CN105902996A - 一种包载花生短肽的纳米脂质体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种包载花生短肽的纳米脂质体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包载花生短肽的纳米脂质体及其制备方法与应用，该纳米脂质体原料包括卵磷脂、花生短肽、胆固醇和脱氧胆酸钠；通过采用薄膜分散与Ostwald熟化相结合的方法制得。本发明纳米脂质体包封率达到82.21％，粒径为89.70nm，具有良好的酸碱环境稳定性、体外缓释性和消化稳定性。

Description

一种包载花生短肽的纳米脂质体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于食品加工领域，具体的，涉及一种包载花生短肽的纳米脂质体及其制备方法与应用。
背景技术
花生短肽的开发近年来受到了广泛的重视，已经报道的花生短肽和酶解产物目前有十几种，生理功能主要集中于ACE抑制、抗氧化活性等。与大量的花生短肽及酶解产物种类不断得到报道相对照，花生短肽的实际应用却基本是空白，主要的原因是作为食品应用的短肽必须通过口服方式进入体内，严苛的胃肠道环境使短肽被胃蛋白酶、胰蛋白酶以及肽酶等降解而丧失生理活性，因此至今未见有花生短肽能够通过小肠上皮细胞成功进入到人体血液或淋巴循环中的相关报道。
构建脂质体运载体系，保护短肽躲避胃肠道环境是解决上述问题的一个有效方案。亲水性、疏水性短肽分别能够以包载、嵌入等多种形式结合到脂质体运载体系中，而完成体内输送。但花生短肽同时又具有强亲水性特征，在脂质体制备时亲水性短肽更倾向于分布在外水相中，包封率过低成为亲水类药物脂质体应用的主要障碍。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包载花生短肽的纳米脂质体及其制备方法与应用。本发明以花生短肽为原料，采用薄膜分散法，通过优化脂质体组成，提高脂质体对短肽的包封率；同时通过优化HPM工艺，制备纳米脂质体，以赋予脂质体更好的体内性质；有效利用Ostwald熟化，增加脂质体包封率和应用稳定性。
为达到以上目的，本发明提供一种包载花生短肽的纳米脂质体，其原料包括卵磷脂、花生短肽、胆固醇和脱氧胆酸钠。
优选地，所述包载花生短肽的纳米脂质体，其原料中卵磷脂与花生短肽的质量比为10-12∶1，进一步优选为11.47∶1；
卵磷脂与胆固醇的质量比为9-10.5∶1，进一步优选为9.52∶1；
卵磷脂与脱氧胆酸钠的质量比为4-5∶1，进一步优选为4.40∶1；
本发明还提供上述包载花生短肽的纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1)将卵磷脂、花生短肽、胆固醇和脱氧胆酸钠加入乙醇，水浴超声直至完全溶解；
2)将步骤1)所得溶液在水浴条件下减压蒸发除去乙醇，直至减压蒸发仪容器(例如茄形瓶)壁上形成一层均匀的脂质薄膜；然后加入PBS(pH7.4)缓冲液，旋转水合，得到脂质体粗悬液；
3)将所述脂质体粗悬液进行高压微射流均质，均质压力为60-130Mpa，循环处理1-4次，得到纳米脂质体；
4)将所述纳米脂质体搅拌，即得所述包载花生短肽的纳米脂质体。
优选地，步骤1)所述卵磷脂与花生短肽的质量比为10-12∶1，进一步优选为11.47∶1；卵磷脂与胆固醇的质量比为9-10.5∶1，进一步优选为9.52∶1；卵磷脂与脱氧胆酸钠的质量比为4-5∶1，进一步优选为4.40∶1；
优选地，步骤1)所得溶液(溶剂为乙醇)中卵磷脂的浓度为3.8-4.6mg/mL，进一步优选为4.21mg/mL。
优选地，步骤1)所述乙醇为95％乙醇(体积分数)。
优选地，步骤2)中PBS(pH7.4)缓冲液的加入量与步骤1)乙醇的加入量相同；
优选地，所述PBS(pH7.4)缓冲液的浓度为0.01mol/L；
优选地，使步骤2)所得脂质体充分溶解于PBS缓冲液中；
优选地，步骤2)所述水浴温度为40-50℃，进一步优选为45℃；
优选地，步骤2)所述加压蒸发真空度为-0.07～-0.10Mpa，进一步优选为-0.09Mpa；
优选地，步骤2)所述旋转水合时间为30-120min；进一步优选为60min。
优选地，步骤3)所述均质压力为110-130MPa，进一步优选为120Mpa；
优选地，步骤3)所述循环处理次数为2-4次。
步骤3)可通过高压微射流均质机进行均质。
步骤3)中通过高压微射流的高速碰撞、高频振荡、瞬时压降、强烈剪切等作用将会破坏脂质体结构，促进脂质体结构重组，使脂质体具有更强的机械和环境适应性。
优选地，步骤4)所述搅拌在室温(一般温度为15-30℃)条件下进行；
优选地，步骤4)所述搅拌速度为20-100rpm，进一步优选为30-70rpm，更优选为50rmp；
优选地，步骤4)所述搅拌时间为12-24h；
步骤4)所述搅拌可采用磁力搅拌器。
步骤4)中低速搅拌目的是促进脂质体充分水合，形成有限聚集，增加对亲水性短肽的包封率。
具体地，上述制备方法，包括以下步骤：
1)将卵磷脂、花生短肽、胆固醇和脱氧胆酸钠加入乙醇，水浴超声直至完全溶解；卵磷脂与花生短肽的质量比为11.47∶1；卵磷脂与胆固醇的质量比为9.52∶1；卵磷脂与脱氧胆酸钠的质量比为4.40∶1；所得溶液中卵磷脂的浓度为4.21mg/mL；
2)将步骤1)所得溶液在45℃水浴条件下减压蒸发除去乙醇，真空度为-0.09Mpa，直至减压蒸发仪容器壁上形成一层均匀的脂质薄膜；然后加入与步骤1)所加乙醇等量的0.01mol/L的PBS缓冲液，旋转水合60min，得到脂质体粗悬液；
3)将所述脂质体粗悬液进行高压微射流均质，均质压力为120Mpa，循环处理4次，得到纳米脂质体；
4)将所述纳米脂质体搅拌，搅拌速度为50rpm搅拌时间为12-24h，即得。
本发明还提供了利用上述方法制备的包载花生短肽的纳米脂质体。
本发明还提供了上述包载花生短肽的纳米脂质体或按照上述方法制备的包载花生短肽的纳米脂质体在制备用于抑制ACE(即血管紧张素转化酶)活性和/或抗氧化活性的制剂中的应用。
优选地，所述制剂包括降压食品或降压药品。
本发明所述花生短肽可由现有技术常规方法制备得到或市售得到；例如采用李宁等的方法(李宁,红芝,刘丽,王强.中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽的研究.中国农业科学,2013,46(24):5237-5247)制备。
本发明所述Ostwald熟化是指Wilhelm Ostwald在1896年发现的一种描述固溶体中多相结构随着时间的变化而变化的一种现象。
有益效果：
1.本发明所述包载花生短肽的纳米脂质体采用薄膜分散与Ostwald熟化相结合的方法制备而成，采用优化的组成、高压微射流压力和循环次数，实现了脂质体对花生短肽的最大程度包封，为后续脂质体体内应用创造了最佳的作用环境；
2.本发明所述的花生短肽纳米脂质体的制备方法，成本低廉，制备工艺简单，可操作性强；
3.本发明所述的花生短肽纳米脂质体的制备方法，所获得的脂质体短肽包封率达到82.21％，粒径为89.70nm，具有体外的体外缓释性和抗消化能力。
附图说明
图1为本发明所述薄膜分散与Ostwald熟化相结合制备包封短肽纳米脂质体的方法示意图。
图2为本发明实施例1中高压微射流不同压力对花生短肽脂质体的粒径和多分散指数的影响。
图3为本发明实施例1中高压微射流不同压力对花生短肽脂质体的包封率影响。
图4为本发明中高压微射流120MPa处理压力下不同循环次数对花生短肽脂质体粒径和包封率的影响。
图5为本发明实施例4中所得花生短肽纳米脂质体和粗脂质体在不同pH条件下泄漏率变化对比。
图6为本发明实施例5中所得花生短肽纳米脂质体与粗脂质体、游离肽体外释放度对比。
图7为本发明实施例6中所得花生短肽纳米脂质体与粗脂质体、游离肽、水体外模拟消化前后ACE抑制活性变化对比。
图8为本发明实施例6中所得花生短肽纳米脂质体与粗脂质体体外模拟消化前后微观结构变化对比。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
下述实施例中采用的旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器有限公司；高压微射流处理为通过微射流高压均质机进行，设备为美国BEEinternational公司生产；粒径分析采用的仪器为英国马尔文仪器有限公司生产的Zeta电位分析仪；透射电镜为日本日立公司生产的H-7500透射电子显微镜；高效液相色谱采用美国Waters公司的Waters 1525高效液相色谱系统。
以下实施例所用花生短肽采用李宁等的方法(李宁,红芝,刘丽,王强.中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽的研究.中国农业科学,2013,46(24):5237-5247)制备。
下述实施例中采用下述方法进行测定和分析。
脂质体包封率测定：超滤离心法
脂质体破乳后测定肽含量(C0)，取10mL脂质体，置于截留量为10KDa的超滤离心管中，常温下3500rpm转速离心15min，取上清液0.2mL，测定肽含量(C1)，按照计算包封率。
脂质体粒径和多分散指数(PDI)的测定：Zeta电位仪法
用Zeta电位仪测定脂质体粒径，测定温度25℃。采用仪器自带软件，计算多分散指数。
脂质体不同酸碱环境下稳定性测定
脂质体和超滤离心滤液先经破乳处理，福林酚法测定肽含量(C0)和滤液肽含量(C1)。取6mL脂质体装入截留分子量为10KDa的透析袋中，分别置于pH值2.0、4.5、6.0、8.0、10.0的50mL浓度0.01M磷酸缓冲液中，37℃水浴摇床中100rpm振荡30min。之后，取3mL脂质体移入截留分子量为3KDa的超滤离心管中，3500rpm转速离心15min，滤液破乳后测定肽含量(C2)。泄露率按下式计算。
脂质体体外释放度的测定
脂质体和游离肽的体外释放采用Liu等(2015)的透析方法略加修改。脂质体和超滤离心滤液破乳后，分别测定脂质体(C0)和滤液(C1)肽含量。然后，取50mL脂质体样品和游离肽样品(肽浓度与脂质体相同)中装入截留分子量为10KDa的透析袋中，置于50mL pH 7.0的0.01M磷酸缓冲液中，37℃水浴摇床中100rpm振荡。之后，每隔固定时间取样3mL脂质体移入截留分子量为3KDa的超滤离心管中，3500rpm转速离心15min，滤液破乳后测定肽含量(C2)。泄露率按下式计算。
对于脂质体，C0为脂质体样品中肽含量；C1为脂质体样品超滤离心滤液中肽含量；C2为每个取样时间点的样品超滤离心滤液肽含量。
对于游离肽，C0为游离肽样品中肽含量；C1＝0；C2为每个取样时间点的样品肽含量。
脂质体体外消化分析
5mL脂质体样品中加入1.0mol/L HCl将溶液pH调至2.0，并加入用0.1M HCl(pH 2.0)配制浓度为80mg/mL的胃蛋白酶120μL，37℃模拟胃液消化1h。然后，采用1.0mol/L NaOH将体系pH调至7.5，并加入400μL配制在0.1M NaHCO3溶液中的肠液消化酶(含4mg/mL胰酶和24mg/mL脱氧胆酸钠)，进行37℃模拟肠液消化1h。冷却至4℃灭酶。
ACE抑制活性的测定：高效液相色谱法
分别精确称取花生短肽，加入去离子水分别配制成2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.05mg/mL浓度的短肽溶液，采用高效液相色谱对短肽的ACE抑制活性进行测定，条件为：色谱柱Sunfire TM-C18(250×4.6mm)，流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝50：50：0.05，流速：0.4mL/min，温度：30℃；检测波长：228nm。测定结果采用Origin 8.0软件计算IC50值。
微观结构观察：透射电镜法
用去离子水将固体样品配制成浓度为1mg/mL(w/v)的溶液，取一滴溶液加到覆有聚乙烯醇缩甲醛脂膜的铜网上，铜网水平放置2～3min使分子聚集体沉积到网面上，用滤纸吸去表面多余溶液，之后滴加2％的醋酸双氧釉溶液负染2min，将铜网在滤纸上放置3min使充分染色并吸去多余的染液，干燥后用透射电子显微镜观察并拍照。
实施例1高压微射流不同压力处理对脂质体粒径和包封率影响
第一步：称取卵磷脂421mg，花生短肽36.7mg，胆固醇44.2mg，脱氧胆酸钠95.7mg，加入95％乙醇100mL，水浴超声直至完全溶解；
第二步：将溶液在45℃水浴条件下减压，旋转蒸发除去乙醇，真空度为-0.09MPa，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。向旋转蒸发瓶中加入100mL的0.01mol/L的PBS(pH7.4)缓冲液，旋转水合60min，得到脂质体粗悬液；
第三步：将所述脂质体粗悬液通过高压微射流均质机，处理压力分别为60、90、120、150、180MPa，循环处理1次，测定脂质体粒径和包封率。
脂质体粒径结果如图2所示，很明显HPM处理能够显著降低载荷花生短肽的脂质体粒径。即使在最低的60MPa处理下，脂质体粒径也有大幅度的下降，从对照时301.85±15.91nm降低到60MPa时的92.43±2.48nm，已经成为纳米脂质体。随着压力的增加脂质体粒径继续下降。
脂质体的多分散指数在120MPa之前随压力增加而持续下降，而在120MPa之后随压力上升与120MPa对比有显著上升。低的PDI表明了窄的粒径分布，PDI在120MPa之前持续下降表明随压力增加脂质体颗粒趋向均一化，而120MPa后PDI增大，预示着体系构成开始趋向杂乱，这也会对体系的性质产生影响。
脂质体包封率测定结果如图3所示，除120MPa外，HPM不同压力处理均显著降低了载荷花生短肽脂质体的包封率(p＜0.05)。有所区别的是，120MPa之前包封率的下降幅度要小于120MPa之后，总体来讲，HPM处理会降低脂质体包封率。Frederik等(1991)曾经报道过粒径小于200nm的亲水性药物，包封率会随着粒径的下降而显著降低，过低的粒径并不利于包封能力的提高，因此就包封率来讲，120Mpa为适宜的HPM处理压力。
实施例2高压微射流120MPa处理不同循环次数对脂质体粒径和包封率影响
第一步：称取卵磷脂421mg，花生短肽36.7mg，胆固醇44.2mg，脱氧胆酸钠95.7mg，加入95％乙醇100mL，水浴超声直至完全溶解；
第二步：将溶液在45℃水浴条件下减压，旋转蒸发除去乙醇，真空度为-0.09MPa，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。向旋转蒸发瓶中加入100mL的0.01mol/L的PBS(pH7.4)缓冲液，旋转水合60min，得到脂质体粗悬液；
第三步：将所述脂质体粗悬液通过高压微射流均质机，处理压力为120MPa，循环处理1-5次，测定不同循环处理的脂质体粒径和包封率。
从图4中可以看出，HPM处理压力120MPa下不同循环次数对于脂质体粒径和包封率也会产生一定影响。循环次数显著改变了脂质体包封率。循环处理4次使脂质体包封率从41.72±1.97％增加到59.65±2.81％，循环次数增加包封率则有所下降。
而从脂质体粒径来看，循环次数增加也能降低粒径，从1次循环时的79.70±1.05nm，降低至4次循环时的65.10±1.29nm，继续处理对于粒径无明显影响，因此综合考虑，采用120MPa下处理4次可以作为纳米脂质体制备的工艺参数。
实施例3纳米脂质体Ostwald熟化对包封率影响
第一步：称取卵磷脂421mg，花生短肽36.7mg，胆固醇44.2mg，脱氧胆酸钠95.7mg，加入95％乙醇100mL，水浴超声直至完全溶解；
第二步：将溶液在45℃水浴条件下减压，旋转蒸发除去乙醇，真空度为-0.09MPa，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。向旋转蒸发瓶中加入100mL的0.01mol/L的PBS(pH7.4)缓冲液，旋转水合60min，得到脂质体粗悬液；
第三步：将所述脂质体粗悬液通过高压微射流均质机，处理压力为120MPa，循环处理4次，得到纳米脂质体；
第四步：将所述纳米脂质体室温条件下分别以20、50、100rpm速率搅拌，搅拌时间分别为12h、24h、36h和48h。测定脂质体粒径包封率。
刚制备完成纳米脂质体的包封率为55.28±3.31％，从表1可以发现，常温下适度搅拌都能提高包封率，低速、长时搅拌包封率提升较大。同等时间下，搅拌速度为50rpm时有更高的效率，因此选择50rpm搅拌速度，而搅拌24h和48h之间虽然有所差别，但差异并不显著(p＞0.05)，此外，考虑到常温下长时间存放可能会造成脂质体氧化等因素，因此选择50rpm下搅拌24h作为适宜的主动Ostwald熟化工艺，经过处理后，脂质体包封率可提高到80％以上。
表1搅拌时间、速度对于脂质体包封率影响
方法 12h(％) 24h(％) 36h(％) 48h(％)
20rpm 62.84±4.55c 75.69±2.91b 77.78±4.52a 82.46±3.54a
50rpm 65.39±3.27b 82.21±4.58a 84.29±3.41a 85.24±3.06a
100rpm 56.83±2.27b 66.24±3.48a 72.29±2.34a 74.35±5.51a
注：同一行不同字母表示差异显著。
实施例4纳米脂质体酸碱环境下稳定性
第一步：称取卵磷脂421mg，花生短肽36.7mg，胆固醇44.2mg，脱氧胆酸钠95.7mg，加入95％乙醇100mL，水浴超声直至完全溶解；
第二步：将溶液在45℃水浴条件下减压，旋转蒸发除去乙醇，真空度为-0.09MPa，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。向旋转蒸发瓶中加入100mL的0.01mol/L的PBS(pH7.4)缓冲液，旋转水合60min，得到脂质体粗悬液；
第三步：将所述脂质体粗悬液通过高压微射流均质机，处理压力为120MPa，循环处理4次，得到纳米脂质体；
第四步：将所述纳米脂质体室温条件下以50rpm速率搅拌24，24h，获得包封花生短肽的纳米脂质体。
第五步：测定制备的纳米脂质体与粗脂质体在不同pH条件下泄漏率。
从图5可以发现，载荷花生短肽的脂质体在不同pH环境下表现了较好的稳定性，最高泄漏率出现在pH2.0条件下，粗脂质体和纳米脂质体分别为21.96±0.95％和12.53±0.53％。纳米脂质体具有更好的酸性条件下稳定性。
实施例5纳米脂质体体外释放度
第一步：称取卵磷脂842mg，花生短肽73.4mg，胆固醇88.4mg，脱氧胆酸钠191.4mg，加入95％乙醇200mL，水浴超声直至完全溶解；
第二步：将溶液在45℃水浴条件下减压，旋转蒸发除去乙醇，真空度为-0.09MPa，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。向旋转蒸发瓶中加入200mL的0.01mol/L的PBS(pH7.4)缓冲液，旋转水合60min，得到脂质体粗悬液；
第三步：将所述脂质体粗悬液通过高压微射流均质机，处理压力为120MPa，循环处理4次，得到纳米脂质体；
第四步：将所述纳米脂质体室温条件下以50rpm速率搅拌24，24h，获得包封花生短肽的纳米脂质体。
第五步：测定制备的纳米脂质体与粗脂质体和游离短肽的体外释放度。
从图6可以看出，游离肽快速释放到介质中，4h时的释放率达到49.37±3.07％，而粗脂质体和纳米脂质体的释放则要缓慢的多，分别只有3.57±0.23％和1.27±0.06％。温孵时间达到16h时，游离肽几乎完全释放，而两种脂质体则都低于30％，脂质体明显延迟了肽的释放，具有良好的缓释效果。粗脂质体和纳米脂质体36h的累计释放率分别为78.12±4.69％和59.21±2.67％，纳米脂质体表现了更好的体外缓释性。
实施例6纳米脂质体抗消化性
第一步：称取卵磷脂1263mg，花生短肽110.1mg，胆固醇132.6mg，脱氧胆酸钠287.1mg，加入95％乙醇300mL，水浴超声直至完全溶解；
第二步：将溶液在45℃水浴条件下减压，旋转蒸发除去乙醇，真空度为-0.09MPa，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。向旋转蒸发瓶中加入300mL的0.01mol/L的PBS(pH7.4)缓冲液，旋转水合60min，得到脂质体粗悬液；
第三步：将所述脂质体粗悬液通过高压微射流均质机，处理压力为120MPa，循环处理4次，得到纳米脂质体；
第四步：将所述纳米脂质体室温条件下以50rpm速率搅拌24，24h，获得包封花生短肽的纳米脂质体。
第五步：将制备的纳米脂质体与粗脂质体进行模拟体外消化，测定消化后ACE抑制活性变化，采用透射电镜观察微观结构变化。
从图7中可以看出消化前粗脂质体、纳米脂质体和游离肽表现了相近的ACE抑制活性。而经过体外模拟消化后，包括水在内，试验样品的ACE抑制活性都有显著提高这表明胃肠道消化酶系对花生短肽的ACE抑制活性有一定影响。游离肽的ACE抑制活性提高幅度最小，而纳米脂质体的活性上升最大，这表明纳米脂质体比粗脂质体和游离肽表现了更高的生物利用度。
从图8中可以看出，纳米脂质体表现了较高的消化稳定性，可以从对消化后脂质体微观结构变化中得到证实。粗脂质体结构破损多，基本见不到完整脂质体结构；而纳米脂质体则保持了相对完整的结构，这表明纳米脂质体能够成功地保护花生短肽免于胃肠道消化酶系和强酸性环境的攻击。
本发明具有以下有益效果：对比亲水性短肽，本发明制备的脂质体明显提高了具有强亲水性特征的花生短肽的包封率，达到82.21％，粒径为89.70nm；纳米脂质体具有良好的酸碱环境稳定性和体外缓释性；体外模拟消化后ACE抑制活性保持稳定，基本保持了完整的结构形态，表现了良好的抗消化稳定性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种包载花生短肽的纳米脂质体，其原料包括卵磷脂、花生短肽、胆固醇和脱氧胆酸钠。
2.根据权利要求1所述的包载花生短肽的纳米脂质体，其特征在于，其原料中卵磷脂与花生短肽的质量比为10-12∶1，卵磷脂与胆固醇的质量比为9-10.5∶1，卵磷脂与脱氧胆酸钠的质量比为4-5∶1；
优选地，其原料中卵磷脂与花生短肽的质量比为11.47∶1；卵磷脂与胆固醇的质量比为9.52∶1；卵磷脂与脱氧胆酸钠的质量比为4.40∶1。
3.权利要求1或2所述包载花生短肽的纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1)将卵磷脂、花生短肽、胆固醇和脱氧胆酸钠加入乙醇，水浴超声直至完全溶解；
2)将步骤1)所得溶液在水浴条件下减压蒸发除去乙醇，直至减压蒸发仪容器壁上形成一层均匀的脂质薄膜；然后加入PBS缓冲液，旋转水合，得到脂质体粗悬液；
3)将所述脂质体粗悬液进行高压微射流均质，均质压力为60-130Mpa，循环处理1-4次，得到纳米脂质体；
4)将所述纳米脂质体搅拌，即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所得溶液中卵磷脂的浓度为3.8-4.6mg/mL，优选为4.21mg/mL。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中PBS缓冲液的加入量与步骤1)乙醇的加入量相同；优选地，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH值为7.4。
6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述水浴温度为40-50℃，优选为45℃；
所述加压蒸发真空度为-0.07～-0.10Mpa，优选为-0.09Mpa；
所述旋转水合时间为30-120min，优选为60min。
7.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述均质压力为110-130MPa，优选为120Mpa；所述循环处理次数为2-4次。
8.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述搅拌速度为20-100rpm，优选为30-70rpm，更优选为50rmp；
和/或，所述搅拌时间为12-24h。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将卵磷脂、花生短肽、胆固醇和脱氧胆酸钠加入乙醇，水浴超声直至完全溶解；卵磷脂与花生短肽的质量比为11.47∶1；卵磷脂与胆固醇的质量比为9.52∶1；卵磷脂与脱氧胆酸钠的质量比为4.40∶1；所得溶液中卵磷脂的浓度为4.21mg/mL；
2)将步骤1)所得溶液在45℃水浴条件下减压蒸发除去乙醇，真空度为-0.09Mpa，直至减压蒸发仪容器壁上形成一层均匀的脂质薄膜；然后加入与步骤1)所加乙醇等量的0.01mol/L的PBS缓冲液，旋转水合60min，得到脂质体粗悬液；
3)将所述脂质体粗悬液进行高压微射流均质，均质压力为120Mpa，循环处理4次，得到纳米脂质体；
4)将所述纳米脂质体搅拌，搅拌速度为50rpm搅拌时间为12-24h，即得。
10.权利要求1或2所述的包载花生短肽的纳米脂质体或权利要求3-9任一项所述方法制备的包载花生短肽的纳米脂质体在制备用于抑制ACE活性和/或抗氧化活性的制剂中的应用；
优选地，所述制剂包括降压食品或降压药品。
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