CN101530394B - 一种负载辅酶q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒的制备方法 - Google Patents
一种负载辅酶q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒其制备方法。即室温下将聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇嵌段共聚物和辅酶Q10混合后溶于二甲基甲酰胺与四氢呋喃的混合溶剂中；后经透析、离心分离等，上层清液过滤，得辅酶Q10-聚肽载药胶束溶液，加入醋酸调节pH值；同时将壳聚糖溶于相同pH值的醋酸溶液中并与上述辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液混合后滴加三聚磷酸钠溶液，即得负载辅酶Q10的壳聚糖-聚肽复合纳米粒子，粒子的粒径为80～900nm，平均载药率为2～5％之间，包封率为30～70％。本发明所得的纳米粒子，具有更高稳定性、可缓释、生物相容性好的辅酶Q10纳米疏水药物粒子。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制备负载脂溶性药物的纳米载药粒子，具体涉及一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒其制备方法。
背景技术
辅酶Q10又称泛醌，是一种细胞自身产生的天然抗氧化剂，安全无毒，能提高有机体的免疫力。将辅酶Q10用于人体皮肤的抗氧化和活化剂，在老年皮肤中具有实质功效，是一种既可作为药物也可以作为保健品的优良抗衰老物质。然而辅酶Q10的水溶性及光稳定性较差，使其应用受到影响，选择适宜的聚合物载体对辅酶Q10进行包埋并制备成纳米粒子，用于药物的传递和控释，具有超微体积，能够直接作用于细胞，增加药物稳定性、延长药物疗效的特点。
在常用的聚合物载体材料中，人工合成的聚肽共聚物和天然生物材料壳聚糖以其作为药物载体材料显现出的优良综合性能为人们所关注。对于上述两种药物传输和控释载体，目前的研究主要是停留在单一的载药体系。然而对于单一的两亲性聚肽-聚乙二醇嵌段共聚物载体，最大的缺点是稳定性较差，易聚集。而单一壳聚糖载体的缺点是对包埋脂溶性的药物有限制。
现有用于制备纳米载药胶束的两亲性聚肽共聚物为聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段，其结构如下：
发明内容
本发明的目的在于为了克服现有技术中药物载体材料停留在单一的载药体系，且单一载药体系稳定性较差，易聚集等缺点提出一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒及其制备方法。
本发明的技术原理
一种以两亲性聚肽共聚物为聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段和壳聚糖复合体系为药物载体，以疏水性辅酶Q10为活性物质的含有辅酶Q10的复合纳米粒子，从而获得具有更高稳定性、可缓释、生物相容性好的辅酶Q10纳米疏水药物粒子。
本发明的技术方案
一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒制备方法，包括如下步骤：
(1)、室温下将聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物和辅酶Q10混合物溶于二甲基甲酰胺(DMF)与四氢呋喃(THF)的混合溶剂中；待完全溶解后放入透析袋，在去离子水流中透析72h，除去有机溶剂，再离心分离，控制离心时的转速为5000r/min，时间为10min，除去未包埋药物辅酶Q10，上层清液用直径为0.45μm的滤膜过滤，即得辅酶Q10-聚肽载药胶束溶液；
其中聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物和辅酶Q10混合物按聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物与辅酶Q10的质量比1～24∶1～30混合；
其中二甲基甲酰胺(DMF)与四氢呋喃(THF)的混合溶剂按二甲基甲酰胺(DMF)溶液与四氢呋喃(THF)溶液的体积比为7∶3混合；
其中聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物和辅酶Q10混合物占二甲基甲酰胺(DMF)/四氢呋喃(THF)混合溶剂的重量体积百分比为1∶25；
其中所用的聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物的结构式为：
其中：R为苄基；
(2)、将步骤(1)制备好的辅酶Q10-聚肽载药胶束溶液，加入浓度为4.5mg/mL的醋酸调节pH值为5.0，得含辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液；同时将壳聚糖溶于相同pH值的醋酸溶液中，壳聚糖与醋酸溶液按重量体积比为3∶1～2混合，待壳聚糖完全溶解后，得壳聚糖的醋酸溶液；
将上述辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液和壳聚糖的醋酸溶液按体积比为2∶1混合并搅拌，转速600r/min，边搅拌边滴加浓度为0.5～1.5mg/mL三聚磷酸钠(TPP)溶液，即得负载辅酶Q10的壳聚糖-聚肽复合纳米粒子；
三聚磷酸钠(TPP)溶液的滴加量控制在其与上述辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液和壳聚糖的醋酸溶液的混合液的体积比为1∶1。
本发明所得的负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒中的粒子的粒径为80nm～900nm，符合正态分布，粒子的平均载药率为2～20％之间， 包封率为30～70％之间。
本发明的技术效果
本发明在原有单一聚肽基础上体系中引入了正负电荷，由于电荷在聚肽胶束表面的吸附以及相同电荷间的排斥作用，使新生成的纳米粒子之间稳定性更高，避免了粒子间的聚集现象。同时由于壳层载体的厚度比单一聚肽有所增加，体系72小时的累积释放量有所降低，说明该复合体系的缓释效果好于原有单一体系。该复合体系还改变了单一壳聚糖体系不宜负载油溶性药物的缺点。
综上所述，本发明一种以两亲性聚肽嵌段共聚物和壳聚糖复合体系为药物载体，以疏水性辅酶Q10为活性物质的含有辅酶Q10的复合纳米粒子，从而获得具有更高稳定性、可缓释、生物相容性好的辅酶Q10纳米疏水药物粒子。
附图说明
图1、是本发明所述含辅酶Q10复合纳米粒子经磷钨酸染色后的电镜照片
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进行说明，但并不限制本发明。
纳米粒子的累积释放率、粒子的载药率、包封率采用紫外光谱来定量分析。
即将辅酶Q10及包埋辅酶Q10的壳聚糖-聚肽复合纳米粒子分别按制备用量超声破碎并加DMF进行溶解，在190～500nm范围内进行扫描。结果表明，辅酶Q10在275nm处有最大吸收，壁材不干扰测定。以DMF为空白，于275nm测定吸光值A，绘制辅酶Q10浓度-吸光值标准曲线，得线性回归方程为：A＝15255.7367C-0.0915，其中R＝0.9971；C：辅酶Q10 的浓度，单位：g/mL。
在环境温度(37±1)℃，(80±5)次/分振荡器中，量取经洗涤分散后的辅酶Q10复合纳米粒子溶液5mL放入密封的透析袋中，在pH＝7.4的5mL模拟体液-磷酸盐缓冲溶液中缓释，定时更换介质，然后将缓释出来的含有辅酶Q10的缓冲体液冻干后用DMF溶液溶解过滤并定容，用紫外分光光度计测定275nm处的吸光度值。更换介质，测定不同时间缓冲溶液中释放的辅酶Q10的吸光值，根据吸光值按同等条件下测定的辅酶Q10浓度代入回归方程计算释药量及释药速率。
同样方法将制备的纳米载药微粒经离心分离后冻干并精确称重，取此称重后的载药纳米粒子用DMF溶解并定容至10.0mL，用紫外分光光度计进行测试。将测得的数据代入回归方程计算得载药率和包封率。
实施例1
室温下将2.5mg的PBLG-b-PEG嵌段共聚物和3mg辅酶Q10混合物溶于25mL的二甲基甲酰胺(DMF)/四氢呋喃(THF)混合溶剂中，完全溶解后放入透析袋，在去离子水流中透析72h，并每3h替换一次新鲜去离子水，除去有机溶剂。在去离子水中透析后，离心分离除去未包埋药物，上层清液用直径为0.45μm的滤膜过滤，得到载药胶束溶液。
量取20mL的已制备好的辅酶Q10-聚肽自组装纳米溶液，加入醋酸，使其醋酸浓度为1.5mg/mL，同时将15mg壳聚糖溶于相同浓度的10mL醋酸溶液中，待壳聚糖完全溶解后，将辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液和壳聚糖的醋酸溶液混合搅拌，边搅拌边滴加浓度为1.5mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液30mL，制得包埋辅酶Q10的壳聚糖-聚肽复合纳米粒子。所得的含辅酶Q10复合纳米载药微粒呈球形，具有明显的壳-核结构，为O/W型粒子。纳米粒子粒径大小在80nm到300nm之间，符合正态分布。体系的ZETA(电动电位)电位为50.9mV，该复合体系稳定性较好。在 5h之内存在突释，然后呈现缓慢释放的趋势，72小时的累积释放率为75.0％，粒子的载药率为3.46±0.3％，包封率为59.7±2.1％。
实施例2
室温下将2.5mg的PBLG-b-PEG嵌段共聚物和8mg辅酶Q10混合物溶于25mL的二甲基甲酰胺(DMF)/四氢呋喃(THF)混合溶剂中，完全溶解后放入透析袋，在去离子水流中透析72h，并每3h替换一次新鲜去离子水，除去有机溶剂。在去离子水中透析后，离心分离除去未包埋药物，上层清液用直径为0.45μm的滤膜过滤，得到载药胶束溶液。
量取20mL的已制备好的辅酶Q10-聚肽自组装纳米溶液，加入醋酸，使其醋酸浓度为1.5mg/mL，同时将30mg壳聚糖溶于相同浓度的10mL醋酸溶液中，待壳聚糖完全溶解后，将辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液和壳聚糖的醋酸溶液混合搅拌，边搅拌边滴加浓度为1.5mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液30mL，制得包埋辅酶Q10的壳聚糖-聚肽复合纳米粒子。所得的含辅酶Q10复合纳米载药微粒呈球形，具有明显的壳-核结构，为O/W型粒子。纳米粒子平均粒径大小为887nm，符合正态分布。粒子的平均载药率为4.52％，包封率为35.14％。
实施例3
室温下将2.5mg的PBLG-b-PEG嵌段共聚物和2.5mg辅酶Q10混合物溶于25mL的二甲基甲酰胺(DMF)/四氢呋喃(THF)混合溶剂中，完全溶解后放入透析袋，在去离子水流中透析72h，并每3h替换一次新鲜去离子水，除去有机溶剂。在去离子水中透析后，离心分离除去未包埋药物，上层清液用直径为0.45μm的滤膜过滤，得到载药胶束溶液。
量取20mL的已制备好的辅酶Q10-聚肽自组装纳米溶液，加入醋酸，使其醋酸浓度为1.5mg/mL，同时将30mg壳聚糖溶于相同浓度的10mL醋酸溶液中，待壳聚糖完全溶解后，将辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液和壳聚糖 的醋酸溶液混合搅拌，边搅拌边滴加浓度为0.5mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液30mL，制得包埋辅酶Q10的壳聚糖-聚肽复合纳米粒子。所得的含辅酶Q10复合纳米载药微粒呈球形，具有明显的壳-核结构，为O/W型粒子。纳米粒子平均粒径大小为305nm之间，符合正态分布。粒子的平均载药率为2.74％，包封率为67.23％。
Claims (6)
1.一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒的制备方法，其特征在于如下步骤：(1)室温下将2.5mg的聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物和3mg辅酶Q10混合物溶于25mL的二甲基甲酰胺(DMF)/四氢呋喃(THF)混合溶剂中，完全溶解后放入透析袋，在去离子水流中透析72h，并每3h替换一次新鲜去离子水，除去有机溶剂；在去离子水中透析后，离心分离除去未包埋药物，上层清液用直径为0.45μm的滤膜过滤，得到载药胶束溶液；
其中所用的聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物的结构式为：
其中：R为苄基；
(2)量取20mL步骤(1)制备好的辅酶Q10-聚肽自组装纳米溶液，加入醋酸，使其醋酸浓度为1.5mg/mL，同时将15mg壳聚糖溶于相同浓度的10mL醋酸溶液中，待壳聚糖完全溶解后，将辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液和壳聚糖的醋酸溶液混合搅拌，边搅拌边滴加浓度为1.5mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液30mL，制得包埋辅酶Q10的壳聚糖-聚肽复合纳米粒子。
2.一种如权利要求1所述的一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒制备方法，其特征在于所得的负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒中的粒子的粒径为80nm～300nm，符合正态分布，粒子的载药率为3.46±0.3％，包封率为59.7±2.1％。
3.一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒的制备方法，其特征在于如下步骤：(1)室温下将2.5mg的聚L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物和8mg辅酶Q10混合物溶于25mL的二甲基甲酰胺(DMF)/四氢呋喃(THF)混合溶剂中，完全溶解后放入透析袋，在去离子水流中透析72h，并每3h替换一次新鲜去离子水，除去有机溶剂；在去离子水中透析后，离心分离除去未包埋药物，上层清液用直径为0.45μm的滤膜过滤，得到载药胶束溶液；
其中所用的聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物的结构式为：
其中：R为苄基；
(2)量取20mL步骤(1)制备好的辅酶Q10-聚肽自组装纳米溶液，加入醋酸，使其醋酸浓度为1.5mg/mL，同时将30mg壳聚糖溶于相同浓度的10mL醋酸溶液中，待壳聚糖完全溶解后，将辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液和壳聚糖的醋酸溶液混合搅拌，边搅拌边滴加浓度为1.5mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液30mL，制得包埋辅酶Q10的壳聚糖-聚肽复合纳米粒子。
4.一种如权利要求3所述的一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒制备方法，其特征在于所得的负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒子平均粒径大小为887nm，符合正态分布，粒子的平均载药率为4.52％，包封率为35.14％。
5.一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒的制备方法，其特征在于如下步骤：(1)室温下将2.5mg的聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物和2.5mg辅酶Q10混合物溶于25mL的二甲基甲酰胺(DMF)/四氢呋喃(THF)混合溶剂中，完全溶解后放入透析袋，在去离子水流中透析72h，并每3h替换一次新鲜去离子水，除去有机溶剂；在去离子水中透析后，离心分离除去未包埋药物，上层清液用直径为0.45μm的滤膜过滤，得到载药胶束溶液；
其中所用的聚-L-谷氨酸-γ-苄酯-聚乙二醇(PBLG-b-PEG)嵌段共聚物的结构式为：
其中：R为苄基；
(2)量取20mL步骤(1)制备好的辅酶Q10-聚肽自组装纳米溶液，加入醋酸，使其醋酸浓度为1.5mg/mL，同时将30mg壳聚糖溶于相同浓度的10mL醋酸溶液中，待壳聚糖完全溶解后，将辅酶Q10-聚肽的醋酸溶液和壳聚糖的醋酸溶液混合搅拌，边搅拌边滴加浓度为0.5mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)溶液30mL，制得包埋辅酶Q10的壳聚糖-聚肽复合纳米粒子。
6.一种如权利要求5所述的一种负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒制备方法，其特征在于所得的负载辅酶Q10的聚肽-壳聚糖复合纳米粒子平均粒径大小为305nm，符合正态分布，粒子的平均载药率为2.74％，包封率为67.23％。
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