CN104824787A - 一种包封溶菌酶的脂质体及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包封溶菌酶的脂质体，由以下组份组成：大豆卵磷脂、胆固醇、溶菌酶、缓冲液，其中，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2-5:1，大豆卵磷脂与溶菌酶的质量比为10-50:1，溶菌酶与缓冲液的固液比（mg/ml）为0.1-0.6:1。本发明还公开了一种包封溶菌酶的脂质体的制备工艺。本发明的包封溶菌酶的脂质体及制备方法，通过采用逆向蒸发法制备溶菌酶脂质体，并采用水浴超声仪进行超声处理，直至为稳定的体系，该方法可显著提高溶菌酶脂质体的稳定性，通过调整确定了脂质成分及缓冲液的比例，经过磁力搅拌、超声及旋转蒸发等工艺步骤，可有效的控制脂质体的粒径，提高包封率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种包封溶菌酶的脂质体及制备方法。
背景技术
脂质体是一种人工膜，在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25-1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。
溶菌酶，又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。还可作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效。但是在潮湿、阳光、高温等条件下，溶菌酶的生物活性容易被破坏，在非保护状态下生物利用率不高，针对以上溶菌酶在实际利用当中出现的问题，有必要对溶菌酶进行包埋并制备溶菌酶脂质体，提高它的生物利用度，延长溶菌酶的寿命，有效地保持其活性，可广泛用于食品、保健品和药品中。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种包封溶菌酶的脂质体及制备方法。具体技术方案如下：
一种包封溶菌酶的脂质体，由以下组份组成：大豆卵磷脂、胆固醇、溶菌酶、缓冲液，其中，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2-5:1，大豆卵磷脂与溶菌酶的质量比为10-50:1，溶菌酶与缓冲液的固液比（mg/mL）为0.1-0.6:1。
进一步的，所述胆固醇为蛋白胆固醇、血清胆固醇、蛋黄胆固醇或胆囊胆固醇中的任一种。
进一步的，所述缓冲液为PH=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
进一步的，所述缓冲液为0.2mol/L的Na2HPO4溶液与0.2mol/L的NaH2PO4溶液按0.9-1:1体积比混合制得。
一种包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，采用如下步骤：
1）将大豆卵磷脂与胆固醇按质量比2-5：1的比例溶解在有机溶剂中得溶液A，其中，固液比（mg/mL）为16:1；
2）将溶菌酶溶于PH=6.8的磷酸盐缓冲溶液中得溶液B，其中，固液比（mg/mL）为1-4:1；
3）将A液和B液混合，先后经磁力搅拌及水浴超声仪超声处理，使混合液变成澄清的单相，再将混合液置于旋转蒸发仪中减压蒸发直至形成一层脂质薄膜；
4）向脂质薄膜中加入磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C；
5）将溶液C过滤膜，超声，放4℃冰箱中保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
进一步的，步骤1）中所述的有机溶剂为乙醚与三氯甲烷的混合溶剂，所述乙醚与三氯甲烷的体积比为1-2:1。
进一步的，步骤3）中磁力搅拌时间为30-55分钟，水浴超声仪在功率100Hz的条件下，超声7-12分钟。
进一步的，步骤3）中减压蒸发真空度为0.06-0.1Mpa。
进一步的，步骤5）中所述的滤膜孔径为0.45μm，超声时间为13-17分钟。
进一步的，所述磷酸盐缓冲溶液为0.2mol/L的Na2HPO4溶液与0.2mol/L的NaH2PO4溶液按0.9-1:1体积比混合制得。
本发明的有益效果是：
本发明的包封溶菌酶的脂质体及制备方法，通过采用逆向蒸发法制备溶菌酶脂质体，并采用水浴超声仪进行超声处理，直至为稳定的体系，该方法可显著提高溶菌酶脂质体的稳定性，通过调整确定了脂质成分及缓冲液的比例，经过磁力搅拌、超声及旋转蒸发等工艺步骤，可有效的控制脂质体的粒径，提高包封率；本发明溶菌酶脂质体开拓了脂质体的应用范围，运用脂质体作为载体包埋溶菌酶，其制备工艺简单，设备要求较低，便于推广应用，可产业化生产。
附图说明
图1是本发明的溶菌酶脂质体的粒径示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明予以进一步详述。
实施例1
将192mg大豆卵磷脂和48mg胆固醇溶于含有6mL三氯甲烷和9mL乙醚的混合溶液中得A液，将8mg溶菌酶溶于4mL磷酸盐缓冲溶液中得B液，将A液和B液两种溶液混合，先磁力搅拌40min，然后在水浴超声仪频率为100Hz的条件下超声10min，再磁力搅拌10min，使混合液变成澄清的单相；在37℃的水浴，0.09 Mpa的真空压下，将混合溶液旋转蒸发直至形成一层脂质薄膜；向脂质薄膜中加入30mL磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C；将溶液C过0.45μm滤膜，滤液超声15min，置于4℃冰箱保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
磷酸盐缓冲液的配置：
0.2mol/L的Na2HPO4溶液：称取磷酸氢二钠71.64g，加蒸馏水溶解并定容到1000mL。
0.2mol/L的NaH2PO4溶液：称取磷酸二氢钠31.21g，加蒸馏水溶解并定容到1000mL。
将上述两溶液分别装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时两溶液各按不同比例混合，即可得到所需pH的缓冲液。
将0.2mol/L的Na2HPO4溶液、0.2mol/L的NaH2PO4溶液按0.9-1：1体积混合，即得到pH为6.8的磷酸盐缓冲液。
实施例2
将160mg大豆卵磷脂和80mg胆固醇溶于含有6mL三氯甲烷和9mL乙醚的混合溶液中得A液，将12mg溶菌酶溶于4mL磷酸盐缓冲溶液中得B液，将A液和B液两种溶液混合，先磁力搅拌40min，然后在水浴超声仪频率为100Hz的条件下超声10min，再磁力搅拌10min，使混合液变成澄清的单相；在37℃的水浴，0.09 Mpa的真空压下，将混合溶液旋转蒸发直至形成一层脂质薄膜；向脂质薄膜中加入30mL磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C；将溶液C过0.45μm滤膜，滤液超声15min，置于4℃冰箱保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
磷酸盐缓冲液的配置同实例1。
实施例3
将200mg大豆卵磷脂和40mg胆固醇溶于含有6mL三氯甲烷和9mL乙醚的混合溶液中得A液，将16mg溶菌酶溶于4mL磷酸盐缓冲溶液中得B液，将A液和B液两种溶液混合，先磁力搅拌40min，然后在水浴超声仪频率为100Hz的条件下超声10min，再磁力搅拌10min，使混合液变成澄清的单相；在37℃的水浴，0.09 Mpa的真空压下，将混合溶液旋转蒸发直至形成一层脂质薄膜；向脂质薄膜中加入30ml磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C；将溶液C过0.45μm滤膜，滤液超声15min，置于4℃冰箱保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
磷酸盐缓冲液的配置同实例1。
如图1所示溶菌酶脂质体的粒径，从图中可以看出，曲线圆滑，曲线的范围在200nm左右，说明采用该制备方法制得的溶菌酶脂质体的粒径较小，基本处于纳米级别，粒径小的纳米脂质体能更好的渗透组织、细胞，到达目标发挥作用。
Claims (10)
1.一种包封溶菌酶的脂质体，其特征在于：由以下组份组成：大豆卵磷脂、胆固醇、溶菌酶、缓冲液，其中，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2-5:1，大豆卵磷脂与溶菌酶的质量比为10-50:1，溶菌酶与缓冲液的固液比（mg/mL）为0.1-0.6:1。
2.如权利要求1所述的包封溶菌酶的脂质体，其特征在于：所述胆固醇为蛋白胆固醇、血清胆固醇、蛋黄胆固醇或胆囊胆固醇中的任一种。
3.如权利要求1所述的包封溶菌酶的脂质体，其特征在于：所述缓冲液为PH=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
4.如权利要求3所述的包封溶菌酶的脂质体，其特征在于：所述缓冲液为0.2mol/L的Na2HPO4溶液与0.2mol/L的NaH2PO4溶液按0.9-1:1体积比混合制得。
5.一种包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于：采用如下步骤：
1）将大豆卵磷脂与胆固醇按质量比2-5：1的比例溶解在有机溶剂中得溶液A，其中，固液比（mg/mL）为16:1；
2）将溶菌酶溶于PH=6.8的磷酸盐缓冲溶液中得溶液B，其中，固液比（mg/mL）为1-4:1；
3）将A液和B液混合，先后经磁力搅拌及水浴超声仪超声处理，使混合液变成澄清的单相，再将混合液置于旋转蒸发仪中减压蒸发直至形成一层脂质薄膜；
4）向脂质薄膜中加入磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C；
5）将溶液C过滤膜，超声，放4℃冰箱中保存，即得包封溶菌酶的脂质体。
6.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于：步骤1）中所述的有机溶剂为乙醚与三氯甲烷的混合溶剂，所述乙醚与三氯甲烷的体积比为1-2:1。
7.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于：步骤3）中磁力搅拌时间为30-55分钟，水浴超声仪在功率100Hz的条件下，超声7-12分钟。
8.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于：步骤3）中减压蒸发真空度为0.06-0.1Mpa。
9.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于：步骤5）中所述的滤膜孔径为0.45μm，超声时间为13-17分钟。
10.如权利要求5所述的包封溶菌酶的脂质体的制备工艺，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液为0.2mol/L的Na2HPO4溶液与0.2mol/L的NaH2PO4溶液按0.9-1:1体积比混合制得。
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