CN103421740A

CN103421740A - 一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法

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Publication number: CN103421740A
Application number: CN2013103182666A
Authority: CN
Inventors: 周萱
Original assignee: JIANGSU STEM CELL OSDBIO Co Ltd
Current assignee: JIANGSU STEM CELL OSDBIO Co Ltd
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2013-07-25
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2033-07-25
Also published as: CN103421740B

Abstract

本发明公开了一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，通过将DMEM培养基作为基础培养基，并依次加入L-谷氨酰胺，维生素C，胰岛素，红细胞生成素，然后以氢氧化钠调节pH值，最后加入胎牛血清并过滤除菌，得到新的培养基作为基础，再将细胞进行培养。本发明可明显提高人骨髓间充质干细胞的扩增数量和细胞活性；同时保持生物学效应及多向分化潜能；增强细胞移植修复肌体组织细胞损伤的功效；可以及时有效地为科研和临床所用。

Description

一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，可明显提高细胞扩增数量和细胞活性，增强细胞移植修复肌体组织细胞损伤的功效。

背景技术

人骨髓间充质干细胞作为一种新的用途广泛的种子细胞，既具有增殖能力，又具有多向分化的潜能，在特定的诱导条件下可以分化为骨细胞或软骨细胞、神经元样细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等组织细胞。同时可以分泌多种细胞因子，生长因子和促进造血干细胞增殖、成熟的基质分子；是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。也可在体外培养、诱导和分化，在细胞移植、基因治疗、细胞治疗、组织工程等领域具有广泛的应用前景。

尽管近年来对人骨髓间充质干细胞的研究取得了很大进展，但是分离培养方法的局限性仍然制约着更深一步的研究。目前常用的分离方法有贴壁培养法、密度梯度离心法及流式细胞仪筛选法或免疫磁珠法。①贴壁培养法是根据骨髓间充质干细胞贴壁生长，而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行培养分离，同时利用骨髓间充质干细胞较淋巴细胞、单核细胞易脱落的特点，保证骨髓间充质干细胞在短时间内与培养瓶底分开，从而使骨髓间充质干细胞得到进一步纯化，该法获得的细胞不均一。②密度梯度离心法又分为两种：Ficoll分离液法和Percoll分离液法。贴壁培养法和Ficoll分离液法所获得的干细胞生长较快但纯度过低。而Percoll分离液法所获得的干细胞纯度较好，但生长速度较慢而且可能缺失一部分干细胞。③流式细胞仪筛选法或免疫磁珠法：根据细胞大小不同或者根据细胞表面的一些特殊标志来分离细胞，该方法分选的细胞纯度高，但对细胞的损伤较大，分选后的细胞活力较弱。

国内外大量实验证明，通过长期培养后获得的骨髓间充质干细胞具有非常广泛的分化潜能，形成的终末组织包括脑、视网膜、肝、肠、脾、骨髓、血液、皮肤、软骨等。一方面说明了骨髓间充质干细胞具有跨胚层分化的能力，另一方面说明在适当的培养环境下，骨髓间充质干细胞能诱导向多种细胞分化。培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合。无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁物质的组合置换培养基中的成分，在某些培养方案中，细胞直接进入无血清培养，可以消除来自血清的不均一性。但无血清培养基是有化学限定性的，在培养过程中它仍有变动，培养起始时可能有些物质缺乏，而后细胞的产物可能积累，从而使培养基的成分改变，随着传代次数的增加而使细胞处于负增殖状态。因此，获得充足、安全的骨髓间充质干细胞是研究和应用的前提条件。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，本发明能提高人骨髓间充质干细胞的的扩增效率，同时保持生物学效应及多向分化潜能，可及时准确的为医学科研教学及临床应用提供相关需要的骨髓间充质干细胞。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，包括以下步骤：

步骤1）将DMEM培养基作为基础培养基，并依次调整浓度加入100mg/L-500mg/L的L-谷氨酰胺、15mg/L-150mg/L的维生素C、10mU/L-20mU/L的胰岛素、10U/L-50U/L的红细胞生成素和5μg/L-255μg/L的血管内皮生长因子，然后以氢氧化钠调节PH值，最后加入胎牛血清并过滤除菌，得到新的培养基；

步骤2）收集人骨髓间充质干细胞原代细胞，制成细胞悬液，计细胞数，调整细胞密度后加入培养基，并接种至培养皿中；

步骤3）将培养皿置于37℃、5%的CO2、95%饱和湿度的CO2培养箱中培养；

步骤4）使用倒置相差显微镜观察细胞贴壁及生长状况，在首次传代后24小时首次换液，并在换液后每48小时换液1次；

步骤5）当细胞达80%至90%融合时，使用PBS洗掉非贴壁细胞及杂质，得到贴壁细胞。

进一步的，所述步骤1）中的新的培养基需放入4℃的环境中保存。

进一步的，所述步骤1）中PH值的范围为7.0-7.2。

进一步的，所述步骤2）中原代细胞用胰蛋白酶消化制成细胞悬液。

本发明的有益效果是:

1）本发明中的以DMEM基础培养液作为一般种子细胞生长发育的基本微环境；并加入L-谷氨酰胺、维生素C、胰岛素、红细胞生成素和人基质细胞衍生因子-1等组成成分。

a）L-谷氨酰胺可促进骨髓间充质干细胞发育生长期间核酸和蛋白质的合成。

b）维生素C是体内一种重要的辅酶和抗氧化剂，具有可逆的氧化还原作用，可参与细胞内呼吸链作用，维持组织细胞及器官的正常能量代谢，从而有利于细胞的完整存活和增殖发育；人体由细胞组成，细胞靠细胞间质联系起来，细胞间质的关键成分是胶原蛋白，维生素C参与胶原蛋白的合成，有助于人体创伤的愈合；维生素C可增强血管壁的强度，当体内含量不足，微血管脆性增强容易破裂，引起体内发生疼痛和关节涨痛；维生素C略带酸性，作为微量营养素被摄入体内，经体内溶解、消化，预防动脉硬化，使沉积的粥样斑块溶解；可以保护其它抗氧化剂；阻断亚硝酸盐形成强致癌物，有助于防止癌细胞的扩散；维生素C的抗氧化作用可以抵御自由基对细胞的伤害，防止细胞的变异；维生素C参与人体酶代谢，使双硫键（-S-S）还原为-SH，从而提高相关酶的活性，发挥抗氧化和保证细胞的完整性的作用，保护肝脏的解毒能力和细胞的正常代谢；维生素C可增强中性粒细胞的趋化性和变形能力，提高杀菌能力，并且维生素C还参与免疫球蛋白的合成，进而提高机体的免疫力。

c）胰岛素为一具多种生物学效应的激素，除了调节糖代谢外，胰岛素还促进脂肪的合成、减少脂质降解、促进氨基酸转入细胞；同时它还调节转录、改变mRNA的含量；另外，它还具有刺激增殖、增加DNA的合成和细胞复制的作用。正是由于以上机制，决定了胰岛素无论是生理情况还是病理状态下都对细胞的生长、增殖发挥着重要作用。

d）红细胞生成素可促进骨髓间充质干细胞进入DNA合成期，从而有更多的细胞分裂，产生大量的增殖细胞。

e）人基质细胞衍生因子具有多种生物学功能，参与细胞的形成与发展，调节细胞的迁徙与增值，刺激细胞免疫反应。

本发明方法培养的骨髓间充质干细胞传代后细胞活力强，增殖快，经形态学观察及流式细胞术等检测均符合骨髓间充质干细胞特性。

2）本发明方法简单，可重复性强，操作简便易行，为有关人骨髓间充质干细胞及其应用的科研、教学、临床等能起到不可估量的作用。

3）本发明培养扩增细胞的过程中所添加的细胞营养物质为人体所必须的物质，所得的人骨髓间充质干细胞具有安全性，提高了细胞的稳定性，明显增加了细胞的扩增数量，临床研究效果增强。

4）本发明培养扩增细胞的过程中使用了低浓度胎牛血清，有效的减少细胞自发分化和多次传代后的细胞衰老，在培养过程中可有效的维持细胞转录水平的稳定，为有关人骨髓间充质干细胞及其应用的科研、教学、临床等能起到不可估量的作用。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明与传统培养基的细胞生长曲线图；

图2是使用传统培养基的细胞特征图（10X）；

图3是本发明的细胞特征图（10X）；

图4是本发明的流程图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

参照图4所示，本实施例具体实施方式如下：

1）配制骨髓间充质干细胞培养基，其步骤包括：

a）配置950mlDMEM培养基作为基础培养基；b）再依次分别加入300mgL-谷氨酰胺、50mg维生素C、15mU胰岛素、10U红细胞生成素和10μg人基质细胞衍生因子-1；c)以氢氧化钠调节PH至7.0-7.2；d)加入50ml胎牛血清并过滤除菌，放入4℃备用。

2）细胞培养

收集骨髓间充质干细胞原代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，计细胞数，调整细胞密度，以2×10⁵个/ml接种至加有骨髓间充质干细胞培养基；接种至培养皿中，置37℃、5%的CO₂、95%饱和湿度的CO₂培养箱培养。倒置相差显微镜下观察细胞贴壁及生长状况，传代第二天首次换液，以后每2天换液1次，3天时细胞达80%-90%融合，PBS洗掉非贴壁细胞，收集贴壁细胞供进一步实验用。

3）人骨髓间充质干细胞体外培养增殖鉴定

a)骨髓间充质干细胞生长曲线测定

以第3代细胞为标本，制备单细胞悬液,调整密度为2×10⁴个/mL，分为对照组：传统培养基（DMEM，10%的胎牛血清）组和实验组：骨髓间充质干细胞培养基组，接种于12孔培养板，每孔500μL，每2天换液。分别于1、2、3、4、5、6、7、8天,每组取2孔进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。实验组扩增速度明显增殖，生长曲线如图1所示；

b）形态学观察

经过2次传代培养其形态呈较为均一的成纤维细胞样外形，增殖速度很快，3天即再次汇合达90％，形态均一，成梭形，如图2所示。

与传统培养基（DMEM，10%的胎牛血清）相比，本发明方法培养的人骨髓间充质干细胞呈较小的纺锤体形态，更显示了细胞的原始形态，如图3所示。

在图2中：传统培养基组（DMEM，10%的胎牛血清）培养3天的P3代10X细胞呈胞体较扁，体积较大的近似纤维细胞样；

在图3中：骨髓间充质干细胞培养基组培养3天的P3代10X细胞呈较小的纺锤体形态，更显示了细胞的原始形态。

c)流式细胞术细胞表面标记物检测鉴定

收集经骨髓间充质干细胞培养基培养的第4代细胞，1500转离心5分钟；弃上清，加PBS溶液重悬，吸取100μL细胞悬液（约3.0×105个细胞）加入EP管内；按量分别加入检测抗体；避光孵育30min；每样品管加入1.5～2mLPBS溶液PBS洗一次，1500转离心5分钟；弃上清，每样品管加300μLPBS溶液重悬，进行流式检测。

结果表明培养的细胞经流式细胞仪检测，阴性对照：0.07%；阳性表达：CD73-98.47%，CD90-99.84%；而阴性表达：CD34-2.81%、CD45-0.01%。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1）将DMEM培养基作为基础培养基，并依次调整浓度加入100mg/L-500mg/L的L-谷氨酰胺、15mg/L-150mg/L的维生素C、10mU/L-20mU/L的胰岛素、10U/L-50U/L的红细胞生成素和5μg/L-255μg/L的血管内皮生长因子等，然后以氢氧化钠调节PH值，最后加入胎牛血清并过滤除菌，得到新的培养基；

2.根据权利要求1所述的一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，其特征在于：所述步骤1）中的新的培养基需放入4℃的环境中保存。

3.根据权利要求1所述的一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，其特征在于：所述步骤1）中PH值的范围为7.0-7.2。

4.根据权利要求1所述的一种人骨髓间充质干细胞体外培养扩增方法，其特征在于：所述步骤2）中原代细胞用胰蛋白酶消化制成细胞悬液。