CN102204939A - 逆向蒸发法制备石榴皮多酚脂质体的方法 - Google Patents
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Abstract
一种逆向蒸发法制备石榴皮多酚脂质体的方法，采用脂质体对石榴皮多酚进行包埋处理，通过调节大豆卵磷脂与胆固醇的质量比、氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比、磷酸盐缓冲液的pH值制备成包封率高的石榴皮多酚脂质体。经质量评价，所得石榴皮多酚脂质体粒度均匀，具有良好的体外缓释性和稳定性。本发明制备方法操作简单、生产成本低，可应用于石榴皮多酚脂质体的制备。
Description
技术领域
本发明属于食品、药品加工领域中多酚类物质脂质体技术领域，具体涉及以纯化后的石榴皮多酚为原料，逆向蒸发法制备石榴皮多酚脂质体。
背景技术
石榴皮多酚为石榴科植物石榴果皮的主要活性成分，是石榴皮中所含的一类多羟基酚类化合物的总称。其组成成分包括安石榴苷、没食子酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、咖啡酸、芦丁等多种化合物。石榴皮多酚具有抗氧化、清除自由基活性、抗突变和抗肿瘤、防癌、抑菌消炎、抗病毒活性、防治心脑血管疾病、降血脂作用，还具有养肝护肾、调节免疫、抗疲劳等多种药理功能。石榴皮多酚作为一种天然的功能性成分，其应用领域十分广阔，已在医药、食品、保健品、动物饲料和化妆品等领域拥有突出优势。但是，石榴皮多酚稳定性差，易受光、热、氧气、pH等因素影响，极易失去生理活性功能和营养价值，极大地限制了其应用。因此，石榴皮多酚的稳定性及生物利用率成为现在研究的焦点。
脂质体是由磷脂双分子层构成的脂质微囊，粒径可从几十纳米到几微米，分散性和生物相溶性均较为理想。同时，脂质体作为药物或保健食品载体，具有天然无毒及生物可降解性，提高了药物的稳定性，促进药物吸收，延长药物作用时间，对局部病变部位有靶向作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简便、生产成本低、包封率高、产物粒度均匀、稳定性好的石榴皮多酚脂质体的制备方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：用氯仿溶解大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为1～5∶1的混合物，加入浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液，胆固醇与石榴皮多酚的质量比为1∶0.025，氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比为1～5∶1，超声至混合物形成均匀单相体系，蒸除氯仿，用pH值为4.5～8.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体。
上述浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液是由石榴皮干粉末与pH值为6.5的磷酸盐缓冲液配制成。
本发明优选大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2～4∶1，氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲液的体积比为2～4∶1，磷酸盐缓冲液的pH值为5.5～7.5。
本发明最佳选择大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为3.08∶1、氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比为4∶1、磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.17。
本发明采用脂质体对石榴皮多酚进行包埋处理，采用逆向蒸发法制备石榴皮多酚脂质体，并通过响应曲面法优化工艺条件，制备出包封率较高的脂质体，经对制备的脂质体进行质量评价，所制备的石榴皮多酚脂质体质量良好。
附图说明
图1是大豆卵磷脂与胆固醇的质量比、氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比两个因素对石榴皮多酚脂质体包封率的交互作用影响图。
图2是石榴皮多酚脂质体的光学显微镜照片。
图3是石榴皮多酚脂质体透射显微镜照片。
图4是石榴皮多酚脂质体的粒径分布图。
图5是石榴皮多酚脂质体的Zeta电位图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
将大豆卵磷脂308mg、胆固醇100mg置于梨形瓶中，加入10mL氯仿溶解大豆卵磷脂和胆固醇，加入浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液2.5mL，超声5～8分钟，混合物形成均匀单相体系，40℃旋转蒸发除去氯仿，使脂质体在瓶壁成膜，用30mL pH值为6.17的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体，其包封率为54.87％。
本实施例浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液是由石榴皮干粉末与pH值为6.5的磷酸盐缓冲液配制而成。
实施例2
将大豆卵磷脂300mg、胆固醇100mg置于梨形瓶中，加入7.5mL氯仿溶解大豆卵磷脂和胆固醇，加入浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液2.5mL，超声5～8分钟，混合物形成均匀单相体系，40℃旋转蒸发除去氯仿，使脂质体在瓶壁成膜，用30mL pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体，其包封率为53.24％。
本实施例石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的配制方法与实施例1相同。
实施例3
将大豆卵磷脂100mg、胆固醇100mg置于梨形瓶中，加入2.5mL氯仿溶解大豆卵磷脂和胆固醇，加入浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液2.5mL，超声5～8分钟，混合物形成均匀单相体系，40℃旋转蒸发除去氯仿，使脂质体在瓶壁成膜，用30mL pH值为4.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体。
本实施例石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的配制方法与实施例1相同。
实施例4
将大豆卵磷脂500mg、胆固醇100mg置于梨形瓶中，加入12.5mL氯仿溶解大豆卵磷脂和胆固醇，加入浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液2.5mL，超声5～8分钟，混合物形成均匀单相体系，40℃旋转蒸发除去氯仿，使脂质体在瓶壁成膜，用30mL pH值为8.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体。
本实施例石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的配制方法与实施例1相同。
实施例5
将大豆卵磷脂200mg、胆固醇100mg置于梨形瓶中，加入5.0mL氯仿溶解大豆卵磷脂和胆固醇，加入浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液2.5mL，超声5～8分钟，混合物形成均匀单相体系，40℃旋转蒸发除去氯仿，使脂质体在瓶壁成膜，用30mL pH值为5.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体。
本实施例石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的配制方法与实施例1相同。
实施例6
将大豆卵磷脂400mg、胆固醇100mg置于梨形瓶中，加入10.0mL氯仿溶解大豆卵磷脂和胆固醇，加入浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液2.5mL，超声5～8分钟，混合物形成均匀单相体系，40℃旋转蒸发除去氯仿，使脂质体在瓶壁成膜，用30mL pH值为7.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体。
本实施例石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的配制方法与实施例1相同。
为了确定本发明的最佳工艺条件，发明人进行了大量的实验室研究试验，每种试验重复三次，试验结果为三次重复试验的平均值，各种试验情况如下：
实验仪器：XW-80A型漩涡混合器，由海门市其林贝尔仪器有限责任公司提供；3k30超高速低温离心机，由美国Sigma公司提供；TU-1810型紫外可见分光光度计，由北京普析通用仪器有限责任公司提供；NANO-ZS型激光粒度和Zeta电位仪，由英国Malvern公司提供；H-600型透射式电子显微镜，由日本日立公司提供。
1、大豆卵磷脂与胆固醇的质量比对脂质体包封率的影响
向5个25mL梨形瓶中均加入胆固醇100mg、大豆卵磷脂、7.5mL氯仿、2.5mL浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液，大豆卵磷脂与胆固醇的质量比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，超声至混合物形成均匀单相体系，40℃旋转蒸发除去氯仿，使脂质体在瓶壁成膜，用30mL pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体。研究大豆卵磷脂与胆固醇的质量比对脂质体包封率的影响。
制作标准曲线：精确称取石榴皮多酚标准品6.25mg，加入25mL的棕色容量瓶中，用二次蒸馏水定容，配制成质量浓度为250μg/mL的石榴皮多酚标准溶液；精密移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL质量浓度为250μg/mL的石榴皮多酚标准溶液于25mL的棕色容量瓶中，用二次蒸馏水定容，配制成质量浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40μg/mL的石榴皮多酚工作溶液，在最佳波长260nm处用紫外可见分光光度计分别测定石榴皮多酚工作溶液的吸光度值，以石榴皮多酚的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，并进行回归分析，得到线性回归方程：
y＝0.0249x+0.0095
式中x为石榴皮多酚的质量浓度，y为吸光度值，相关系数R2＝0.9997。
高速冷冻离心法测定脂质体包封率：取石榴皮多酚脂质体、空白脂质体溶液各3mL于离心管中，分别加入3mL无水乙醇，置于漩涡混合器中涡旋破乳3分钟，4℃条件下15000转/分钟离心30分钟，取上清液1mL分别置于25mL容量瓶中，用无水乙醇定容，以空白脂质体溶液作为对照，在最佳波长260nm处测定吸光度，代入线性回归方程，得到石榴皮多酚的质量浓度x，经计算，得到总药物量Ct；另取石榴皮多酚脂质体、空白脂质体溶液各3mL于离心管中，4℃条件下15000转/分钟离心30分钟，取上清液1mL定容至25mL容量瓶中，以空白脂质体溶液作为对照，在最佳波长260nm处测定吸光度，代入线性回归方程，得到石榴皮多酚的质量浓度x，经计算，得到游离石榴皮多酚的量Cf。根据下式计算脂质体的包封率：
试验和计算结果见表1。
表1大豆卵磷脂与胆固醇的质量比对脂质体包封率的影响
| 大豆卵磷脂与胆固醇的质量比 | 1∶1 | 2∶1 | 3∶1 | 4∶1 | 5∶1 |
| 包封率(％) | 34.23 | 46.01 | 53.27 | 51.25 | 49.21 |
由表1可见，随着大豆卵磷脂加入比例的增大，包封率逐渐增大，当大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为3∶1时，包封率最大，继续增加大豆卵磷脂的加入比例，脂质体包封率呈减小趋势但相差不大。本发明选择大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为1～5∶1，优选2～4∶1。
2、氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比对脂质体包封率的影响
向5个25mL梨形瓶中均加入胆固醇100mg、大豆卵磷脂300mg、氯仿、2.5mL浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液，氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1时，超声至混合物形成均匀单相体系，40℃旋转蒸发除去氯仿，使脂质体在瓶壁成膜，用30mL pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体。按照试验1中的方法测定包封率，研究氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比对石榴皮多酚脂质体包封率的影响，结果见表2。
表2氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比对脂质体包封率的影响
| 氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比 | 1∶1 | 2∶1 | 3∶1 | 4∶1 | 5∶1 |
| 包封率(％) | 43.27 | 46.28 | 53.29 | 50.12 | 47.2 |
由表2可见，随着氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液体积比的增加，包封率呈现增加的趋势，当氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比增加到3∶1时，包封率最大，继续增加氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比，包封率又逐渐减小。本发明选择氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比为1～5∶1，优选2～4∶1。
3、磷酸盐缓冲液的pH值对脂质体包封率的影响
向5个25mL梨形瓶中均加入胆固醇100mg、大豆卵磷脂300mg、氯仿7.5mL、浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液2.5mL，超声至混合物形成均匀单相体系，40℃旋转蒸发除去氯仿，使脂质体在瓶壁成膜，分别用30mL pH值为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，充分水合，用孔径为0.45μm的滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体。按照试验1中的方法测定包封率，研究磷酸盐缓冲溶液的pH值对石榴皮多酚脂质体包封率的影响。按照试验1中的方法测定包封率，结果见表3。
表3磷酸盐缓冲溶液的pH值对脂质体包封率的影响
| 磷酸盐缓冲溶液的pH值 | 4.5 | 5.5 | 6.5 | 7.5 | 8.5 |
| 包封率(％) | 46.24 | 47.89 | 53.24 | 47.23 | 45.27 |
由表3可见，石榴皮多酚脂质体的包封率随着pH值的增加而增加，当磷酸盐缓冲液的pH值增加到6.5时，包封率最大，之后随着磷酸盐缓冲液pH值的增加包封率反而减小。本发明选择磷酸盐缓冲液的pH值为4.5～8.5，优选5.5～7.5。
4、响应曲面法优化制备石榴皮多酚脂质体的工艺条件
采用统计软件design-expert7.0.0中的响应曲面法，建立三因素三水平的Box-Behnken模型，以大豆卵磷脂与胆固醇的质量比、氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比、磷酸盐缓冲溶液的pH值为影响因素，分别以A、B、C表示，根据试验1～3的实验结果，根据表4设计自变量因素编码及水平，自变量的编码值1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平。工艺条件的优化模型及试验结果见表5。
表4响应曲面设计因素、水平及编码值
表5石榴皮多酚脂质体制备工艺条件优化试验及结果
| 试验号 | A | B | C | 包封率(％) |
| 1 | -1 | -1 | 0 | 39.65 |
| 2 | 0 | 1 | -1 | 54.87 |
| 3 | 1 | 0 | 1 | 45.33 |
| 4 | 0 | 1 | 1 | 53.06 |
| 5 | 0 | 0 | 0 | 53.01 |
| 6 | 1 | -1 | 0 | 47.78 |
| 7 | 0 | -1 | 1 | 47.23 |
| 8 | 1 | 1 | 0 | 48.42 |
| 9 | -1 | 0 | -1 | 42.01 |
| 10 | 0 | -1 | -1 | 49.02 |
| 11 | 0 | 0 | 0 | 52.66 |
| 12 | 0 | 0 | 0 | 52.99 |
| 13 | -1 | 1 | 0 | 46.56 |
| 14 | 0 | 0 | 0 | 50.38 |
| 15 | 0 | 0 | 0 | 51.67 |
| 16 | 1 | 0 | -1 | 47.61 |
| 17 | -1 | 0 | 1 | 40.38 |
对表5试验数据进行回归分析，得到A、B、C三因素的二次多元回归方程：
Y＝52.14+2.57A+2.40B-0.93C-1.57AB-0.16AC-0.05BC-6.88A2+0.34B2-1.43C2对该模型进行方差分析，结果见表6，模型系数显著性检验见表7。
表6制备石榴皮多酚脂质体工艺条件优化试验回归方程方差分析结果
由表6方差分析结果可见，模型P＜0.0001，表明模型极其显著；失拟P为0.6616(＞0.05)，表明模型失拟度不显著；校正决定系数R2 Adj为0.9507说明该模型能解释95.07％响应值的变化；复相关系数R2＝0.9784，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，可用此模型对石榴皮多酚脂质体制备工艺进行分析和预测。
表7石榴皮多酚脂质体制备工艺条件优化试验回归模型系数显著性检验
| 系数项 | 回归系数 | 自由度 | 标准误差 | F值 | P值 | 显著性 |
| A | 2.57 | 1 | 0.36 | 50.90 | 0.0002 | ** |
| B | 2.40 | 1 | 0.36 | 44.62 | 0.0003 | ** |
| C | -0.94 | 1 | 0.36 | 6.80 | 0.0350 | * |
| AB | -1.57 | 1 | 0.51 | 9.48 | 0.0178 | * |
| AC | -0.16 | 1 | 0.51 | 0.10 | 0.7588 | |
| BC | -5.0×10-3 | 1 | 0.51 | 9.65×10-5 | 0.9924 | |
| A2 | -6.88 | 1 | 0.50 | 192.16 | ＜0.0001 | ** |
| B2 | 0.34 | 1 | 0.50 | 0.46 | 0.5193 | |
| C2 | -1.43 | 1 | 0.50 | 8.35 | 0.0233 | * |
注：**差异极显著，P＜0.01；*差异显著，P＜0.05。
由表7回归模型系数显著性检验结果可知，模型中A、B这两个因素对包封率的影响极其显著，且A因素以指数形式影响包封率；C对包封率的影响显著，也以指数形式影响包封率；AB之间的交互作用对包封率影响显著；其余项影响均不显著。在所选的各因素水平范围内，对包封率影响的主次顺序为：A＞B＞C。
本试验中AC、BC之间的交互作用影响不显著，所以不予考虑。AB对包封率的影响显著，当pH值为6.17时，AB对包封率的影响曲面图如图1所示。由图1可见，当大豆卵磷脂与胆固醇的质量比(A)处于低水平或高水平，包封率都随着氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液体积比(B)的升高而增大，且以一次函数形式影响包封率的变化；当氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比处于低水平或是高水平，包封率随着大豆卵磷脂与胆固醇的质量比变化呈二次函数形式变化，当大豆卵磷脂与胆固醇的质量比小于编码值0.08时，包封率随着大豆卵磷脂与胆固醇质量比的升高而增大，当大豆卵磷脂与胆固醇的质量比大于编码值0.08时，包封率随着大豆卵磷脂与胆固醇质量比的升高而减小。
通过软件分析，得到石榴皮多酚脂质体制备的最佳工艺条件为：大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为3.08∶1，氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲液的体积比为4∶1，磷酸盐缓冲液pH值为6.17，在此条件下制备的石榴皮多酚脂质体包封率理论值为55.08％。采用上述优化条件进行实际验证，3次平行试验得出实际的包封率平均值为54.87％，相对误差为0.4％。
为了验证本发明的有益效果，发明人对本发明实施例1制备的石榴皮多酚脂质体进行了质量评价，各种指标如下：
1、石榴皮多酚脂质体外观检验
色泽：淡黄色。
外观：均匀、无沉淀的混悬液。
2、石榴皮多酚脂质体的显微形态结构
a.光学显微镜试验取稀释后的石榴皮多酚脂质体1滴，放于载玻片上，用光学显微镜(×40)观察，结果见图2。
b.透射电子显微镜形态结构鉴定采用负染法：取稀释后的石榴皮多酚脂质体1滴滴在滤纸上的铜网上，晾干，再将铜网放在染液滴(2％的磷钨酸)上染色15分钟，用滤纸从铜网边缘吸干多余染液，晾干，用透射电子显微镜(×10000)观察其粒径大小和形态，结果见图3。
由图2和图3可见，所制备的石榴皮多酚脂质体轮廓清晰，呈椭球形和圆球状，形状比较规整。
3、石榴皮多酚脂质体粒度及Zeta电位测定
将石榴皮多酚脂质体用二次蒸馏水稀释5倍，用0.45μm滤膜过滤，采用激光粒度和Zeta电位仪测定脂质体的粒径大小、粒径分布及电势大小，结果见图4和图5。图4是石榴皮多酚脂质体的粒径分布图，图5是石榴皮多酚脂质体的Zeta电位图。
由图4可见，石榴皮多酚脂质体的粒径呈正态分布，有效粒径为91.13±2.5nm，分散系数(Pdi)为0.613，说明粒径分布均匀。由图5可见，石榴皮多酚脂质体电位为-55.7mV，此电位处于-30～-60mV范围内，说明该脂质体表面带负电荷，且体系比较稳定。
4、石榴皮多酚脂质体体外缓释性
体外缓释性可反映脂质体延缓释放程度的快慢，是评价脂质体性能的重要指标，发明人采用动态膜透析法测定石榴皮多酚脂质体的体外缓释性，具体方法如下：
以pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液为溶剂，分别配制质量浓度为10μg/mL的石榴皮多酚脂质体溶液、质量浓度为10μg/mL的石榴皮多酚溶液。精密移取10mL质量浓度为10μg/mL的石榴皮多酚脂质体溶液，以10mL质量浓度为10μg/mL的石榴皮多酚溶液作为参照，将两种溶液分别加入已处理好的分子量为12000Mwco的透析袋中，将袋口扎紧，悬置于装有250mL pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液中，在37℃水浴中磁力搅拌，分别在搅拌2、4、6、12、20、28、36、44小时时吸取5mL透析液，并及时补充等量新鲜恒温的pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液，用0.45μm滤膜过滤透析液，在最佳波长260nm处测定吸光度，将其值代入回归方程(1)，计算石榴皮多酚释放的总量，累计释放量及缓释率见下式：
W释放＝C1×V1+C2×V2+...Cn-1×Vn-1+Cn×Vn
式中：W释放为累计释放量，C1为第1次取透析液的质量浓度，V1为第1次取透析液的体积，Cn-1为第n-1次取透析液的质量浓度，Vn-1为第n-1次取透析液的体积，Cn为第n次取透析液的浓度，Vn为第n次取透析液的体积，Q为缓释率，W总量为透析前石榴皮多酚的总量。试验结果见表8。
表8石榴皮多酚脂质体与石榴皮多酚缓释率的对比
| 时间(天) | 2 | 4 | 6 | 12 | 20 | 28 | 36 | 44 |
| 石榴皮多酚溶液缓释率(％) | 12 | 48 | 78 | 97.26 | 97.66 | 97.69 | 97.62 | 97.68 |
| 石榴皮多酚脂质体缓释率(％) | 6 | 20 | 39.12 | 55.11 | 69.32 | 87.29 | 96.34 | 97.54 |
由表8可见，石榴皮多酚溶液在12小时之内缓释率达到97.26％，而石榴皮多酚脂质体释放相对比较缓慢，36小时之内缓释率才达到96.34％，44小时后升至97.54％。试验结果说明，石榴皮多酚脂质体具有良好的体外缓释性。
5、石榴皮多酚脂质体的稳定性
在4℃与常温条件下分别将石榴皮多酚脂质体放置0、10、20、30、40、50、60天，测定脂质体包封率的变化。试验结果见表9。
表9石榴皮多酚脂质体在常温和4℃条件下的稳定性
| 时间(天) | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 常温保存包封率(％) | 54 | 40.21 | 28.39 | 15.67 | 8.23 | 4.01 | 1.22 |
| 4℃保存包封率(％) | 54 | 53.89 | 53.01 | 50.33 | 48.21 | 45.1 | 40.28 |
由表9可见，常温下放置的脂质体稳定性很差，随着时间的延长，包封率急剧下降，常温放置60天后被包裹的石榴皮多酚已基本完全渗漏，脂质体出现了不同程度的絮凝和沉淀，且略有发霉现象。而石榴皮多酚脂质体在4℃条件下储存稳定性良好，前20天包封率基本没变化，说明脂质体中的石榴皮多酚在储存的过程中基本没有渗漏，随着时间的延长，包封率呈缓慢下降趋势，4℃储存60天包封率共下降13.72％，外观上脂质体溶液也基本无絮凝和沉淀现象。因此，石榴皮多酚脂质体在温度为4℃的环境中具有良好的稳定性，适合在4℃储存。
Claims (5)
1.一种逆向蒸发法制备石榴皮多酚脂质体的方法，其特征在于：用氯仿溶解大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为1～5∶1的混合物，加入浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液，胆固醇与石榴皮多酚的质量比为1∶0.025，氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比为1～5∶1，超声至混合物形成均匀单相体系，蒸除氯仿，用pH值为4.5～8.5的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，用0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体；
上述浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液是由石榴皮干粉末与pH值为6.5的磷酸盐缓冲液配制成。
2.根据权利要求1所述的逆向蒸发法制备石榴皮多酚脂质体的方法，其特征在于：大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为2～4∶1。
3.根据权利要求1所述的逆向蒸发法制备石榴皮多酚脂质体的方法，其特征在于：氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲液的体积比为2～4∶1。
4.根据权利要求1所述的逆向蒸发法制备石榴皮多酚脂质体的方法，其特征在于：磷酸盐缓冲液的pH值为5.5～7.5。
5.根据权利要求1所述的逆向蒸发法制备石榴皮多酚脂质体的方法，其特征在于：用氯仿溶解大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为3.08∶1的混合物，加入浓度为1mg/mL的石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液，胆固醇与石榴皮多酚的质量比为1∶0.025，氯仿与石榴皮多酚磷酸盐缓冲溶液的体积比为4∶1，超声至混合物形成均匀单相体系，蒸除氯仿，用pH值为6.17的磷酸盐缓冲溶液溶解脂质膜，用0.45μm滤膜过滤，制备成石榴皮多酚脂质体。
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