CN106109442B - 一种山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents
一种山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒,它是以丙酮、聚乳酸羟基乙酸、山药多糖和泊洛沙姆188为原料,以复乳法制备得到的。本发明还公开了山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备方法和在制备免疫增强药物中的应用。与现有技术相比,本发明所得纳米粒悬液包封率较高,药物性质稳定,同时可使药物在动物机体内缓慢释放,有效地延长药效,具免疫增强作用,对防治动物疫病有重要意义。同时,本发明作为一种新型中兽药,没有副作用。
Description
技术领域
本发明属于药物领域,具体涉及一种山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒及其制备方法与应用。
背景技术
山药是药食兼用植物之一,传统中医认为山药具有补益强壮,补脾养胃,生津益肺,补肾涩精,治疗消渴功效。现代的研究发现,山药不仅具有多种营养成分,而且具备性平,味甘,健脾止泻、补肺益肾等药用价值。山药中含有多糖、尿囊素、皂甙、糖蛋白等活性成分,而多糖作为植物和食用菌的活性成分已成为当前药学研究的热点,山药多糖是从山药块茎中分离提取的主要活性成分,主要由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成,已成为近年来山药研究的热点。其具有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老和抗氧化等作用。山药多糖不仅具有增强机体免疫功能的作用,可作为免疫增强剂,用于提高机体免疫力,主要表现在免疫增强或免疫刺激,诱导T淋巴细胞分化、B淋巴细胞分泌抗体等;同时山药便宜易得,对动物而言,其具有良好应用前景,然而另一方面,山药多糖属于大分子多糖,若直接用于临床,则存在着多糖在体内代谢较快,作用时间短,作用范围不集中,临床用量大以及由此带来的副作用增强等缺点。由此可知,如何合理利用山药多糖这种活性成分,提高山药多糖的生物利用率,突出其增强免疫的效果,是其在临床推广应用首要解决的问题。
聚乳酸羟基乙酸共聚物又叫又叫聚乙丙交酯,是乳酸与羟基乙酸聚合而成,它有着良好的生物相容性和安全性,无毒、无刺激性,还有很好的稳定性,具有易于被吞噬细胞摄取,通过在颗粒表面吸附相应的配体可以定位到特定的组织或器官等优点,同时因其含有亲水性基团,所以在体内降解为二氧化碳和水,现已被美国食品药品管理局(FDA)批准为药用辅料。聚乳酸羟基乙酸包裹药物制成注射微球已成为制剂学热点之一,例如在药物,包括蛋白、多肽、基因等缓释领域已被广泛研究。聚乳酸羟基乙酸纳米粒缓控释系统适用于半衰期短或口服生物利用度低而又需要长期给药的药物,制成聚乳酸羟基乙酸纳米粒可保护被包裹药物不被破坏,可有效控制包裹在纳米粒内的药物在体内的降解,其优点是能在几周或几个月时间内以一定速率释放药物,维持有效血液浓度, 减少给药次数,且能够持续释放,提高治疗效果,减少用药的总剂量,所以被深入研究。目前已有多种药物采用聚乳酸羟基乙酸作为骨架材料制备生物可降解微球,实现了对药物的缓释和控释,因此已被广泛应用于人的临床医学。
本发明首次利用复乳法制备山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒胶体悬液,对其工艺进行优化,并体外刺激小鼠淋巴细胞增殖,建立了山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备方法,优化了制备条件,发现山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒能显著提高山药多糖的免疫活性及免疫增强功能,提高其生物利用度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒,以解决现有技术存在的生物利用率不高,效果不佳等问题。
本发明还要解决的技术问题是提供上述山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的应用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种制备山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的方法,它包括如下步骤:
(1)取山药多糖溶于水中,经超声溶解得到内水相;将聚乳酸羟基乙酸和丙酮混合后搅拌,经超声溶解得到油相;将泊洛沙姆188溶于水中,得到外水相;
(2)将步骤(1)中制备得到的内水相加入步骤(1)中制备得到的油相中,经超声得到稳定的油包水型初乳;将油包水型初乳加入步骤(1)中制备得到的外水相中,经超声得到水包油包水型复乳;水包油包水型复乳经减压蒸发除去有机溶剂和离心去除较大沉淀后,收集上清液,即得山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒。
步骤(1)中,内水相中,山药多糖的浓度为2~20mg/mL,优选10mg/mL。
步骤(1)中,油相中,聚乳酸羟基乙酸的浓度为10~40mg/mL,优选20mg/mL。
步骤(1)中,外水相中,泊洛沙姆188的质量百分比为0.1~0.7%,优选0.7%。
步骤(2)中,内水相和油项的体积比为1:3~9,优选1:9。
步骤(2)中,油包水型初乳和外水相的体积比为1:4~10,优选1:10。
步骤(2)中,得到稳定的油包水型初乳的超声方法为:在120W的功率下超声2s间歇3s,总时长2min。
步骤(2)中,得到水包油包水型复乳的超声方法为:在150W的功率下超声2s间歇3s,总时长2min。
步骤(2)中,减压蒸发的方法为:在旋转蒸发仪上以55℃和100rpm的条件减压蒸发20min左右。
步骤(2)中,离心的方法为2500rpm离心8min。
上述制备方法中任意一项制备得到的山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒也在本发明的保护范围之内。
上述山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒在制备免疫增强药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
按此方法制备的山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒,包封率高达66.82%。得到山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒后,利用马尔文粒度分析仪对山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的粒径、多分散系数(PDI)及表面电势进行了分析,并通过透射电镜对山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的表面形态进行了研究,发现山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒呈现均一的纳米分散体系。
体外将山药多糖以及山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒以一定浓度重悬,用透析袋模拟体内半透膜,探究两者的释放规律。发现山药多糖被聚乳酸羟基乙酸包裹后,明显减缓了药物的释放。说明聚乳酸羟基乙酸有缓释效果。
体外探究山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒对小鼠淋巴细胞的最大安全浓度,在安全浓度下刺激淋巴细胞增殖。发现与其他空白组相比,载药纳米粒组在不同浓度下均能显著刺激淋巴细胞增值。表明了其具有较好的免疫增强功能,对提高动物机体的免疫功能,防治疾病具有重要应用价值。
有益效果
动物疫病主要靠疫苗来预防,但是很多疫苗存在免疫原性较弱、诱导产生的免疫反应持续时间较短,需多次接种等缺点,需要免疫增强剂辅助才能产生强大的免疫应答。现有的常用免疫增强剂如油佐剂、铝胶佐剂等,这些佐剂通常存在刺激性较强、有残留等缺点。由于中药具有绿色安全的特点,从中药中开发免疫增强剂已成为热点。
山药多糖是山药中所含的主要有效成分之一,其具有增强免疫、抗肿瘤、抗衰老和抗氧化等作用。山药多糖不仅具有增强机体免疫功能的作用,可作为免疫增强剂,用于提高机体免疫力,主要表现在免疫增强或免疫刺激,诱导T淋巴细胞分化、B淋巴细胞 分泌抗体等;同时山药便宜易得,对动物而言,其具有良好应用前景,然而,山药多糖作为一种免疫增强剂直接用于兽医临床,存在着分子量较大、药物释放太快、药量过大、副作用增强、生物利用度低导致免疫增强作用相对较弱等问题,从而限制了其临床应用。利用聚乳酸羟基乙酸包被山药多糖,不仅可以减缓山药多糖在体内被排除,解决用药量大等问题,而且可以有效维持山药多糖在机体内的有效浓度,提高其生物利用度。
本发明采用复乳法将山药多糖制备成山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒,所得纳米粒悬液包封率较高,药物性质稳定,同时可使药物在动物机体内缓慢释放,有效地延长药效,具免疫增强作用,对防治动物疫病有重要意义。本发明作为一种新型中兽药,没有副作用。
与现有技术相比,本发明优点如下:
1.山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备国内外未见报道,本发明提供了一种山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备方法及其优化的条件,填补了国内外研究的空白。
2.山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的免疫增强活性未见报道。通过本发明的实施,证明山药多糖通过制备成山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒后能够显著增强其免疫活性,表现为体外刺激小鼠淋巴细胞增殖,与山药多糖相比,具有较强的缓释作用,从而长时间刺激动物免疫系统以达到增强免疫的效果。因此,山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒可作为研制新型免疫增强剂的材料,为研制新型免疫增强剂提供了材料和示范。
附图说明
图1为山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒(CYPP)和空白聚乳酸羟基乙酸纳米粒(BP)的透射电镜和扫描电镜图;其中,A1和A2为BP的透射电镜图像,B1和B2为CYPP的透射电镜图像;C1和C2为CYPP的扫描电镜图像;
图2为山药多糖(CYP)和山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒(CYPP)的体外释放结果图;
图3为药物单独刺激时淋巴细胞增殖的变化示意图;
图4为药物协同LPS作用时淋巴细胞增殖的变化示意图;
图5为药物协同PHA刺激时淋巴细胞增殖的变化示意图。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的制备
精确称取一定量的山药多糖于小烧杯中,以超声溶解形成内水相,其浓度为10mg/mL;精确称取一定量的聚乳酸羟基乙酸,加入丙酮,超声溶解形成油相,浓度为20mg/mL;精确称取一定量的泊洛沙姆188,溶于一定量的去离子水中形成外水相,其浓度为0.7%。将内水相缓慢加入油相中,并以功率120W,超声2s间歇3s,总时2min的条件进行超声得到稳定的油包水型初乳,将初乳缓慢加入外水相中,并以功率150W,超声2s间歇3s,总时2min的条件进行超声得到稳定的水包油包水型复乳,之后在旋转蒸发仪上减压蒸发去除有机溶剂,转速100rpm,水浴55℃,约20min。最后,将复乳装入EP管中,以转速2500rpm离心8min后收集上清,即得山药多糖的聚乳酸羟基乙酸纳米粒。
在单一因素考察的基础上,确定影响山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒包封率的3个主要影响因素,即内水相与油相的体积比(V/V)、初乳与外水相的体积比(V/V)以及泊洛沙姆188的浓度(%)等3个因素,以此3个因素为自变量,每个因素又选择3个水平,以包封率为响应值,做3因素3水平共17个试验点(5个中心点)二次回归正交组合试验。试验设计及结果见表1。
对表1中试验结果进行响应面分析,经过二次回归拟合后,得到内水相与油相的体积比(V/V)、初乳与外水相的体积比(V/V)以及泊洛沙姆188的浓度(%)的二次多项回归方程为:
Y=+57.66+4.91X1+3.74X2+1.93X3+0.50X1X2+0.83X1X3+1.38X2X3–1.48X1 2–0.48X2 2-2.16X3 2
表1
利用Design expert 7.0软件对表1的结果进行多元线性回归拟合,对模型进行方差分析,结果见表2。由表2可知,模型P<0.05,表示模型显著;说明该模型成立,本实验方法可靠。失拟项P=0.3263>0.05,不显著,表明回归方程无失拟因素存在,回归式拟合的较好。进一步说明在试验范围内可以用来解释和预测试验结果。模型中的A、B、C的“P”值均小于0.05,说明其对山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒包封率有显著影响;相关性R2=0.9276,校正决定系数RAdj 2=0.8346,仅有约10%的山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒包封率总变异不能由此模型进行解释。综上表明,此模型拟合度较好。
表2
通过响应面设计法优化得到制备山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的最佳制备条件为:内水相与油相的体积比为1:9,初乳与外水相的体积比为1:10,泊洛沙姆188的浓度为0.69%,所得山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的包封率高达66.82%。
实施例2山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的表征
(1)粒径电位检测及透射电镜观察
分别取实施例1中制备得到的山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒(CYPP)和空白聚乳酸羟基乙酸纳米粒(BP)(其制备方法同实施例1,所不同的是,在制备初乳时,以等体积的去离子水作为内水相代替山药多糖溶液所制备的纳米粒),使用马尔文粒径分析仪分析两种纳米粒的粒径和电势,结果见表3。
表面形态使用透射电镜和扫描电镜分析,结果见图1。
表3
从表3可以看出,CYPP的粒径较BP的粒径大,其原因在于其包裹了多糖;纳米粒的Zeta电势均为负值,CYPP的Zeta电势绝对值较BP大,Zeta电势的绝对值越大说明纳米粒稳定性越好;PDI指示的是纳米粒粒径分布的均匀度,PDI越小说明纳米粒大小越均匀,分散性也就越好,从表中看出所制备的纳米粒的多分散性(PDI)小于0.3,说明其分散性较好。
由透射电镜图可以看出,山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒(CYPP)和空白聚乳酸羟基乙酸纳米粒(BP)分布均匀,粒子均呈圆整的球形,大小均一,表面光滑。扫描电镜下,观察纳米粒CYPP呈均匀圆整的球体,且球体大小均一,纳米球囊壁致密无孔。电镜及粒径、电势分析表明山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒具有优良的物理化学性质。
(2)体外药物释放
选择PBS(PH=7.4)作为释放介质,其中包含0.08%吐温80,其作用是增加纳米粒在PBS中的溶解度和湿润度。将5mL 1mg/mL的山药多糖(CYP)和5mL 1mg/mL的山药多糖PLGA纳米粒(CYPP)置于透析袋中,密封好透析袋后置于释放介质中,并密封瓶口,置于摇床中在37℃下恒温振荡(80rpm)。定时取样(0.5h,1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,36h,48h,72h,96h),取样后加入等量含有0.08%吐温80的PBS,用硫酸苯酚法测定多糖含量,计算药物累积释放百分率。
由山药多糖(CYP)和山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒(CYPP)的体外释放结果(图2)可知,CYP在前24h药物累积释放百分率为53.86%,在48h时几乎释放完全且药物累积释放百分率随时间的增加并无明显的上升。而CYPP在前24h药物累积释放百分率为42.84%,且随时间的增加,药物累积释放百分率呈逐渐上升趋势。对比两条曲线可知,CYPP较CYP有明显的缓释效果,这是由于纳米粒的粒径使它具有特殊的表面效应和小尺寸效应,从而减缓了药物的释放。
实施例3山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒体外免疫增强活性比较
以根据最佳制备条件制备的山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒(CYPP)为研究对象,以山药多糖(CYP)和空白聚乳酸羟基乙酸(BP)作为对照,探索其体外对小鼠淋巴细 胞增殖的影响。
(1)脾脏淋巴细胞的准备
用颈椎脱臼法处死小鼠,75%乙醇浸泡3-5min。在超净台内,将小鼠置于一平皿中,左侧面朝上,在最后一根肋骨处打开皮肤和腹腔,小心取出脾脏,将脾移入200目钢筛。用剪刀和镊子将脾脏破碎,加入少许PBS,用玻璃研磨棒轻轻研磨脾脏,边研边加PBS(加5mL左右即可),使细胞悬液流入平皿中。将细胞悬液混匀后加入10mL离心管中,以1500r·min-1离心8min,弃上清,加入适量红细胞裂解液,并用吸管吹打均匀后静置3min,以1500r·min-1离心8min,沉淀经PBS反复洗涤2次。用RPMI-1640细胞培养液调节细胞密度至2.8×106个·mL-1。
(2)最大安全浓度的测定
用RPMI-1640细胞培养液分别将CYPP和CYP自0.8mg·mL-1倍比稀释至11个浓度。在96孔细胞培养板中,加入各浓度的CYPP和CYP,每孔100μL,每个浓度重复4孔,同时加入RPMI-1640细胞培养液设为细胞对照组,将所得到的淋巴细胞悬液加入细胞培养板,除空白调零孔外其余孔中,每孔100μL。置于细胞培养箱中37℃、5%CO2条件下连续培养48h后,每孔加入30μL MTT,继续培养4h,加入DMSO 100μL裂解细胞,微量震荡器震荡5min,待沉淀完全溶解,酶联免疫检测仪中测定570nm波长处的吸光值(A570值)。CYPP和CYP组的A570值显著高于细胞对照组时,表示CYPP和CYP促进细胞生长显著。选择A570值不显著低于细胞对照组时的CYPP和CYP的最大浓度作为它们的最大安全浓度。
表4
由表4可知,CYPP浓度在800-400μg·mL-1时的A570值显著小于细胞对照(P<0.05),浓度200μg·mL-1至0.781μg·mL-1与细胞对照差异均不显著(P>0.05),且浓度为1.562μg·mL-1 1时A570值高于对照组,说明在此浓度,CYPP促进淋巴细胞的生长。CYP在800μg·mL-1的A570值显著小于细胞对照(P<0.05),在浓度400μg·mL-1至0.781μg·mL-1与细胞对照差异均不显著(P>0.05),且浓度为100μg·mL-1到12.5μg·mL-1时和浓度为0.781μg·mL-1时A570值均高于对照组,说明在此浓度范围内,CYP促进淋巴细胞的生长。CYPP在200μg·mL-1时的A570值不显著小于细胞对照组(P>0.05),CYP在400μg·mL-1时的A570值不显著小于细胞对照组(P>0.05)。因此,将200μg·mL-1和400μg·mL-1分别定为CYPP和CYP的最大安全浓度。
(3)淋巴细胞增殖测定
淋巴细胞制备同上,将细胞悬液加到96孔细胞板中,每个样品重复12个孔,每孔80μL,其中4个孔每孔加LPS(10μg·mL-1)20uL,另外4个孔每孔加PHA(5μg·mL-1)20μL,剩余4个孔每孔加RPMI-1640细胞培养液(不含小牛血清)20μL。用LPS刺激B淋巴细胞转化,用PHA刺激T淋巴细胞转化。37℃、5%CO2条件下培养44h后,每孔加入30μL MTT,继续培养4h。离心后将每孔中的上清弃去,加入100μL DMSO,在微量振荡器上振荡5min左右使沉淀完全溶解。用酶联免疫仪检测570nm波长处的吸光值(A570)。
由图3可知,在药物单独刺激淋巴细胞增殖的情况下,CYPP组在12.5-200μg·mL-1浓度的A570值均显著高于CYP组和BP组(P<0.05),CYP组在12.5-100μg·mL-1浓度的A570值均显著高于BP组(P<0.05)。图3表明这些浓度下刺激淋巴细胞生长。
如图4所示,在药物协同LPS作用对淋巴细胞增殖的情况下,在浓度为 12.5-200μg·mL-1时,CYPP组的A570值均为最高,并且均显著高于LPS对照组(P<0.05),且在12.5-200μg·mL-1时显著高于BP组(P<0.05);CYP组在12.5-200μg·mL-1时的A570值均显著高于LPS对照组(P>0.05),且在12.5-25μg·mL-1均显著高于BP组。见图4,表明它们在这些浓度均能协同LPS促进淋巴细胞增殖,并且CYPP协同LPS作用促进淋巴细胞增殖的效果在适合浓度下强于CYP。
如图5所示,在药物协同PHA刺激时淋巴细胞增殖的情况下,浓度范围在12.5-25μg·mL-1时和100-200μg·mL-1,CYPP组的A570值均为最高,并且均显著高于PHA对照组及细胞对照组(P<0.05),且在12.5μg·mL-1时和100-200μg·mL-1时均显著高于CYP组(P<0.05),在浓度为200μg·mL-1时的A570值最高;CYP组在12.5-200μg·mL-1时的A570值均显著高于PHA组(P<0.05),见图5。表明CYPP和CYP在这些浓度时,能协同PHA促进淋巴细胞的增殖,并且CYPP协同PHA作用促进淋巴细胞增殖的效果强于CYP,且显效范围大。
根据上述体外刺激淋巴细胞增值试验结果可以得出山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒能够单独和协同LPS、PHA分别刺激T、B淋巴细胞增殖,结果显示所有浓度组均显著比对照组高。说明本发明涉及的山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒能够提高山药多糖的免疫活性,可用于提高动物机体免疫功能以达到抵抗疾病的目的。
Claims (3)
1.一种制备山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒的方法,其特征在于,它包括如下步骤:
(1)取山药多糖溶于水中,得到内水相;将聚乳酸羟基乙酸和丙酮混合后搅拌,得到油相;将泊洛沙姆188溶于水中,得到外水相;
(2)将步骤(1)中制备得到的内水相加入步骤(1)中制备得到的油相中,经超声得到稳定的油包水型初乳;将油包水型初乳加入外水相中,经超声得到水包油包水型复乳;水包油包水型复乳经减压蒸发和离心后收集上清液,即得山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒;
步骤(1)中,内水相中,山药多糖的浓度为2~20mg/mL;
步骤(1)中,油相中,聚乳酸羟基乙酸的浓度为10~40mg/mL;
步骤(1)中,外水相中,泊洛沙姆188的质量百分比为0.1~0.7%;
步骤(2)中,内水相和油相的体积比为1:3~9;
步骤(2)中,油包水型初乳和外水相的体积比为1:4~10。
2.权利要求1中制备得到的山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒。
3.权利要求2所述的山药多糖聚乳酸羟基乙酸纳米粒在制备免疫增强药物中的应用。
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