CN103319733B - 一种微乳液制备壳聚糖-阴离子多糖复合物纳米微球的方法 - Google Patents
一种微乳液制备壳聚糖-阴离子多糖复合物纳米微球的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医药领域，具体涉及一种微乳液制备壳聚糖-阴离子多糖复合物纳米微球的方法，采用水/油微乳液中壳聚糖和阴离子多糖之间以静电相互作用形成复合多糖纳米微球，更具体地说，先制备壳聚糖微乳液和阴离子多糖微乳液，再将壳聚糖微乳液与阴离子多糖微乳液混合搅拌制得，其中壳聚糖微乳液的油相为柠檬烯。本发明提供一种壳聚糖与其他天然阴离子多糖形成的静电复合物纳米微球载体，该载体平均粒不超过300nm，粒径分布高度均一，该载体可用于口服蛋白质药物、基因药物、食品天然活性产物的肠道靶向输送。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种微乳液制备壳聚糖-阴离子多糖复合物纳米微球的方法。
背景技术
蛋白质药物经口服后被胃酸水解及胃肠道内的酶催化降解、也不易透过胃肠道粘膜等障碍，导致其生物有效性极低。为了成功地经口服输送蛋白质药物，必须将蛋白质药物保护起来以抵制胃内的苛刻环境，避免蛋白质药物的水解和酶降解，同时还需要增加蛋白质药物对肠道粘膜的渗透性。
一些合成的高分子聚合物如聚乳酸、聚2-含氧酸等被用来包埋蛋白质药物，但高分子的合成需要苛刻的环境，容易造成蛋白质药物的变性；而且合成的聚合物在胃液中不稳定，很难透过粘液屏障，生物相容性较低，具有免疫原性且不能被生物降解，实际应用中受到限制。
近年来，壳聚糖作为潜在的吸附增强剂能使多肽类药物通过粘膜上皮细胞受到广泛的注意。壳聚糖通过打开上皮细胞连接区（epithelial tight junctions）而起到渗透增强剂的作用。壳聚糖能增强通过细胞的吸附途径，这对于输送亲水性药物如治疗性的多肽、蛋白质和反义寡核苷酸通过细胞膜很重要。这种渗透增强效应的基本机制可能是高分子的正电荷作用于细胞膜，使连接区相关的蛋白质结构重组。由于壳聚糖在酸性条件下很容易溶解及很强的亲水性，对蛋白质药物的控制释放能力有限。但将壳聚糖和阴离子多糖（如卡拉胶、海藻酸钠等）溶液混合时，多糖的阴离子和壳聚糖的氨基发生离子相互作用形成高分子电解质复合物，壳聚糖在低pH时易溶解的性质被该条件下阴离子胶体网络抑制，而在高pH时，阴离子多糖的溶解作用又被该条件下不溶的壳聚糖抑制。这种复合作用可以制备壳聚糖-阴离子多糖凝聚物的药物载体。
当前，以壳聚糖与阴离子多糖的静电复合物作为口服蛋白质药物或其他活性成分的载体的制备技术主要是采用将两种溶液混合搅拌的方法制备复合载体粒子，该方法的缺陷是制得的粒子粒径较大（微米以上），粒径分布范围极广，粒子形状不规则，从而限制了蛋白质药物的释放。
发明内容
本发明目的在于提供一种壳聚糖与其他天然阴离子多糖形成的静电复合物纳米微球载体，该载体平均粒不超过300nm，粒径分布高度均一，该载体可用于口服蛋白质药物、基因药物、食品天然活性产物的肠道靶向输送。
本发明采用一种安全低毒的食品级水/油微乳液体系制备多糖复合纳米微球。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：发明提供了一种微乳液制备壳聚糖-阴离子多糖复合物纳米微球的方法，采用水/油微乳液中壳聚糖和阴离子多糖之间以静电相互作用形成复合多糖纳米微球，先制备壳聚糖微乳液和阴离子多糖微乳液，再将壳聚糖微乳液和阴离子多糖微乳液混合搅拌制得，其中壳聚糖微乳液的油相为柠檬烯。
所述的多糖微乳液为油相-乳化剂混合相，所述乳化剂为Tween60。
所述的壳聚糖微乳液中还包括助乳化剂，所述助乳化剂为高级醇。优选地，所述的高级醇为乙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇中的一种或几种。
所述的阴离子多糖为海藻酸钠、卡拉胶、低甲氧基果胶中的一种或多种。优选食品级的原料。
优选地，所述的壳聚糖的脱乙酰度＞90％。可以是高度脱乙酰化（脱乙酰度＞90％）的食品级壳聚糖。
本发明所提供的方法包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖溶液：将壳聚糖溶解在pH2～3的酸（优选醋酸或盐酸）溶液中，再调节将pH值至4～5，过滤除掉不溶性的杂质；作为一种优选的方案，此步骤中还可以进一步包括：在壳聚糖溶液中添加钙离子，钙离子在溶液中的终浓度为0.01molL-1～0.2molL-1；优选添加氯化钙；
（2）制备阴离子多糖溶液：将阴离子多糖分散在水中，加热搅拌至完全溶解后，调pH值至4～5，过滤除去不溶性杂质；
（3）制备油相-乳化剂混合相：将柠檬烯和助乳化剂混合获得油相，然后加入乳化剂，制成油相-乳化剂混合相；
（4）分别制备壳聚糖微乳液和阴离子多糖微乳液：将步骤（1）的壳聚糖溶液在搅拌的同时滴入油相-乳化剂混合相中获得壳聚糖微乳液；将步骤（2）的阴离子多糖溶液在搅拌的同时滴入油相-乳化剂混合相中获得阴离子多糖微乳液。
（5）将步骤（4）所得的壳聚糖微乳液和阴离子多糖溶液混合，搅拌，离心后获得纳米粒子。
优选地，步骤（3）所述油相中柠檬烯:助乳化剂的质量比为1:3~3:1，油相和乳化剂的质量比分别为3:7~7:3；壳聚糖溶液和非水相（油相-乳化剂混合相）的质量比为0.1:10~1.5:10，阴离子多糖溶液和非水相（油相-乳化剂混合相）的质量比为0.1:10~1.5:10。
更优选地，油相中柠檬烯与助乳化剂的质量比为1:1~2:1；油相和乳化剂的质量比为45:40~45:55。优选地，壳聚糖溶液和非水相（油相-乳化剂混合相）的质量比为0.5:10~1.0:10，阴离子多糖溶液和非水相（油相-乳化剂混合相）的质量比为0.5:10~1.0:10。
优选地，在上述的步骤（1）中所述的壳聚糖溶液的质量分数为0.05%～0.5%；步骤（2）中所述的阴离子多糖溶液的质量分数为0.05%～0.5%%。
优选地，步骤（5）所述的离心条件为8,000g～15,000g，离心时间20～40min。
离心获得纳米粒子之后，优选进一步以乙醇清洗柠檬烯和乳化剂，离心除去乙醇，干燥后即得纳米微球。
作为一种优选的方案，本发明还可以采用其他辅料，如丙二醇、山梨醇、甘油和氯化钙。丙二醇、山梨醇、甘油作为辅料，可溶解在阴离子多糖水溶液中和壳聚糖溶液中；它们在多糖溶液中最终的浓度范围分别是0～40%、0～1%、0～20%。氯化钙只能溶解在壳聚糖溶液中，浓度为0.01molL-1～0.2molL-1。
作为一种优选的方案，本发明采用以下方法制备纳米微球：
（1）壳聚糖溶液的制备：将壳聚糖溶解在稀酸溶液（醋酸溶液、盐酸溶液等）中，用氢氧化钠溶液将其pH调到4～5，过滤除掉不溶性的杂质。
（2）阴离子多糖溶液的制备：将阴离子多糖分散在水中，加热到80℃左右，搅拌至完全溶解后，调pH到4～5，过滤除去不溶性杂质。
（3）多糖微乳液的制备：将柠檬烯和高级醇按照一定质量比例混合，然后加入Tween 60，制成油相-乳化剂混合相，将上述制备的多糖溶液滴入混合相中，边滴边搅拌，以混合溶液不出现肉眼可见的混浊和絮凝物为度，分别制成壳聚糖微乳液和阴离子多糖微乳液。
（4）纳米微球的制备：将制得的壳聚糖微乳液和阴离子多糖微乳液溶液混合，搅拌，高速离心后分离出纳米粒子，以乙醇清洗柠檬烯和乳化剂，离心除去乙醇，干燥后即得纳米微球。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用水/油微乳液中壳聚糖和阴离子多糖之间以静电相互作用形成复合多糖纳米微球，更具体地说，先制备壳聚糖微乳液和阴离子多糖微乳液，再将壳聚糖微乳液与阴离子多糖微乳液混合搅拌制得，其中壳聚糖微乳液的油相为柠檬烯。
本发明采用天然的多糖材料制备高分子纳米微球，制备过程依据多糖之间的静电相互作用，不添加化学交联剂，克服了化学聚合反应的副产物对人体的伤害及合成材料与人体的不相容性。本发明采用对人体安全的柠檬烯和Tween 60作为油相和乳化剂相制备W/O微乳液，多糖溶液的混合是在纳米纬度的微水相环境中进行的，混合后制得多糖复合纳米微球粒径不超过300nm，微球粒径分布高度均一，克服了直接将多糖溶液在剧烈搅拌的情况下混合导致的微球粒径大、粒径分布大小不均的缺陷。该载体可用于口服蛋白质药物、基因药物、食品天然活性产物的肠道靶向输送。
附图说明
图1为实施例4制得的复合多糖纳米微球的电镜照片。
具体实施方式：
为了能够更清楚地理解本发明的内容，特举以下实例详细说明。本实例仅作为解释理解本发明的目的。
实施例1
将柠檬烯和正丁醇的混合液（柠檬烯:正丁醇＝2:1）与Tween 60以质量比4：6的比例混合，分别取混合液两份(每份10g)，其中一份滴加0.1％的壳聚糖溶液（pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液；另一份滴加0.1％的卡拉胶溶液（pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液。将两种微乳液混合，搅拌30min，高速离心分离，收集离心沉淀物，用乙醇超声分散后离心，收集沉淀物，50℃真空干燥后即得纳米微球。利用激光粒度仪测定其平均粒径500nm，PDI为0.3。
实施例2
将柠檬烯和正丁醇的混合液（柠檬烯:正丁醇＝2:1）与Tween 60以质量比1:1的比例混合，分别取混合液两份(每份10g)，其中一份滴加0.1％的壳聚糖溶液（pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液；另一份滴加0.1％的海藻酸钠溶液（pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液。将两种微乳液混合，搅拌30min，然后加入2 ml 0.1mol/L的氯化钙溶液，继续搅拌，30min，高速离心分离，收集离心沉淀物，用乙醇超声分散后离心，收集沉淀物，50℃真空干燥后即得纳米微球。利用激光粒度仪测定其平均粒径300nm，PDI为0.25。
实施例3
将柠檬烯和正丁醇的混合液（柠檬烯:正丁醇＝2:1）与Tween 60以质量比1:1的比例混合，分别取混合液两份(每份10g)，其中一份滴加0.1％的壳聚糖溶液（溶液中含有20％的丙二醇，pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液；另一份滴加0.1％的卡拉胶溶液（溶液中含有20％的丙二醇，pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液。将两种微乳液混合，搅拌30min，然后加入2 ml 0.1mol/L的氯化钙溶液，继续搅拌，30min，高速离心分离，收集离心沉淀物，用乙醇超声分散后离心，收集沉淀物，50℃真空干燥后即得纳米微球。利用激光粒度仪测定其平均粒径300nm，PDI为0.34。
实施例4
将柠檬烯和正丁醇的混合液（柠檬烯:正丁醇＝2:1）与Tween 60以质量比45:55的比例混合，分别取混合液两份(每份10g)，其中一份滴加0.1％的壳聚糖溶液（溶液中含有20％的丙二醇、氯化钙0.1molL-1，pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液；另一份滴加0.1％的卡拉胶溶液（溶液中含有20％的丙二醇，pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液。将两种微乳液混合，搅拌30min，高速离心分离，收集离心沉淀物，用乙醇超声分散后离心，收集沉淀物，50℃真空干燥后即得纳米微球。利用激光粒度仪测定其平均粒径250nm，PDI为0.34。
实施例5
将柠檬烯和正丁醇的混合液（柠檬烯:正丁醇＝1:1）与Tween 60以质量比1:1的比例混合，分别取混合液两份(每份10g)，其中一份滴加0.1％的壳聚糖溶液（溶液中含有5％的丙三醇、氯化钙0.1molL-1，pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液；另一份滴加0.1％的海藻酸钠（溶液中含有20％的丙三醇，pH5.0）1g，搅拌后形成微乳液。将两种微乳液混合，搅拌30min，高速离心分离，收集离心沉淀物，用乙醇超声分散后离心，收集沉淀物，50℃真空干燥后即得纳米微球。利用激光粒度仪测定其平均粒径450nm，PDI为0.4。
Claims (9)
1.一种微乳液制备壳聚糖-阴离子多糖复合物纳米微球的方法，其特征在于，制备壳聚糖微乳液和阴离子多糖微乳液，并将两者混合搅拌制得，其中壳聚糖微乳液和/或阴离子多糖微乳液中的油相为柠檬烯；所述的阴离子多糖微乳液为油相-乳化剂-多糖溶液三相，所述乳化剂为Tween60。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的壳聚糖微乳液中还包括助乳化剂，所述助乳化剂为乙醇、正丁醇、正己醇、正辛醇中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的阴离子多糖为海藻酸钠、卡拉胶、低甲氧基果胶中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的壳聚糖的脱乙酰度＞90％。
5.如权利要求1-4任一权利要求所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备壳聚糖溶液：将壳聚糖溶解在pH2~3的盐酸或醋酸溶液中，再调节将pH值至4～5，过滤除掉不溶性的杂质；
（2）制备阴离子多糖溶液：将阴离子多糖分散在水中，加热搅拌至完全溶解后，调pH值至4～5，过滤除去不溶性杂质；
（3）制备油相-乳化剂混合相：将柠檬烯和助乳化剂混合获得油相，然后加入乳化剂，制成油相-乳化剂混合相；
（4）分别制备壳聚糖微乳液和阴离子多糖微乳液：将步骤（1）的壳聚糖溶液在搅拌的同时滴入油相-乳化剂混合相中获得壳聚糖微乳液；将步骤（2）的阴离子多糖溶液在搅拌的同时滴入油相-乳化剂混合相中获得阴离子多糖微乳液；
（5）将步骤（4）所得的壳聚糖微乳液和阴离子多糖溶液混合，搅拌，离心后获得纳米粒子。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述油相中柠檬烯与助乳化剂的质量比为1:3~3:1，油相和乳化剂的质量比为3:7~7:3；壳聚糖溶液和油相-乳化剂混合相的质量比为0.1:10~1.5:10，阴离子多糖溶液和油相-乳化剂混合相的质量比为0.1:10~1.5:10。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖溶液的质量分数为0.05～0.5%；所述的阴离子多糖溶液的质量分数为0.05～0.5%。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的离心条件为8,000g～15,000g，离心时间20～40min。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的油相中柠檬烯与助乳化剂的质量比为1:1~2:1；油相和乳化剂的质量比为45:40~45:55。
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