CN108837156A - 一种碳点载药体系的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种碳点载药体系的制备方法。以牡丹花粉为原料，尿素为修饰试剂，采用水热法制备出粒径均匀的碳点，再将碳点分别与盐酸阿霉素(DOX)、柠檬酸铁(FAC)进行避光偶联反应，得到CDs‑DOX和CDs‑FAC。本发明所制备的CDs‑DOX载药量高，具有缓释性，且具有癌细胞靶向释放的特征；所制备的CDs‑FAC载药量高，具有缓释性，且胃液释放慢于肠液释放，CDs‑FAC可减轻FAC对胃的刺激作用，有利于小肠吸收，适合口服用药。制备方法简单、操作简便，反应易控制；所得产物有利于改善单纯DOX或FAC的给药效果，减轻其毒副作用，可用于治疗铁紊乱相关疾病。

Description

一种碳点载药体系的制备方法
技术领域
本发明涉及一种载药体系的制备方法，特别是碳点载铁紊乱疾病相关药物的制备方法，属于生物科学技术领域。
背景技术
铁是人体必需的微量元素，铁缺乏或铁过载都会导致人体的疾病状态。铁过载会导致过氧化损伤，提高患癌率，研究表明铁过载与多种癌症的发生、发展有关。癌症是当今威胁人类健康和生存质量的一大杀手，也是致死的主要原因之一。目前临床的治疗方法包括手术切除、化学治疗、放射治疗、中西医结合疗法等。在传统治疗癌症的化疗过程中，盐酸阿霉素是一种常用的广谱抗癌药物，不仅可以杀死癌细胞，也可以杀死健康细胞，有很大的副作用。所以，寻找一种无毒的载体，能运载抗癌药物到达指定的癌细胞部位进行释放，以此达到靶向治疗的目的非常重要。人体铁缺乏会影响生长发育，甚至会引起贫血等疾病。柠檬酸铁是一种常用的补铁剂，但是其口感差、对胃肠道消化系统有刺激、并且生物利用率低，难以达到有效补铁。所以，寻找一种无毒的，能克服柠檬酸铁应用缺点的载体也是非常重要的。
碳是日常生活中最常见的材料，也是人体的重要组成元素。碳点是一种新型的、粒径小于10nm的碳纳米材料，具有粒径小，易修饰，生物相容性好，无毒性和优良的光学性质，已被成功用于生物成像、催化、生物传感、药物输送等多个领域。因此，将碳点用作药物载体，制备成碳点载药体系，用来治疗铁紊乱相关疾病如癌症和缺铁性贫血等，预期会缓解单独药物利用的弊端。
发明内容
本发明的目的是提供一种碳点载药体系的制备方法，所得到的CDs-DOX 分别在不同pH值的缓冲溶液中具有缓释性，且释放率依次降低，克服了盐酸阿霉素作为抗癌药物有毒副作用和柠檬酸铁口感差、生物利用率低的缺陷。
本发明解决其技术问题采取的技术方案是这样的：
本发明利用牡丹花粉为原料、尿素为修饰试剂，采用水热法制备得到碳点。将所得碳点与DOX或FAC以不同的质量比进行偶联反应，优化得到高载药量的CDs-DOX和CDs-FAC的制备条件。并分别研究了CDs-DOX和 CDs-FAC在不同pH值介质或胃肠液的体外释放情况。
具体的，本发明的碳点载药体系的制备方法包括以下步骤：
(1)按照质量比称取牡丹花粉和尿素，m牡丹花粉：m尿素＝1:1～1:5，溶于水中，充分搅拌后转至聚四氟乙烯反应釜中，200℃下水热反应10小时，冷却至室温，得到棕黑色溶液，过滤、离心，除去大颗粒杂质，静止、取上清液，透析除去游离的尿素，所得溶液即碳点，记为CDs；
(2)取一定体积的CDs溶液于烘箱烘干，称量所得到的固体碳点的质量，计算出碳点溶液的质量浓度；
(3)配制一定质量浓度的盐酸阿霉素(DOX)溶液，然后取步骤(1) 得到的CDs溶液与DOX溶液，按两种溶液中纯物质质量比mCDs:mDOX＝(1： 0.5)～(1：3)进行溶液混合，在振荡器上避光反应，透析除去游离的盐酸阿霉素，得到CDs-DOX；
或者，将步骤(1)得到的CDs溶液与一定质量浓度的柠檬酸铁(FAC) 溶液，按两种溶液中纯物质质量比mCDs:mFAC＝(1：0.5)～(1：2)进行溶液混合，然后在振荡器上避光反应，透析除去游离的柠檬酸铁，得到CDs-FAC。
将上述方法制得的碳点在透射电镜下观察，发现CDs为实心圆球状，粒径约为5nm(图1)。
将CDs与DOX在避光条件下进行偶联反应，测试产物(CDs-DOX) 的紫外-可见吸收光谱(图2)，从图2中看到，CDs在波长230–240nm 处有特征吸收峰，这是CDs中的C＝C的π-π*伸缩振动。DOX在488nm 处显示出特征吸收峰。当CDs与DOX结合后，CDs-DOX在510nm范围处出现了吸收峰，与DOX的特征峰相比，发生了红移，这是因为形成了 CDs-DOX，CDs与DOX之间有相互作用。
为了研究碳点载药体系CDs-DOX的药物释放特征，申请人进行了体外释放研究。将制得的CDs-DOX溶液放入透析袋(MWCO 1000)，再分别放入80mL三种不同pH值分别为7.4、6.5和5.0的PBS缓冲溶液中，置于 37℃恒温振荡器中，研究药物的释放。间隔一定的时间间隔取出1mL释放介质，同时补入1mL相同的释放介质。以释放介质为空白对照，测定一定时间CDs-DOX中DOX的释放量。结果发现，随着介质酸度的增加，DOX释放量增加。释放80小时后，pH＝5.0时，DOX释放约69.1％；而pH＝7.4 时仅释放了14.7％，pH＝6.5时释放了22.7％(图3)；这说明CDs-DOX 具有缓释性。由于人体内正常细胞呈中性，而癌细胞表面呈酸性，因此，说明CDs-DOX同时具有癌细胞靶向释放的特征。
将CDs与FAC在避光条件下进行偶联反应，测试产物(CDs-FAC) 的紫外-可见吸收光谱(图4)，从图上可以看到，CDs在波长240nm处有吸收峰，FAC在260nm处有特征吸收峰。当CDs与FAC结合后，形成的CDs-FAC在260nm-270nm之间显示出特征吸收，FAC相比，吸收峰位置发生了红移，并且变宽，这是因为FAC连在CDs表面，二者之间发生了相互作用。
为了研究碳点载药体系CDs-FAC的药物释放特征，申请人进行了体外释放研究。将制得的CDs-FAC和同体积的模拟胃液(pH＝1.3，胃蛋白酶) 或肠液(pH＝7.4，胰蛋白酶)混合，注入透析袋(MWCO 1000)，再放入装有80mL pH＝1.3盐酸溶液(或pH＝7.4PBS溶液)烧杯中，用锡箔纸密封烧杯口，置于37℃恒温振荡器中，研究药物的释放。间隔一定的时间间隔取出 1mL释放介质，同时补入1mL相同的释放介质。以释放介质为空白对照，测定一定时间CDs-FAC中FAC的释放量。结果发现，CDs-FAC在胃液中三小时内的释放率为13.37％，而肠液中的释放量达95％，CDs-FAC在肠液中的释放明显快于胃液(图5)，这说明CDs-FAC可减轻FAC对胃的刺激作用，同时有利于小肠吸收，适合口服用药。
本发明取得的有益效果如下：
利用上述方法制得的CDs-DOX载药量高，制备方法简单，对肿瘤细胞有靶向释放作用，可提高DOX的药效，降低毒副作用。所制得的CDs-FAC 同样具有载药量高，制备方法简单的优点，对于其在模拟胃液、肠液中的释放，肠液中释放量远大于胃液，说明制备的CDs-FAC中的柠檬酸铁可被小肠大量吸收，适用于口服用药。
附图说明
图1是碳点(CDs)的透射电镜图(TEM)。
图2是碳点-盐酸阿霉素载药体系(CDs-DOX)的紫外-可见吸收光谱图。
图3是CDs-DOX在不同PBS缓冲溶液(pH分别为5.0，6.5，7.4)中的释放曲线。
图4是碳点-柠檬酸铁载药体系(CDs-FAC)的紫外-可见吸收光谱图。
图5是CDs-FAC在模拟胃肠液中的体外释放曲线。
具体实施方式
以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1 一种由牡丹花粉制备碳点(CDs)的方法
将采摘的牡丹花瓣放入电热鼓风干燥箱中，80℃烘干，将烘干的花瓣研磨成花粉，密封保存。按照m牡丹粉：m尿素＝1:3称取牡丹粉和尿素，放入烧杯中。加入10mL水，磁力搅拌器搅拌，均匀后，转入聚四氟乙烯内胆中。然后将反应釜放入电热鼓风干燥箱中200℃加热10小时，得到棕黑色溶液。过滤除去大颗粒杂质，4000rmp/min离心10分钟，静止数小时后取上清液，透析6 小时，除去多余的修饰试剂尿素，即可得到碳点。取一定体积的CDs溶液于 80℃烘箱烘干，称量所得到的固体碳点的质量，求出碳点溶液的质量浓度。
实施例2 一种由牡丹花粉制备碳点-阿霉素(CDs-DOX)载药体系的方法(载药量37.2％)
(1)碳点-阿霉素(CDs-DOX)载药体系的制备
所用碳点(CDs)由实施例1中的方法得到。按质量比mCDs：mDOX＝1:2 进行溶液配制，置于振荡器上避光反应12小时，透析除去游离的DOX，制得CDs-DOX。
(2)碳点-阿霉素(CDs-DOX)载药体系载药量计算
分别绘制CDs和DOX在波长330nm和488nm处的标准曲线，将制备好的CDs-DOX溶液稀释10倍，用紫外分光光度计测其在330nm和488nm 处的吸光度，根据标准曲线计算浓度，根据下面公式计算载药量：
实施例3一种由牡丹花粉制备碳点-柠檬酸铁(CDs-FAC)载药体系的方法 (载药量54.0％)
(1)碳点-柠檬酸铁(CDs-FAC)载药体系的制备
所用碳点(CDs)由实施例1中的方法得到。按质量比mCDs：mFAC＝1:1 进行溶液配制，在振荡器上避光反应12小时，透析除去游离的FAC,制得 CDs-FAC。
(2)碳点-柠檬酸铁(CDs-FAC)载药体系载药量计算
绘制FAC在波长260nm处的标准曲线，取上述透析后透析袋外的释放介质，用紫外分光光度计测其在260nm处的吸光度，根据标准曲线计算浓度，根据下面公式计算载药量：
说明：本发明中使用的化学物质的缩写式如下(物质的化学名称)：
CDs：碳点
DOX：盐酸阿霉素
FAC：柠檬酸铁
CDs-DOX：碳点-盐酸阿霉素载药体系
CDs-FAC：碳点-柠檬酸铁载药体系。

Claims (1)

1.一种碳点载药体系的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)按照质量比称取牡丹花粉和尿素，m牡丹花粉：m尿素＝1:1～1:5，溶于水中，充分搅拌后转至聚四氟乙烯反应釜中，200℃下水热反应10小时，冷却至室温，得到棕黑色溶液，过滤、离心，除去大颗粒杂质，静止、取上清液，透析除去游离的尿素，所得溶液即为碳点，记为CDs；
(2)取一定体积的CDs溶液于烘箱烘干，称量所得到的固体碳点的质量，计算出碳点溶液的质量浓度；
(3)配制一定质量浓度的盐酸阿霉素(DOX)溶液，然后取步骤(1)得到的CDs溶液与DOX溶液，按两种溶液中纯物质质量比mCDs:mDOX＝(1：0.5)～(1：3)进行溶液混合，在振荡器上避光反应，透析除去游离的盐酸阿霉素，得到CDs-DOX；
或者，取步骤(1)得到的CDs溶液与一定质量浓度的柠檬酸铁(FAC)溶液，按两种溶液中纯物质质量比mCDs:mFAC＝(1：0.5)～(1：2)进行溶液混合，然后在振荡器上避光反应，透析除去游离的柠檬酸铁，得到CDs-FAC。
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