CN101810674B - 一种用于增强免疫力的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于增强免疫力的中药组合物及其制备方法，其特征是该组合物主要由下列重量份的原料药材制成：破壁灵芝孢子粉100～200重量份，紫苏籽油300～500重量份。本发明药物组合物充分发挥两者的药效，优势互补，组方的药效优于单味药材，不仅能够显著的增强人体免疫能力，还能降低单味药材的毒副作用。并且，本发明组合物可制备得到质量稳定，增强免疫力效果显著的软胶囊制剂。

Description

一种用于增强免疫力的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种增强免疫力的中药组合物及其制备方法。

背景技术

灵芝孢子粉为灵芝成熟时从菌盖弹射的孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质。灵芝孢子经破壁加工后，开发成新的保健药材，它浓缩了灵芝的精华，禀天地生云之气，药效及临床应用效果更有明显提高。

灵芝孢子含有蛋白质、氨基酸类、三萜类、多糖类、腺苷类、甾醇类、生物碱类、脂肪酸类等化学物质。现代药理研究及临床试验证实，灵芝孢子粉比灵芝具有更强更全面的作用，灵芝孢子具有抗染色体突变，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、杀伤癌细胞，拮抗环磷酰胺引起的小鼠耐力下降、血红蛋白与白细胞下降、巨噬细胞吞噬力下降和SGPT升高，抑制⁶⁰Co照射引起的白细胞减少不良反应、激活并提高特异性杀伤细胞(CTL)和非特异性杀伤细胞(NK、LAK)的抗肿瘤作用、增强单核-巨噬细胞吞噬功能，并具有抗脂质过氧化反应等作用。以上总总，显示出灵芝孢子在调节免疫功能等方面的良好应用前景。从而也为“疗虚劳、益气血”，提供了新的客观依据。

紫苏(Perilla frutescens)为唇形科(Labiatae)紫苏属的一年生草本植物，又名苏子、香苏等，具有多种药用和食用功效，在我国已有两千多年的栽培历史，是传统的多用途经济植物，也是国家卫生部首批颁布的既是药品又是食品的60种中药之一。紫苏在我国已有2000多年的栽培历史，主产于江苏、安徽、湖南等地，分布于全国20多个省(自治区、直辖市)，具有极为广泛的资源。

近些年来，紫苏因其特有的活性物质及营养成分，成为一种倍受世界关注的多用途植物，经济价值很高。俄罗斯、日本、韩国、美国、加拿大等国对紫苏属植物进行了大量的商业性栽种，开发出了食用油、药品、淹渍品、饼干等几十种紫苏产品。现代科学研究表明，紫苏是一种极具开发价值的保健资源。

紫苏种子富含油脂，用种子榨出的油，色浅淡似茶油，透明，味道芳香可口，且不含芥酸、胆固醇等有害物质，是一种独特的保健油料作物，近年来备受国内外学者瞩目。从紫苏籽中提取的紫苏油含有丰富的α-亚麻酸，具有降低胆固醇、降血压、提高记忆力、保护视力、增强免疫力、延缓机体衰老，预防老年痴呆症，以及在治疗心脑血管疾病、抗癌、促进大脑发育等方面均有显著作用。

至今为止，寻找一种能有效增强人体免疫力的天然产品组方仍是科学研究的热点，发明人经过反复探索并通过药效实验验证，终于找到具有该种功效的天然产品组方，该组方以破壁灵芝孢子粉、紫苏籽油为主要原料，增强免疫力的疗效比单味药材有显著性提高，并且组合使用能够减少单味药材的毒副作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于增强免疫力的中药组合物。

本发明的另一目的是提供该增强免疫力的中药组合物的制备方法。

一种用于增强免疫力的中药组合物，该组合物主要由下列重量份的原料药制成：破壁灵芝孢子粉100～200重量份，紫苏籽油300～500重量份。所述的破壁灵芝孢子粉可为将灵芝孢子或灵芝孢子粉进行破壁粉碎后得到的破壁灵芝孢子粉，或市售破壁灵芝孢子粉，破壁率95％以上即可。

上述中药组合物优选由下列重量份的原料药制成：破壁灵芝孢子粉120～150重量份，紫苏籽油350～380重量份。

上述中药组合物进一步优选由下列重量份的原料药制成：破壁灵芝孢子粉132重量份，紫苏籽油368重量份。

上述用于增强免疫力的中药组合物的制备方法，其特征是该方法包括下列步骤：取处方量的破壁灵芝孢子粉，加入处方量1/3重量的紫苏籽油，研磨均匀，再逐渐加入剩余量的紫苏籽油，边加边研磨均匀，直至物料粒径在80um以下。优选混悬液中混悬粒子的平均粒径为15～80um，进一步优选平均粒径为15～60um，再进一步优选平均粒径为15～40um，最优选平均粒径为15～25um。

本发明组合物可混合均匀后加入药学上允许的辅料制成药学规定的剂型，优选制成软胶囊制剂。

本发明用于增强免疫力的中药组合物软胶囊由以下组分组成：破壁灵芝孢子粉100～200重量份，紫苏籽油300～500重量份，明胶200～300重量份，甘油70～90重量份，纯化水200～300重量份。

优选按照以下配比：破壁灵芝孢子粉120～150重量份，紫苏籽油350～380重量份，明胶240～280重量份，甘油75～85重量份，纯化水240～280重量份。

最优选配比为：破壁灵芝孢子粉132重量份，紫苏籽油368重量份，明胶250重量份，甘油80重量份，纯化水250重量份。

上述软胶囊是通过下列步骤制备得到的：

先将甘油、纯化水混匀，搅拌加热至60～70℃，缓慢投入明胶，加热至75～85℃，待明胶完全溶解后继续保温搅拌20～30min得到胶液；

取破壁灵芝孢子粉，再加入处方量1/3重量的紫苏籽油，研磨均匀，逐渐加入剩余量的紫苏籽油，边加边研磨均匀，直至物料粒径在80um以下，成为均匀细腻的混悬液；将混悬液与胶液按照常规制备软胶囊的方法制得软胶囊。优选混悬液中混悬粒子的平均粒径为15～80um，进一步优选平均粒径为15～60um，再进一步优选平均粒径为15～40um，最优选平均粒径为15～25um。

上述用于增强免疫力的中药组合物软胶囊的制备方法，其特征是该方法包括下列步骤：

先将上述处方量的甘油、纯化水混匀，搅拌加热至60～70℃，缓慢投入明胶，加热至75～85℃，待明胶完全溶解后继续保温搅拌20～30min得到胶液；

取破壁灵芝孢子粉，再加入处方量1/3重量的紫苏籽油，研磨均匀，逐渐加入剩余量的紫苏籽油，边加边研磨均匀，直至物料粒径在80um以下，成为均匀细腻的混悬液，将混悬液与胶液制软胶囊，即得。优选混悬液中混悬粒子平均粒径为15～80um，进一步优选的平均粒径为15～60um，再进一步优选平均粒径为15～40um，最优选平均粒径为15～25um。

为进一步降低混悬微粒的粒径，上述全部紫苏籽油和破壁灵芝孢子粉研磨均匀后可在胶体磨中进一步进行研磨，采用的研磨条件为：研磨1～5次，每次20～40min；优选采用的研磨条件为：研磨3～5次，每次20～40min。

本发明所述的中药组合物或其软胶囊制剂可在制备增强免疫力的药物中应用。

以下通过实验进一步说明本发明组合物制备工艺条件的筛选过程：

1、破壁粉碎：取灵芝孢子粉置于破壁微粉机进行破壁粉碎，得破壁灵芝孢子粉。

2、为了保证生产过程的顺利进行以及贮存过程软胶囊内容物的混悬状态，处方工艺研究的重点在于：破壁灵芝孢子粉紫苏籽油混悬液的物理性质，包括：混悬粒子的粒径、混悬的稳定性、混悬液的流动性。

各指标的检测方式如下：

①粒径：采用显微镜检的方式考察。取一滴混悬液至载玻片上，在显微镜下观察混悬粒子的平均粒径以及分散的均匀性，此指标主要采用定性方式进行。

②沉降容积比：将配制好的混悬液装入带有刻度的量瓶中，塞住瓶口，振摇20次，静置，记录此时的高度为HO；在不同时间测定沉降物的高度，记为Hu；计算沉降容积比F＝Hu/H0，F值越大，表明沉降越少，混悬剂越稳定。

③再分散性：将已沉降的混悬液，将上述放置7天后的已沉降混悬液，以20r/min的速度，将量筒倒置翻转，记录量筒底沉降物完全分散时需翻转量筒的次数，所需次数越少，表明混悬液易于分散，混悬剂越稳定。

④流动性：将刚制好的混悬液倒入烧杯，用NDJ-1旋转式黏度计以1号转子，60转/min，在常温下测定黏度，连测3次取平均值，黏度越大沉降速度越慢，混悬液越稳定。黏度以厘泊表示。但同时要考虑到，过高的黏度可能会影响混悬液的流动，导致软胶囊内容物难以填充。

以下是处方工艺研究过程中的实例。

处方1

                 R1               R2            R3            R4            R5

破壁灵芝孢子粉   1.0g             2.0g          2.5g          3.0g          4.0g

紫苏籽油         8.4g             8.4g          8.4g          8.4g          8.4g

工艺：取处方量的破壁灵芝孢子粉和紫苏籽油，至研钵中研磨至均匀，考察沉降容积比、再分散性和流动性。

结果：沉降容积比和再分散性的测定结果见表1。

表1破壁灵芝孢子粉和紫苏籽油不同配比条件下的沉降容积比

从沉降容积比和再分散次数的测定结果看，以R4和R5较佳，但是，R5表现出稍黏稠，较难流动，会影响今后混悬液灌装到软胶囊中，因此综合考虑，选择R4的配比左右即可，即：破壁灵芝孢子粉/紫苏籽油两者的比例为1∶2.3～3.2，最优选1∶2.7～2.8(质量∶质量).

处方2

破壁灵芝孢子粉        33g

紫苏籽油              92g

工艺1：取处方量的破壁灵芝孢子粉和紫苏籽油，至研钵中研磨至均匀，考察粒径、沉降容积比、再分散性和流动性。

结果：在研磨过程中发现，放大量后，破壁灵芝孢子粉不易与紫苏籽油混匀。最后得到的混悬液粒径分布范围很大，在10～200um之间居多，沉降容积比为0.85，再分散性不佳，可自由流动，黏度为510mPas。

分析：显微镜下观察到混悬微粒的粒径分布范围很宽，粒子非常不均匀，有极大的粒子，也有极小的粒子。沉积物则较为致密，再分散性不佳，可能是沉降后小粒子插入大粒子中导致的。应该进一步改善工艺，降低混悬微粒的粒径，减少粒径分布范围。

处方3

破壁灵芝孢子粉    33g

紫苏籽油          92g

工艺2：取处方量的破壁灵芝孢子粉，加入处方量的1/3紫苏籽油，首先研磨至均匀糊状，再将剩余量的紫苏籽油逐渐加入，边加边研磨，使成均匀的混悬液。考察粒径、沉降容积比、再分散性和流动性。

结果：显微镜下观察，微粒粒径在80um以下，平均粒径约为40～80um，粒径分布范围明显减少。测定的沉降容积比为0.90，再分散性改善，混悬液可自由流动，黏度为525mPas。

分析：通过改变工艺，首先使用少量的油来分散破壁灵芝孢子粉，可显著改善混悬微粒的粒径和粒径分布，由于粒径较为均匀，所形成的沉降物也较为疏松，沉降容积比大，再分散性好。另外，也可考虑通过胶体磨进一步降低混悬微粒的粒径。

处方4

破壁灵芝孢子粉     132g

紫苏籽油           368g

工艺3：进一步放量进行试验，取处方量的破壁灵芝孢子粉，加入处方量的1/3紫苏籽油，首先研磨至均匀糊状，再将剩余量的紫苏籽油逐渐加入，边加边研磨，使成均匀的混悬液。置胶体磨研磨，分别在研磨前、研磨1次、研磨3次、研磨5次后取少量样品，每次研磨20～40分钟，显微镜考察粒径。研磨5次后的样品测定沉降容积比、再分散性和流动性等指标。

结果：研磨不同次数后混悬微粒的粒径如表2所示。由表可知，采用胶体磨研磨后，混悬微粒的粒径显著降低，粒径分布范围进一步减少。但研磨达到3次以后，粒径已经不再明显改变。

表2  混悬液研磨前后粒径的变化情况

研磨5次后，样品的沉降容积比见表3，再分散性良好，样品可自由流动，黏度为545mPas。

表3  混悬液研磨5次后沉降容积比的测定结果

分析：采用胶体磨研磨可显著改善混悬物的各项指标，其中，混悬微粒粒径小且分布范围窄，这明显有利于提高混悬微粒的物理稳定性，表现在沉降容积比很高，而且在配液结束后8个小时内灌装，样品的沉降非常少，可以保证软胶囊含量的均匀性。样品的再分散性良好，也说明其沉积物不会结块。良好的可流动性也能保证大生产的顺利灌装。

因此，综合考虑，破壁灵芝孢子粉100～200重量份，紫苏籽油300～500重量份为本发明的合适处方，进一步优选破壁灵芝孢子粉120～150重量份，紫苏籽油350～380重量份，两者的最佳处方为破壁灵芝孢子粉132重量份，紫苏籽油368重量份。并且，最优的处方工艺为：取全部破壁灵芝孢子粉，加入按处方1/3重量的紫苏籽油，研磨均匀，再加入剩余量的紫苏籽油，研磨均匀，物料粒径达到80um以下。为进一步降低物料粒径，再转移至胶体磨中，研磨1～5次，每次20～40分钟，使成均匀细腻的混悬液，最优研磨3～5次，物料平均粒径可达到15～25um。

为确定本发明组方配方的合理性，发明人对该组方进行了药效学初步研究，进一步阐述本发明的有益效果。

一、灵芝孢子紫苏籽油软胶囊致突变试验

样品：灵芝孢子紫苏籽油软胶囊(按照实施例1方法制备得到)，人体推荐摄入量为2.0g/人/目(软胶囊内容物、人的体重按60kg计)。破壁灵芝孢子粉，紫苏籽油。

实验动物：上海斯莱克实验动物有限责任公司繁殖的清洁级ICR健康小鼠。

1、小鼠骨髓细胞微核试验

试验方法

选用体重26.4～30.0g ICR种清洁级小鼠70只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为7个组，每组10只，雌雄各半。高剂量首选10000mg/kg，故设10000、2500、625mg/kg·bw 3个剂量组、阴性对照组(玉米油)、阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg·bw)、破壁灵芝孢子粉组625mg/kg·bw，紫苏籽油组625mg/kg·bw。受试样品用玉米油配制，高、中、低剂量组分别含受试样品浓度为500、125、31.25mg/mL，以20mL/kg·bw灌胃，采用30h给受试物法。两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检，每鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞(PCE)，观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计，结果采用Poisson分布U检验进行统计处理。每鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数，并计算嗜多染红细胞与成熟红细胞比值(PCE/RBC)。

试验结果

由表4可见，灵芝孢子紫苏籽油软胶囊的各剂量组微核率与阴性对照组相比无显著性差异(P＞0.05)，而阳性对照组则显著高于阴性对照组(P＜0.01)。未见灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核形成及PCE/RBC比值产生影响。

表4 灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠骨髓细胞微核发生率和PCE/RBC比值的影响

注：“**”与阴性对照组比较P＜0.01。

2、小鼠精子畸形试验

试验方法

选用体重28.3～31.8g ICR种清洁级性成熟雄性小鼠35只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为7组，每组5只。高剂量首选10000mg/kg，故设10000、2500、625mg/kg·bw 3个剂量组、阴性对照组(玉米油)、阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg·bw)、破壁灵芝孢子粉组625mg/kg·bw，紫苏籽油组625mg/kg·bw。受试样品用玉米油配制，高、中、低剂量组分别含受试样品浓度为500、125、31.25mg/mL，以20mL/kg·bw灌胃，每天1次，连续5d。于首次给受试样品后的第35天处死动物，取两侧附睾精子滤液按常规制片、镜检。每鼠计数1000个结构完整的精子，计算精子畸形发生率(以百分率计)，结果采用秩和检验进行统计处理。

试验结果

由表5、表6可见，各剂量组精子畸形率与阴性对照组比较，无显著性差异(P＞0.05)，而阳性对照组小鼠精子畸形率与阴性对照组比较有显著提高(P＜0.01)。因此灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠精子畸形率未产生影响。

表5 灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠精子畸形率的影响

注：“**”与阴性对照组比较P＜0.01。

表6 灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠精子畸形类型及比例的影响

灵芝孢子紫苏籽油软胶囊小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性，小鼠精子畸形试验结果为阴性，且比单味药材毒副作用小。因此，本发明无明显毒副作用，安全可靠。

二、本发明增强免疫力功能的药效实验

样品：灵芝孢子紫苏籽油软胶囊(按照实施例1方法制备得到)，规格：0.50g/粒，性状为棕色油状混悬液。

试验动物及分组：选用上海西普尔-必凯实验动物有限公司繁殖的清洁级BI/F1代健康雄性小鼠200只。

小鼠按体重随机分为5个大组，其中I组小鼠60只，分为6个剂量组，每组10只，进行ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化；II组小鼠60只，分为6个剂量组，每组10只，进行二硝基氟苯诱导小鼠DTH试验；III组小鼠60只，分为6个剂量组，每组10只，进行小鼠碳廓清试验；IV组小鼠60只，分为6个剂量组，每组10只，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验；V组小鼠60只，分为6个剂量组，每组10只，进行NK细胞活性试验。

剂量：灵芝孢子紫苏籽油软胶囊的人体推荐剂量2.0g/人/日(以60kg体重计)，设0.17g/kg·bw、0.33g/kg·bw、1.00g/kg·bw三个剂量组(分别相当于人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍)，另设0g/kg·bw组以食用油代替受试样品。破壁灵芝孢子粉组1g/kg·bw，紫苏籽油组1g/kg·bw。受试样品用食用油配制，低、中、高剂量配制浓度分别为17mg/mL、33mg/mL、100mg/mL，经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试样品，小鼠灌胃量为10mL/kg·bw。连续灌胃1个月后测定各项增强免疫力功能指标。

实验方法：

1、ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验——MTT法：

各剂量组动物连续灌胃1个月后，颈椎脱臼法处死动物，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾脏，制成单个细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1mL RPMI1640完全培养液中，台酚蓝染色计数活细胞数(均在95％以上)，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为3×10⁶个/mL。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μL ConA液，另一孔作为对照，置37℃、5％CO₂培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。将溶解液移入96孔培养板中，用酶标仪在波长570nm下测定各样品管光密度值。

用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。

2、DNFB诱导小鼠迟发型变态反应(DTH)——耳肿胀法：

各剂量组动物连续灌胃1个月后，每鼠用剃毛机将腹部毛剃去，范围约3cm×3cm，用10mg/mL DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏。5日后用10mg/mL DNFB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击，攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm耳片，称重。

用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。

3、小鼠碳廓清试验：

各剂量组动物连续灌胃1个月后，每鼠尾静脉注入4倍稀释的印度墨汁(0.1mL/10g·bw)，待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2min及10min分别从眼内眦静脉丛取血20μL，并将其加到2mL0.1％Na₂CO₃溶液中，用721分光光度计在600nm波长处测光密度值，并取胸腺、肝、脾，利用光密度值、肝重和脾重计算吞噬指数a。另计算胸腺/体比、脾/体比。

以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。

4、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验——半体内法：

各剂量组动物连续灌胃1个月，制备20％(v/v)的鸡红细胞悬液，每只鼠腹腔注射1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死小鼠，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃恒温培养箱孵育30min，然后，于生理盐水中漂洗，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干，封片，光镜下观察。

受试样品组的吞噬百分率或吞噬指数与对照组比较，差异均有显著性，方可判定该项实验结果阳性。

5、NK细胞活性测定——乳酸脱氢酶测定法：

各剂量组动物连续灌胃1个月，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，研磨脾脏，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank’s液及8mL Hank’s液，离心10min(1000r/min)，用含10％小牛血清RPMI1640完全培养液重悬，1％冰乙酸稀释后计数，台酚蓝染色计数活细胞数(均在95％以上)，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。

试验前24h将靶细胞(YAC-1细胞)传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。取YAC-1细胞和脾细胞各100μL(效靶比50∶1)加入U型96孔培养板中，YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培养液各100μL，YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和1％NP40各100μL，上述各项均设三个平行孔，于37℃、5％CO₂培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应10min，每孔加入1mol/L的HCl30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值。

受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，方可判定该项实验结果阳性。

结果判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。

其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定结果中两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核-巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。

结果

1、灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响

经口给予小鼠不同剂量的灵芝孢子紫苏籽油软胶囊1个月后，加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值经方差齐性检验，不满足方差齐性要求，用秩和检验进行统计处理。由表7结果可见，1.00g/kg·bw组加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值显著高于0g/kg·bw组。

表7 灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响

2、灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对DNFB诱导小鼠DTH的影响

经口给予小鼠不同剂量的灵芝孢子紫苏籽油软胶囊1个月后，耳壳增重经方差齐性检验，满足方差齐要求，用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表8结果可见，0.17g/kg·bw、0.33g/kg·bw、1.00g/kg·bw组耳壳增重显著高于0g/kg·bw组。

表8 灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对DNFB诱导小鼠DTH的影响

3、灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠碳廓清能力的影响

经口给予小鼠不同剂量的灵芝孢子紫苏籽油软胶囊1个月后，吞噬指数a经方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表9结果可见，1.00g/kg·bw组碳廓清能力显著高于0g/kg·bw组。

表9 灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠碳廓清能力的影响

6、灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数的影响

经口给予小鼠不同剂量的灵芝孢子紫苏籽油软胶囊1个月后，吞噬指数、吞噬百分率经sin^-1p^1/2(P为吞噬百分率，用小数表示)转化后经方差齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表10结果可见，1.00g/kg·bw组吞噬率及吞噬指数显著高于0g/kg·bw组。

表10 灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率及吞噬指数影响

7、灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠NK细胞活性的影响

经口给予小鼠不同剂量的灵芝孢子紫苏籽油软胶囊1个月，NK细胞活性经sin^-1p^1/2(P为NK细胞活性，用小数表示)转化后进行方差齐性检验，不满足方差齐性要求，用秩和检验进行统计处理。由表11结果可见1.00g/kg·bw组NK细胞活性显著高于0g/kg·bw组。

表11 灵芝孢子紫苏籽油软胶囊对小鼠NK细胞活性的影响

结论

灵芝孢子紫苏籽油软胶囊以0.17g/kg·bw、0.33g/kg·bw、1.00g/kg·bw连续给样1个月，结果显示：

细胞免疫功能：ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验中1.00g/kg·bw组加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值显著高于0g/kg·bw组；DNFB诱导小鼠DTH实验中0.17g/kg·bw、0.33g/kg·bw、1.00g/kg·bw组耳壳增重显著高于0g/kg·bw组。单核-巨噬细胞功能：小鼠碳廓清实验中1.00g/kg·bw组碳廓清能力显著高于0g/kg·bw组；鸡红细胞吞噬实验中1.00g/kg·bw组吞噬率及吞噬指数显著高于0g/kg·bw组。NK细胞活性：小鼠NK细胞活性测定实验中1.00g/kg·bw组NK细胞活性显著高于0g/kg·bw组。

在上述实验过程中，使用本发明组合物的动物饮水摄食正常，外观无异常。

与现有技术比较本发明的有益效果：本发明药物组合物选用一定配比的破壁灵芝孢子粉和紫苏籽油，能增强小鼠淋巴细胞增殖能力及DTH的能力；增强小鼠吞噬细胞吞噬鸡红细胞及碳廓清的能力；提高NK细胞活性。因此，本发明组合物具有增强免疫力的功能，充分发挥两者的药效，优势互补，组方的药效不仅优于单味药材，还能降低单味药材的毒副作用。并且，通过本发明方法可制备得到质量稳定，增强免疫力效果显著的软胶囊制剂。

具体实施方式

以下通过实施例进一步阐述本发明。

灵芝孢子来源于黄山华仁堂药业(饮片)有限公司。紫苏籽油来源于大连瑞芳生化物品有限公司。明胶来源于上海鑫港明胶有限公司，质量符合GB6783-94的要求。甘油来源于嘉里油脂化学工业(上海)有限公司，质量符合中华人民共和国药典2005年版的要求。纯化水质量符合中华人民共和国药典2005年版的要求。破壁灵芝孢子粉为取灵芝孢子置于破壁微粉机进行破壁粉碎，破壁率98％左右。

实施例1

配方：破壁灵芝孢子粉132g；紫苏籽油368g；明胶250g；甘油80g；纯化水250g，制成1000粒。

工艺：

先将配方量的甘油、纯化水倒入化胶罐中，搅拌，加热至65℃左右。将明胶缓慢投入化胶罐中，加热至80℃，待明胶完全溶解后继续保温搅拌约30min制得胶液。

取处方量的破壁灵芝孢子粉，加入122.7g的紫苏籽油，研磨均匀，加入剩余量的紫苏籽油，研磨使均匀；转移至胶体磨中，研磨5次，每次30分钟。使成均匀细腻的混悬液，物料粒径达到15～25um。

将混悬液与胶液按照常规制备软胶囊方法制丸，用酒精为95％食用乙醇洗丸10h，在温度控制在20～30℃，湿度控制在20～40％下干燥，拣丸即得。

软胶囊剂质量考察：取供试品6粒，置升降式崩解仪中，按2005版药典规定测试崩解度。结果如下表所示。

结果：6粒胶囊在1h内完全崩解，符合中国药典2005版对软胶囊的质量要求。

并且按照GB/T 4789.2-2003，GB/T 4789.3-2003，GB/T 4789.4-2003，GB/T 4789.5-2003，GB/T 4789.10-2003，GB/T 4789.11-2003，GB/T 4789.15-2003食品卫生微生物学检验，指标均符合标准。

实施例2

配方：破壁灵芝孢子粉150g；紫苏籽油380g；明胶280g；甘油85g；纯化水240g，制成1000粒。

工艺：

先将配方量的甘油、纯化水倒入化胶罐中，搅拌，加热至70℃。将明胶缓慢投入化胶罐中，加热至85℃，待明胶完全溶解后继续保温搅拌约20min制得胶液。

取处方量的破壁灵芝孢子粉，加入126.7g的紫苏籽油，研磨均匀，加入剩余量的紫苏籽油，研磨使均匀；转移至胶体磨中，研磨3次，每次20分钟，物料粒径达到15～25um。使成均匀细腻的混悬液。

将混悬液与胶液按照常规制备软胶囊方法制丸，用酒精为95％食用乙醇洗丸8h，在温度控制在20～30℃，湿度控制在20～40％下干燥，拣丸，即得。

实施例3

配方：破壁灵芝孢子粉120g；紫苏籽油350g；明胶240g；甘油75g；纯化水280g，制成1000粒。

工艺：

先将配方量的甘油、纯化水倒入化胶罐中，搅拌，加热至60℃。将明胶缓慢投入化胶罐中，加热至75℃，待明胶完全溶解后继续保温搅拌约20min制得胶液。

取处方量的破壁灵芝孢子粉，加入116.7g的紫苏籽油，研磨均匀，加入剩余量的紫苏籽油，研磨使均匀；转移至胶体磨中，研磨4次，每次40分钟，物料粒径达到15～25um。使成均匀细腻的混悬液。

将混悬液与胶液按照常规制备软胶囊方法制丸，用酒精为95％食用乙醇洗丸12h，在温度控制在20～30℃，湿度控制在20～40％下干燥，拣丸工序即得。

实施例4配方：破壁灵芝孢子粉100g；紫苏籽油300g；明胶220g；甘油90g；纯化水300g，制成1000粒。

工艺：

先将配方量的甘油、纯化水倒入化胶罐中，搅拌，加热至65℃。将明胶缓慢投入化胶罐中，加热至80℃，待明胶完全溶解后继续保温搅拌约30min制得胶液。

取处方量的破壁灵芝孢子粉，加入100g的紫苏籽油，研磨均匀，加入剩余量的紫苏籽油，研磨使均匀；转移至胶体磨中，研磨1次，每次25分钟，物料粒径达到40～60um。使成均匀细腻的混悬液。

将混悬液与胶液按照常规制备软胶囊方法制丸，用酒精为95％食用乙醇洗丸16h，在温度控制在20～30℃，湿度控制在20～40％下干燥，拣丸，即得。

实施例5

配方：破壁灵芝孢子粉200g；紫苏籽油500g；明胶300g；甘油70g；纯化水200g，制成1000粒。

工艺：

先将配方量的甘油、纯化水倒入化胶罐中，搅拌，加热至65℃。将明胶缓慢投入化胶罐中，加热至80℃，待明胶完全溶解后继续保温搅拌约25min制得胶液。

取处方量的破壁灵芝孢子粉，加入166.7g的紫苏籽油，研磨均匀，加入剩余量的紫苏籽油，研磨使均匀，物料粒径达到40～80um。使成均匀细腻的混悬液。

将混悬液与胶液按照常规制备软胶囊方法制胶丸，用酒精为95％食用乙醇洗丸10h，在温度控制在20～30℃，湿度控制在20～40％下干燥，拣丸，即得。

Claims (9)

1.一种用于增强免疫力的中药组合物，其特征是该组合物由下列重量份的原料药制成：破壁灵芝孢子粉120～150重量份，紫苏籽油350～380重量份；上述用于增强免疫力的中药组合物是通过以下方法制备得到的：取处方量的破壁灵芝孢子粉，加入处方量1/3重量的紫苏籽油，研磨均匀，再逐渐加入剩余量的紫苏籽油，边加边研磨均匀，直至物料粒径在80μm以下。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征是该组合物由下列重量份的原料药制成：破壁灵芝孢子粉132重量份，紫苏籽油368重量份。

3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征是将破壁灵芝孢子粉和紫苏籽油混合均匀加入药学上允许的辅料制成药学规定的剂型。

4.根据权利要求3所述的中药组合物，其特征是所述的剂型为软胶囊。

5.一种权利要求1所述的用于增强免疫力的中药组合物的制备方法，其特征是该方法包括下列步骤：取破壁灵芝孢子粉，加入处方量1/3重量的紫苏籽油，研磨均匀，再逐渐加入剩余量的紫苏籽油，边加边研磨均匀，直至物料粒径在80μm以下。

6.一种用于增强免疫力的中药组合物软胶囊，其特征是该组合物软胶囊由以下组分组成：破壁灵芝孢子粉100～200重量份，紫苏籽油300～500重量份，明胶200～300重量份，甘油70～90重量份，纯化水200～300重量份；上述用于增强免疫力的中药组合物软胶囊是通过以下方法制备得到的：

先将甘油、纯化水混匀，搅拌加热至60～70℃，缓慢投入明胶，加热至75～85℃，待明胶完全溶解后继续保温搅拌20～30min得到胶液；

取破壁灵芝孢子粉，再加入处方量1/3重量的紫苏籽油，研磨均匀，逐渐加入剩余量的紫苏籽油，边加边研磨均匀，直至物料粒径在80μm以下，成为均匀细腻的混悬液；将混悬液与胶液制软胶囊，即得。

7.一种权利要求6所述的用于增强免疫力的中药组合物软胶囊的制备方法，其特征是该方法包括下列步骤：

先将甘油、纯化水混匀，搅拌加热至60～70℃，缓慢投入明胶，加热至75～85℃，待明胶完全溶解后继续保温搅拌20～30min得到胶液；

取破壁灵芝孢子粉，再加入处方量1/3重量的紫苏籽油，研磨均匀，逐渐加入剩余量的紫苏籽油，边加边研磨均匀，直至物料粒径在80μm以下，成为均匀细腻的混悬液；将混悬液与胶液制软胶囊，即得。

8.根据权利要求7所述的用于增强免疫力的中药组合物软胶囊的制备方法，其特征是将全部破壁灵芝孢子粉和紫苏籽油研磨均匀后，在胶体磨中进一步研磨，采用的研磨条件为：研磨1～5次，每次20～40min。

9.权利要求1所述的中药组合物在制备增强免疫力的药物中的应用。