟萃分析确定的(参见图1)。水平虚线指示估计的FC截止值为1.3(CMap数据中共享了AD的apoE4/4特征中的151个上调基因和71个下调基因)。CMap数据中布美他尼处理之后所有基因的平均FC秩为11,066.54(垂直灰色虚线)。apoE4/4 AD中的151个上调基因的平均FC秩为12,393.62(垂直红色虚线)，表明响应于布美他尼的较低秩和较低表达。apoE4/4 AD中的71个下调基因的平均FC秩为8,815.22(垂直红线)，表明响应于布美他尼的较高秩和较高表达。右y轴表示散点图值的直方图中的基因数目。图(f，g)示出了从来自针对apoE4/4 AD中上调基因(n＝151)(f)和下调基因(n＝71)(g)的CMap的布美他尼处理数据中随机采集的尺寸匹配基因集的1000个排列的FC秩的直方图。布美他尼处理之后人apoE4/4特异性上调基因的FC秩(12,393.62，垂直红色虚线)是显著更高的(蒙特卡罗模拟，P＝0.003)，而布美他尼之后的下调基因的FC秩(8,815.22，垂直红色虚线)显著低于(蒙特卡罗模拟，P＝0.002)由蒙特卡罗模拟计算的1000个排列的平均值，分别指示了向更低表达和更高表达的移动。

FDA批准的环-利尿剂布美他尼对apoE4/4 AD具有最佳的预测评分(图2，图a)，而对apoE3/4和apoE3/3 AD具有弱得多的CMap评分(图2，图b和c)。在CMap数据库中经布美他尼处理的细胞中，apoE4/4 AD中上调的基因向下移动(较高的秩数，通过蒙特卡罗模拟，P＝0.003)，而apoE4/4 AD中下调的基因向上移动(较低的秩数，通过蒙特卡罗模拟，P＝0.002)(图2，图d至g)，证实了布美他尼的转录组扰动特征与apoE4/4AD的转录组扰动特征负相关。

还可观察到人E3/4转录组特征与人E4/4 AD特征非常不同(图1)，而布美他尼对E3/4的药物预测评分甚至比E3/3 AD更严格(图2)。

实施例2

针对布美他尼对记忆的作用的体内动物模型测试

描述了研究方案并在此处示出结果。

如下所示，在体内在ApoE3/3和ApoE4/4敲入(KI)小鼠中测试布美他尼的作用。总体而言，观察到认知功能在用布美他尼处理的具有apoE4/4基因型的小鼠中改善。

确定布美他尼对衰老的apoE4-KI和apoE3-KI小鼠的空间学习和记忆表现的作用。使用莫里斯水迷宫(MWM)以在隐藏平台学习试验中测试5天中的空间学习和记忆，随后在最后隐藏试验之后24小时时进行短期记忆的探索试验，以及在72和120小时时进行长期记忆的探索试验。在隐藏试验期间，学习曲线和游泳速度在基因型或处理组中没有差异。然而，经载剂处理的apoE4-KI小鼠的短期空间记忆受损，这未见于经载剂处理的apoE3-KI小鼠中。引人注目地，在24小时的探索试验中，布美他尼挽救了apoE4-KI小鼠的记忆缺陷，其表现得与apoE3-KI小鼠一样好。经布美他尼和经载剂处理的apoE3-KI小鼠表现得同样好，表明布美他尼不会对记忆形成产生不良影响。在120小时的探索试验中，经布美他尼处理的apoE4-KI小鼠仍然对目标象限有显著的偏好，表明具有强的长期记忆。令人感兴趣地，在120小时的探索试验中，经布美他尼处理的apoE3-KI小鼠记得隐藏的平台位置，而经载剂处理的apoE3-KI小鼠却没有，表明布美他尼对衰老apoE3-KI小鼠的长期记忆的有益作用。在对空间记忆的更严格测试中，对每次探索试验期间，目标平台位置与其他象限中类似区域的精确跨越(precise crossing)进行计数，以评估记忆表现的特异性和准确性。引人注目地，在24小时和120小时的探索试验二者中，经布美他尼处理的apoE4-KI小鼠而非apoE3-KI小鼠在目标象限中具有显著更多的平台跨越。因此，布美他尼在apoE4-KI小鼠中恢复了短期和长期记忆表现二者的准确性。通过评估探索试验中前10秒内朝平台位置行进的距离，证实了这些发现。因此，布美他尼在衰老apoE4-KI小鼠中恢复短期和长期记忆以及记忆准确性，并增强衰老apoE3-KI小鼠的长期记忆，但未增强记忆准确性。

图3示出了布美他尼处理特别地在衰老apoE4-KI小鼠中挽救空间记忆缺陷。图(a)示出了MWM测试的示意图。将小鼠置于进入点处的迷宫中，并使用远侧空间提示以找到隐藏平台。图(b)示出了在1至5天的学习天数中，经布美他尼处理的(以0.02mg/kg的低剂量和以0.2mg/kg的高剂量每天腹膜内注射持续8周)，和经载剂处理的apoE3-KI小鼠(分别地，n＝11、10和10)以及apoE4-KI小鼠(分别地，n＝10、9和10)的逃避潜伏期在组之间没有差异。图(c)示出了在24小时的探索试验中，低剂量和高剂量的布美他尼处理均使apoE4-KI小鼠在目标象限(每种处理条件的左侧条)中花费的百分比时间相比于在其他象限(每种处理条件的右侧条)中的平均百分比时间提高至经载剂处理的apoE3-KI小鼠的水平。与经载剂处理的apoE3-KI小鼠相比，高剂量的布美他尼处理损害apoE3-KI小鼠的记忆。图(d)示出了，在120小时的探索试验中，与对照相比，经高布美他尼处理的apoE4-KI小鼠在目标象限(每种处理条件的左侧条)中花费更多时间。图(e，f)示出了，在24小时(e)和120小时(f)的探索试验中，高剂量的布美他尼处理在apoE4-KI小鼠中显著提高了目标象限(每种处理条件的左侧条)相比于其他象限(每种处理条件的右侧条)中的平台跨越。值是平均值±SEM。c至f中组内差异通过配对的双侧t检验确定，p值如图的图中所示。在c至f中，lo-Bum指示低剂量的布美他尼处理组，而hi-Bum指示高剂量的布美他尼处理组。

图6，图(a)和(b)示出了布美他尼处理不影响游泳速度或可见的试验表现。(a)在apoE4-KI和apoE3-KI小鼠的隐藏平台试验期间，布美他尼不显著影响游泳速度。(b)在可见试验中，任何组之间不存在显著差异，表明任何组均不存在运动或视觉损害。

对于体内验证，对布美他尼处理(以0.02mg/kg的低剂量和以0.2mg/kg的高剂量每天腹膜内注射，持续8周)在16个月龄的apoE4-KI小鼠中对于认知缺陷的作用进行检查。使用莫里斯水迷宫(MWM)^20-23以在隐藏平台学习试验中测试5天中的空间学习和记忆，随后在最后隐藏试验之后24小时时进行短期记忆的探索试验，以及在120小时时进行长期记忆的探索试验(图3，图a)。在隐藏和可见试验期间，学习曲线和游泳速度在基因型或处理组中没有差异(图3，图b；图6，图a，b)。然而，经载剂处理的apoE4-KI小鼠的短期空间记忆受损，这未见于经载剂处理的apoE3-KI小鼠中(图3，图c)。引人注目地，在24小时的探索试验中，低剂量和高剂量的布美他尼处理均挽救了apoE4-KI小鼠的短期记忆缺陷，其表现得与apoE3-KI小鼠一样好(图3，图c)。经低布美他尼和经载剂处理的apoE3-KI小鼠表现得同样好，表明低剂量的布美他尼处理不会对记忆形成产生不良影响。然而，在24小时的探索试验中，高剂量的布美他尼处理损害apoE3-KI小鼠的短期记忆(图3，图c)，表明布美他尼对apoE4-KI小鼠的有益作用的特异性。在120小时的探索试验中，经高布美他尼处理的apoE4-KI小鼠仍然对目标象限有显著的偏好(图3，图d)，表明布美他尼对apoE4-KI小鼠的长期记忆具有强的有益作用。令人感兴趣地，在120小时的探索试验中，经低和高布美他尼二者处理的apoE3-KI小鼠均忘记隐藏的平台位置，与经载剂处理的apoE3-KI小鼠一样(图3，图d)，进一步表明布美他尼对长期记忆的有益作用对于apoE4-KI小鼠具有特异性。

在对空间记忆的更严格测试中，在每次探索试验期间，对目标平台位置与其他象限中类似区域的精确跨越进行计数，以评估记忆表现的特异性和准确性。引人注目地，在24小时和120小时的探索试验二者中，经高布美他尼处理的apoE4-KI小鼠而非apoE3-KI小鼠在目标象限中具有显著更多的平台跨越(图3，图e和f)。在24小时的探索试验中，经低布美他尼处理的apoE4-KI小鼠具有短期记忆准确性显著提高的趋势(图3，图e)。综上所述，这些数据表明布美他尼特别地在apoE4-KI小鼠中恢复短期和长期记忆表现二者的准确性。

实施例3

布美他尼对转录组的作用的体内测试

为了探索布美他尼在体内对转录组的作用，进行对来自用载剂或布美他尼处理(0.2mg/kg每天腹膜内注射)持续8周的apoE4-KI小鼠的海马(被认为是AD病理的中心的颞叶区域)的RNA序列分析。层次聚类和主成分分析显示出基于来自布美他尼与载剂处理的DE基因的样品的显著聚类，表明在海马中有独特的药物作用。此外，在经布美他尼处理的apoE4-KI小鼠中，在apoE4/4 AD中显著上调的基因在其表达秩方面向下移动(趋向更高的编号秩)(通过蒙特卡罗模拟，P＜0.001)，证实了CMap数据和这样的假说：疾病特异性转录组特征的逆转是计算药物再利用的合理策略，即使在动物模型中也是如此。在apoE4-KI小鼠中，表达最受布美他尼影响的基因(P＜0.05)的途径分析鉴定了71条显著扰动的途径。令人感兴趣地，这些途径中的6条与富集于apoE4/4 AD特征中的途径重叠：-GABA受体信号传导、cAMP介导的信号传导、G蛋白偶联的受体信号传导、VDR/RXR激活、突触长期抑制和CCR3途径。

图4示出了布美他尼在apoE4-KI小鼠的海马中的转录组扰动特征的RNA-seq分析。图(a)示出了来自在用布美他尼(0.2mg/kg腹膜内注射，持续8周)或载剂处理之后的apoE4-KI小鼠海马组织的如通过RNA-seq定量的DE基因(P＜0.05)的比例化规则log(rld)变换的RNA表达水平的层次聚类分析。彩色条指示比例化的rld表达水平。图(b)示出了apoE4-KI小鼠海马组织中DE基因的主成分分析(PCA)，其将经布美他尼处理的样品与经载剂处理的样品分开。主成分1(PC1)占方差的57.4％，以及PC2占方差的11.2％。图(c)示出了表示如来源于也在apoE4-KI小鼠海马中通过RNA-seq检测的人颞叶样品的分析(参见图1)的AD的apoE4/4-特异性转录组特征的基因集。将布美他尼处理之后apoE4-KI小鼠海马组织中这些基因的表达秩与载剂处理相比的变化针对与健康对照相比的apoE4/4 AD的人颞叶样品中的估计FC绘图。布美他尼处理之后所有基因的表达秩的平均变化如所预期的为零(垂直灰色虚线)。在布美他尼处理之后，在apoE4/4人AD中上调的157个基因的表达秩平均变化为49.76(垂直红色虚线)，表明响应于布美他尼而向更低的秩和更低的表达的移动。右y轴指示散点图值直方图中的基因数目。图(d)和(e)示出了针对apoE4/4 AD中的上调基因(n＝157)(d)和下调基因(n＝56)(e)的集合的尺寸匹配基因集的1000个随机排列的布美他尼处理之后表达秩的平均变化的直方图。如通过蒙特卡罗模拟计算的，布美他尼处理之后人apoE4/4特异性上调基因的表达秩的平均变化(49.76，红色虚线)显著高于零(1000个排列的平均值)，表明向更低表达的显著移动；下调基因的表达秩的平均变化没有显著地从零移开。图(f)是与显著富集于人中apoE4/4 AD中的途径相比的来自布美他尼处理之后apoE4-KI小鼠海马的DE基因(P＜0.05)的通过Ingenuity Pathway Analysis(IPA)得出的独特的(65条)和共享的(6条)显著富集的本体途径的维恩图和表。

层次聚类和主成分分析显示出基于来自布美他尼与载剂处理的DE基因的样品的显著聚类(图4，图a和b)，表明在海马中独特的药物作用。此外，在经布美他尼处理的apoE4-KI小鼠中，在apoE4/4 AD中显著上调的基因在其表达秩方面向下移动(趋向更高的编号秩)(图4，图c和d，通过蒙特卡罗模拟，P＜0.001)，证实了CMap数据和这样的假说：疾病特异性转录组特征的逆转是计算药物再利用的合理策略，即使在动物模型中也是如此。然而，在apoE4-KI小鼠中，布美他尼并未在apoE4/4 AD中改变下调的较小基因子集(图4，图e)，可能是因为一些下调的基因反映了细胞死亡，而不是apoE4/4 AD中改变的基因表达。

总体而言，在apoE4-KI小鼠中的其表达最受布美他尼影响的基因(P＜0.05)的途径分析导致鉴定出71条显著扰动的途径。令人感兴趣地，这些途径中的6条与富集于apoE4/4 AD特征中的途径重叠：-GABA受体信号传导、cAMP介导的信号传导、G蛋白偶联的受体信号传导、VDR/RXR激活、突触长期抑制和CCR3途径(图4，图f)。

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尽管上文已讨论许多的示例性方面和实施方案，然而本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可进行多种改变并且可替换等同方案。另外，可进行许多修改、置换、添加，及其子组合，以使特定情况、材料、物质组成、过程、过程的一个或更多个步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这样的修改旨在在其所附权利要求书的范围之内。

实施例4

布美他尼处理在衰老APOE4-K1小鼠中挽救神经元可塑性和兴奋性缺陷

为了获得对apoE4特异性行为挽救的潜在机制的更好的理解，测试了布美他尼对长时程增强(LTP)的基因型特异性作用。LTP是神经元可塑性的电生理测量。它被认为是构成正常记忆形成的基础的分子机制，并且它在AD的动物模型中受损。与衰老(16个月龄)的apoE4-KI小鼠的记忆损害一致，在海马切片的CA1区中记录的LTP显示了衰老的经载剂处理的apoE4-KI小鼠中与年龄匹配的经载剂处理的apoE3-KI小鼠相比的显著缺陷(图12，图a和b)。布美他尼处理(0.2mg/kg，持续8周)在衰老apoE4-KI小鼠中完全挽救了LTP缺陷(图12，图a和b)。此外，还通过布美他尼处理对通过输入-输出曲线分析测量的apoE4-KI小鼠中海马的CA1区中的神经元过度兴奋性进行归一化(图12，图c)。因此，体内布美他尼处理在衰老apoE4-KI小鼠的海马中恢复了神经元可塑性和兴奋性，其是正常记忆形成的基础。

如上所讨论的，图12提供了表明布美他尼处理特别地在衰老apoE4-KI小鼠中挽救神经元可塑性缺陷的图。(图a和b)高剂量(0.2mg/kg)的布美他尼处理持续8周挽救了来自apoE4-KI小鼠的离体海马切片中的LTP缺陷。对来自16个月龄的以下小鼠的离体海马切片测量了θ脉冲群刺激(theta burst stimulation，TBS)诱导的LTP：经载剂处理的apoE3-KI小鼠(n＝来自6只小鼠的14个脑切片)、经布美他尼处理的apoE3-KI小鼠(n＝来自3只小鼠的11个脑切片)、经载剂处理的apoE4-KI小鼠(n＝来自6只小鼠的14个脑切片)以及经布美他尼处理的apoE4-KI小鼠(n＝来自3只小鼠的12个脑切片)。将平均fPSP斜率值归为一分钟间隔，并以对照归一化(a)。总结了实验组中的LTP增益结局(b)。(图c)高剂量的布美他尼处理在来自apoE4-KI小鼠的离体海马切片中挽救了海马网络兴奋性缺陷。对来自16个月龄的以下小鼠的离体海马切片测量了Shaeffer侧支-CA1网络中的输入-输出关系：经载剂处理的apoE3-KI小鼠(n＝来自7只小鼠的23个脑切片)、经布美他尼处理的apoE3-KI小鼠(n＝来自3只小鼠的10个脑切片)、经载剂处理的apoE4-KI小鼠(n＝来自3只小鼠的11个脑切片)以及经布美他尼处理的apoE4-KI小鼠(n＝来自3只小鼠的12个脑切片)。示出了在提高的刺激幅度中的平均fPSP斜率值(归一化为最小值)。值是平均值±SEM。将双尾t检验用于b中组间LTP增益结果的统计学分析。将曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U-test)用于分析c中动物组之间的差异。**p＜0.01；***p＜0.001。

实施例5

布美他尼处理再衰老APOE4-KI小鼠海马中翻转选择性神经元类型中的APOE4/4AD转录组特征基因

为了探索布美他尼对体内单独海马细胞中转录组的作用，在布美他尼处理之后，在来自用载剂或布美他尼处理(0.2mg/kg每天腹膜内注射)持续8周的apoE4-KI小鼠的海马(认为是AD病理的中心的颞叶区域)中进行差异基因表达的单一细胞核RNA-seq分析。鉴定出18个独特的海马细胞簇，并进一步分析细胞类型特异性药物作用(图13A至13C)。在12种细胞类型，包括所有兴奋性和混合性神经元簇以及SST/PV中间神经元中，在布美他尼处理之后，在apoE4/4 AD中上调的基因向下移动至较高的秩数，而在apoE4/4 AD中下调的基因向上移动至较低的秩数(通过蒙特卡罗模拟，P＜0.05)，证实了在这些神经元细胞类型中，布美他尼的转录组扰动特征与人apoE4/4 AD的转录组扰动特征负相关(图13D和13E)。这种移动证实CMap数据和这样的假说：疾病特异性转录组特征的逆转是计算药物再利用的合理策略，即使在动物模型中的神经元细胞中也是如此。无论DE基因的数目如何，在兴奋性神经元细胞类型和SST/PV中间神经元中观察到这种移动，表明该作用在药物作用和簇尺寸二者中都是稳健的(图13F)。存在富集于具有对人apoE4/4 AD基因的显著“翻转”的至少一种神经元细胞类型中的104条本体途径(p＜0.005)(图13G)，其中19条也富集于人中apoE4/4介导的AD中(由黑色箭头标识)。

如上文所论述的，图13A至13G提供了示出布美他尼在apoE4-KI小鼠海马中的转录组扰动特征的单一细胞核RNA-seq分析的结果的示意图、绘图和图。(图13A)通过高通量条码多路复用，将来自经布美他尼和经载剂处理的小鼠的海马的超过24,000个核在单一实验中一起测序。(图13B)通过t-SNE进行的聚类和可视化鉴定出根据细胞类型编号的18个独特簇。星号指示这样的簇，其中如来源于人颞叶样品AD的分析的AD的apoE4/4特异性转录组特征中上调基因的FC的平均秩显著下调并且人apoE4/4 AD中的下调基因显著上调(P＜0.05)。(图13C)通过处理的颜色编码的簇显示独特的药物作用。(图13D)还通过单一细胞核seq在apoE4-KI小鼠海马中在4个代表性簇中检出的AD基因集的人apoE4/4-特异性转录组特征的直方图。将与载剂处理相比的布美他尼处理之后apoE4-KI小鼠海马中齿状回颗粒细胞簇、CA1神经元簇、CA2/3神经元簇和Sst/Pv中间神经元簇中这些基因的FC秩相对于在y轴上该秩的基因数目而绘制在x轴上。该基因集中所有基因的平均秩由黑线指示，上调基因(直方图中以红色着色)的平均值平均FC秩由红色虚线指示，以及下调基因(直方图中以蓝色着色)的平均值FC秩由蓝色虚线指示。示出了如通过蒙特卡罗模拟计算的上调和下调的FC秩平均值偏离所有基因的秩平均值的“翻转”的显著性的P值(P＜0.05被认为是显著的)。(图13E)在人apoE4/4 AD中通过估计FC进行秩排序和颜色编码(顶部)，并随后在apoE4/4-KI小鼠海马中的4个代表性细胞类型中在布美他尼之后通过FC秩进行再颜色编码(底部)的AD的apoE4/4特异性转录组特征的基因的热图。布美他尼使这四个簇中AD的人apoE4/4特异性转录组特征中的上调和下调基因二者的表达秩翻转。(图13F)将AD的apoE4/4特异性转录组特征的“翻转”的P值相对于x轴上每个簇中DE基因的数目而绘制在y轴上。虚线指示P＝0.05，并且所有兴奋性神经元簇以黑色轮廓突出显示。尽管DE基因的数目不同，但所有兴奋性神经元簇、混合性神经元簇、Sst/Pv中间神经元和内皮/成纤维样细胞在这些基因中均表现出显著的“翻转”。(图13G)在表现出对AD的apoe4/4特异性转录组特征的“翻转”行为的所有神经元簇中的失调本体途径的p值的热图揭示了在这些细胞类型中的至少一种中失调的104条途径(P＜0.005)。用箭头示出的途径名称(n＝19条途径)与apoE4/4介导的人AD特征共享。在y轴上从左至右的细胞类型组如下：非神经元、抑制性神经元、兴奋性神经元、混合性神经元、兴奋性神经元、非神经元、兴奋性神经元、抑制性神经元和兴奋性神经元。在x轴上从左至右列出的途径如下：非洲锥虫病、血清素能突触、基础转录因子、尼古丁成瘾(Nicotine addiction)、磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇信号传导系统、上皮细胞的细菌侵入、Wnt信号传导途径、Rap 1信号传导途径、T细胞受体信号传导途径、胆碱能突触、长时程抑制、Gap连接、N-聚糖生物合成、磷脂酶D信号传导途径、癌症中的蛋白聚糖、mRNA监测途径、酒精中毒、雌激素信号传导途径、GABA能突触、吗啡成瘾、Apelin信号传导途径、内分泌和其他因子调节的钙重吸收、收集导管酸分泌、类风湿性关节炎、胃癌、丙酸代谢、膀胱癌、细胞衰老、蛋白酶体、柠檬酸循环(TCA循环)、胞吞、亨廷顿病(Huntington disease)、非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、氧化磷酸化、帕金森病(Parkinson disease)、细胞周期、FoxO信号传导途径、神经营养因子信号传导途径、黏着连接、卵母细胞减数分裂(Oocyte meosis)、长寿调节途径、肌动蛋白细胞骨架的调节、结核、长时程增强、突触囊泡循环、轴突引导、催产素信号传导途径、昼夜节律夹带(Circadianentrainment)、谷氨酸能突触、苯丙胺成瘾、多巴胺能突触、人类免疫缺陷病毒1感染、自噬动物(Autophagy-animal)、泛素介导的蛋白酶解、胰高血糖素信号传导途径、内质网中的蛋白质加工、cAMP信号传导途径、心肌细胞中的肾上腺素信号传导、cGMP-PKG信号传导途径、溶酶体、囊泡运输中的SNARE相互作用、剪接体、与卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)相关的疱疹病毒感染、人T细胞白血病病毒1感染、RNA转运、内分泌抗性、肾细胞癌、胰岛素信号传导途径、甲状腺激素信号传导途径、阿尔茨海默病、产热、癌症中的胆碱代谢、沙门菌感染、人巨细胞病毒感染、逆行内源性大麻素信号传导、ErbB信号传导途径、孕酮介导的卵母细胞成熟、mTOR信号传导途径、吞噬体、朊病毒病、铁死亡(Ferroptosis)、核糖体、黑素瘤、B细胞受体信号传导途径、FcγR介导的吞噬、胰腺癌、FcεRI信号传导途径、非小细胞肺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、胶质瘤、前列腺癌、线粒体自噬动物、真核生物中的核糖体生物合成、甲状腺癌、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、病毒性致癌、肌萎缩侧索硬化(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、蛋白质输出、RNA降解、血管升压素调节的水重吸收、代谢途径、膦酸和次膦酸代谢。

实施例6

布美他尼处理在APOE4/4-IPSC来源的人神经元中翻转APOE4/4 AD转录组特征基因。

将ApoE4/4-iPSC来源的人神经元(约75％兴奋性神经元、约15％抑制性神经元和约5％多巴胺能神经元)在体外用布美他尼(10μM)处理6小时，然后通过RNA-seq分析探询转录变化(图14A)。主成分分析显示基于来自布美他尼与载剂处理的差异表达(DE)基因的样品的显著聚类(图14B)，表明对人apoE4/4-iPSC来源的神经元具有独特的药物作用。此外，在经布美他尼处理的apoE4/4-iPSC来源的神经元中，在布美他尼处理之后，在apoE4/4 AD中上调的基因向下移动至较高的秩数，而在apoE4/4AD中下调的基因向上移动至较低的秩数(通过蒙特卡罗模拟，P＜0.05)，进一步证实了CMap数据库的预测，并强调了人iPSC来源的神经元在体外药物再利用努力方面的适用性(图14C和14D)。

在apoE4/4-iPSC来源的人神经元中其表达受布美他尼影响的基因的途径分析鉴定出27条显著扰动的途径(图14E)。令人感兴趣地，这些途径中的14条与富集于表现出预测的药物作用的小鼠海马神经元细胞(包括兴奋性神经元和SST/PV中间神经元)中的途径重叠，并且这些途径中的4条也与来自人的apoE4/4 AD特征共享：GABA能突触、昼夜节律夹带、逆行内源性大麻素信号传导和突触囊泡循环(图14E和14F)。

如上文所论述的，图14A至14F提供了示出apoE4/4-iPSC来源的人神经元中布美他尼的转录组扰动特征的RNA-seq分析的结果的示意图和图。(图14A)将ApoE4/4-iPSC来源的人神经元用10μM布美他尼处理6小时，然后通过RNA-seq分析转录组变化。(图14B)经布美他尼处理的apoE4/4-iPSC来源的人神经元中DE基因的主成分分析(PCA)使经布美他尼处理的样品与经载剂处理的样品分开。主成分1(PC1)占方差的71.9％，以及PC2占方差的12.4％。(图14C)在布美他尼处理之后，在apoE4/4-iPSC来源的人神经元中还通过RNA-Seq检出的AD基因集的人apoE4/4-特异性转录组特征的直方图。将与载剂处理相比的布美他尼处理之后iPSC来源的人神经元中这些基因的FC秩相对于在y轴上该秩处的基因的数目而绘制在x轴上。该基因集中所有基因的平均秩由黑线指示，上调基因的平均值平均FC秩由虚线指示并相应地标记，而下调基因的平均值FC秩由虚线指示并相应地标记。示出了如通过蒙特卡罗模拟计算的上调和下调的FC秩平均值偏离所有基因的秩平均值的“翻转”的显著性P值(P＜0.001)。(图14D)来自通过apoE4/4 AD中的估计FC进行秩排序和颜色编码(顶部)并随后通过布美他尼处理之后iPS来源的神经元中的FC秩进行再颜色编码(底部)的AD的人apoE4/4特异性转录组特征的基因的热图。(图14E)布美他尼处理之后apoE4/4-iPSC来源的人神经元中富集的本体途径(n＝27)的p值及其在人apoE4/4特异性AD和如图13A至13G中所示的表现出“翻转”表型的所有神经元细胞类型(所有兴奋性神经元、混合性神经元和SST/PV中间神经元)中的相应的富集p值的热图。以粗体文本突出显示的途径指示在布美他尼处理之后，在apoE4/4-iPSC来源的人神经元与在apoE4-KI小鼠海马中表现出“翻转”的神经元细胞类型之间共享的途径(n＝14条途径，关于细胞类型的具体信息参见图13A至13G)。以红色突出显示的途径指示在布美他尼处理之后，在apoE4/4-iPSC来源的人神经元与在apoE4-KI小鼠海马中表现出“翻转”的神经元细胞类型(关于细胞类型的具体信息参见图13A至13G)，以及人apoE4/4特异性AD中之间共享的途径(关于人途径信息，参见图1，n＝4条途径)。(图14F)布美他尼之后apoE4/4-iPSC来源的人神经元，布美他尼之后在apoE4/4-KI小鼠海马中表现出“翻转”的神经元细胞类型(关于细胞类型的具体信息参见图13A至13G)，以及显著富集于人中apoE4/4 AD中的途径之间的维恩图以及独特和共享的富集的本体途径。

Claims (42)

1.在具有apoE4/4基因型的对象中治疗阿尔茨海默病(AD)的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的布美他尼。

2.权利要求1所述的方法，其中所述施用包括以0.05mg/kg/天或更少的剂量向所述对象施用布美他尼。

3.权利要求2所述的方法，其中所述施用包括以0.02mg/kg/天或更少的剂量向所述对象施用布美他尼。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将所述布美他尼配制为包含可药用载体的经口剂型，并且其中所述经口剂型经口施用。

5.权利要求4所述的方法，其中所述经口剂型作为胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂，或小药囊剂每天施用一次。

6.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述布美他尼静脉内或肠胃外施用。

7.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述布美他尼以经皮贴剂提供。

8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

9.权利要求8所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

10.在具有apoE4/4基因型的对象中治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括：

a)将对象鉴定为具有apoE4/4基因型；以及

b)向所述对象施用治疗有效量的布美他尼。

11.权利要求10所述的方法，其中所述鉴定包括对来自所述对象的生物样品进行基于PCR的DNA分析方法。

12.权利要求11所述的方法，其还包括从所述对象分离所述生物样品。

13.权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述施用包括以0.05mg/kg/天或更少的剂量向所述对象施用布美他尼。

14.权利要求13所述的方法，其中所述施用包括以0.02mg/kg/天或更少的剂量向所述对象施用布美他尼。

15.权利要求10至14中任一项所述的方法，其中将所述布美他尼配制为包含可药用载体的经口剂型，并且其中所述经口剂型经口施用。

16.权利要求15所述的方法，其中所述经口剂型作为胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂每天施用一次。

17.权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述布美他尼静脉内或肠胃外施用。

18.权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述布美他尼以经皮贴剂提供。

19.权利要求10至18中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

20.权利要求19所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

21.药盒，其包含：

a)布美他尼制剂；

b)包装；以及

c)电子或纸质形式的信息，其包含向具有apoE4/4基因型的对象施用布美他尼的说明。

22.权利要求21所述的药盒，其中所述说明指出向所述对象施用所述布美他尼制剂是基于对象体重以及所施用制剂的重量和/或体积。

23.权利要求22所述的药盒，其中所述说明包含以0.05mg/kg/天或更少的布美他尼的剂量向所述对象施用所述制剂的说明。

24.权利要求23所述的药盒，其中所述说明包含以0.02mg/kg/天或更少的布美他尼的剂量向所述对象施用所述制剂的说明。

25.权利要求21至24中任一项所述的药盒，其还包含用于容纳从要针对一种或更多种apoE基因型进行测试的对象分离的生物样品的容器。

26.权利要求25所述的药盒，其还包含用于进行PCR或微阵列分析以允许特异性检测所述生物样品中apoE4等位基因的一种或更多种试剂，以及针对使所述试剂与所述生物样品发生反应的电子或纸质说明。

27.权利要求26所述的药盒，其还包含一个或更多个对照参考样品。

28.权利要求21至27中任一项所述的药盒，其中所述布美他尼制剂为用于经口递送的胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂的形式。

29.权利要求21至27中任一项所述的药盒，其中所述布美他尼制剂适用于注射器以进行静脉内或肠胃外递送。

30.权利要求21至27中任一项所述的药盒，其中所述布美他尼制剂为经皮贴剂的形式。

31.药盒，其包含：

a)包含含有可药用载体和布美他尼的一个或更多个剂量的制剂的容器；以及

b)针对治疗具有apoE4/4基因型的对象的电子或纸质说明。

32.权利要求31所述的药盒，其中所述制剂的每个剂量不包含超过2mg的布美他尼。

33.权利要求32所述的药盒，其中所述制剂的每个剂量不包含超过1mg的布美他尼。

34.权利要求31至33中任一项所述的药盒，其中所述剂量被配制成用于经口施用。

35.权利要求34所述的药盒，其中用于经口施用的所述剂量被配制为每天一次的胶囊剂、片剂、崩解片剂或锭剂或小药囊剂。

36.权利要求31至33中任一项所述的药盒，其中所述制剂的剂量被配制为静脉内或肠胃外施用。

37.权利要求31所述的药盒，其中所述制剂的剂量被配制为通过经皮贴剂施用。

38.权利要求31至37中任一项所述的药盒，其中所述对象是哺乳动物。

39.权利要求38所述的药盒，其中所述哺乳动物是人。

40.权利要求31至39中任一项所述的药盒，其还包含用于进行PCR或微阵列分析以允许特异性检测来自所述对象的生物样品中apoE4等位基因的一种或更多种试剂，以及针对使所述试剂与所述生物样品发生反应的电子或纸质说明。

41.权利要求40所述的药盒，其还包含一个或更多个对照参考样品。

42.权利要求31至41中任一项所述的药盒，其中：

针对治疗所述对象的所述说明指出基于对象体重以及所施用制剂的重量或体积的剂量。

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