CN105664167A - 蛋白包载方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，公开了一种蛋白包载方法，具体为将三聚磷酸钠溶液滴加到含有待包载蛋白的壳聚糖季铵盐溶液中，然后对所得混合溶液离心、过滤即可。本发明的方法不需要使用有机溶剂，条件温和，操作简单，非常适合用于包载蛋白类药物。本发明就用其作为载体，分别包载了牛血清白蛋白和重组釉原蛋白。载牛血清白蛋白纳米粒的粒径在205.48～278.68nm之间，最终释放量最高可接近100％。载重组釉原蛋白纳米粒的最终释放量最高可达50％。

Description

蛋白包载方法
技术领域
本发明涉及一种医药技术领域的纳米粒制备方法，具体涉及一种蛋白包载方法。
背景技术
壳聚糖是天然存在的惟一的碱性多糖。它毒性低、可再生，具有优良的生物降解性和生物亲和性。其分子链上有丰富的羟基和氨基，易于进行化学反应。随着高分子材料学和药剂学的发展，壳聚糖作为一种新型制剂辅料正受到人们的普遍重视。但是壳聚糖不溶于水和一般的有机溶剂，可溶于稀的无机酸和某些有机酸。壳聚糖只能溶于酸性溶液的缺陷使其应用受到限制。因为酸性介质易对敏感药物的性能产生干扰，并且容易对生物体产生毒性。使用壳聚糖季铵化的衍生物不仅保持了分子的阳离子性，还克服了壳聚糖本身溶解性差的缺点，更加适合作为敏感药物的纳米载体。蛋白类药物药效高，针对性强，副作用低，但同时由于蛋白类药物在体内外不稳定，十分敏感，若使用乳化聚合法、自动乳化法等包载蛋白容易使蛋白质变性。因此，使用条件温和，操作简单的方法制备载蛋白的纳米粒很有意义。
经过对现有技术的文献进行检索发现：中国专利公开号为CN1686560A，公开日为2005年10月26日，专利名称为壳聚糖季铵盐纳米粒子及其制备方法和用途，该专利是一种用作药物载体的壳聚糖季铵盐纳米粒子，其不足之处在于药物的释放量较低，造成药物的浪费。二是未考察壳聚糖季铵盐包载药用蛋白后的粒径、载药量等参数。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种蛋白包载方法。本发明的方法没有使用有机溶剂和有毒的交联剂，操作简单，安全可靠，成本低，制备所得的纳米粒粒径均一，形态好。适合用于包载蛋白，制备所得的纳米粒载药量高，同时可实现药物的缓慢和充分释放。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种蛋白包载方法，具体为将三聚磷酸钠(TPP)溶液滴加到含有待包载蛋白的壳聚糖季铵盐溶液中，然后对所得混合溶液离心、过滤即可。
优选地，所述待包载蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)或重组釉原蛋白(rHAm)等。
优选地，所述三聚磷酸钠(TPP)溶液的溶剂为水，溶质三聚磷酸钠在所述溶剂中的质量浓度为0.35～0.6mg/mL。
优选地，所述壳聚糖季铵盐溶液的溶剂为水，溶质壳聚糖季铵盐在所述溶剂中的质量浓度为1.5～2.3mg/mL；所述壳聚糖季铵盐的分子量为50KDa，取代度为42％。
进一步优选地，所述水为超纯水。
优选地，所述三聚磷酸钠(TPP)溶液与所述壳聚糖季铵盐溶液的体积比为1:(1～2)。
优选地，所述滴加的速度为0.2～0.8mL/min。
优选地，所述滴加采用的设备包括恒流泵。
优选地，所述滴加完毕后需再搅拌20～40min。
优选地，所述离心的条件为4500～5000rpm、12～18min。所述离心具体采用高速离心机。
优选地，所述过滤具体是：取离心所得上清液，通过0.22μm的滤膜过滤。用滤膜能过滤除去大分子，实验室常用的滤膜有0.22μm和0.45μm两种。使用0.22μm的滤膜能过滤除去更多的大分子，使粒径的PDI更小，粒径更均一，从而提高纳米粒的稳定性。
第二方面，本发明提供一种通过所述方法获得的蛋白复合体。
第三方面，本发明提供一种含有所述蛋白复合体的制品。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)通过使用分子量50KDa，取代度为42％的壳聚糖季铵盐作为载体，使得制备所得的纳米粒粒径均一，载药量和包封率更高，药物释放量更多；
(2)通过用高速离心机离心、0.22μm的滤膜过滤，使得制备所得的纳米粒粒径均一，PDI在0.16～0.31范围内，纳米粒的稳定性更高；
(3)通过使用本发明所述的制备方法和浓度比，使得载药纳米粒的药物释放量高，释放速度快，50小时即可释放药物40～100％。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为纳米粒的扫描电镜图；
其中，(a)是空白纳米粒，(b)为载BSA纳米粒；(c)为载rHAm纳米粒；
图2为药物从纳米粒中释放的时间-累积释放度曲线图；
其中，(a)是不同HACC浓度条件下制备的载BSA纳米粒，(b)是不同HACC浓度条件下制备的载rHAm纳米粒。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及空白纳米粒的制备和粒径测定，通过控制反应物的浓度、比例、滴加速度等，确定形成纳米粒的条件，减少后续制备载药纳米粒的探究步骤。具体操作如下：
步骤一，将壳聚糖季铵盐(HACC)溶于超纯水，配制成质量浓度为1.5～2.3mg/mL的壳聚糖季铵盐水溶液。
步骤二，将质量浓度为0.35～0.6mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液通过恒流泵以0.2～0.8mL/min的速度滴加到上述溶液中，滴完再搅拌20～40min。三聚磷酸钠(TPP)溶液与壳聚糖季铵盐溶液的体积比控制在1:(1～2)范围内。
步骤三，用高速离心机以4500～5000rpm、12～18min的条件离心。取上清液，用0.22μm的滤膜过滤。
直接吸取1mL制备完的纳米粒，采用动态光散射仪测定粒径。
结果见附表1和表2，由表1和表2可知，TPP浓度的增加会使纳米粒粒径增加，HACC浓度的增加会使纳米粒粒径减小。同时采用该方法制备所得的纳米粒的粒径比较均一。
表1三聚磷酸钠浓度对空白纳米粒粒径的影响
表2壳聚糖季铵盐浓度对空白纳米粒粒径的影响
HACC(mg/mL) TPP(mg/mL) 粒径(nm) PDI
1.5 0.45 251.1±48.21 0.31±0.02
2.0 0.45 389.53±29.63 0.21±0.09
2.3 0.45 430.93±18.53 0.16±0.13
实施例2
本实施例涉及载BSA纳米粒的制备和粒径测定，具体操作如下：
步骤一，将牛血清白蛋白(BSA)以不同的质量浓度0.5、0.9、1.3mg/mL溶于2.0mg/mL的壳聚糖季铵盐(HACC)水溶液；
步骤二，将0.45mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液通过恒流泵以0.2～0.8mL/min的速度滴加到上述溶液中，滴完再搅拌20～40min。三聚磷酸钠(TPP)溶液与壳聚糖季铵盐溶液的体积比控制在1:(1～2)范围内。
步骤三，用高速离心机以4500～5000rpm、12～18min的条件离心。取上清液，用0.22μm的滤膜过滤。
直接吸取1mL制备完的纳米粒，采用动态光散射仪测定粒径。结果见附表3。由表3可知，BSA浓度的增加，会使载药纳米粒的粒径增加。
表3牛血清白蛋白浓度对载药纳米粒粒径的影响
BSA(mg/mL) HACC(mg/mL) TPP(mg/mL) 粒径(nm) PDI
0.5 2 0.45 205.48±2.8 0.29±0.01
0.9 2 0.45 222.68±1.62 0.15±0.03
1.3 2 0.45 267.68±3.16 0.06±0.06
实施例3
本实施例涉及载rHAm纳米粒的制备，具体操作如下：
步骤一，将重组釉原蛋白(rHAm)以0.5mg/mL的质量浓度溶于1.5～2.3mg/mL的壳聚糖季铵盐(HACC)水溶液；
步骤二，将0.35～0.6mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液通过恒流泵以0.2～0.8mL/min的速度滴加到上述溶液中，滴完再搅拌20～40min。三聚磷酸钠(TPP)溶液与壳聚糖季铵盐溶液的体积比控制在1:(1～2)范围内。
步骤三，用高速离心机以4500～5000rpm、12～18min的条件离心。取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，即得载rHAm纳米粒。
实施例4
本实施例涉及载药纳米粒载药量和包封率的测定，具体操作如下：
将制备所得的纳米粒溶液加入超速离心管内，并用超纯水稀释到20mL。在3.0×104rpm，4℃下离心20min，取出上清液，在595nm处用考马斯亮蓝法测定相应浓度下的吸光度A，再计算出BSA或rHAm的载药量和包封率。结果见附表4-7。
表4TPP浓度对BSA载药量和包封率的影响
BSA(mg/mL) TPP(mg/mL) HACC(mg/mL) 包封率(％) 载药量(％)
0.9 0.35 2 28.17±0.17 9.39±0.06
0.9 0.45 2 44.39±0.53 13.96±0.17
0.9 0.6 2 43.18±0.56 14.13±0.18
表5HACC浓度对BSA载药量和包封率的影响
BSA(mg/mL) HACC(mg/mL) TPP(mg/mL) 包封率(％) 载药量(％)
0.9 1.5 0.45 21.29±0.59 7.95±0.22
0.9 2 0.45 44.39±0.53 13.96±0.17
0.9 2.3 0.45 29.30±0.18 7.96±0.05
表6TPP浓度对rHAm载药量和包封率的影响
rHAm(mg/mL) TPP(mg/mL) HACC(mg/mL) 包封率(％) 载药量(％)
0.5 0.35 2 31.51±0.22 10.10±0.07
0.5 0.45 2 35.82±0.32 11.26±0.10
0.5 0.6 2 26.67±0.13 8.23±0.04
表7HACC浓度对rHAm载药量和包封率的影响
rHAm(mg/mL) TPP(mg/mL) HACC(mg/mL) 包封率(％) 载药量(％)
0.5 0.45 1.5 14.67±0.44 5.48±0.16
0.5 0.45 2 35.82±0.32 11.26±0.10
0.5 0.45 2.3 18.52±0.18 5.03±0.05
实施例4
本实施例涉及纳米粒的SEM研究，具体操作如下：
对空白纳米粒(HACC：2mg/mL，TPP：0.45mg/mL)，载BSA纳米粒(HACC：2mg/mL，TPP：0.45mg/mL，BSA：0.5mg/mL)和载rHAm纳米粒(HACC：2mg/mL，TPP：0.45mg/mL，rHAm：0.5mg/mL)的表面形态采用扫描电镜(scanningelectronmicroscope,SEM)观察，样品制备方法如下：剪一小片具有导电功能的铜片，然后将纳米粒溶液滴加到铜片上，用导电胶贴于样品台上，低温真空烘干。以15mA的电流喷涂金-钯试剂粉末30s，吹掉未固定牢固的试剂粉末，以SEM观察纳米粒的表面形态。结果见附图1。由图1可知，纳米粒是较为规整的球形，分散均匀，但稍有聚集现象。
实施例5
本实施例涉及载药纳米粒释放行为的考察，具体操作如下：
将不同HACC浓度条件下制备所得的载BSA纳米粒和载rHAm纳米粒的沉淀转移到50mL的离心管中，加入15mL0.1mol/L、pH＝7.4的PBS溶液。将离心管置于200rpm的摇床中37℃恒温处理，分别在0.5、2、4、6、8、10、12、24、36和48h时间点取样。每次取5mL上清液，同时用等量缓冲液补充。样品超速离心，取上清液，用考马斯亮蓝法测量释放出的BSA或rHAm的量，绘制纳米粒子的释放曲线。结果见附图2。由图2可知，不同的蛋白药物有其特定的释放特性，HACC的浓度使药物的释放量有所差异。
本发明应用上述离子凝胶化法制备壳聚糖季铵盐纳米粒，没有使用有毒试剂，简单安全，粒子形态好。特别适合用于包载蛋白类药物。在包载蛋白时，先将一定浓度的牛血清白蛋白(BSA)或重组釉原蛋白(rHAm)溶于壳聚糖季铵盐的水溶液中，再依照上述步骤制备载药的壳聚糖季铵盐纳米粒。壳聚糖季铵盐纳米粒中蛋白药物的定量分析方法，包括：将制备所得的纳米粒溶液加入超速离心管内，并用超纯水稀释。在4℃下，以3.0×104rpm的转速离心20min，取出上清液，用考马斯亮蓝法测定其中蛋白质的浓度。
本发明考察了壳聚糖季铵盐、三聚磷酸钠的浓度对空白纳米粒的形成和粒径的影响，同时考察了牛血清白蛋白的浓度对载药纳米粒粒径的影响。结果发现，当HACC的浓度为2.0mg/mL，TPP的浓度从0.35mg/mL增大到0.6mg/mL时，纳米粒的粒径由350.88nm降到248nm。再增加TPP的浓度至0.75mg/mL时，形成了较明显的凝胶。可见TPP浓度的增加，会使纳米粒的粒径降低，并且TPP浓度的增加到一定程度会形成凝胶。当TPP的浓度为0.45mg/mL，HACC的浓度为1.0mg/mL，溶液澄清，未形成纳米粒。当TPP的浓度为0.45mg/mL，HACC的浓度从1.5mg/mL增大到2.3mg/mL时，纳米粒的粒径由251.1nm增加到430.93nm。可见HACC浓度的增加，会使纳米粒的粒径增加，并且HACC的浓度较小时，无法形成纳米粒。对于载BSA的纳米粒来说，当HACC的浓度为2.0mg/mL，TPP的浓度为0.45mg/mL时，随着加入BSA的浓度从0.5mg/mL增加到2.0mg/mL，纳米粒的粒径从205.48nm增加到278.68nm。可见BSA浓度的增加，会使载药纳米粒的粒径增加。
本发明用扫描电镜观察了制备所得的纳米粒(对于空白纳米粒：HACC：2mg/mL，TPP：0.45mg/mL；对于载BSA纳米粒：HACC：2mg/mL，TPP：0.45mg/mL，BSA：0.5mg/mL；对于载rHAm纳米粒：HACC：2mg/mL，TPP：0.45mg/mL，rHAm：0.5mg/mL)，从照片上可以清晰的看到纳米粒是较为规整的球形，分散均匀，但稍有聚集现象。
本发明中蛋白含量的测定方法具体为将制备所得的纳米粒溶液加入超速离心管内，并用超纯水稀释。在低温下高速离心，取出上清液，用考马斯亮蓝法测定其中蛋白质的浓度。结果BSA的载药量为10％左右，包封率为40％左右；rHAm的载药量为10％左右，包封率为30％左右。
本发明对不同处方纳米粒中蛋白药物的释放性能进行了考察。从药物释放曲线中可以看出，所有的药物释放曲线呈现为两个特征阶段，初期(1～12小时)的快速药物释放阶段和后期(12～48小时)的慢速药物释放阶段。总体来说，释药速度较快，能在短时间内发挥疗效。在固定TPP浓度0.45mg/mL，BSA浓度0.9mg/mL的条件下，BSA从HACC浓度为1.5mg/mL和2mg/mL的纳米粒中累积释放度接近100％，从HACC浓度为2.3mg/mL的纳米粒中累积释放度接近85％。在固定TPP浓度0.45mg/mL，rHAm浓度0.5mg/mL的条件下，rHAm从HACC浓度为1.5mg/mL的纳米粒中累积释放度接近40％，从HACC浓度为2mg/mL和2.3mg/mL的纳米粒中累积释放度达到50％。可见，HACC的浓度使药物的释放量有所差异，并且包载不同种类蛋白质的纳米粒有其自身特定的释放性质。
综上所述，本发明提供一种蛋白包载方法；本发明的方法通过调节HACC和TPP的浓度对蛋白进行包载，调控包载药量与释放，较直接使用纳米粒与蛋白混合的包载方式具有本质区别，可制备所得的纳米粒粒径均一，形态好。适合用于包载蛋白，制备所得的纳米粒载药量高，同时可实现药物的缓慢和充分释放。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种蛋白包载方法，其特征在于，具体为将三聚磷酸钠溶液滴加到含有待包载蛋白的壳聚糖季铵盐溶液中，然后对所得混合溶液离心、过滤即可。
2.根据权利要求1所述的蛋白包载方法，其特征在于，所述待包载蛋白为牛血清白蛋白或重组釉原蛋白。
3.根据权利要求1所述的蛋白包载方法，其特征在于，所述三聚磷酸钠溶液的溶剂为水，溶质三聚磷酸钠在所述溶剂中的质量浓度为0.35～0.6mg/mL。
4.根据权利要求1所述的蛋白包载方法，其特征在于，所述壳聚糖季铵盐溶液的溶剂为水，溶质壳聚糖季铵盐在所述溶剂中的质量浓度为1.5～2.3mg/mL。
5.根据权利要求1所述的蛋白包载方法，其特征在于，所述三聚磷酸钠溶液与所述壳聚糖季铵盐溶液的体积比为1:(1～2)。
6.根据权利要求1所述的蛋白包载方法，其特征在于，所述滴加的速度为0.2～0.8mL/min。
7.根据权利要求1所述的蛋白包载方法，其特征在于，所述离心的条件为4500～5000rpm、12～18min。
8.根据权利要求1所述的蛋白包载方法，其特征在于，所述过滤具体是：将离心所得上清液通过0.22μm滤膜进行过滤。
9.一种权利要求1至8任一项所述方法获得的蛋白复合体。
10.一种含有权利要求9所述蛋白复合体的制品。
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