CN104814929A - 一种褐藻胶寡糖脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种褐藻胶寡糖脂质体的制备方法,包括:步骤一、称取一定量的胆固醇和大豆卵磷脂于小烧杯中,溶解于有机溶剂中;步骤二、用PBS配制褐藻胶寡糖溶液,然后倒入配制好的有机溶剂中,磁力搅拌,超声,再磁力搅拌,旋转蒸发,使有机溶剂全部挥发,在圆底烧瓶底部形成均匀的薄膜;步骤三、用PBS溶液定容洗膜,再加入一定量的吐温-80制备得到褐藻胶寡糖脂质体,将溶解后的液体超声并置于4℃冰箱保存备用。本发明制备的脂质体,质量稳定,脂质体均匀,分布范围窄,褐藻胶寡糖的包封率为66.07%,粒径为338.2nm,制备的脂质体储藏稳定性好。本发明利用逆相蒸发法来制备褐藻胶寡糖脂质体,包封率比较高,稳定性比较强。
Description
技术领域
本发明涉及脂质体领域,具体是一种褐藻胶寡糖脂质体的制备方法。
背景技术
褐藻酸寡糖(alginate oligosaccharides,AOS)主要是通过采用化学或是生物方法降解褐藻胶得到的,它是由是 2~10 个 α-L-古洛糖醛酸(G)或者其 C5 差向异构体β-D-甘露糖醛酸(M)通过β-1,4 糖苷键连接而成的糖链。褐藻胶寡糖有很多功能:抗肿瘤,褐藻胶寡糖对非特异性免疫或特异性免疫系统具有良好的激活和促进作用,能激活巨噬细胞,激活后具有细胞毒作用,可抑制肿瘤细胞增殖从而杀死肿瘤;抗凝血作用,褐藻胶寡糖保持了良好的抗凝活性,又有较小的副作用;降血糖血脂作用,合适剂量的褐藻胶寡糖能较好地防止高胆固醇血症的形成,有降脂、维护心血管正常功能的作用;免疫调节活性作用等。但是褐藻胶寡糖的价格较为昂贵,因此提高褐藻胶寡糖的生物利用度尤为重要。
脂质体作为一种新型药物载体,有利于增强药物的靶向性,提高药物的生物利用度,增加药物的稳定性,降低药物的毒副作用,达到药物控释缓释的目的。纳米脂质体的制备方法主要有薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸发法、冻融法等。
发明内容
本发明的目的是通过逆相蒸发法制备得到褐藻胶寡糖脂质体,本发明制备的褐藻胶寡糖脂质体稳定而均匀,生物利用度高,可用于食品、保健品、药品、饲料、添加剂等。
本发明所采用的技术方案是:
一种褐藻胶寡糖脂质体的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、称取一定量的胆固醇和大豆卵磷脂于小烧杯中,溶解于有机溶剂中;
步骤二、用PBS配制褐藻胶寡糖溶液,然后倒入配制好的有机溶剂中,磁力搅拌,超声,再磁力搅拌,旋转蒸发,使有机溶剂全部挥发,在圆底烧瓶底部形成均匀的薄膜;
步骤三、用PBS溶液定容洗膜,再加入一定量的吐温-80制备得到褐藻胶寡糖脂质体,将溶解后的液体超声并置于4℃冰箱保存备用。
进一步的,备得到的褐藻胶寡糖脂质体的组分为:褐藻胶寡糖,卵磷脂,胆固醇,吐温,其余为PBS。
进一步的,所述有机溶剂是氯仿和乙醚,其体积比为2:3。
进一步的,所述胆固醇和大豆卵磷脂重量比为4.5:1。
进一步的,所述褐藻胶寡糖的浓度为8.5mg/mL。
进一步的,外内水相之比为5:1。
本发明的有益效果是:应用本发明制备的脂质体,质量稳定,脂质体均匀,分布范围窄,褐藻胶寡糖的包封率为66.07%,粒径为338.2nm,制备的脂质体储藏稳定性好。本发明利用逆相蒸发法来制备褐藻胶寡糖脂质体,包封率比较高,稳定性比较强。
附图说明
图1是制备褐藻胶寡糖脂质体的方法流程图。
图2是葡萄糖含量对吸光度的标准曲线图。
图3是脂胆比对褐藻胶寡糖脂质体制备的包封率影响图;
图4是褐藻胶寡糖浓度对褐藻胶寡糖脂质体制备的包封率影响图;
图5是吐温含量对褐藻胶寡糖脂质体制备的包封率影响图;
图6是外内水相之比对褐藻胶寡糖脂质体制备的包封率影响图;
图7是脂胆比与外内水相之比交互作用的响应面示意图;
图8是脂胆比与吐温交互作用的响应面示意图;
图9是褐藻胶寡糖浓度与外内水相之比交互作用的响应面示意图;
图10是吐温与外内水相之比交互作用的响应面示意图;
图11是褐藻胶寡糖脂质体14天的释放率示意图。
具体实施方式
为了更清晰地阐明本发明的技术方案,下面结合具体实施方式做进一步阐述。
一种褐藻胶寡糖脂质体的制备方法,所述褐藻胶寡糖脂质体的组分及其含量:褐藻胶寡糖 8.5mg/mL,卵磷脂99mg,胆固醇22mg,吐温1%(1%的PBS量),其余为PBS。
1、褐藻胶寡糖脂质体的制备
称取一定量的胆固醇和大豆卵磷脂(共121mg)于小烧杯中,溶解于15ml有机溶剂中(氯仿:乙醚=2:3)。用PBS配制褐藻胶寡糖溶液3mL,然后倒入配制好的有机溶剂中,磁力搅拌30min,超声5min,再磁力搅拌5min,38℃旋转蒸发,使乙醚和氯仿全部挥发掉,使之在圆底烧瓶底部形成一个均匀的薄膜;用PBS溶液定容洗膜,再加入一定量的吐温-80制备得到褐藻胶寡糖脂质体,将溶解后的液体超声17min于4℃冰箱保存备用。
2、空白脂质体的制备
称取一定量的胆固醇和大豆卵磷脂(共120mg)于50mL的小烧杯中,加入有机溶剂氯仿和乙醚溶剂15mL(氯仿:乙醚=2:3),用3mL的PBS代替上面的褐藻胶寡糖溶液,倒入配制好的有机溶剂中,磁力搅拌30min,超声5min,38℃旋转蒸发使乙醚和氯仿全部挥发掉,使之在圆底烧瓶底部形成一个均匀的薄膜;用PBS溶液定容洗膜,再加入0.45mL的吐温-80制备得到空白脂质体,将溶解后的液体超声17min于4℃冰箱保存备用。
3、标准曲线的制备
精密称取干燥恒重的葡萄糖200mg,用PBS溶解并稀释至100ml,备用。精密吸取备用液10ml加PBS稀释至100ml 定容,得葡萄糖标准液,用pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制成0.2 mg/mL的标准溶液。精密吸取标准液100、200、…700 微升,分别置于试管内,各加水使成2ml,再各加6%苯酚试剂1.0ml,各管迅速滴加浓硫酸5.0ml,立刻摇匀。沸水加热15分钟,迅速冷却,另取2mlPBS,同法操作加入试剂作空白对照。
4、单因素试验
固定脂胆比3:1、褐藻胶寡糖浓度6 mg/mL、吐温含量1.5%、外内水相之比为5:1这四个因素中的三个因素来考察剩下的一个因素对包封率和粒径的影响。
5、响应面优化试验
多因素试验采用Box-Behnken设计,利用响应曲面法进行分析优化综合之前的单因素试验结果,选择脂胆比、褐藻胶寡糖浓度、外内水相之比、吐温含量为考察因素,以包封率为响应值,利用 Design-Expert 8.0 软件进行优化实验的设计,进行四因素三水平的响应面分析实验,分析结果,同时对模型进行验证。
6、包封率的测定
精密吸取1ml褐藻胶寡糖脂质体和空白脂质体于10mL容量瓶中,定容后倒入到离心管中,5000 r /min 离心30 min,取上清液,用空白脂质体作为对照组,在490nm处测定其吸光值,代入回归方程,测得游离寡糖的浓度(P游离)。
精密吸取1ml褐藻胶寡糖脂质体和空白脂质体于10ml容量瓶中,加入9ml无水乙醇破乳,再定容至10ml,倒入离心管,漩涡3 min,然后以5000 r /min离心30 min,取沉淀溶解,用空白脂质体作为对照组,在490nm处测定其吸光值,带入代入回归方程测得总寡糖的浓度(P总)。
包封率计算为:包封率(% ) = (P总-P游离) /P总×100%
7、粒径的测定
使用马尔文 2000 进行粒径的测定,其测量范围在 0.1-1000μm,设定水的折射率为 1.33,使用通用的计算模型计算出粒径大小。
8、脂质体稳定性的评价
将制备好的褐藻胶寡糖脂质体在4 ℃冰箱存放,分别在第2、4、6、8、10、12、14 d测定体外释放率。
释放率%=(1- )
释放率的测定使用等式进行计算。
A0代表刚制备好的乳铁蛋白脂质体包封率,
A1代表经过处理后的乳铁蛋白脂质体的包封率。
实验结果:
(1)标准曲线的制作
用紫外可见分光光度计在入=490nm 测定吸光度。以吸光度为纵坐标,以葡萄糖的毫克数为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y=5.6629X+0.02(R2=0.9937),结果表明在葡萄糖毫克数在为0.02至0.14 mg的区间内,线性关系良好,如图2所示。
(2)单因素试验
①脂胆比对包封率的影响
试验号 | 脂胆比 | 寡糖浓度 | 吐温含量 | 外内水相之比 |
1 | 1.5 | 6 | 1.5 | 5 |
2 | 3 | 6 | 1.5 | 5 |
3 | 4.5 | 6 | 1.5 | 5 |
4 | 6 | 6 | 1.5 | 5 |
从图3可以看出,当褐藻胶寡糖浓度为6mg/mL、有机相与水相之比为5:1、吐温含量为1.5%的条件下,脂胆比由1.5:1增至4.5:1时,随着脂胆比的增大,褐藻胶寡糖脂质体的包封率从48.73%升高到62.23%,而当脂胆比超过4.5:1范围时,褐藻胶寡糖脂质体的包封率不再增加,有大幅度的降低。原因是胆固醇和卵磷脂是组成脂质体的膜材,随着膜材的质量增加,其可以包埋住更多的褐藻胶寡糖,但是当到达一定程度后,膜材所能包埋的物质达到饱和,其包封率将不会有所增加。因此,从包封率等综合考虑,选择脂胆比为4.5:1。
② 褐藻胶寡糖浓度对包封率的影响
试验号 | 脂胆比 | 寡糖浓度 | 吐温含量 | 外内水相之比 |
1 | 3 | 3.5 | 1.5 | 5 |
2 | 3 | 6 | 1.5 | 5 |
3 | 3 | 8.5 | 1.5 | 5 |
4 | 3 | 11 | 1.5 | 5 |
由图4可见,随着褐藻胶寡糖浓度的升高 ,褐藻胶寡糖脂质体的包封率呈现先增大后减小的变化趋势。褐藻胶寡糖的浓度从3.5mg/mL增加到8.5mg/mL,褐藻胶寡糖脂质体的包封率从48.61%增加到57.83%,浓度大于8.5mg/mL时,包封率下降。这是由于随着褐藻胶寡糖含量的增加,被包埋进去的寡糖也越来越多,但是,膜材的空间有限,所以即使褐藻胶寡糖浓度再高,也不会对包封率的增加起到一定的效果。
③吐温含量对包封率的影响
试验号 | 脂胆比 | 寡糖浓度 | 吐温含量 | 外内水相之比 |
1 | 3 | 6 | 0.5 | 5 |
2 | 3 | 6 | 1 | 5 |
3 | 3 | 6 | 1.5 | 5 |
4 | 3 | 6 | 2 | 5 |
由图5可以看出,褐藻胶寡糖脂质体的包封率随着吐温质量分数的增加而逐渐增加,后趋于平缓。吐温含量从0.5%增加到1%,褐藻胶寡糖脂质体的包封率从50.7%增加到62.04%,之后趋于平缓。因此 吐温含量选择1%。
④外内水相之比对包封率的影响
试验号 | 脂胆比 | 寡糖浓度 | 吐温含量 | 外内水相之比 |
1 | 3 | 6 | 1.5 | 3 |
2 | 3 | 6 | 1.5 | 5 |
3 | 3 | 6 | 1.5 | 7 |
4 | 3 | 6 | 1.5 | 9 |
由图6可知,褐藻胶寡糖脂质体的包封率随着有外内水相的体积比的增加,呈现了先升高后降低的变化趋势。外内水相之比从3:1增加到5:1,褐藻胶寡糖脂质体的包封率从50.88%增加到55.11%.因此,外内水相之比选择5:1。
综合以上分析,最后确定脂胆比 4.5:1、褐藻胶寡糖浓度为 8.5mg/mL、吐温含量1%、外内水相之比为 5:1 为中心值,进行响应面优化制备褐藻胶寡糖脂质体。
(3)响应面优化试验
在单因素结果的基础上,选取脂胆比、褐藻胶寡糖浓度、吐温含量、外内水相之比,用Design expert 软件中的Box-Behnken模型进行响应面优化试验设计,以包封率(Y)为评价指标。响应面优化试验的因素水平表见下表1,试验方案及结果见表2
表1 响应面因素水平表
表2 中心组合试验设计方案与结果
编号 | A | B(mg/mL) | C(%) | D | 包封率 |
1 | 3 | 8.5 | 1.5 | 5 | 57.29 |
2 | 6 | 8.5 | 0.5 | 5 | 61.81 |
3 | 6 | 11 | 1 | 5 | 58.08 |
4 | 4.5 | 11 | 0.5 | 5 | 59.27 |
5 | 4.5 | 11 | 1 | 7 | 53.74 |
6 | 6 | 8.5 | 1 | 7 | 61.86 |
7 | 4.5 | 8.5 | 1 | 5 | 65.39 |
8 | 4.5 | 11 | 1.5 | 5 | 55.37 |
9 | 6 | 6 | 1 | 5 | 60.69 |
10 | 6 | 8.5 | 1 | 3 | 58.81 |
11 | 4.5 | 8.5 | 0.5 | 7 | 61.26 |
12 | 4.5 | 8.5 | 1 | 5 | 65.69 |
13 | 4.5 | 6 | 1 | 7 | 54.93 |
14 | 4.5 | 8.5 | 1.5 | 7 | 57.89 |
15 | 3 | 8.5 | 1 | 3 | 48.43 |
16 | 4.5 | 8.5 | 1.5 | 7 | 57.33 |
17 | 6 | 8.5 | 1.5 | 5 | 63.66 |
18 | 4.5 | 8.5 | 1 | 5 | 66.07 |
19 | 4.5 | 8.5 | 0.5 | 3 | 49.23 |
20 | 4.5 | 11 | 1 | 3 | 52.07 |
21 | 4.5 | 6 | 1 | 3 | 48.8 |
22 | 3 | 8.5 | 0.5 | 5 | 54.19 |
23 | 4.5 | 8.5 | 1 | 5 | 65.28 |
24 | 4.5 | 6 | 0.5 | 5 | 49.76 |
25 | 3 | 11 | 1 | 5 | 51.32 |
26 | 4.5 | 8.5 | 1 | 5 | 61.48 |
27 | 4.5 | 6 | 1.5 | 5 | 59.12 |
28 | 3 | 6 | 1 | 5 | 48.03 |
29 | 3 | 8.5 | 1 | 7 | 52.65 |
①不同因素对包封率的影响
由表2试验结果得到包封率(Y) 与脂胆比(A)、寡糖浓度(B)、吐温含量(C)和外内水相之比(D) 之间的二次多元回归模型:
Y =64.78 + 4.42A +0.71B + 1.26C + 2.21D - 1.47AB - 0.31AC - 0.29AD - 3.32BC - 1.12BD - 3.15CD - 3.44A2 - 6.64B2 - 2.27C2 - 5.62D2
利用统计分析软件Design expert8.0对表2试验结果进行方差分析,结果见表3。
表3 回归方程的方差分析
由表3可知,脂胆比、外内水相之比、脂胆比的平方、寡糖浓度的平方、外内水相之比的平方对包封率的影响极显著( P < 0.01) ; 吐温含量、脂胆比与寡糖浓度的交互项、寡糖浓度与吐温含量的交互项、吐温含量与外内水相之比的交互项、吐温含量的平方对包封率的影响显著( P <0.05) ; 影响因素主次顺序为: 脂胆比> 外内水相之比>吐温含量>褐藻胶寡糖的浓度。模型的P值< 0.000 1,表明该回归方程线性极显著; 失拟值为0.9281 ( P>0.05) ,失拟不显著; 并且该模型R2 = 0.9711,R2 Adj = 0.9422,变异系数为2.37。以上均表明该回归方程拟合程度好。
②各因素间的交互作用对包封率响应面的分析
利用Design expert8.0软件对试验数据进行多项回归拟合,做各因素间交互作用的二次响应面分析。将建立的回归模型中的任意两因素固定在零水平,得到另外两因素的交互影响结果: 二次回归方程的响应面见图7~图10。
(4)褐藻胶寡糖稳定性评价结果
从图11可以看出,随着贮藏时间的推移,脂质体的释放率略有增加。说明一定的贮藏时间对脂质体的影响不大。
虽然本发明的特定实施例已被描述,但是这些实施例只是通过实例的方式进行表述,并不意欲限制本发明的实施范围。
Claims (6)
1.一种褐藻胶寡糖脂质体的制备方法,包括如下步骤:
步骤一、称取一定量的胆固醇和大豆卵磷脂于小烧杯中,溶解于有机溶剂中;
步骤二、用PBS配制褐藻胶寡糖溶液,然后倒入配制好的有机溶剂中,磁力搅拌,超声,再磁力搅拌,旋转蒸发,使有机溶剂全部挥发,在圆底烧瓶底部形成均匀的薄膜;
步骤三、用PBS溶液定容洗膜,再加入一定量的吐温-80制备得到褐藻胶寡糖脂质体,将溶解后的液体超声并置于4℃冰箱保存备用。
2.如权利要求1所述的褐藻胶寡糖脂质体的制备方法,其特征在于:制备得到的褐藻胶寡糖脂质体的组分为:褐藻胶寡糖,卵磷脂,胆固醇,吐温,其余为PBS。
3.如权利要求1所述的褐藻胶寡糖脂质体的制备方法,其特征在于:所述有机溶剂是氯仿和乙醚,其体积比为2:3。
4.如权利要求2所述的褐藻胶寡糖脂质体的制备方法,其特征在于:所述胆固醇和大豆卵磷脂重量比为4.5:1。
5.如权利要求2所述的褐藻胶寡糖脂质体的制备方法,其特征在于:所述褐藻胶寡糖的浓度为8.5mg/mL。
6.如权利要求2所述的褐藻胶寡糖脂质体的制备方法,其特征在于:外内水相之比为5:1。
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