CN107090430B - 一种裂环烯醚萜苷类复合物的制备及其提高骨髓间充质干细胞活力的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物医学领域,为解决体外培养的骨髓间充质干细胞BMSCs出现细胞形态、代谢、增殖和分化潜能改变,为促进体外培养的BMSCs增殖,并保持其有较好的分化潜能,提供一种裂环烯醚萜苷类复合物的制备及其提高骨髓间充质干细胞活力的应用。由橄榄苦苷、地黄苷A、龙胆苦苷以及常规体外细胞培养的培养基按一定比例混合配制而成。能提高BMSCs增殖能力,有助于短期内扩增获得大量细胞用于移植治疗,且能提高移植细胞在体内的存活率;本发明所述复合物长期作用于BMSCs能够增加细胞抗氧化损伤的能力,促进BMSCs向神经元方向分化,且不改变BMSCs的生物学特征。为BMSCs在医学组织工程学研究中的广泛应用提供了方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,具体涉及一种裂环烯醚萜苷类复合物的制备及其提高骨髓间充质干细胞增殖和分化活力的应用,裂环烯醚萜苷类复合物由橄榄苦苷(Oleuropein,OE)、地黄苷A(Rehmaionoside A)和龙胆苦苷(Gentiopicroside)配制组成。
背景技术
萜类化合物在自然界中种类较多,分布较广,具有广泛的生理活性。其中环烯醚萜类化合物(Iridoids)作为单萜类化合物是臭蚁二醛(Iridodial)的缩醛衍生物[孙宇佳,唐淑含,王姗姗,等. 环烯醚萜类化合物的结构分类及生物活性[J]. 黑龙江科技信息,2014,(2):80.]。环烯醚萜类化合物广泛分布于玄参科、茜草科、唇形科、龙胆科、马鞭科、木犀科等双子叶植物中,目前专业人员已从多种药材中分离鉴定得到1000余种此类化合物[万进,方建国. 环烯醚萜类化合物的研究进展[J]. 医药导报,2006,25(6):530-533.]。
环烯醚萜类化合物的基本母核是环烯醚萜醇(半缩醛结构),其1位醇羟基属于半缩醛羟基(见图1),性质活泼,易于为糖基取代,因此环烯醚萜类化合物多以苷类的形式存在[郑礼胜,刘向前. 环烯醚萜类研究进展[J]. 天然产物研究与开发,2009,21(4):702.]。
橄榄苦苷(Oleuropein,OE)是非毒性苯酚类裂环环烯醚萜苷家族的主要成员,广泛存在于木樨科的木樨榄属、丁香属、女贞属和茉莉属植物中[刘天亮,王玲洁,宋宗辉,等.橄榄苦苷的药理作用及其研究进展[J]. 西南国防医药,2016,26(6):685-687.]。橄榄苦苷的分子式为C25H32O13(见图2),主要从油橄榄树叶中提取,具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤和改善骨质疏松等作用,目前已被逐渐应用于医药、保健食品、化妆品等行业领域。
地黄苷A(Rehmaionoside A)的分子式是C21H32O15(见图3),为地黄中的单体化学成分, 具有滋阴、调节免疫功能等药理活性[王军,于震,李更生,等. 地黄苷A 对“阴虚”及免疫功能低下小鼠的药理作用[J]. 中国药学杂志,2002,37(1):20-22.],可以促使机体分泌造血因子,促进DNA合成和细胞增殖,升高模型小鼠的白细胞数和血小板数及红细胞数,对抗环磷酰胺所致外周白细胞减少,对白细胞减少症模型小鼠具有明显治疗作用[于震,王军,李更生,等. 地黄苷A对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症的影响[J]. 中草药,2001,32(11):1002-1004.]。
龙胆苦苷(Gentiopicroside)的分子式是C16H20O9(见图4),广泛存在于条叶龙胆、龙胆、三花龙胆、坚龙胆等植物中。龙胆苦苷属于环烯醚萜苷类,具有保护肝脏、促进胃排空和肠蠕动、抗氧化、抗炎、兴奋中枢神经系统等药理活性作用 [杨书彬,王承. 龙胆化学成分和药理作用研究进展 [J]. 中医药学报,2005,33(6): 54-56.],可以抑制主动脉弓缩窄术所诱导的心肌肥厚,降低模型组小鼠的心肌细胞横截面积,保护心肌细胞,不同剂量的龙胆苦苷均能减轻小鼠心力衰竭相关指标,且存在一定的剂量-效应相关趋势[王戈,王宁,易蔚,等. 龙胆苦苷对压力负荷致小鼠心肌肥厚的保护作用[J]. 中国动脉硬化杂志,2014,22(10): 981-987.]。
骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞,因具有易分离培养、扩增纯化、便于自体移植等特点,成为医学组织工程理想的种子细胞[贺泽斌,赵云鹤,杨桂姣,等. p53抑制剂对扩增晚期人骨髓间充质干细胞活力的影响[J]. 中国组织工程研究,2015, 19(23): 3616-3620.]。在不同诱导条件下,BMSCs不仅能够分化成为中胚层起源的脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞等,而且还能跨越胚层横向分化成为外胚层起源的神经细胞,是组织工程学重要的工具细胞[李程浩,赵晨,贺婵婷,等. PSMB5 基因过表达促人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化[J]. 神经解剖学杂志,2015, 31(4): 428-432.]。因此,应用BMSCs进行细胞移植治疗已成为生命科学领域的研究热点,并在实验研究和临床应用中取得成功经验。
在组织工程学研究中,需要高浓度BMSCs进行移植接种以保证实验效果。但从体内分离的BMSCs存在数量上的局限性,需经体外扩增后用于移植治疗。然而,在体外扩增培养过程中因各种理化因素的影响,常导致BMSCs出现细胞形态、代谢、增殖和分化潜能的改变,其氧化产物堆积以及生物大分子氧化损伤的累积,可能是导致BMSCs功能损伤的重要原因。如何在体外扩增中最大限度地维持BMSCs活力,是BMSCs应用领域中亟待解决的核心问题。
发明内容
本发明为了解决体外培养的骨髓间充质干细胞BMSCs出现细胞形态、代谢、增殖和分化潜能改变,为了促进体外培养的BMSCs增殖,并保持其有较好的分化潜能,提供了一种裂环烯醚萜苷类复合物的制备及其提高骨髓间充质干细胞活力的应用。
本发明由如下技术方案实现的:一种裂环烯醚萜苷类复合物,所述裂环烯醚萜苷类复合物由5~80μM的橄榄苦苷、10μM的地黄苷A、50μM的龙胆苦苷以及常规体外细胞培养的培养基混合配制而成;
制备方法为:首先配制含橄榄苦苷和地黄苷A的复合物A储液;其次用高糖型DMEM粉配制含龙胆苦苷的复合物B;采用无菌胎牛血清原液、复合物A储液和复合物B混合制备裂环烯醚萜苷类复合物;具体步骤为:
(1)制备复合物A储液:依据表1所示,精密称取橄榄苦苷和地黄苷A于10mL DMSO中,超声溶解仪加热超声溶解,加热温度为50℃,超声功率300W,工作5s,间隔停5s,共超声5次,得到复合物A溶液;将复合物A溶液用0.22μm孔径滤器过滤、分装;置4℃冰箱密封避光保存备用,此为复合物A储液;
表1:复合物A储液的配制方案
(2)制备复合物B:取高糖型DMEM培养基粉1袋,13.5g,对应体积为1L,倒入无菌烧杯中;精密称取0.0178g龙胆苦苷和2.5g NaHCO3,然后加入18.25兆欧超纯水至800mL;放入磁力棒,于磁力搅拌器上搅拌混匀,然后加入L-谷氨酰胺1mL和20万U/mL的青霉素和链霉素各0.5mL;用浓盐酸和NaHCO3边搅拌边调节pH值,调节pH值至7.0;用18.25兆欧超纯水定容至899mL,即得到含龙胆苦苷的基础培养基;0.22μM孔径滤器过滤后置4℃冰箱保存,此为复合物B;
(3)制备裂环烯醚萜苷类复合物:以总混合物的总体积为计算基准,在复合物B里加入10%无菌胎牛血清原液和0.1%复合物A储液,即加入量为每899mL复合物B中加入100mL无菌胎牛血清原液和1mL复合物A储液;用10mL的电动移液器反复抽吸混匀即可。
优选配比为:所述裂环烯醚萜苷类复合物由20μM的橄榄苦苷、10μM的地黄苷A、50μM的龙胆苦苷以及常规体外细胞培养的培养基混合配制而成;
制备方法为:首先配制含橄榄苦苷和地黄苷A的复合物A储液;其次用高糖型DMEM粉配制含龙胆苦苷的复合物B;采用无菌胎牛血清原液、复合物A储液和复合物B混合制备裂环烯醚萜苷类复合物;具体步骤为:
(1)制备复合物A储液:精密称取0.108g橄榄苦苷和0.053g地黄苷A于10mL DMSO中,超声溶解仪加热超声溶解,加热温度为50℃,超声功率300W,工作5s,间隔停5s,共超声5次,得到复合物A溶液;将复合物A溶液用0.22μm孔径滤器过滤、分装;置4℃冰箱密封避光保存备用,此为复合物A储液;
(2)制备复合物B:取高糖型DMEM培养基粉1袋,13.5g,对应体积为1L,倒入无菌烧杯中;精密称取0.0178g龙胆苦苷和2.5g NaHCO3加入,然后加入18.25兆欧超纯水至800mL;放入磁力棒,于磁力搅拌器上搅拌混匀,然后加入L-谷氨酰胺1mL和20万U/mL的青霉素和链霉素各0.5mL;用浓盐酸和NaHCO3边搅拌边调节pH值至7.0;18.25兆欧超纯水定容至899mL,即得到含龙胆苦苷的基础培养基;0.22μM孔径滤器过滤后置4℃冰箱保存,此为复合物B;
(3)制备裂环烯醚萜苷类复合物:以总混合物的总体积为计算基准,在复合物B里加入10%无菌胎牛血清原液和0.1%复合物A储液,即加入量为每899mL复合物B中加入100mL无菌胎牛血清原液和1mL复合物A储液;用10mL的电动移液器反复抽吸混匀即可。
所述裂环烯醚萜苷类复合物具体应用方法为:在所述裂环烯醚萜苷类复合物中接种BMSCs,每隔2天换液一次,待BMSCs生长达80%融合时即进行传代,细胞扩增培养10代后进行BMSCs增殖、抗氧化损伤、分化能力以及体内移植后存活能力的检测,并检测所述裂环烯醚萜苷类复合物对BMSCs生物学特征的影响。
本发明所制备的裂环烯醚萜苷类复合物,能够提高体外扩增培养BMSCs的增殖能力、增强BMSCs抗氧化损伤的能力、维持BMSCs多向分化潜能,改善移植BMSCs在体内的存活率。同时,应用该复合物并不改变BMSCs的生物学特征。
本发明用上述三种环烯醚萜类化合物制备的复合物,能够增强BMSCs细胞的抗氧化功能,提高细胞的自我增殖能力,进而维持细胞活力。其基本机制是:橄榄苦苷的药理活性与其结构上的羟基和苷元有关,实验研究结果表明,橄榄苦苷对羟基自由基有一定的清除作用,对超氧自由基有很强的抑制作用,具有良好的抗氧化效果。地黄苷A则能够刺激细胞分泌活性因子,促进DNA合成,提高细胞的增殖能力。龙胆苦苷能够抑制凋亡相关基因的转录,增加细胞的活力,减少细胞凋亡。
本发明具有如下有益效果:应用本发明所述裂环烯醚萜苷类复合物能够有效提高体外培养BMSCs的增殖能力,并保持其有较好的分化潜能,有助于短期内扩增获得大量细胞用于移植治疗,且能够提高移植细胞在体内的存活率;应用本发明所述复合物长期作用于BMSCs能够增加细胞抗氧化损伤的能力,促进BMSCs向神经元方向分化,且不改变BMSCs的生物学特征。为BMSCs在医学组织工程学研究中广泛应用提供了方法。
附图说明
图1为环烯醚萜醇基本结构式;图2为橄榄苦苷的化学结构式;图3为地黄苷A化学结构式;图4为龙胆苦苷化学结构式;图5为本发明所述复合物对BMSCs增殖能力的影响结果图,图中:图5a为不同试剂配方对BMSCs增殖能力的影响;图5b为试剂3持续作用30天BMSCs的生长曲线。图6为试剂3作用后BMSCs内活性氧的检测实验结果。
图7为试剂3作用后对BMSCs生物学特征影响的鉴定实验结果图。图中:图7a为试剂3作用后BMSCs表面标记分子CD44免疫荧光染色,图7b为试剂3作用后BMSCs表面标记分子CD71免疫荧光染色,图7c为试剂3作用后BMSCs表面标记分子CD90免疫荧光染色。
图8为试剂3作用后对BMSCs分化能力影响的检测实验结果图。图中:图8a为早期组BMSC经诱导分化进行早期神经元标记物Tuj1免疫荧光染色检测BMSC分化能力,图8b为对照组BMSC经诱导分化进行早期神经元标记物Tuj1免疫荧光染色检测BMSC分化能力,图8c为试剂3组BMSC经诱导分化进行早期神经元标记物Tuj1免疫荧光染色检测BMSC分化能力;图8d为Tuj1阳性细胞率的统计直方图。
图9为试剂3作用后对BMSCs移植存活能力影响的实验结果图。图中:图9a为应用GFP标记移植细胞检测对照组BMSCs脑内移植7d后的存活数量,图9b为应用GFP标记移植细胞检测试剂3组BMSCs脑内移植7d后的存活数量;图9c为对照组和试剂3组脑内移植存活BMSCs的统计直方图。
具体实施方式
实施例:一种裂环烯醚萜苷类复合物,所述裂环烯醚萜苷类复合物由5~80μM的橄榄苦苷、10μM的地黄苷A、50μM的龙胆苦苷以及常规体外细胞培养的培养基配制而成。常规体外细胞培养的培养基含必要的细胞培养添加物,如血清、NaHCO3等。
制备方法为:首先配制含橄榄苦苷和地黄苷A的复合物A储液;其次用DMEM粉配制含龙胆苦苷的复合物B;采用无菌胎牛血清原液、不同比例(V/V)复合物A储液和复合物B混合制备裂环烯醚萜苷类复合物;具体步骤为:
(1)制备复合物A储液:依据表1所示,精密称取橄榄苦苷和地黄苷A于10mL DMSO中,超声溶解仪加热超声溶解,加热温度为50℃,超声功率300W,工作5s,间隔停5s,共超声5次,得到复合物A溶液;将复合物A溶液用0.22μm孔径滤器过滤、分装;置4℃冰箱密封避光保存备用,此为复合物A储液;
表1:复合物A储液的配制方案
(2)制备复合物B:取DMEM培养基粉1袋,13.5g,对应体积为1L,剪口轻缓倒入倒入无菌烧杯中;精密称取0.0178g龙胆苦苷和2.5g NaHCO3加入,然后加入18.25兆欧超纯水至800mL;放入磁力棒,于磁力搅拌器上搅拌混匀,然后加入L-谷氨酰胺1mL和20万U/mL的青霉素和链霉素各0.5mL;用浓盐酸和NaHCO3边搅拌边调节pH值,调节pH值至7.0;18.25兆欧超纯水定容至899mL,即得到含龙胆苦苷的基础培养基;0.22μM孔径滤器过滤后置4℃冰箱保存,此为复合物B;
(3)制备裂环烯醚萜苷类复合物:以总混合物的总体积为计算基准,在复合物B里加入10%(V/V)无菌胎牛血清原液和0.1%(V/V)复合物A储液,即加入量为每899mL复合物B中加入100mL无菌胎牛血清原液和1mL复合物A储液;用10mL的电动移液器反复抽吸混匀即可。其具体配制方案见表2。
表2 含裂环烯醚萜苷类复合物的完全培养基配制方案
实验例1:本发明所述裂环烯醚萜苷类复合物对BMSCs增殖能力的影响
按0.2×104 cells/well传代接种BMSCs于96孔板,次日将已贴壁的BMSCs分为对照组和试剂1组、试剂2组、试剂3组、试剂4组、试剂5组,每组设至少3个复孔。试剂组为依据表1和表2所述的配制方案制备的裂环烯醚萜苷类复合物,对照组更换为含有与试剂组等体积DMSO的常规培养基10% FBS-DMEM。作用48小时后向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要产生气泡,以免影响OD值),37℃ 5% CO2培养箱孵育2 ~ 4小时,酶标仪测定450nm处的吸光度。结果见图5a。结果显示,试剂3组BMSCs的增殖能力显著高于其他组别,由此确定了裂环烯醚萜苷类复合物的最佳配比为20μM橄榄苦苷、10μM地黄苷A和50μM龙胆苦苷。
按0.2×104 cells/well传代接种BMSCs于96孔板,次日将已贴壁的BMSCs分为对照组和试剂3组。试剂3组为依据表1和表2所述的试剂3组的配制方案制备的裂环烯醚萜苷类复合物,对照组更换为含有与试剂组等体积DMSO的常规培养基10% FBS-DMEM。依此,每隔2天换液一次,每5天传代一次,每次传代后计数的细胞数除以初始细胞数得到一次群体倍增值,持续作用30天累计获得6次群体倍增值。结果见图5b。结果显示,应用试剂3组裂环烯醚萜苷类复合物能够显著提高细胞的累积群体倍增值,增加细胞的增殖能力。
实验例2:本发明所述环烯醚萜苷类化合物复合物对BMSCs内活性氧的检测实验
按6×104 cells/well传代接种BMSCs于6孔板,次日将已贴壁的BMSCs分为对照组和试剂3组。试剂3组为依据表1和表2所述的试剂3组的配制方案制备的裂环烯醚萜苷类复合物,对照组为含有与试剂组等体积DMSO的常规培养基10% FBS-DMEM。依此,每隔2天换液一次,待BMSCs生长达80%融合时即进行传代,作用30天后利用活性氧试剂盒进行检测。结果见图6。结果显示,试剂3组BMSCs活性氧水平较对照组降低30%,说明试剂3组裂环烯醚萜苷类复合物持续作用30天可降低细胞内活性氧的水平,减少活性氧的堆积,从而减轻氧化应激反应对BMSCs的影响,发挥细胞保护作用。
实验例3:本发明所述环烯醚萜苷类化合物复合物对BMSCs生物学特征影响的鉴定实验
试剂3持续作用BMSCs 30天,按0.8×104 cells/well传代接种BMSCs于24孔板,次日贴壁后进行免疫荧光染色,检测CD44、CD71和CD90的表达。结果见图7。结果显示,应用含试剂3培养基持续培养30天,细胞仍然表达BMSCs标志物CD44、CD71和CD90 ( Bar = 100μm )。说明应用试剂3组裂环烯醚萜苷类复合物长期作用于BMSCs并未改变细胞的生物学特征。
实验例4:本发明所述环烯醚萜苷类化合物复合物对BMSCs分化能力影响的检测实验
BMSCs具有向神经元样细胞分化的能力,为验证试剂3对BMSCs分化能力的影响,将早期组、对照组和试剂3组BMSCs依次经1mM β-巯基乙醇(β-ME)诱导24h,35ng/mL视黄酸(RA)诱导3d,生长因子HRG(200ng/mL)、PDGF-AA(5ng/mL)、bFGF(10ng/mL)和Forskolin(5μM)共同诱导3d后,应用免疫荧光染色技术观察Tuj1阳性神经元的数量。结果见图8。结果显示,试剂3组裂环烯醚萜苷类复合物能够维持体外培养BMSCs的分化能力,细胞经诱导后分化为Tuj1阳性神经元数量较对照组增高,与早期BMSCs的分化能力相似(Bar=100μm)。
实验例5:本发明所述环烯醚萜苷类化合物复合物对BMSCs移植存活能力影响的检测实验
按6×104cells/well传代接种BMSCs于6孔板,次日将已贴壁的BMSCs分为对照组和试剂3组。试剂3组为依据表1和表2所述的试剂3组的配制方案制备的裂环烯醚萜苷类复合物,对照组为含有与试剂组等体积DMSO的常规培养基10% FBS-DMEM。依此,每隔2天换液一次,待BMSCs生长达80%融合时即进行传代,作用30天后用GFP慢病毒转染3d标记细胞。然后收集已标记的BMSCs于1×PBS平衡液中,并调整细胞浓度至2×104cells/μL。取3月龄小鼠,3 ~ 5%水合氯醛麻醉后固定于脑立体定位注射仪上,混匀上述标记好的细胞悬液,微量注射器抽取5μL(即1×105cells/侧)缓慢注射入DG区稍上方,双侧均注射,7天后观察针道周围GFP阳性细胞,计数存活细胞的数量。结果见图9。结果显示,试剂3组裂环烯醚萜苷类复合物能够显著提高BMSCs细胞的活力,注射针道周围有大量存活细胞,平均每只小鼠的存活细胞数量是对照组的1.5倍(Bar=100μm)。
Claims (2)
1.一种裂环烯醚萜苷类复合物,其特征在于:所述裂环烯醚萜苷类复合物由20μM的橄榄苦苷、10μM的地黄苷A、50μM的龙胆苦苷以及常规体外细胞培养的培养基混合配制而成;
制备方法为:首先配制含橄榄苦苷和地黄苷A的复合物A储液;其次用高糖型DMEM粉配制含龙胆苦苷的复合物B;采用无菌胎牛血清原液、复合物A储液和复合物B混合制备裂环烯醚萜苷类复合物;具体步骤为:
(1)制备复合物A储液:精密称取0.108g橄榄苦苷和0.053g地黄苷A于10mL DMSO中,超声溶解仪加热超声溶解,加热温度为50℃,超声功率300W,工作5s,间隔停5s,共超声5次,得到复合物A溶液;将复合物A溶液用0.22μm孔径滤器过滤、分装;置4℃冰箱密封避光保存备用,此为复合物A储液;
(2)制备复合物B:取高糖型DMEM培养基粉1袋,13.5g,对应体积为1L,倒入无菌烧杯中;精密称取0.039g龙胆苦苷和2.5g NaHCO3加入,然后加入18.25兆欧超纯水至800mL;放入磁力棒,于磁力搅拌器上搅拌混匀,然后加入L-谷氨酰胺1mL和20万U/mL的青霉素和链霉素各0.5mL;用浓盐酸和NaHCO3边搅拌边调节pH值至7.0;18.25兆欧超纯水定容至899mL,即得到含龙胆苦苷的基础培养基;0.22μM孔径滤器过滤后置4℃冰箱保存,此为复合物B;
(3)制备裂环烯醚萜苷类复合物:以总混合物的总体积为计算基准,在复合物B里加入10%无菌胎牛血清原液和0.1%复合物A储液,即加入量为每899mL复合物B中加入100mL无菌胎牛血清原液和1mL复合物A储液;用10mL的电动移液器反复抽吸混匀即可。
2.根据权利要求1所述的一种裂环烯醚萜苷类复合物,其特征在于:所述裂环烯醚萜苷类复合物具体应用方法为:在所述裂环烯醚萜苷类复合物中接种BMSCs,每隔2天换液一次,待BMSCs生长达80%融合时即进行传代,细胞扩增培养10代后进行BMSCs增殖、抗氧化损伤、分化能力以及体内移植后存活能力的检测,并检测所述裂环烯醚萜苷类复合物对BMSCs生物学特征的影响。
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