TWI727411B - 口服藥物傳遞系統及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種口服藥物傳遞系統，其包含仿生礦化載體以及酵母膠囊。前述仿生礦化載體包含金屬有機骨架和生物大分子，金屬有機骨架具有一內部空間，生物大分子被包覆於金屬有機骨架之內部空間中。而前述酵母膠囊裝載仿生礦化載體。藉此，本發明之口服藥物傳遞系統可保護其中所包覆的生物大分子抵抗胃腸道中的pH值變化和蛋白酶，使所包覆的生物大分子維持活性，並可靶向腸道的微皺褶細胞，使本發明之口服藥物傳遞系統以膜吞噬模式有效地跨上皮運輸以突破黏膜屏障。

Description

口服藥物傳遞系統及其製備方法
本發明係關於一種藥物傳遞系統及其製備方法，特別是一種口服藥物傳遞系統及其製備方法。
藥物為具有療效且能治療疾病、減輕病患痛苦或預防人類疾病的物質，包含天然成分、化學合成物質以及生物製劑等。而一般藥物的給藥方式可區分為注射方式(例如靜脈注射、肌肉注射或皮下注射等)、內服方式(例如經胃腸道口服用藥、舌下含錠及口含錠等)以及外用方式(例如經皮膚黏膜用藥、經皮吸收用藥及經鼻腔黏膜或肺部呼吸道用藥等)。
口服給藥係以吞服藥物經胃腸黏膜吸收，並藉由血流輸送到身體的各個部位使其在體內發揮作用。口服給藥無需使用針且方便使用，有利於患者的自我管理，因此被認為是一種很有前途的給藥方式。此外，胃腸道具有誘導粘膜免疫(分泌性免疫球蛋白A，S-IgA)和全身免疫應答(血清免疫球蛋白G，IgG)的優點，因此若遞送的藥物為疫苗，可藉由口服疫苗誘發完全的免疫應答。
然而，口服給藥仍存在問題，例如胃腸道中的pH值變化可能會使有效成分為蛋白質的口服藥變性，並被胃腸道蛋白酶降解。口服給藥也易遇到腸道上緊密排列的上皮細胞所構成的黏膜屏障而降低其效力。此外，若欲以口服方式引發強效免疫反應的先決條件為疫苗製劑在粘膜上的有效攝取。因此，如何發展出一種新型口服藥物傳遞系統，其可保護其中所包覆的生物大分子不受胃腸道的環境影響，並可有效地將生物大分子遞送至體內之標的，儼然成為現今藥學領域的重要發展目標。
有鑒於此，本發明提供一種口服藥物傳遞系統，可藉由生物模擬礦化的金屬有機骨架保護所包覆的生物大分子，抵抗胃腸道中高度酸性和蛋白酶降解的環境，使所包覆的生物大分子維持活性，並可協同作用作為遞送載體和佐劑。而裝載仿生礦化載體的酵母膠囊可靶向腸道的微皺褶(microfold,M)細胞，使口服藥物傳遞系統以膜吞噬模式有效地跨上皮運輸以突破黏膜屏障，再藉由胞吞作用進入巨噬細胞中，並聚集於腸繫膜淋巴結中，產生有效且持久的免疫反應。
本發明另提供一種口服藥物傳遞系統之製備方法，其為簡單的一鍋法製備仿生礦化載體，藉由溫和的超音波處理有機配位體和金屬離子以合成奈米級的金屬有機骨架，並進一步模擬生物體分泌無機礦物質形成外骨骼的方式 將生物大分子包覆於金屬有機骨架中，以形成表面帶有正電荷的仿生礦化載體。並藉由靜電力將仿生礦化載體裝載至表面帶有負電荷的酵母膠囊中，以形成口服藥物傳遞系統。
本發明之一態樣係在於提供一種口服藥物傳遞系統，其包含仿生礦化載體和酵母膠囊。前述仿生礦化載體表面帶有正電荷且包含金屬有機骨架和生物大分子。前述金屬有機骨架具有一內部空間，且金屬有機骨架之表面具有複數個孔洞。前述生物大分子被包覆於金屬有機骨架之內部空間中。前述酵母膠囊係由一酵母菌移除細胞質之β-葡聚醣細胞壁殼所構成，且酵母膠囊之表面帶有負電荷，前述酵母膠囊藉由靜電力裝載前述仿生礦化載體。
依據前述之口服藥物傳遞系統，其中前述仿生礦化載體之粒徑可介於25nm至100nm之間。
依據前述之口服藥物傳遞系統，其中前述金屬有機骨架可為MIL-53(Al,Fe,Cr)、MIL-100(Al,Fe,Cr)、MIL-101(Al,Fe,Cr)、MIL-127(Al,Fe,Cr)、PCN-88(Cu)、NU-1000(Zr)或UIO-66(Zr)。
依據前述之口服藥物傳遞系統，其中前述生物大分子可為核酸或蛋白質。進一步地，前述核酸可係選自寡或聚雙股DNA、寡或聚單股DNA及寡或聚單股RNA組成之群組。
依據前述之口服藥物傳遞系統，其中前述酵母菌可為啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念 珠菌(Candida albicans)、深紅酵母菌(Rhodotorula rubra)或圓酵母(Torulopsis utilis)。
本發明之另一態樣係在於提供一種口服藥物傳遞系統之製備方法，其包含提供混合溶液、進行包覆步驟、收集仿生礦化載體、提供第一溶液、提供第二溶液以及進行裝載步驟。前述混合溶液包含有機配位體、金屬離子、生物大分子和水。包覆步驟係將混合溶液以一超音波振盪方式使有機配位體與金屬離子進行配位反應以形成內部空間，並將生物大分子以原位包覆於內部空間中以形成仿生礦化載體，其中仿生礦化載體之表面帶有正電荷。而第一溶液包含仿生礦化載體，第二溶液包含酵母膠囊，其中酵母膠囊係由酵母菌以化學方式移除其細胞質之β-葡聚醣細胞壁殼所構成，且酵母膠囊表面帶有負電荷。裝載步驟係將第一溶液與第二溶液混合後進行振盪培養一振盪時間，藉由靜電力將仿生礦化載體裝載至酵母膠囊中以形成口服藥物傳遞系統。
依據前述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中前述混合溶液中之有機配位體、金屬離子和生物大分子的濃度比可為1：1：0.004至1：1：0.018。
依據前述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中前述有機配位體可為2-氨基對苯二甲酸(2-amino terephthalic acid)、對苯二甲酸(terephthalic acid)、3,3’-(萘-2,7-二基)二苯甲酸[3,3’-(naphthalene -2,7-diyl)dibenzoic acid]、3,3’,5,5’-偶氮苯四甲酸 (3,3’,5,5’-azobenzenetetracarboxylic acid)或聯苯-4,4’-二甲酸(biphenyl-4,4’-dicarboxylic acid)。
依據前述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中前述金屬離子係由一金屬鹽類溶於水解離而形成，且前述金屬鹽類可為AlCl3、Al2(SO4)3、Al(NO3)3、異丙醇鋁、FeCl3、Fe2(SO4)3、Fe(NO3)3、CuCl2、CuSO4、Cu(NO3)2、ZrCl4、Zr(NO3)4、Zr(SO4)2、CrCl3、Cr(NO3)3或檸檬酸鋯。
依據前述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中前述生物大分子可為核酸或蛋白質。進一步地，前述核酸可係選自寡或聚雙股DNA、寡或聚單股DNA及寡或聚單股RNA組成之群組。
依據前述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中裝載步驟中第一溶液中之仿生礦化載體和第二溶液中之酵母膠囊的重量比可為1：1至2：1。
依據前述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中前述超音波振盪方式可以一超音波振盪器之30%至50%振幅於0℃處理前述混合溶液90至150分鐘。
依據前述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中前述裝載步驟之振盪時間可為2至6小時。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
100‧‧‧口服藥物傳遞系統
110‧‧‧仿生礦化載體
111‧‧‧金屬有機骨架
112‧‧‧生物大分子
120‧‧‧酵母膠囊
300‧‧‧口服藥物傳遞系統之製備方法
310、320、330、340、350、360‧‧‧步驟
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖繪示本發明之口服藥物傳遞系統之結構示意圖；第1B圖繪示本發明之仿生礦化載體之結構示意圖；第1C圖繪示本發明之口服藥物傳遞系統的作用機制示意圖；第2圖係繪示本發明之口服藥物傳遞系統之製備方法之流程圖；第3A圖為本發明實施例1之仿生礦化載體的穿透式電子顯微鏡照片圖；第3B圖為本發明實施例1之仿生礦化載體的元素線掃描圖；第3C圖為本發明實施例1之仿生礦化載體的PXRD圖譜；第3D圖為本發明實施例1之仿生礦化載體的孔徑分布圖；第3E圖為本發明實施例2之仿生礦化載體的β-Gal活性分析結果圖；第3F圖、第3G圖和第3H圖為本發明實施例1之仿生礦化載體於模擬胃腸道環境的穩定性分析結果圖；第3I圖為本發明實施例1之仿生礦化載體的粒徑和卵白蛋素釋放曲線圖；第4圖為本發明實施例3之仿生礦化載體的紫外和可見 光譜圖；第5A圖為本發明實施例4之口服藥物傳遞系統的掃描式電子顯微鏡照片圖和穿透式電子顯微鏡照片圖；第5B圖為本發明實施例4之口服藥物傳遞系統的介面電位分析圖；第5C圖為本發明實施例4之口服藥物傳遞系統的細胞毒性分析結果圖；第5D圖為本發明實施例4之口服藥物傳遞系統的共軛焦顯微鏡照片圖；第6A圖和第6B圖為巨噬細胞吞噬本發明實施例4之口服藥物傳遞系統的分析結果圖；第7A圖、第7B圖、第7C圖、第7D圖、第7E圖和第7F圖為本發明實施例4之口服藥物傳遞系統的體內傳輸途徑分析結果圖；第7G圖為以不同給藥方案給予本發明實施例4之口服藥物傳遞系統後試驗動物的OVA特異性S-IgA抗體和IgG抗體的濃度分析圖；第7H圖為給予3劑游離OVA、OVA@Al-MOFs和本發明實施例4之口服藥物傳遞系統後試驗動物的OVA特異性S-IgA抗體和IgG抗體的濃度分析圖；第7I圖為試驗動物的腸絨毛和肝臟的免疫組織化學染色結果圖；第7J圖為試驗動物血清中的AST和ALT表現水平分析結果圖； 第7K圖為試驗動物的胃、心臟、肺臟、脾臟和腎臟的免疫組織化學染色結果圖；第8圖為經本發明之口服藥物傳遞系統處理後大腦、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、胰臟和腎臟的非侵入式活體分子影像系統分析結果圖；第9圖為經本發明之口服藥物傳遞系統處理後試驗動物大腦組織的共軛焦顯微鏡照片圖；以及第10圖為經本發明之口服藥物傳遞系統處理後試驗動物大腦組織的免疫螢光染色結果圖。
下述將更詳細討論本發明各實施方式。然而，此實施方式可為各種發明概念的應用，可被具體實行在各種不同的特定範圍內。特定的實施方式是僅以說明為目的，且不受限於揭露的範圍。
除非另有說明，本說明書所用的科學與技術專有名詞之含義與本技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。再者，本說明書所用的名詞均涵蓋該名詞的單數型及複數型，除非另有指明。
所述「個體」或「患者」一詞係指能接受本發明之口服藥物傳遞系統的動物。在一較佳的實施方式中，所述動物為哺乳類。
在本說明書所述，「約」一詞在本文中代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技 術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的範圍、數量、數值與百分比均經過「約」的修飾。因此，除非另有說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值或參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。
請參考第1A圖和第1B圖，第1A圖繪示本發明之口服藥物傳遞系統100之結構示意圖，第1B圖繪示本發明之仿生礦化載體110之結構示意圖。口服藥物傳遞系統100包含仿生礦化載體110和酵母膠囊120。
仿生礦化載體110包含金屬有機骨架111與生物大分子112。具體而言，金屬有機骨架111具有一內部空間，且金屬有機骨架111之表面具有複數個孔洞。生物大分子112被包覆於金屬有機骨架111之內部空間中以形成表面帶正電荷的仿生礦化載體110。其中仿生礦化載體110之粒徑可介於25nm至100nm之間。進一步地，前述金屬有機骨架111可為MIL-53(Al,Fe,Cr)、MIL-100(Al,Fe,Cr)、MIL-101(Al,Fe,Cr)、MIL-127(Al,Fe,Cr)、PCN-88(Cu)、NU-1000(Zr)或UIO-66(Zr)。前述生物大分子112可為核酸或蛋白質，其中核酸可係選自寡或聚雙股DNA、寡或聚單股DNA及寡或聚單股RNA組成之群組。
酵母膠囊120係由酵母菌移除細胞質之β-葡聚醣細胞壁殼所構成，且酵母膠囊120之表面帶有負電荷，且前述酵母膠囊120藉由靜電力裝載前述仿生礦化載體110，以形成口服藥物傳遞系統100。其中前述酵母菌可為啤酒酵 母菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、深紅酵母菌(Rhodotorula rubra)或圓酵母(Torulopsis utilis)。
藉此，本發明之口服藥物傳遞系統100可藉由生物模擬礦化的金屬有機骨架111保護所包覆的生物大分子112，抵抗胃腸道中高度酸性和蛋白酶降解的環境，使所包覆的生物大分子112維持活性，並可協同作用作為遞送載體和佐劑。而裝載仿生礦化載體110的酵母膠囊120可靶向腸道的微皺褶(microfold,M)細胞，使口服藥物傳遞系統100以膜吞噬模式有效地跨上皮運輸以突破黏膜屏障，再藉由胞吞作用進入巨噬細胞中，並聚集於腸繫膜淋巴結中，產生有效且持久的免疫反應。請參照第1C圖，其係繪示本發明之口服藥物傳遞系統100的作用機制示意圖。在口服本發明之口服藥物傳遞系統100之後，裝甲形式的金屬有機骨架111的仿生外骨骼可以有效地保護其包覆的生物大分子112避免受到胃腸道條件的影響。同時，酵母膠囊120可作為「特洛伊木馬」，將所裝載的仿生礦化載體110靶向M細胞並將生物大分子112/佐劑(金屬有機骨架111)一起穿過緊密堆積的黏膜上皮細胞傳遞到腸淋巴組織的誘導位點。隨後經抗原呈現細胞(例如巨噬細胞)吞噬作用後，口服藥物傳遞系統100最終累積在腸繫膜淋巴結中，並激活抗原特異性黏膜S-IgA抗體和血清IgG抗體的免疫應答。
請參照第2圖，其係繪示本發明之口服藥物傳遞系統之製備方法300之流程圖。口服藥物傳遞系統之製備方 法300包含步驟310、步驟320、步驟330、步驟340、步驟350和步驟360。
步驟310為提供混合溶液，前述混合溶液包含有機配位體、金屬離子、生物大分子和水。其中有機配位體、金屬離子和生物大分子的濃度比可為1：1：0.004至1：1：0.018。有機配位體可為2-氨基對苯二甲酸(2-amino terephthalic acid)、對苯二甲酸(terephthalic acid)、3,3’-(萘-2,7-二基)二苯甲酸[3,3’-(naphthalene-2,7-diyl)dibenzoic acid]、3,3’,5,5’-偶氮苯四甲酸(3,3’,5,5’-azobenzenetetracarboxylic acid)或聯苯-4,4’-二甲酸(biphenyl-4,4’-dicarboxylic acid)。金屬離子係由一金屬鹽類溶於水解離而形成，且前述金屬鹽類可為AlCl3、Al2(SO4)3、Al(NO3)3、異丙醇鋁、FeCl3、Fe2(SO4)3、Fe(NO3)3、CuCl2、CuSO4、Cu(NO3)2、ZrCl4、Zr(NO3)4、Zr(SO4)2、CrCl3、Cr(NO3)3或檸檬酸鋯。生物大分子可為核酸或蛋白質。進一步地，核酸可係選自寡或聚雙股DNA、寡或聚單股DNA及寡或聚單股RNA組成之群組。
步驟320為進行包覆步驟，係將混合溶液以一超音波振盪方式使有機配位體與金屬離子進行配位反應以形成內部空間，並將生物大分子以原位包覆於內部空間中以形成仿生礦化載體，所得到的仿生礦化載體之表面帶有正電荷。前述超音波振盪方式可以一超音波振盪器之30%至50%振幅於0℃處理前述混合溶液90至150分鐘。
步驟330為收集仿生礦化載體，其可經由減壓濃縮、離心、過濾、清洗或乾燥等步驟來達成。
步驟340為提供第一溶液，其中第一溶液包含經由步驟310至步驟330所得到的仿生礦化載體。
步驟350為提供第二溶液，包含酵母膠囊，其中酵母膠囊係由酵母菌以化學方式移除其細胞質之β-葡聚醣細胞壁殼所構成，且酵母膠囊表面帶有負電荷。例如藉由鹼、酸和有機溶劑處理酵母菌，獲得β-葡聚醣細胞壁殼，以製備酵母膠囊。較佳地，可先利用酸鹼破壞酵母菌，再利用異丙醇及丙酮溶液去除其細胞質。前述酵母菌可為啤酒酵母菌、白色念珠菌、深紅酵母菌或圓酵母。
步驟360為進行裝載步驟，係將第一溶液與第二溶液混合後進行振盪培養一振盪時間，藉由靜電力將仿生礦化載體裝載至酵母膠囊中以形成口服藥物傳遞系統。前述振盪時間可為2至6小時。其中第一溶液中之仿生礦化載體和第二溶液中之酵母膠囊的重量比可為1：1至2：1。
據此，本發明之口服藥物傳遞系統之製備方法，其為簡單的一鍋法製備仿生礦化載體，藉由溫和的超音波處理有機配位體和金屬離子以合成奈米級的金屬有機骨架，並進一步模擬生物體分泌無機礦物質形成外骨骼的方式將生物大分子包覆於金屬有機骨架中，以形成表面帶有正電荷的仿生礦化載體。並藉由靜電力將仿生礦化載體裝載至表面帶有負電荷的酵母膠囊中，以形成口服藥物傳遞系統。
以下將進一步藉由實施例說明前述口服藥物傳遞系統，並藉由實施例、比較實施例評估本發明之口服藥物傳遞系統所能達成之功效，惟實施例所列之條件非用以限制本發明所欲保護之範疇，合先敘明。
<實施例> 一、本發明之仿生礦化載體及其製備方法 [實施方式一] 1.1 仿生礦化載體之製備與結構和特性分析
於本試驗例中，先製備實施例1之仿生礦化載體，以測試最佳製備條件。並利用穿透式電子顯微鏡(JEM-2100F,JEOL Technics)觀察實施例1之仿生礦化載體的形態。利用奈米粒徑及介面電位分析儀(Zetasizer，3000 HS，Malvern Instruments,Worcestershire)分析實施例1之仿生礦化載體的粒徑和介面電位(zeta potential)，並使用X射線衍射儀(Cu Kα radiation,XRD-6000,Shimadzu)測定實施例1之仿生礦化載體的晶體結構，並以BJH(Barrett-Joyner-Halenda)方法(BELSORP-mini,BEL)分析實施例1之仿生礦化載體的孔徑。
實施例1之仿生礦化載體所使用的有機配位體為2-氨基對苯二甲酸(2-amino terephthalic acid)，金屬鹽類為異丙醇鋁，生物大分子為蛋白質，並以卵白蛋素(ovalbumin,OVA)作為例示，詳細製備流程如下述。將0.5mmol的異丙醇鋁、0.5mmol的2-氨基對苯二甲酸和3×10-3 mmol的OVA溶解在30mL的去離子水中以得到混合溶液，並在室溫下震盪60秒。再使用VCX 750超音波振盪器(Sonics & Materials,Newtown,CT,USA)以40%振幅於0℃溫和地超音波處理混合溶液120分鐘，以得到實施例1之仿生礦化載體(以下以OVA@Al-MOFs表示)。將獲得的OVA@Al-MOFs以離心力18,000rpm離心30分鐘，再用去離子水洗滌兩次，並於50℃下以十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液(5% w/w)沖洗以除去表面的游離OVA。
此外，為了量化OVA@Al-MOFs中的包覆含量(loading content,LC)和包覆率(loading efficiency,LE)，將稱重的測試樣品溶解在乙二胺四乙酸(EDTA，0.1M)中，然後在室溫下振盪3小時以釋放包覆於其中的OVA。再使用Pierce TM BCA蛋白質測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham)定量釋放的OVA的量，並使用以下等式計算OVA@Al-MOFs中OVA的包覆含量和包覆率。
Figure 108131118-A0101-12-0014-1
Figure 108131118-A0101-12-0014-2
請參照下表一，為以不同濃度比的2-氨基對苯二甲酸、Al離子和OVA所製備而得的OVA@Al-MOFs的包覆含量和包覆率。
Figure 108131118-A0101-12-0014-3
Figure 108131118-A0101-12-0015-4
由表一的結果顯示，隨著OVA的進料濃度增加，OVA的包覆含量增加，在OVA、Al離子和2-氨基對苯二甲酸的濃度比為0.007：1.0：1.0時達到最大值，其包覆含量為14.7±1.3%，包覆率為94.1±4.8%(n=6)，因此後續試驗中的仿生礦化載體以此製備條件製備。
請參照第3A圖至第3D圖，第3A圖為OVA@Al-MOFs的穿透式電子顯微鏡照片圖，第3B圖為OVA@Al-MOFs的元素線掃描，第3C圖為OVA@Al-MOFs的PXRD圖譜，第3D圖為OVA@Al-MOFs的孔徑分布圖。
由第3A圖的結果顯示，經過優化的OVA@Al-MOFs具有爆米花形狀，並如動態光散射的分析結果可見，OVA@Al-MOFs的平均粒徑為65.2±8.9nm，介面電位為28.7±4.8mV。此外，由第3B圖的結果顯示，將穿透式電子顯微鏡樣品進行能量色散X射線光譜線掃描分析，OVA@Al-MOFs係由Al、O、N和S的元素所組成其中Al和O源自Al-MOFs，N和S源自OVA，此結果顯示OVA成功被包覆於Al-MOFs中。由第3C圖的結果顯示，藉由粉末X射線衍射(PXRD)分析OVA@Al-MOFs的晶體結構，經前述合成的OVA@Al-MOFs的PXRD圖與純 MIL-53(Al)-NH2的模擬圖案相似，顯示包覆OVA後的OVA@Al-MOFs不會顯著改變晶體結構。另由第3D圖的結果顯示，藉由BJH方法測定的OVA@Al-MOFs晶體中孔徑的直徑約為15.0±3.0Å。
1.2 仿生礦化載體之穩定性分析
為了確定本發明之仿生礦化載體是否能夠在不同環境溫度下長時間保持蛋白質抗原的活性，試驗上以前述的製備條件製備包覆另一例示的β-半乳糖苷酶(β-gal)於Al-MOFs中作為實施例2之仿生礦化載體(以下以β-Gal@Al-MOFs表示)，並進一步測量β-Gal@Al-MOFs中β-Gal的活性，以確定蛋白質活性的穩定性。在量化β-Gal活性之前，將β-Gal@Al-MOFs儲存在4℃、20℃或37℃的生理鹽水中預定的間隔(0-63天)，再以試劑套組(Thermo Fisher Scientific)進行評估。
請參照第3E圖，為β-Gal@Al-MOFs的β-Gal活性分析結果圖，其繪製了在4℃、20℃或37℃下儲存9周的游離β-Gal和β-Gal@Al-MOFs的穩定性。在所有測試的環境溫度下，游離β-Gal在2周內其活性顯著地喪失，而β-Gal@Al-MOFs的β-Gal在9周後其保留了約90%的活性。上述結果顯示本發明之仿生礦化載體具有在環境溫度下長期保存其包覆的蛋白活性的優勢，具有可解決蛋白質藥物或疫苗需保存於低溫的問題。
此外，口服藥物的另一需要解決的問題在於需保持胃腸道運輸期間的物理穩定性。本試驗進一步以體外試 驗評估本發明之仿生礦化載體於胃腸道條件下的穩定性，試驗上分別將OVA@Al-MOFs在37℃下培養於模擬胃液(SGF)和腸液(SIF)的環境下。其中模擬胃液的環境為培養於含有0.2% w/v的NaCl和0.5mg/mL胃蛋白酶的HCl溶液中(pH 2.0)。模擬腸液的環境為培養於含有2.5mg/mL的胰蛋白酶的水溶液中(pH 7.0)。在預定的持續時間後，藉由偵測OVA@Al-MOFs的粒徑和OVA含量可得知經培養後OVA@Al-MOFs的穩定性。並藉由傅立葉變換紅外光譜(Perkin-Elmer,Buckinghamshire)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進一步分析包覆於OVA@Al-MOFs中的OVA的完整性。
請參照第3F圖至第3H圖，為OVA@Al-MOFs於模擬胃腸道環境的穩定性分析結果圖，其中第3F圖為OVA@Al-MOFs的粒徑和OVA含量的分析結果圖，第3G圖為傅立葉變換紅外光譜光譜圖，第3H圖為SDS-PAGE結果圖。
第3F圖的結果顯示，不論是在模擬胃液或是腸液的環境下培育OVA@Al-MOFs，OVA@Al-MOFs的粒徑和其中OVA含量與未處理對照組結果相似(P>0.05)。此外，第3H圖的SDS-PAGE結果，無論是以模擬胃液或是腸液的環境培育的OVA@Al-MOFs，其中OVA仍保持其完整性(分別為泳道7和9)，而游離的OVA以模擬胃液或是腸液的環境培育後，可明顯觀察到降解的條帶(分別為泳道6和8)。已知傅立葉變換紅外光譜對蛋白質的二級結構敏感，在 第3G圖傅立葉變換紅外光譜的結果顯示，將OVA@Al-MOFs培育於模擬胃液或是腸液的環境，與對照組的OVA@Al-MOFs相比沒有改變其結構特徵，而天然存在的OVA可以觀察到於1640-1660cm-1和1510-1560cm-1條帶範圍內有分別為來自醯胺I和II的訊號。前述分析數據顯示，OVA@Al-MOFs對模擬的胃和腸道條件具有抗性，並顯示OVA@Al-MOFs具有在體內胃腸道中保持完整的潛力。
由此部分的試驗例結果顯示，本發明之仿生礦化載體可以於所欲包覆地生物大分子外形成保護性外骨骼，起到裝甲的作用，在生理鹽水儲存期間和惡劣胃腸道條件下提供非凡的穩定性。不論是暴露於環境溫度或胃酸後，金屬有機骨架可防止包覆於其中的蛋白質展開，從而降低其變性。此外，仿生礦化載體的小孔徑(例如OVA@Al-MOFs的直徑約15Å)則可提供有效屏障，以避免相對較大的胃腸道蛋白酶(例如胃蛋白酶的大小為45×49×62Å3，胰蛋白酶的大小為49×39×33Å3)與其中所包覆的蛋白質接觸，限制了胃腸道蛋白酶的蛋白水解作用。因此，本發明之仿生礦化載體可以承受胃的酸性條件，並使其中所包覆的蛋白質在胃腸道的高消化環境中保持活性。
1.3 仿生礦化載體之體外降解性分析
本試驗進一步評估本發明之仿生礦化載體在進入胃腸道後釋放其中所包覆的生物大分子的條件。當仿生礦化載體被巨噬細胞以胞吞作用吞噬並暴露於具有高濃度磷 酸根離子的細胞內液時，預期可藉由磷酸根離子競爭性替換仿生礦化載體的有機配位體，使仿生礦化載體的金屬有機骨架解體，從而釋放包覆於其中的生物大分子。
請參照第3I圖，為OVA@Al-MOFs的粒徑和OVA釋放曲線圖。結果顯示，在模擬細胞內液體的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中的OVA@Al-MOFs可以緩慢崩解，並於7天內持續減少其粒徑和釋放包覆於其中的OVA。
[實施方式二]
於本試驗例中，另製備實施例3之仿生礦化載體，所使用的有機配位體為2-氨基對苯二甲酸，金屬鹽類為異丙醇鋁，生物大分子為核酸，並以DNA作為例示，詳細製備流程如下述。將0.5mmol的異丙醇鋁、0.5mmol的2-氨基對苯二甲酸和100ng的DNA溶解在30mL的去離子水中以得到混合溶液，並在室溫下震盪60秒。再使用VCX 750超音波振盪器以40%振幅於0℃溫和地超音波處理混合溶液120分鐘，以得到實施例3之仿生礦化載體(以下以DNA@Al-MOFs表示)。將獲得的DNA@Al-MOFs以離心力18,000rpm離心30分鐘，再用去離子水洗滌兩次，除去表面的游離DNA。所得到的DNA@Al-MOFs進一步地分別在37℃下培養於模擬胃液和腸液的環境下，以測試其於胃腸道環境下的穩定性。
請參照第4圖，為DNA@Al-MOFs的紫外和可見光譜圖，由紫外和可見光譜圖的結果顯示，對照組的DNA@Al-MOFs於260nm可見有吸收峰，顯示 DNA@Al-MOFs確實將DNA包覆於其中，且在模擬胃液與腸液的環境下，DNA@Al-MOFs於260nm的吸收峰沒有明顯變化，證明DNA@Al-MOFs所包覆的DNA未被胃腸道的強酸與酵素破壞。
二、本發明之口服藥物傳遞系統及其製備方法
2.1 口服藥物傳遞系統之製備與結構、特性和細胞毒性分析
以前述最佳製備仿生礦化載體的條件進一步製備本發明之口服藥物傳遞系統。於此試驗例中所使用的仿生礦化載體為OVA@Al-MOFs，將製備好的OVA@Al-MOFs(150mg)溶於10mL的去離子水中以得到第一溶液。試驗上另預備酵母膠囊(yeast capsules,YCs)，於本試驗例中，利用鹼、酸和有機溶劑處理啤酒酵母菌，以去除其細胞質獲得β-葡聚醣細胞壁殼，以得到製備好的酵母膠囊，其可進一步冷凍乾燥並保存以利後續使用。將製備好且乾燥的酵母膠囊(100mg)於100mL的去離子水中培育30分鐘以得到第二溶液，將第一溶液和第二溶液混合後，進行振盪培養4小時後，使仿生礦化載體裝載至酵母膠囊內以得到實施例4之口服藥物傳遞系統(以下以OVA@Al-MOFs/YCs表示)，以離心力2,500rpm離心10分鐘收集OVA@Al-MOFs/YCs。再使用去離子水徹底洗滌所收集的OVA@Al-MOFs/YCs，以除去未裝載的OVA@Al-MOFs。再使用BCA蛋白質測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific)在水溶液中定量未裝載的 OVA@Al-MOFs來測定酵母膠囊中OVA@Al-MOFs的量。
此外，為了量化OVA@Al-MOFs/YCs中的包覆含量和包覆率，以不同重量的OVA@Al-MOFs和酵母膠囊混合比例製備OVA@Al-MOFs/YCs，並進一步計算其包覆含量和包覆率。請參照下表二，為以不同重量比的OVA@Al-MOFs和酵母膠囊所製備而得的OVA@Al-MOFs/YCs的包覆含量和包覆率。
Figure 108131118-A0101-12-0021-5
由表二的結果顯示，在OVA@Al-MOFs和酵母膠囊的進料重量比為1.5：1.0時，OVA@Al-MOFs/YCs的包覆含量達到最大值(7.0±0.8%)，且其包覆率為91.5±2.6%(n=6)，因此後續試驗中的口服藥物傳遞系統以此製備條件製備。
先利用掃描式電子顯微鏡(Hitachi SU8010，Hitachi High- Technologies)和穿透式電子顯微鏡(JEM-2100F)觀察OVA@Al-MOFs/YCs的形態。請參照第5A圖，為OVA@Al-MOFs/YCs的掃描式電子顯微鏡照片圖和穿透式電子顯微鏡照片圖，其中每一大圖為掃描式電子顯微鏡照片圖，每一小圖為相應樣本的穿透式電子顯微 鏡照片圖，左圖為未移除細胞質的啤酒酵母菌，中間為經處理後所得到的酵母膠囊(YCs)，右圖為OVA@Al-MOFs/YCs。第5A圖的結果顯示未移除細胞質的啤酒酵母菌，其形態為圓形且直徑約為3至5μm。而由掃描式電子顯微鏡照片圖可見，經處理除去細胞質和β-葡聚醣外的其他細胞壁多醣後，可明顯萎縮結構的空心細胞壁殼，並且在穿透式電子顯微鏡照片圖中可見對比度顯著降低。大多數的酵母膠囊具有一個直徑約為900nm的大孔(箭頭所指之處)，其為芽痕。此外，由掃描式電子顯微鏡照片圖可見，在裝載OVA@Al-MOFs後OVA@Al-MOFs/YCs具有緻密的結構。
再利用奈米粒徑及介面電位分析儀分析OVA@Al-MOFs/YCs的介面電位。請參照第5B圖，為OVA@Al-MOFs/YCs的介面電位分析圖。介面電位測量的結果顯示，酵母膠囊帶有負電荷，並且在裝載帶有正電荷的OVA@Al-MOFs(28.7±4.8mV)後，介面電位從-18.3mV變為8.4mV。
在OVA@Al-MOFs/YCs細胞毒性分析的部分，將不同濃度的OVA(0-200μg/mL)包覆於OVA@Al-MOFs/YCs中，並分別將游離的OVA、Al-MOFs、YCs和前述製備好的OVA@Al-MOFs/YCs與人上皮Caco-2細胞共培養24小時後，使用CellTiter-Glo®冷光細胞存活測定試劑組(Promega，Madison， Wisconsin，USA)評估細胞存活率。所述人上皮Caco-2細胞為一可靠的腸道細胞毒性研究體外模型。
請參照第5C圖，為OVA@Al-MOFs/YCs的細胞毒性分析結果圖。結果顯示，不論所包覆的OVA濃度為何，經OVA@Al-MOFs/YCs處理的人上皮Caco-2細胞的細胞存活率與未處理的對照組相比未檢測到顯著差異(P>0.05)。此外，經游離的OVA、YCs、Al-MOFs處理的人上皮Caco-2細胞的細胞存活率與未處理的對照組相比亦未檢測到顯著差異(P>0.05)。
進一步地為了追踪裝載至酵母膠囊中的OVA@Al-MOFs，分別以FITC螢光標記酵母膠囊(FITC-YCs)和以Alexa Flour 633螢光標記OVA(AF633-OVA)，再利用共軛焦顯微鏡(Zeiss LSM780,Carl Zeiss,Jena GmbH)進行觀察。請參照第5D圖，為OVA@Al-MOFs/YCs的共軛焦顯微鏡照片圖。如第5D圖的結果顯示，AF633-OVA@Al-MOFs(粉紅色)確實成功加裝載至FITC-YCs(綠色)中。
2.2 口服藥物傳遞系統之巨噬細胞吞噬及其成熟分析
為了激活所需的免疫反應，抗原呈現細胞必須接種疫苗。於本試驗中藉由具有可以識別酵母膠囊上β-葡聚醣的Dectin-1受體的鼠巨噬細胞系(RAW264.7)評估所製備的OVA@Al-MOFs/YCs的被吞噬狀況。將RAW264.7巨噬細胞(1×106cells/mL)與AF633-OVA@Al-MOFs/FITC-YCs共同培育6、12和24小時後，收集經處理過的 RAW264.7巨噬細胞，與含有LysoTrackerTM Red DND-99的新鮮培養基共同培養，以PBS中徹底洗滌後以用DAPI染色，再以共軛焦顯微鏡進行觀察。
請參照第6A圖，為RAW264.7巨噬細胞的共軛焦顯微鏡照片圖。由第6A圖的結果顯示，在培養6小時後，可見FITC-YCs的綠色螢光與以LysoTracker標定胞內體/溶酶體的紅色螢光有清晰的細胞內共位，顯示OVA@Al-MOFs/YCs的受體靶向吞噬作用係藉由內溶酶體運輸路徑，這對於抗原的遞送和處理至關重要。目前已知巨噬細胞可吞噬直徑為1-10μm的大顆粒。而隨著培育時間(12小時)的增加，可檢測到片段化的綠色螢光，顯示因存在大範圍的細胞內蛋白酶，可在細胞內檢測到被吞噬的FITC-YCs的降解。更長的培育時間(24小時)導致FITC-YCs幾乎完全降解；同時，在細胞中亦可觀察到均勻的粉紅色螢光(AF633-OVA)。前述結果顯示，當酵母膠囊被酵素降解後，裝載於其中的OVA@Al-MOFs直接暴露於含磷酸根離子的細胞內液體，導致Al-MOFs裝甲的分解，觸發其包覆的OVA分子(抗原)和崩解的的Al離子(佐劑)的細胞內釋放。
疫苗的細胞吞噬可能導致巨噬細胞的活化，進而正調控其共刺激因子(如CD80和第二型MHC分子)的表面表達，此為巨噬細胞成熟的標誌；並促進促炎細胞因子[例如白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)和白細胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)的分泌，這對調節免疫反應起了 重要作用。試驗上將包覆的OVA濃度為100μg/mL的OVA@Al-MOFs/YCs及其組分(游離的OVA、Al-MOFs、OVA@Al-MOFs和YCs)分別與RAW264.7巨噬細胞培育以評估巨噬細胞的成熟，試驗上另包含以未處理的細胞作為對照組，以及以脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)處理的細胞作為正對照組，其為已知的巨噬細胞成熟劑。培育24小時後，分別收集各組中的細胞和培養上清液。將收集的細胞以接合APC的抗小鼠CD80抗體(eBioscience,San Diego)或接合Alexa Fluor 647的抗小鼠第二型MHC分子抗體(BioLegend,San Diego)標記，再使用BD Accuri TM C6流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose)進行分析。並藉由Cytometric Bead Array(CBA,BD Bioscience)檢測的培養上清液中IL-6和IL-1β細胞因子的濃度。
請參照第6B圖，為巨噬細胞成熟標記的分析結果圖。由流式細胞儀的分析結果顯示，以LPS激活的巨噬細胞表現出高濃度的成熟標誌物(CD80和第二型MHC分子)和促炎細胞因子(IL-6和IL-1β)。而處理OVA@Al-MOFs的組別與處理游離OVA的組別相比，CD80、第二型MHC分子、IL-6和IL-1β表達具有顯著地(P<0.05)提升，顯示Al-MOFs可以作為有效的以佐劑為基礎的抗原遞送系統。值得注意的是，僅通過YCs的刺激可顯著增加了CD80，第二型MHC分子、IL-6和IL-1β的細胞表達水平(P<0.05)，顯示YCs可用作為佐劑。此外，處理OVA@Al-MOFs/YCs的組別與處理OVA@Al-MOFs的組別相比，除了可提供 YCs固有的佐劑功能外，還能增強成熟標誌物和促炎細胞因子在細胞中的表達水平(P<0.05)。前述的實驗結果顯示，本發明之口服藥物傳遞系統可以藉由受體靶向吞噬作用被巨噬細胞吞噬，並刺激巨噬細胞的成熟和細胞因子釋放，藉以增強巨噬細胞在體內的免疫刺激活性。
2.3 口服藥物傳遞系統之體內傳輸路線
本試驗將進一步研究本發明之口服藥物傳遞系統如何通過黏膜屏障以改善OVA@Al-MOFs的傳輸能力。為了確認OVA@Al-MOFs/YCs的體內傳輸途徑，實驗組的試驗動物口服給予螢光標記的OVA@Al-MOFs/YCs，在處理後4小時犧牲試驗動物，並收集其胃腸道和腸道淋巴系統(腸繫膜淋巴結中的絨毛和派氏結)進行處理，再使用共軛焦顯微鏡離體確認FITC-YCs的分佈，試驗上另包含處理AF633-OVA@Al-MOFs的試驗動物作為對照組。此外，為了研究本發明之口服藥物傳遞系統的傳輸是否依賴腸道淋巴系統，試驗動物另口服昆布多醣(laminarin)進行口服預處理，其可以阻止激動性β-葡聚醣與Dectin-1的結合。試驗上在口服給予螢光標記的OVA@Al-MOFs/YCs前3小時，以口服給予試驗動物會抑製藥物進入淋巴系統昆布多醣做為實驗對照組，以及僅處理昆布多醣做為負對照組。實驗對照組和負對照組施用的昆布多醣劑量皆為25mg/kg。於本試驗例中試驗動物為6至8周齡的C57BL/6小鼠(BioLASCO Taiwan)。
請參照第7A圖至第7F圖，為本發明實施例4之口服藥物傳遞系統的體內傳輸途徑分析結果圖，其中第7A圖為實驗組的M細胞示意圖及共軛焦顯微鏡照片圖，第7B圖為實驗組的腸道中巨噬細胞示意圖及共軛焦顯微鏡照片圖，第7C圖為實驗組的淋巴管示意圖及共軛焦顯微鏡照片圖，第7D圖為實驗組的腸繫膜淋巴結(MLN)示意圖及共軛焦顯微鏡照片圖，第7E圖為實驗對照組的腸道示意圖及共軛焦顯微鏡照片圖，第7F圖為負對照組的腸道示意圖及共軛焦顯微鏡照片圖。
第7A圖的結果顯示，有大量的FITC-YCs(綠色)粘附/靶向M細胞(紅色)，並進入派氏結中。第7B圖至第7D圖的結果顯示，FITC-YCs(綠色)可被巨噬細胞吞噬(紅色)，並藉由腸繫膜淋巴管傳輸，最後累積在腸繫膜淋巴結中。前述結果證明，YCs的β-葡聚醣參與M細胞受體Dectin-1的識別，在胃腸道及其鄰近的淋巴組織中存在大量的巨噬細胞，以及腸繫膜淋巴結為激活免疫反應提供了重要的位點。
另第7E圖的結果顯示，在後口服給藥的實驗對照組中，只有少數AF633-OVA@Al-MOFs(粉紅色)進入派氏結。第7F圖的結果顯示，以昆布多醣預處理的負對照組的絨毛或派氏結中未檢測到來自FITC-YCs的顯著螢光信號，顯示昆布多醣確實阻斷了腸淋巴傳輸。
2.4 口服藥物傳遞系統之OVA特異性粘膜免疫應答和全身免疫應答
本試驗例進一步研究OVA@Al-MOFs/YCs在體內產生抗原特異性S-IgA抗體和IgG抗體的能力。試驗上以口服給藥OVA@Al-MOFs/YCs於C57BL/6小鼠，並在第0天，第7天和/或第8天以不同初免-追加組合進行口服免疫，每次口服劑量為100μg的OVA。免疫後收集試驗動物的糞便萃取物和血清樣品，並在7周內使用ELISA分別測量所收集到的糞便萃取物和血清樣品的OVA特異性S-IgA抗體和IgG抗體水平。前述初免-追加組合分別為：第0天給予1劑的OVA@Al-MOFs/YCs，第0天和第7天或第0天和第14天給予2劑的OVA@Al-MOFs/YCs，或第0天、第7天和第14天給予3劑的OVA@Al-MOFs/YCs。此外，試驗上另包含於第0天、第7天和第14天給予含有相同量OVA(100μg)的3劑游離OVA或OVA@Al-MOFs的對照組小鼠(每組n=6)。
請參照第7G圖，為以不同給藥方案給予本發明實施例4之口服藥物傳遞系統後試驗動物的OVA特異性S-IgA抗體和IgG抗體的濃度分析圖，可見給予1劑或2劑疫苗的C57BL/6小鼠體內S-IgA抗體和IgG抗體力價相對較低，而給予3劑疫苗的C57BL/6小鼠體內S-IgA抗體和IgG抗體力價穩定增加，並可得到強黏膜免疫應答和全身免疫應答(P<0.05)。
試驗上另分別給予3劑可溶性OVA(游離OVA)、OVA@Al-MOFs和OVA@Al-MOFs/YCs，以評估所誘發的免疫應答效力。請參照第7H圖，為給予3劑游離 OVA、OVA@Al-MOFs和OVA@Al-MOFs/YCs後試驗動物的OVA特異性S-IgA抗體和IgG抗體的濃度分析圖。第7H圖的結果顯示，不同疫苗的效力存在相當大的差異，單獨施用OVA或OVA@Al-MOFs所刺激的S-IgA抗體和IgG抗體力價與OVA@Al-MOFs/YCs所刺激的S-IgA抗體和IgG抗體力價具有顯著的差異(P<0.05)。可溶性OVA的低效力可能是因蛋白水解酶的抗原降解所導致，而OVA@Al-MOFs的效力可歸因於口服吸收的低劑量抗原。相較之下，OVA@Al-MOFs/YCs可在胃腸道傳輸過程中保護抗原，並特異性靶向M細胞增加OVA@Al-MOFs/YCs的跨上皮吸收，以及促進巨噬細胞通過淋巴系統易位使OVA@Al-MOFs/YCs最終在腸繫膜淋巴結中積累，產生高濃度的黏膜S-IgA抗體和血清IgG抗體。
2.5 口服藥物傳遞系統之體內細胞毒性分析
為了測量OVA@Al-MOFs/YCs的潛在體內毒性，在試驗2.4結束後的在一周內將口服給予3劑OVA@Al-MOFs/YCs免疫計畫的測試小鼠安樂死(即口服疫苗的第7周)，取出其主要器官(小腸、肝臟、胃、心臟、肺臟、脾臟和腎臟)，以10%中性緩衝福爾馬林固定，並用蘇木精和伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。再使用IX83倒立顯微鏡(Olympus)拍攝HE染色的組織切片照片。此外，為了評估肝臟中的毒性，使用商業試劑盒(Thermo Fisher Scientific)測量血清中的天冬氨酸轉氨酶 (aspartate aminotransferase,AST)和丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)的活性。
請參照第7I圖至第7K圖，第7I圖為試驗動物的腸絨毛和肝臟的免疫組織化學染色結果圖，第7J圖為試驗動物血清中的AST和ALT表現水平分析結果圖，第7K圖為試驗動物的胃、心臟、肺臟、脾臟和腎臟的免疫組織化學染色結果圖。結果顯示，給予OVA@Al-MOFs/YCs的治療組和未處理的對照組相比，皆未觀察到任何組織有炎症反應。此外，治療組和對照組血清中所表現的AST和ALT水平相似(P>0.05)，顯示本發明之口服藥物傳遞系統為一安全載體，其可傳遞其中所包覆的生物大分子，在重複免疫接種時產生高水平的黏膜S-IgA抗體和血清IgG抗體以及更持久的免疫力。
2.6 口服藥物傳遞系統之傳輸至大腦的路線
前述試驗已證實本發明之口服藥物傳遞系統可被巨噬細胞吞噬後進入腸淋巴系統，本試驗將研究本發明之口服藥物傳遞系統是否能進一步藉由淋巴系統將其中所包覆的生物大分子傳輸至大腦中。試驗上治療組的試驗動物口服給予螢光標記的OVA@Al-MOFs/YCs，在口服後6小時犧牲試驗動物，使用非侵入式活體分子影像系統(in vivo imaging system,IVIS)確認試驗動物大腦、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、胰臟和腎臟中FITC-YCs的分佈，並取出大腦組織切片進行免疫螢光染色，以共軛焦顯微鏡觀察並拍攝照片。試驗上另包含未處理的試驗動物作為對照組。
請參照第8圖至第10圖，第8圖為經本發明之口服藥物傳遞系統處理後大腦、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、胰臟和腎臟的非侵入式活體分子影像系統分析結果圖，第9圖為經本發明之口服藥物傳遞系統處理後試驗動物大腦組織的共軛焦顯微鏡照片圖，第10圖為經本發明之口服藥物傳遞系統處理後試驗動物大腦組織的免疫螢光染色結果圖。第8圖和第9圖的結果顯示，口服OVA@Al-MOFs/YCs的治療組在大腦中確實可以偵測到FITC-YCs的分佈，而對照組則未偵測到FITC的訊號。此外，由第10圖的結果可見，FITC-YCs的綠色螢光與標定巨噬細胞的紅色螢光有清晰的細胞內共位，顯示OVA@Al-MOFs/YCs可藉由被巨噬細胞吞噬後，經由淋巴系統進入大腦，證實本發明之口服藥物傳遞系統具有將其中所包覆的生物大分子傳遞至大腦中的能力。
綜合上述，本發明之口服藥物傳遞系統，可藉由生物模擬礦化的金屬有機骨架保護所包覆的生物大分子，抵抗胃腸道中高度酸性和蛋白酶降解的環境，使所包覆的生物大分子維持活性，並可協同作用地遞送載體和佐劑。而裝載仿生礦化載體的酵母膠囊可靶向腸道的M細胞，使口服藥物傳遞系統以膜吞噬模式有效地跨上皮運輸以突破黏膜屏障，再藉由胞吞作用進入巨噬細胞中，並聚集於腸繫膜淋巴結中，產生有效且持久的免疫反應。並可進一步地在被巨噬細胞吞噬後經由淋巴系統進入大腦，將其中所包覆的生 物大分子傳遞至大腦中，可做為以口服給藥傳遞治療腦部藥物的口服藥物傳遞系統。
本發明之口服藥物傳遞系統之製備方法，可以簡單的一鍋法製備仿生礦化載體，藉由溫和的超音波處理有機配位體和金屬離子以合成奈米級的金屬有機骨架，並進一步模擬生物體分泌無機礦物質形成外骨骼的方式，將生物大分子包覆於金屬有機骨架中，以形成表面帶有正電荷的仿生礦化載體。並藉由靜電力將仿生礦化載體裝載至表面帶有負電荷的酵母膠囊中，以形成口服藥物傳遞系統。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
100‧‧‧口服藥物傳遞系統
110‧‧‧仿生礦化載體
120‧‧‧酵母膠囊

Claims (14)

  1. 一種口服藥物傳遞系統，包含：一仿生礦化載體，其表面帶有正電荷，包含：一鋁金屬有機骨架，具有一內部空間，且該鋁金屬有機骨架之表面具有複數個孔洞；及一生物大分子，該生物大分子被包覆於該鋁金屬有機骨架之該內部空間中；以及一酵母膠囊，係由一酵母菌移除細胞質之一β-葡聚醣細胞壁殼所構成，且該酵母膠囊之表面帶有負電荷，該酵母膠囊藉由一靜電力裝載該仿生礦化載體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之口服藥物傳遞系統，其中該仿生礦化載體之粒徑介於25nm至100nm之間。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之口服藥物傳遞系統，其中該生物大分子為一核酸或一蛋白質。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之口服藥物傳遞系統，其中該核酸係選自寡或聚雙股DNA、寡或聚單股DNA及寡或聚單股RNA組成之群組。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之口服藥物傳遞系統，其中該酵母菌為啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、深紅酵母菌(Rhodotorula rubra)或圓酵母(Torulopsis utilis)。
  6. 一種如申請專利範圍第1項所述之口服藥物傳遞系統之製備方法，包含：提供一混合溶液，該混合溶液包含一有機配位體、一鋁離子、該生物大分子和水；進行一包覆步驟，係將該混合溶液以一超音波振盪方式使該有機配位體與該鋁離子進行配位反應以形成該內部空間，並將該生物大分子以原位包覆於該內部空間中以形成該仿生礦化載體，其中該仿生礦化載體之表面帶有正電荷；收集該仿生礦化載體；提供一第一溶液，該第一溶液包含該仿生礦化載體；提供一第二溶液，該第二溶液包含該酵母膠囊，其中該酵母膠囊係由該酵母菌以一化學方式移除其細胞質之該β-葡聚醣細胞壁殼所構成，且該酵母膠囊表面帶有負電荷；以及 進行一裝載步驟，係將該第一溶液與該第二溶液混合後進行振盪培養一振盪時間，藉由該靜電力將該仿生礦化載體裝載至該酵母膠囊中以形成該口服藥物傳遞系統。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中該混合溶液中之該有機配位體、該鋁離子和該生物大分子的濃度比為1：1：0.004至1：1：0.018。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中該有機配位體為2-氨基對苯二甲酸(2-amino terephthalic acid)、對苯二甲酸(terephthalic acid)、3,3’-(萘-2,7-二基)二苯甲酸[3,3’-(naphthalene-2,7-diyl)dibenzoic acid]、3,3’,5,5’-偶氮苯四甲酸(3,3’,5,5’-azobenzenetetracarboxylic acid)或聯苯-4,4’-二甲酸(biphenyl-4,4’-dicarboxylic acid)。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中該鋁離子係由一金屬鹽類溶於水解離而形成，且該金屬鹽類為AlCl3、Al2(SO4)3、Al(NO3)3或異丙醇鋁。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中該生物大分子為一核酸或一蛋白質。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中該核酸係選自寡或聚雙股DNA、寡或聚單股DNA及寡或聚單股RNA組成之群組。
  12. 如申請專利範圍第6項所述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中於裝載步驟中該第一溶液中之該仿生礦化載體和該第二溶液中之該酵母膠囊的重量比為1：1至2：1。
  13. 如申請專利範圍第6項所述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中該超音波振盪方式係以一超音波振盪器之30%至50%振幅於0℃處理該混合溶液90至150分鐘。
  14. 如申請專利範圍第6項所述之口服藥物傳遞系統之製備方法，其中該裝載步驟之該振盪時間為2至6小時。
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