CN103610642A

CN103610642A - 一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体及制备方法

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Publication number: CN103610642A
Application number: CN201310663590.1A
Authority: CN
Inventors: 骆晓波; 关荣发; 沈海涛; 赵进; 胡颖; 叶兴乾
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103610642B

Abstract

本发明公开了一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体及制备工艺，脂质体由以下组份组成：大豆卵磷脂、胆固醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、缓冲液、吐温-80；本发明制备工艺简单，通过采用逆向蒸发法制备EGCG脂质体，并采用水浴超声仪进行超声处理，直至为稳定的体系，该方法可显著提高EGCG脂质体的稳定性，通过调整脂质成分及缓冲液的比例，经过磁力搅拌、超声及旋转蒸发等工艺步骤，可有效的控制脂质体的粒径，提高包封率；本发明EGCG脂质体开拓了脂质体的应用范围，运用脂质体作为载体包埋EGCG，其制备工艺简单，设备要求较低，便于推广应用，可产业化生产。

Description

一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体及制备方法。

背景技术

脂质体是一种人工膜，在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25-1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。

表没食子儿茶素没食子酸酯 (以下简称EGCG)是绿茶中最有效的抗氧化多酚，具有抗氧化、抗癌、抗突变等活性。抗氧化活性至少是维生素C的100多倍，是维生素E的25倍，能够保护细胞和DNA免受损害，这种损害相信与癌症、心脏疾病和其他重大疾病有关，EGCG的这些功效归结于他们对氧自由基的清除(抗氧化)能力。因EGCG具有较强的抗氧化性，在潮湿、阳光、高温等条件下极易发生氧化、聚合、缩合等反应，在非保护状态下生物利用率不高，针对以上EGCG在实际利用当中出现的问题，有必要对EGCG进行包埋并制备EGCG脂质体，提高它的生物利用度，解决它的生物利用度低、油溶性差等问题。通过脂质材料对EGCG进行包埋，制备EGCG脂质体，提高EGCG稳定性，有利于储存，可广泛用于食品、保健品和药品中。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体及制备方法。

所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体，其特征在于由以下组份组成：大豆卵磷脂、胆固醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、缓冲液、吐温-80，其中，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2-5:1，大豆卵磷脂与表没食子儿茶素没食子酸酯的质量比为2-8:1，表没食子儿茶素没食子酸酯与缓冲液的固液比（mg/ml）为0.1-0.8:1，吐温-80与缓冲液的体积比为0.005-0.015:1。

所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体，其特征在于所述胆固醇为蛋白胆固醇、血清胆固醇、蛋黄胆固醇或胆囊胆固醇中的任一种。

所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体，其特征在于所述缓冲液为PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液。具体为0.2mol/L的Na₂HPO₄溶液与0.2mol/L的NaH₂PO₄溶液按4:1体积比混合。

所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于采用如下步骤：

1）将大豆卵磷脂与胆固醇按质量比2-5：1的比例溶解在有机溶剂中得溶液A，其中，固液比（mg/ml）为8:1；

2）将表没食子儿茶素没食子酸酯溶于PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中得溶液B，其中，固液比（mg/ml）为1-8:1；

3）将A液和B液混合，先后经磁力搅拌及水浴超声仪超声处理，使混合液变成澄清的单相，再将混合液置于旋转蒸发仪中减压蒸发直至形成一层脂质薄膜；

4）向脂质薄膜中加入磷酸盐缓冲溶液及吐温-80，溶解脂质薄膜，得溶液C；

5）将溶液C于室温下静置1-2小时，再依次过滤纸、滤膜，放4℃冰箱中保存，即得包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体。

所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于步骤1）中所述的有机溶剂为乙醚与三氯甲烷的混合溶剂，所述乙醚与三氯甲烷的体积比为1-2:1。

所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于步骤3）中磁力搅拌时间为1-2小时，水浴超声仪在功率100Hz的条件下，超声3-8分钟。

所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于步骤3）中减压蒸发真空度为0.06-0.1Mpa。

所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于步骤5）中所述的滤纸孔径为0.8μm，滤膜孔径为0.45μm。

本发明的有益效果是：

本发明一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体及制备方法，通过采用逆向蒸发法制备EGCG脂质体，并采用水浴超声仪进行超声处理，直至为稳定的体系，该方法可显著提高EGCG脂质体的稳定性，通过调整脂质成分及缓冲液的比例，经过磁力搅拌、超声及旋转蒸发等工艺步骤，可有效的控制脂质体的粒径，提高包封率；本发明EGCG脂质体开拓了脂质体的应用范围，运用脂质体作为载体包埋EGCG，其制备工艺简单，设备要求较低，便于推广应用，可产业化生产。

附图说明

图1为EGCG脂质体保留率随时间变化图；

图2为EGCG脂质体PH随时间变化图；

图3为EGCG脂质体粒径随时间变化图。

具体实施方式

本发明下面结合实施例予以进一步详述。

实施例1

将90mg大豆卵磷脂和30mg胆固醇溶于含有6ml三氯甲烷和9ml乙醚的混合溶液中得A液，将15mgEGCG溶于3ml磷酸盐缓冲溶液中得B液，将A液和B液两种溶液混合，先磁力搅拌1.5h，然后在水浴超声仪频率为100Hz的条件下超声5min，使混合液变成澄清的单相；在40℃的水浴，0.09 Mpa的真空压下，将混合溶液旋转蒸发直至形成一层脂质薄膜；向脂质薄膜中加入300μl吐温-80和30ml磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C；将溶液C于室温下静置2小时，再依次过0.8μm滤纸，0.45μm滤膜，滤液置于4℃冰箱保存，即得包封EGCG的脂质体。

磷酸盐缓冲液的配置：

0.2mol/L的Na₂HPO₄溶液：称取磷酸氢二钠71.64g，加蒸馏水溶解并定容到1000ml。

0.2mol/L的NaH₂PO₄溶液：称取磷酸二氢钠31.21g，加蒸馏水

溶解并定容到1000ml。

将上述两溶液分别装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时两溶液各按不同比例混合，即可得到所需pH的缓冲液。

将0.2mol/L的Na₂HPO₄溶液、0.2mol/L的NaH₂PO₄溶液按4：1体积混合，即得到pH为7.4的磷酸盐缓冲液。

实施例2

将80mg大豆卵磷脂和40mg胆固醇溶于含有6ml三氯甲烷和9ml乙醚的混合溶液中得A液，将18mgEGCG溶于3ml磷酸盐缓冲溶液中得B液，将A液和B液两种溶液混合，先磁力搅拌1.5h，然后在水浴超声仪频率为100Hz的条件下超声5min，使混合液变成澄清的单相；然后在40℃的水浴，0.09 Mpa的真空压下，将混合溶液旋转蒸发直至形成一层脂质薄膜；向脂质薄膜中加入300μl吐温-80和30ml磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C；将溶液C于室温下静置2小时，再依次过0.8μm滤纸，0.45μm滤膜，滤液置于4℃冰箱保存，即得包封EGCG的脂质体。

磷酸盐缓冲液的配置同实施例1。

实施例3

将100mg大豆卵磷脂和20mg胆固醇溶于含有6ml三氯甲烷和9ml乙醚的混合溶液中得A液，将13mgEGCG溶于3ml磷酸盐缓冲溶液中得B液，将A液和B液两种溶液混合，先磁力搅拌1.5h，然后在水浴超声仪频率为100Hz的条件下超声5min，使混合液变成澄清的单相；在40℃的水浴，0.09 Mpa的真空压下，将混合溶液旋转蒸发直至形成一层脂质薄膜；向脂质薄膜中加入300μl吐温-80和30ml磷酸盐缓冲溶液，溶解脂质薄膜，得溶液C；将溶液C于室温下静置2小时，再依次过0.8μm滤纸，0.45μm滤膜，滤液置于4℃冰箱保存，即得包封EGCG的脂质体。

磷酸盐缓冲溶液的配置同实施例1。

实验例

包封率的测定：分别精密吸取上述三个实施例中制得的EGCG脂质体0.5ml和空白脂质体0.5ml于10ml容量瓶中,定容后转移到离心管中，13000 r /min 离心30 min,取上清液，用空白脂质体作为对照组，在255nm处测定其吸光值，代入回归方程，分别测得实施例1、实施例2及实施例3游离EGCG的浓度（ρ游离），重复三次。分别精密吸取上述三个实施例制得的EGCG脂质体0.5ml和空白脂质体0.5ml于10ml容量瓶中，加入4.5ml无水乙醇破乳，再定容至10ml，倒入离心管,漩涡3 min，然后以13000 r /min离心30 min,取上清液，用空白脂质体作为对照组，在255nm处测定其吸光值，带入代入回归方程测得总EGCG的浓度（ρ总），重复三次，包封率测定结果见表1。

包封率计算为：包封率(% ) = (ρ总-ρ游离) /ρ总×100%

表1 EGCG脂质体包封率测定结果

从表1可以看出，采用该制备方法制得的EGCG脂质体的包封率均在92%以上，高的包封率可有效防止EGCG被氧化破坏。

粒径的测量：使用马尔文粒径仪测定脂质体粒径，各参数如下：

槽型: DTS0012一次性比色皿；溶剂: 蒸馏水；温度: 25℃；测量时间: 运行次数: 3；运行时间 (秒): 10；折射率: 溶剂: 1.330。粒径测量结果见表2。

表2 EGCG脂质体粒径测定结果

由表2可知：采用本发明方法制备的EGCG脂质体粒径较小，基本处于纳米级别，即0-100nm之间，粒径小的纳米脂质体能更好的渗透组织、细胞，到达目标发挥作用。

为测定采用本发明制备方法所制得的EGCG脂质体的稳定性能，可通过保留率、PH指标、粒径随时间变化曲线图体现，其中，PH用PH仪测定，用以下公式测定保留率：

是存放之前的EGCG包封率; 是存放t时刻的EGCG包封率；

Figure 2013106635901100002DEST_PATH_IMAGE009

实施例1制备的EGCG脂质体的保留率、PH、粒径等指标一周内变化曲线分别见图1、图2及图3。

图1为EGCG脂质体保留率随时间变化图，由图1可以看出：在7天内，随着存放时间的增加，所得脂质体的保留率有所下降，但幅度很小，保留率的下降幅度约为0.8%,可见所制备的脂质体的包封率稳定性较好。

图2为EGCG脂质体PH随时间变化图，由图2可以看出：在7天内，随着存放时间的增加，所得脂质体的PH变化很小，仅从7.4变化至7.5，可得所制备的脂质体PH稳定性较高。

图3为EGCG脂质体粒径随时间变化图，由图3可以看出：在7天内，随着存放时间的增加，所得脂质体的粒径变化较稳定，变化幅度极小，可得脂质体的粒径稳定性很高。

采用本发明制备方法制得的EGCG脂质体，具有较高的包封率、较小的粒径及较好的稳定性能，包封率可达到92%以上，粒径在0-100nm之间，平均粒径85nm左右，包封率越高越能保护EGCG，防止EGCG被氧化破坏，粒径小的纳米脂质体能更好的渗透组织、细胞，到达目标发挥作用，该方法制备的EGCG脂质体具有较好的储存稳定性，物理化学性能（包封率、粒径、PH）变化均极小，7天之内，保留率变化仅为0.8%,包封EGCG的效果依旧很好；粒径变化约为4nm，几乎无变化，脂质体始终处于纳米级别大小；PH变化仅为0.1，脂质体的酸碱度很稳定；这些都说明制备的脂质体稳定性非常好，可存放较长时间。EGCG脂质体制备过程中除了乙醚、氯仿，其他的制备材料均无毒无害，乙醚及氯仿可在旋转蒸发过程中完全除尽，最后制得的EGCG脂质体完全无毒；除上述有益效果外，该产品药物EGCG可应用在生物、医学、制药等技术领域，EGCG以其广泛的应用备受关注，结合本发明的制备脂质体方法制备新型的EGCG脂质体，不但保留EGCG原始的效果，而且有脂质成分的保护作用，具有更好的稳定性，将更广泛、更深层次地运用在多个领域，由于制备工艺简单，设备要求低，能大规模的进行工业化生产，可创造更高的商业价值。

本发明制备方法步骤明了、思路清晰、无复杂的操作程序、耗时

短、效率高、大大缩短了制备时间，提高了制备的效率；由于该方法具有较稳定的制备过程和结果，不同的时间、不同的地点、不同的人采用本发明方法所制备的EGCG脂质体具有相同的特征，可重复性高，制备过程中采用水浴超声仪进行超声处理，直至为稳定的体系，可有效提高EGCG脂质体的稳定性，另外，通过两次不同孔径的过滤，可很好的除去粒径较大的杂质，保证获得粒径极小的脂质体，也防止了杂质对脂质体的干扰。

Claims

1.一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体，其特征在于由以下组份组成：大豆卵磷脂、胆固醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、缓冲液、吐温-80，其中，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2-5:1，大豆卵磷脂与表没食子儿茶素没食子酸酯的质量比为2-8:1，表没食子儿茶素没食子酸酯与缓冲液的固液比（mg/ml）为0.1-0.8:1，吐温-80与缓冲液的体积比为0.005-0.015:1。

2.根据权利要求1所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体，其特征在于所述胆固醇为蛋白胆固醇、血清胆固醇、蛋黄胆固醇或胆囊胆固醇中的任一种。

3.根据权利要求1所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体，其特征在于所述缓冲液为PH=7.4的磷酸盐缓冲溶液。

4.一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于采用如下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于步骤1）中所述的有机溶剂为乙醚与三氯甲烷的混合溶剂，所述乙醚与三氯甲烷的体积比为1-2:1。

6.根据权利要求4所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于步骤3）中磁力搅拌时间为1-2小时，水浴超声仪在功率100Hz的条件下，超声3-8分钟。

7.根据权利要求4所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于步骤3）中减压蒸发真空度为0.06-0.1Mpa。

8.根据权利要求4所述的一种包封表没食子儿茶素没食子酸酯的脂质体的制备工艺，其特征在于步骤5）中所述的滤纸孔径为0.8μm，滤膜孔径为0.45μm。