CN109876023B - 一种灵芝孢子油纳米乳及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝孢子油纳米乳及其制备方法与应用。该灵芝孢子油纳米乳包括灵芝孢子油、乳化剂、助乳化剂和水，其中，灵芝孢子油的含量为体积百分比5～15％，乳化剂的含量为质量体积比2～11％，助乳化剂的含量为体积百分比0.06～0.2％，水为余量。本发明通过乳化剂和助乳化剂混匀后，再加入灵芝孢子油和水，均质，得到均一稳定的，且更具有安全性的灵芝孢子油纳米乳；所耗时间缩短，所用辅料减少，更减少制备过程中的人力物力成本。本发明通过优化配方和制备方法，得到的灵芝孢子油纳米乳具有强效的自由基清除能力、抗氧化能力、抗肿瘤效果和降血糖作用，与此同时降低辅料对机体的潜在毒性作用，使其更具有推广意义。

Description

一种灵芝孢子油纳米乳及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药领域和食品领域，特别涉及一种灵芝孢子油纳米乳及其制备方法与应用。

背景技术

在我国，最早论及灵芝(Ganoderma lucidum)的中医药学著作是《神农本草经》，在其中皆被归于“上药”。灵芝孢子(Ganoderma lucidum spores)是灵芝子实体依靠菌丝提供营养发育成熟时从菌盖弹射出来的极为细小的颗粒，是灵芝的生殖细胞；其对于人体的医药价值更高于灵芝子实体，兼具抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫力、保护神经系统、降低血脂、抗炎以及辅助化疗和/或放疗治疗肿瘤等多重功效，可用于中老年人和体质虚弱者的日常保健，可强身健体，增加免疫力，预防疾病，因而日益受到广泛关注。

灵芝孢子油(Ganoderma lucidum spore oil，GLSO)是灵芝孢子经过破壁处理，由超临界二氧化碳流体(SFE-CO₂)萃取方法所得的脂溶性物质，其成分主要有多糖类、三萜类、甾醇类和脂溶性维生素等。其中以不饱和脂肪酸和甘油三酯等物质为其药用活性成分，但是这类活性成分易氧化变质，而且孢子油中的挥发油成分沸点低、对热和光敏感易失效，以上提及的因素都会使灵芝孢子油的品质和使用价值受影响。因此，保护灵芝孢子油活性物质不被氧化是提高灵芝有效成分含量和纯度的主要方法。此外，经低温萃取的灵芝孢子油常温下为油状液体，具有极强的脂溶性，是难以被人体消化吸收的，使用效果不尽明显；因此，有相当一部分的灵芝孢子油被直接排泄掉，造成不必要的浪费。以上这些因素都有可能限制灵芝孢子油在医药食品领域的实际应用。

近年来，纳米技术的发展也促进了灵芝孢子油在医药领域的应用发展，不少研究人员在相关领域也展开了对其剂型改良的研究；但其制备工艺繁琐，耗时过长，不利于实现广泛的生产应用。又或者在合成过程中，加入大量乳化剂和助乳化剂等成分，期望获得粒径小且分散均一的纳米粒子，但是过量加入表面活性剂类物质，也将导致其潜在毒性增加，反而使生物应用受限，不利于孢子油推广开发。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种灵芝孢子油纳米乳。

本发明的另一目的在于提供上述灵芝孢子油纳米乳的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述灵芝孢子油纳米乳及其制备方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种灵芝孢子油纳米乳，包括如下成分：灵芝孢子油、乳化剂、助乳化剂和水；其中，灵芝孢子油的含量为体积百分比5～15％，乳化剂的含量为质量体积比2～11％，助乳化剂的含量为体积百分比0.06～0.2％，水为余量。

所述的灵芝孢子油的含量优选为体积百分比8～12；更优选为体积百分比10％。

所述的乳化剂的含量优选为质量体积比1～3％；更优选为质量体积比2％。

所述的助乳化剂的含量优选为体积百分比0.1～0.3％；更优选为体积百分比0.2％。

所述的乳化剂为泊洛沙姆和吐温中的一种或两种。

所述的泊洛沙姆优选为泊洛沙姆188(P188)。

所述的吐温优选为吐温80(TW80)。

所述的助乳化剂为聚乙二醇和乙醇中的一种或两种。

所述的聚乙二醇优选为聚乙二醇400(PEG₄₀₀)。

所述的灵芝孢子油纳米乳的制备方法，包括如下步骤：

(1)当乳化剂为固体时，步骤如下：

(1-A)先用水溶解乳化剂，得到的乳化剂溶液；

(1-B)将乳化剂溶液和助乳化剂混匀，得到乳化体系；

(1-C)往乳化体系中加入灵芝孢子油，混合均匀，再往其中加入水，得到初乳溶液；

(1-D)将初乳溶液进行均质，得到均一稳定的灵芝孢子油纳米乳；

(2)当乳化剂为液体时，步骤如下：

(2-A)将乳化剂和助乳化剂混匀，得到乳化体系；

(2-B)往乳化体系中加入灵芝孢子油，混合均匀，再往其中加入水，得到初乳溶液；

(2-C)将初乳溶液进行均质，得到均一稳定的灵芝孢子油纳米乳。

步骤(1-B)和步骤(2-A)中所述的混匀的条件优选为：搅拌混合，搅拌速率为200～800转/分，搅拌时间为1～10分钟；更优选为：搅拌速率为300～500转/分，搅拌时间为2～3分钟。

步骤(1-C)和步骤(2-B)中所述的混合均匀的条件优选为：通过搅拌混合，搅拌速率为600～900转/分，搅拌时间为2～20分钟；更优选为：搅拌速率为700～800转/分，搅拌时间为3～5分钟。

步骤(1-D)和步骤(2-C)中所述的均质条件优选为：初步均质压力为100～300巴(bar)，均质时间为1～10分钟；接着高压均质，高压均质压力为800～1300巴(bar)，均质时间为5～60分钟；更优选为：初步均质压力为200巴(bar)，均质时间为2～5分钟；高压均质压力为800～1200巴(bar)，均质时间为5～20分钟，更优选的均质时间为5～10分钟。

所述的灵芝孢子油纳米乳为乳白色，呈规整圆球形，粒径为20～150nm；更优选的粒径为90～110nm；最优选的粒径为95～105nm。

所述的灵芝孢子油纳米乳在生物医药领域中的应用。

所述的灵芝孢子油纳米乳在制备抗肿瘤药物、抗氧化剂、抗自由基制剂和降血糖药物中的应用。

所述的肿瘤包括胃腺癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌等。

所述的自由基包括脂质过氧化物、超氧阴离子、羟基自由基和单线态氧。

本发明相比于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明提供的灵芝孢子油纳米乳，配方中加入低剂量、低生物毒性的乳化剂和助乳化剂，通过物理交联以构成稳定的复合凝聚膜，再结合以高压均质技术来有效改善孢子油的低水溶性，使其更有利于人体吸收。凝聚膜材料也可以在生理环境中有效降解，在剂型开发应用的过程中对人体低毒性损害，有望实现高效低毒的抗肿瘤治疗或其辅助预防目标，充分发挥灵芝孢子油的功效。

2、本发明提供的制备方法，极大程度地缩短了制备时间，减少人力物力以及资源的不必要浪费；并且制样量大、重现性好，可以实现灵芝孢子油纳米乳的低成本大规模产业化生产，并不会对环境产生二次污染问题。

3、本发明提供的灵芝孢子油纳米乳，相比于普通灵芝孢子油，其更具有强效的自由基清除能力，并且对多种自由基有效。纳米技术的应用充分扩大灵芝孢子油的清除自由基和抗氧化能力，从而实现了灵芝孢子油实现自由基累积过多相关的(如炎症、衰老、癌症和某些自身免疫性疾病等)多种人体疾病的治疗及其辅助治疗目标。

4、本发明可以实现灵芝孢子油纳米乳的大规模制备，为其在抗肿瘤、抗氧化和降低血糖等多方面生物医学领域的应用奠定基础。

附图说明

图1为灵芝孢子油纳米化前后的流体动力学粒度对比表征图。

图2为灵芝孢子油纳米化前后样品所表征的透射电镜形貌表征图。

图3为灵芝孢子油纳米化前后样品所表征的原子力显微镜形貌图。

图4为普通孢子油和孢子油纳米乳对不同细胞的生长抑制效果图；其中，图(a)为纳米化孢子油GLSO@P188/PEG₄₀₀对MGC803人胃腺癌细胞、BGC823人胃腺癌细胞、SW480人结肠癌细胞、NCM460人结肠上皮细胞和L02人肝细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)；图(b)为普通孢子油和纳米乳A～C抑制MGC803人胃腺癌细胞的细胞存活率图；图(c)为普通孢子油和纳米乳A～C抑制BGC823人胃腺癌细胞的细胞存活率图；图(d)为普通孢子油和纳米乳A～C抑制SW480人结肠癌细胞的细胞存活率图。

图5为灵芝孢子油纳米化前后样品对ABTS^·+自由基的清除效果图；其中，图(a)为普通灵芝孢子油清除ABTS^·+自由基的效果图；图(b)为纳米化灵芝孢子油GLSO@P188/PEG₄₀₀清除ABTS^·+自由基的效果图。

图6为灵芝孢子油纳米化前后样品处理人胃腺癌细胞MGC803后的细胞内总氧自由基(DCF)水平变化图；其中，图(a)为纳米化灵芝孢子油GLSO@P188/PEG₄₀₀调节细胞内活性氧水平的时间/浓度变化过程；图(b)为普通灵芝孢子油调节细胞内活性氧水平的时间/浓度变化过程；图(c)为DCF探针的荧光照片，从上至下分别为阴性对照组、普通孢子油组和孢子油纳米乳三组，从左到右分别为0分钟、10分钟、40分钟、80分钟、120分钟。

图7为灵芝孢子油纳米化前后样品处理人胃腺癌细胞MGC803后的细胞内脂质过氧化物(DHE)水平变化图；其中，图(a)为纳米化灵芝孢子油GLSO@P188/PEG₄₀₀调节细胞内活性氧水平的时间/浓度变化过程；图(b)为普通灵芝孢子油调节细胞内活性氧水平的时间/浓度变化过程；图(c)为DHE探针的荧光照片，从上至下分别为阴性对照组、普通孢子油组和孢子油纳米乳三组，从左到右分别为0分钟、10分钟、40分钟、80分钟、120分钟。

图8为灵芝孢子油纳米化前后样品对人胃腺癌细胞MGC803细胞周期分布的影响图；其中，图(a)是细胞周期检测结果图，图(b)是对凋亡峰(sub-G1)含量的统计结果图，图(b)是对DNA合成后期/细胞分裂期(G2/M期)含量的统计结果图。

图9为灵芝孢子油纳米化前后对人胃腺癌细胞MGC803细胞内半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族(Caspase)活性水平的影响图。

图10为不同处理对荷瘤裸鼠(MGC803肿瘤细胞)异种移植肿瘤的生长体积变化的影响图。

图11为不同处理对荷瘤裸鼠(MGC803肿瘤细胞)裸鼠体重变化的影响图。

图12为不同处理对荷瘤裸鼠(MGC803肿瘤细胞)异种移植肿瘤的瘤重图。

图13为不同处理对荷瘤裸鼠(MGC803肿瘤细胞)异种移植肿瘤的相对肿瘤体积比率图。

图14为经不同方式处理后裸鼠的血液指标分析图；其中，图(a)为血尿素氮的检测结果图，图(b)为血肌酐检测结果图，图(c)为谷丙转氨酶的检测结果图，图(d)为谷草转氨酶的检测结果图，图(e)肌酸激酶的检测结果图，图(f)为血糖的检测结果图；图中，1表示正常裸鼠，2表示阴性对照，3表示普通孢子油，4表示环磷酰胺，5表示孢子油纳米乳(1.5mL/kg)，6表示孢子油纳米乳(1.5mL/kg)。

图15为经不同方式处理后裸鼠的机体抗氧化能力效果图；其中，图(a)是总超氧化物歧化酶活力度的检测结果图，图(b)是丙二醛的检测结果图，图(c)是总谷胱甘肽过氧化物酶活力度的检测结果图；图中，1表示对照组，2表示普通孢子油，3表示孢子油纳米乳。

图16是不同的灵芝油纳米乳的外观照片图；其中，图a是试验组1在不同均质时间得到的灵芝油纳米乳的外观照片图，图b是试验组2在不同均质时间得到的灵芝油纳米乳的外观照片图，图c是试验组3在不同均质时间得到的灵芝油纳米乳的外观照片图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀的制备

一种灵芝孢子油纳米乳的制备方法，包括如下步骤：

(1)将泊洛沙姆P188固体颗粒(美国Sigma公司)分散于去离子水中，配制质量分数为10％的溶液，放置于4℃冰箱留存备用；

(2)取10mL步骤(1)制备的泊洛沙姆188(P188)溶液于烧杯中，然后加入100μLPEG₄₀₀(美国Sigma公司)，于室温下搅拌2分钟，转速为500转/分钟；

(3)取5mL灵芝孢子油(GLSO)缓慢注入步骤(2)制备的体系中，于室温下搅拌5分钟，转速为800转/分钟；继续向其中缓慢注入去离子水，使初乳溶液终体积成50mL；

(4)将步骤(3)得到的初乳溶液转入高压均质机。首先进行初步均质，均质压力为200巴(bar)，均质时间为2分钟；然后进行高压均质，均质压力为800巴(bar)，均质时间为5分钟，最后获得灵芝孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀。

实施例2孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG400的制备

一种灵芝孢子油纳米乳的制备方法，包括如下步骤：

(1)将泊洛沙姆P188分散于去离子水中，配制质量分数为10％的溶液，存于4℃冰箱，备用；

(2)取10mL步骤(1)制备的泊洛沙姆188(P188)溶液，然后加入100μL PEG₄₀₀，于室温下搅拌2分钟，转速为500转/分钟；

(3)取5mL灵芝孢子油(GLSO)缓慢注入步骤(2)制备的溶液中，于室温下搅拌4分钟，转速为800转/分钟；继续向其中缓慢注入去离子水，使初乳溶液终体积成50mL；

(4)将步骤(3)得到的初乳溶液转入高压均质机。首先进行初步均质，均质压力为200bar，均质时间为5分钟；然后进行高压均质，高压均质压力为1200bar，均质时间为5分钟，最后获得灵芝孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀。

实施例3孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG400的制备

一种灵芝孢子油纳米乳的制备方法，包括如下步骤：

(1)将泊洛沙姆P188分散于去离子水中，配制质量分数为10％的溶液，备用；

(2)取10mL步骤(1)得到的泊洛沙姆(P188)，然后加入100μL的PEG₄₀₀，于室温下搅拌2分钟，转速为300转/分钟；

(3)取5mL的灵芝孢子油(GLSO)缓慢注入步骤(2)得到的溶液中，于室温下搅拌3分钟，转速为800转/分钟；继续向其中注入去离子水，使初乳溶液终体积成50mL；

(4)将步骤(2)得到的初乳溶液转入高压均质机。首先进行初步均质，均质压力为200巴(bar)，均质时间为2分钟；然后进行高压均质，高压均质压力为1200巴(bar)，均质时间为10分钟，最后获得灵芝孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀。

实施例4孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀的体外表征

通过改变灵芝孢子油纳米乳的制备条件，筛选获得粒径较小、稳定性较好、分散均匀的纳米粒子，其中，实施例3制备得到的灵芝孢子油纳米乳效果最优。使用不同来源的灵芝孢子油按实施例3的条件制备灵芝孢子油纳米乳，分别得到纳米乳A、纳米乳B和纳米乳C。对纳米乳A、B和C进行检测，同时以未经纳米化处理的普通孢子油作为对照，检测结果如下：

通过DLS水合粒度的测量，可见不同来源的灵芝孢子油制备的各组纳米乳在水合粒径测量结果及粒子分散性上无显著性差异，流体力学直径分别为103.5±2.6、101.4±1.8、98.5±1.5nm(如图1所示)。

通过TEM透射电镜的表征可得知，三种来源不同的灵芝孢子油纳米乳粒径相近，分散均匀程度也相似。从图2可见，灵芝孢子油纳米粒子的水合粒径接近于100nm；而普通灵芝孢子油的粒径分布在50～500nm范围内，分散极不均匀，并且无规则统一的粒子形态，结果提示普通的灵芝孢子油在物理稳定性上存在明显的缺陷。

通过AFM原子力显微镜的观察，我们也同样发现了灵芝孢子油纳米化前后样品存在形态差异(如图3所示)，孢子油纳米乳的平均尺寸为101nm±1.6，平均高度为11.5nm±0.9，结果与图1、2的结论相符合。以上结果说明本发明优化摸索的孢子油纳米乳的制备方法重现性好，所得纳米乳性质稳定。

实施例5孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀的体外抗肿瘤活性及相关作用机制研究

选择以合成最优纳米乳的方案(按实施例3制备)以进行后续实施例讨论。本实施例对比研究了灵芝孢子油纳米化前后样品的体外抗肿瘤活性作用及其潜在作用机制。本实施例中使用的癌细胞系均购自美国ATCC公司。

I、检测体外抗肿瘤活性

用MTT比色法检测GLSO@P188/PEG₄₀₀和普通灵芝孢子油对于抑制MGC803人胃腺癌细胞、BGC823人胃腺癌细胞、SW480人结肠癌细胞、NCM460人结肠上皮细胞和L02人肝细胞生长的能力，具体实施操作步骤如下：

取对数生长期的细胞以2×10⁴个细胞/mL的密度接种于96孔板，接种体积为100μL，以DMEM(10％胎牛血清，1％双抗，即100单位/mL青霉素、50单位/mL链霉素)为细胞培养基，置于培养箱中培养(37℃、5％二氧化碳、95％相对湿度)。待细胞贴壁培养24小时后，分别加入系列浓度(以DMEM培养基配制)的GLSO@P188/PEG₄₀₀和普通灵芝孢子油GLSO孵育细胞，继续观察细胞生长状态，待72小时观察期结束后，通过MTT法检测细胞存活率。从图4(a)可以看出，孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀对MGC803人胃腺癌细胞的存活抑制作用稍强(半数抑制浓度IC₅₀为1.06μL/mL)；从图4(b)～(d)可看出，3种不同来源制备的孢子油纳米乳A、B和C(GLSO@P188/PEG₄₀₀)对肿瘤细胞MGC803、BGC823和SW480细胞存活率的抑制作用也非常明显，并且抑制细胞增殖能力均随浓度增加而增强，GLSO@P188/PEG₄₀₀(浓度：2μL/mL)使肿瘤细胞存活率分别降至15.6％～18.9％(MGC803人胃腺癌细胞)、16.8％～24.5％(BGC823人胃腺癌细胞)、25.6％～38.9％(SW480人结肠癌细胞)，均显著高于普通灵芝孢子油处理组。

II、检测体外清除自由基的能力

检测孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀(为纳米乳B)和普通灵芝孢子油GLSO体外清除自由基的作用能力。具体实施操作步骤如下：

(1)ABTS^+·工作液配制：取200μL ABTS溶液(7.4mmol/L，PBS配制)与0.1g MnO₂混合，于室温避光孵育12小时；以0.22μm滤膜过滤除去杂质；用pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释40-50倍后，酶标仪检测波长A_734nm＝0.7±0.02时，即为ABTS^+·工作液。

(2)阴性对照组：每孔先加入100μL磷酸盐缓冲液(PBS)，再加入100μL ABTS^+·工作液；

(4)实验组：孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀组，每孔加入100μL GLSO@P188/PEG₄₀₀(以PBS稀释配成系列终浓度)；GLSO组，每孔加入100μL GLSO(以PBS稀释配成系列终浓度)；再向每孔加入100μL ABTS^+·工作液。

(5)检测：上酶标仪检测，读取OD_734nm吸光值。

通过ABTS^+·自由基清除实验结果可以看出，普通灵芝孢子油(GLSO)组仅有较弱的自由基清除能力，普通孢子油GLSO组(以孢子油含量计，10μL/mL)的自由基清除率最高可达到32.3％(1小时)；而孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀组(以孢子油含量计，10μL/mL)的自由基清除率最高可达到69.8％(1小时)，比普通组高出2.16倍。这说明灵芝孢子油经纳米化设计后，可明显增强其自由基清除能力，推测与灵芝孢子油纳米化后，其比表面积增大有关，增加了与自由基反应接触的层面，更有利于清除水溶性自由基。

III、检测诱导肿瘤细胞产生ROS的能力

检测孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀在细胞水平上对活性氧水平下调的作用。众所周知，ROS活性氧族主要包括超氧阴离子、脂质过氧化物、羟基自由基和单线态氧等，正常情况下它们在体内处于动态平衡，而ROS平衡一旦被打破就会对细胞造成损伤，最终杀伤肿瘤细胞。接下来选用实施例3制得的孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀(即纳米乳B)诱导MGC803人胃腺癌细胞产生ROS的量(反映为DCF和DHE探针荧光值的上升以及荧光照片的荧光强度增加)，具体操作步骤如下：

(1)取对数生长期的细胞(2×10⁵个细胞/mL、100μL)接种于96孔板中，以DMEM为培养液(含有10％胎牛血清，1％双抗，100单位/mL青霉素，50单位/mL链霉素)支持细胞生长，将培养板置于培养箱(37℃、5％二氧化碳、95％相对湿度)中观察细胞的生长状态，待细胞贴壁至80％以上后，即可进行后续操作；

(2)抽走96孔板中旧培养基，并以PBS洗涤2～3次，然后加入DCF工作液(10μM，无酚红培养基配制)，于培养箱中孵育30分钟；

(3)向96孔培养板中依次加入普通孢子油GLSO组和孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀组系列浓度药物，于多功能酶标仪读取各组在120分钟内的荧光值(DCF：激发波长488nm/发射波长525nm)；同时记录各组荧光照片的时间变化过程。结果如图6(a)和(b)所示，普通灵芝孢子油GLSO组(浓度：1.6μL/mL)诱导MGC803人胃腺癌细胞产生约53.8％的活性氧(120分钟)；而孢子油纳米化后的GLSO@P188/PEG₄₀₀组(浓度：1.6μL/mL)诱导MGC803人胃腺癌细胞产生约88.9％的活性氧(120分钟)；并且如图6(c)所示，从荧光照片可以看出，在整个120分钟内的检测过程中，孢子油纳米化后得GLSO@P188/PEG₄₀₀对ROS水平的下调使DCF的荧光逐渐减弱，而普通孢子油对此作用不甚明显。

检测孢子油纳米化后的GLSO@P188/PEG₄₀₀对细胞内脂质过氧化物水平的影响能力，具体操作步骤同上述检测DCF探针方法。结果如图7(a)和(b)所示，普通灵芝孢子油GLSO组(浓度：1.6μL/mL)诱导产生约109.8％的活性氧(120分钟)，而孢子油纳米化后的GLSO@P188/PEG₄₀₀(浓度：1.6μL/mL)可迅速降低ROS至约25.8％(10分钟)，随后逐渐缓慢回升ROS水平，最终诱导产生约62.9％的活性氧(120分钟)。同时，图7(c)显示的荧光强度变化也与此结论一致。这说明了灵芝孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀相比于普通孢子油GLSO具有更显著的自由基清除能力。

IV、检测对肿瘤细胞生长周期的影响

取对数生长期的MGC803人胃腺癌细胞(2×10⁴个细胞/mL，6mL)接种于6cm细胞培养皿，然后置于培养箱中培养，待其贴壁生长24小时。先抽走旧培养基，以PBS洗净，然后取实施例3制得的GLSO@P188/PEG₄₀₀(即纳米乳B，以孢子油含量计，浓度：0.8、1.2和1.6μL/mL，以DMEM细胞培养基配制药液)加入细胞培养皿中(6mL/皿)，同时配制最终浓度为的灵芝孢子油GLSO组(以孢子油含量计，浓度：1.6μL/mL，以DMEM培养基配制药液)加入细胞中，用作对比实验组；继续观察细胞生长状态，待24小时的观察期结束后，以胰酶消化收集细胞；然后用500μL 70％乙醇固定细胞(-20℃，固定过夜)待用。通过PI染色后，用流式细胞术分析经孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG400和普通孢子油GLSO处理的MGC803人胃腺癌细胞的周期分布变化。解脱如图8所示，普通灵芝孢子油GLSO(浓度：1.6μL/mL)处理的细胞周期分布与阴性对照组相比无显著性变化，仅可观察到微弱的凋亡峰，从2.5％(阴性对照组)上升至3.2％(GLSO,浓度：1.6μL/mL)；而灵芝孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀(浓度：1.6μL/mL)可引起明显的细胞凋亡现象，经过灵芝孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀处理的凋亡峰(sub-G1)从的2.5％(阴性对照组)上升至43.8％(GLSO@P188/PEG₄₀₀，浓度：1.6μL/mL)；此外，灵芝孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀可引起肿瘤细胞明显的G2/M期阻滞，使其分布比例从10.6％(阴性对照组)上升至34.7％(GLSO@P188/PEG₄₀₀，浓度：1.6μL/mL)。综合来看，流式细胞周期分析的结果提示灵芝孢子油纳米化后可通过诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的方式来强烈抑制MGC803细胞的增殖。

V、检测对肿瘤细胞内调节半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族(Caspase)活性影响

灵芝孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀对MGC803人胃腺癌细胞的Caspase-3/8/9蛋白表达的水平影响程度。具体操作如下：

取对数生长期的MGC803人胃腺癌细胞接种于直径为10cm的培养皿(密度为1×10⁵个细胞/mL，10mL/皿)，待细胞贴壁培养24小时后，先抽走旧培养基，以PBS洗净残留培养基，再加入纳米化孢子油GLSO@P188/PEG₄₀₀(浓度：0.8、1.2和1.6μL/mL，以DMEM培养基配制药液)至培养皿中，普通灵芝孢子油GLSO(浓度：1.6μL/mL，以DMEM培养基配制药液)也如是加入到细胞培养皿中，继续观察培养24小时。抽走培养基，每个皿中加入80～120μL细胞裂解液(RIPA)于4℃环境下裂解细胞10分钟，再以细胞刮刀收集细胞；然后用涡旋振荡仪完全裂解细胞，然后离心(12,000转/分，10分钟，4℃)收集所有上清中的蛋白，然后通过BCA法测定蛋白浓度。每组各取100μg的细胞蛋白与3种半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族成员(即家族成员-3，-8，-9)底物混合，并在37℃环境下避光孵育2小时；于多功能酶标仪检测荧光吸收值(激发和发射波长分别为380和460nm)，最后计算半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族成员-3/8/9底物被激活的程度(％)。

实验结果如图9所示，经孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀处理后，MGC803人胃腺癌细胞内半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族成员-3/8/9水平明显升高，并且家族成员-8被激活的程度高达153.8％(孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀，浓度：1.6μL/mL)，高于家族成员-3/9被激活的程度。家族成员-3从100％(阴性对照组)升高至131.4％(孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀，浓度：1.6μL/mL)，家族成员-8从100％(阴性对照组)升高至153.8％(孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀，浓度：1.6μL/mL)，Caspase-9从100％(阴性对照组)升高至138.6％(孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀，浓度：1.6μL/mL)；而普通孢子油对MGC803细胞的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族并没有明显激活效果。这些结果提示了灵芝孢子油纳米化后的GLSO@P188/PEG₄₀₀可通过死亡受体途径和线粒体途径介导激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族成员-3/8/9，进而诱导肿瘤细胞凋亡。

以上结果充分说明：纳米化灵芝孢子油GLSO@P188/PEG₄₀₀较普通灵芝孢子油GLSO而言，具有更强的自由基清除能力，能明显下调肿瘤细胞内活性氧的水平，破坏其动态平衡；诱导肿瘤细胞发生凋亡和G2/M期阻滞，并能激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶家族成员表达水平，从而增强灵芝孢子油对MGC803人胃腺癌细胞的生长抑制作用。

实施例6孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀的体内抗肿瘤活性评价

对实施例3中制得的纳米化灵芝孢子油GLSO@P188/PEG₄₀₀(即纳米乳B)进行体内抗肿瘤活性评价，具体步骤如如下：

(1)MGC803人胃腺癌荷瘤裸鼠模型建立：

采购雄性BALB/C裸鼠40只，4周龄，体重20g左右(北京维通利华生物科技股份有限公司)。对购入的小鼠检疫10天；期间每日检查小鼠一次，以保证实验动物的健康状态。然后收集体外培养的MGC803人胃腺癌细胞，调整细胞悬液浓度为1×10⁷个细胞/mL，接种前向细胞悬液中加入基质胶(V_细胞/V_基质胶＝5/1)。接着，将裸鼠固定，用75％酒精常规消毒裸鼠右侧腋窝，待酒精完全挥发后，在皮下注射接种0.2mL细胞悬液于裸鼠右侧腋窝，按针时应注意避免注射细胞液的外溢。待肿瘤细胞接种7天后，进针处可见微小肿瘤形成。用游标卡尺隔日测量一次肿瘤长径及短径。待肿瘤体积增长至75～100mm³后将动物随机分组，一共分为5组，每组8只，分别为：空白对照组、环磷酰胺阳性对照组(40mg/kg)、普通灵芝孢子油GLSO组(以主药孢子油含量计，3mL/kg)、低剂量GLSO@P188/PEG₄₀₀组(以主药孢子油含量计，1.5mL/kg)和高剂量GLSO@P188/PEG₄₀₀组(以主药孢子油含量计，3mL/kg)。

(2)药物处理方式：环磷酰胺组裸鼠通过灌胃给药，每4天给药一次，一共给药7次；其余组的荷瘤裸鼠通过灌胃方式给药，隔天给药，一共给药14次，空白对照组给以纯水作对照，第28天后对各组裸鼠进行断颈处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(Tumor volume,TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长宽。

(3)检测结果如图10所示，随着实验时间的延长，空白对照组的肿瘤体积生长迅速，至28天时该组肿瘤平均体积值达到0.85cm³，而普通灵芝孢子油处理组(GLSO)的小鼠肿瘤体积在第28天时达到0.78cm³，这说明普通液体油状的灵芝孢子油并不能有效抑制小鼠体内肿瘤的生长；这可能归因于低水溶性的普通孢子油并不能够充分被小鼠吸收利用，以致于少量进入机体的孢子油难以发挥出理想的抗肿瘤功效。而当灵芝孢子油纳米化后，使用的低剂量和高剂量的孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀组的小鼠肿瘤体积在第28天时分别为0.38和0.35cm³，均明显小于空白对照组和普通灵芝孢子油组，同时也小于临床药物环磷酰胺组(0.46cm³)。同时，在整个动物实验过程中隔天对动物进行称重，记录各组裸鼠的体重变化情况，结果如图11所示，各组裸鼠体重在28天内无显著性差异。接着我们对给药后28天后的各处理组的小鼠肿瘤进行解剖，称重。如图12所示，空白对照组、普通灵芝孢子油组(GLSO)和环磷酰胺组小鼠肿瘤的平均重量分别为：1.72、1.52和0.82克；而当灵芝孢子油纳米化后，其对小鼠肿瘤的生长抑制能力明显增强，低剂量和高剂量的孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀组小鼠肿瘤的平均重量分别为0.83和0.59克，抑瘤率分别高达52.33％和65.0％，如图13所示。因此，这一结果进一步说明实施例3制得的孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀能够促进小鼠对灵芝孢子油的口服吸收，增强其对MGC803肿瘤细胞在小鼠体内的生长抑制作用。

(4)通过检测各处理组裸鼠的血液生化指标，评估各处理方式是否对小鼠各个正常组织如心、肝、脾、肺和肾等造成损伤，或者是否能逆转荷瘤引起小鼠各组织器官的损伤情况。通过分析数据，单纯荷瘤的阴性对照组小鼠的肝脏、肾脏和心脏等器官相关的血液生化指标都与正常裸鼠组之间存在明显的差异，提示荷瘤可能引起小鼠脏器功能异常，甚至可能为动物带来实质性损伤。例如图14(a)所示，血尿素氮水平从正常裸鼠组的6.8mmol/L上升至8.2mmol/L，提示荷瘤可能造成小鼠肾功能轻度受损；如图14(b)所示，血中肌酐含量从正常裸鼠组的13.5μmol/L上升至15.8μmol/L(环磷酰胺组)，提示环磷酰胺可能小鼠肾功能轻度受损；如图14(c)所示，血谷丙转氨酶水平从正常裸鼠组的46.3U/L下降至27.6U/L(阴性对照组)，提示荷瘤可能造成小鼠肝功能下降。而环磷酰胺作为阳性对照药物，固然可在一定程度上改善小鼠的脏器损伤情况，但是也存在一定的毒副作用。另一方面，普通灵芝孢子油(GLSO)在改善荷瘤小鼠血液生化指标异常方面的影响作用并不甚突出，例如图14(c)和(d)所示，血谷草转氨酶水平从阴性对照组的208U/L上升至243U/L(普通孢子油组)，均高于正常裸鼠组(176U/L)；血谷丙转氨酶水平从阴性对照组的28.2U/L上升至30.1U/L(普通孢子油组)，均显著低于正常裸鼠组(46.6U/L)，这说明普通灵芝孢子油对荷瘤裸鼠的肝功能异常情况并没有明显的改善作用。而当孢子油纳米化后，低剂量和高剂量的孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀组均能在一定程度上逆转荷瘤裸鼠的各血液生化指标异常情况，使其恢复到正常水平。例如图14(c)所示，血谷丙转氨酶水平从阴性对照组的28.2U/L分别上升至33.1(低剂量孢子油纳米乳)和46.2U/L(高剂量孢子油纳米乳)，提示GLSO@P188/PEG₄₀₀能逐渐恢复荷瘤引起的小鼠肝功能异常情况；如图14(e)所示，血肌酸激酶水平从阴性对照组的1456U/L分别下降至801(低剂量孢子油纳米乳)和815U/L(高剂量孢子油纳米乳)，几乎恢复到正常水平(798U/L)，提示GLSO@P188/PEG₄₀₀能逆转荷瘤引起的小鼠心功能异常状态。值得一提的是，普通灵芝孢子油(GLSO)引起小鼠的血糖水平下降，从正常裸鼠组的5.5mmol/L下降至3.2mmol/L(普通灵芝孢子油)；而GLSO@P188/PEG₄₀₀只轻微引起血糖下降，其血糖水平分别为4.12(低剂量孢子油纳米乳)和4.9mmol/L(高剂量孢子油纳米乳)，这可与灵芝孢子油中活性成分降血糖的作用联系起来，而微小的血糖水平变化小鼠可适应性调节，如图14(f)所示；而普通灵芝孢子油为油状液体，可能引起小鼠顺应性低下，灌胃后引起小鼠恶心、呃逆等不适反应，使其不思饮食，血糖明显低于正常水平。而灵芝孢子油纳米化后的GLSO@P188/PEG₄₀₀明显改善其水溶性，更加有利于口服吸收，也基本不会引起小鼠任何口服不适反应。

实施例7孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀提高体内抗氧化活性

为研究灵芝孢子油纳米化前后对小鼠体内的抗氧化能力，我们以正常未荷瘤小鼠为研究对象，每组6只，一共3组。以普通灵芝孢子油(GLSO)和实施例3所制得的孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀(即纳米乳B)对小鼠进行灌胃给药，隔日一次，剂量各为3mL/kg(剂量浓度以主药孢子油含量计)，对照组以纯水灌胃，隔日一次。在给药第28天后，将小鼠进行安乐死处理，手术剥取肝脏；称取每只小鼠肝脏约0.1克，加入1mL PBS作为匀浆液，然后转入球磨机中进行低温研磨(60赫兹，2分钟)；接着用低温高速离心机进行离心(2000转/分钟，5分钟)，最后取各组上清液，参照试剂盒说明书进行检测。如图15(a)所示，孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀可引起小鼠肝脏中总超氧化物歧化酶活力有下降现象，其水平从正常对照组的50.2U/mg下降至42.8U/mg(孢子油纳米乳)；而普通的灵芝孢子油(GLSO)则对小鼠无明显功能改变作用，这说明孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀在小鼠体内可作为发挥抗氧化功效的成员之一，而原本体内肝脏的总超氧化物歧化酶活力则选择适应性下降，以调节小鼠体内氧化还原体系的平衡。此外，丙二醛是膜脂质过氧化最重要的产物之一，其过度产生还能引起蛋白质及核酸等生物大分子的交联聚合，加剧线粒体膜的损伤，甚至对机体造成损害。而孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀可明显降低肝脏脂质丙二醛MDA水平，从3.02μM/mg(对照组)降低至2.54μM/mg(孢子油纳米乳)，如图15(b)所示，有效降低脂质氧化的副产物丙二醛在体内的累积量；而普通灵芝孢子油也未显示出相关功效。另外，如图15(c)所示，普通灵芝孢子油和孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀均可在一定程度上提高小鼠肝脏中的总谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px活力，二组分别从2.8mU/mg(对照组)上升至3.4(普通孢子油)和4.4mU/mg(孢子油纳米乳)，这提孢子油纳米乳示GLSO@P188/PEG₄₀₀更能显著增强体内总谷胱甘肽过氧化物酶活力，以此提高小鼠体内抗氧化能力。以上结果说明了普通灵芝孢子油可在一定程度上提高小鼠体内的抗氧化能力，但效果甚微；而当孢子油纳米化后的GLSO@P188/PEG₄₀₀可显著提高体内抗氧化能力，充分发挥灵芝孢子油的抗氧化功效。

实施例8小粒径孢子油纳米乳GLSO@TW80的制备

一种灵芝孢子油纳米乳的制备方法，包括如下步骤：

(1)将吐温-80(TW80)和乙醇加入烧杯中，于室温下搅拌2分钟，转速为500转/分钟；

(2)取适量的灵芝孢子油(GLSO)缓慢注入步骤(1)得到的溶液中，于室温下搅拌5分钟，转速为700转/分钟；继续向其中注入去离子水，使初乳溶液终体积成50mL；

(3)将步骤(2)得到的初乳溶液转入高压均质机。首先进行初步均质，均质压力为200巴，均质时间为2分钟；然后进行高压均质，高压均质压力为1200巴，均质(时间分别为5、10和20分钟)，得到灵芝孢子油纳米乳GLSO@TW80。

其中，不同的试验组设置如表1所示：

表1合成工艺

制备得到的灵芝孢子油纳米乳的外观如图16所示，可见试验组3(编号b)均质10分钟和水具有相似的澄清度。

通过马尔文纳米粒度仪测量各个试验组制备得到的灵芝油纳米乳的水合粒度，检测结果如表2所示：

表2小粒径孢子油纳米乳的水合粒径(nm)

表2的结果表明，均质的时间并不是越长越好。试验组1～3均质10分钟(即试验组1b、2b和3b)的粒径相对比均质5分钟和20分钟的粒径小。

实施例9小粒径孢子油纳米乳对细胞存活率的影响

最后选择每个实验组的10分钟(b)条件下制备的孢子油纳米乳来进行后续抗肿瘤活性测试以及对正常细胞毒性影响，实验组别命名为1b、2b、3b。本实施例对比研究了灵芝孢子油纳米化前后样品的体外抗肿瘤活性作用及其潜在作用机制。本实施例中使用的细胞均购自美国ATCC公司。

首先用MTT比色法检测不同条件下合成的孢子油纳米乳GLSO@TW80(1b、2b、3b)和普通灵芝孢子油对于抑制PC3人前列腺癌细胞、T921人膀胱癌细胞、J82人膀胱癌细胞、MCF7人乳腺癌细胞、SV-HUC-1人正常膀胱上皮细胞系等生长的能力，具体实施操作步骤如下：

将细胞接种于96孔培养板(癌细胞以2×10⁴个细胞/mL的密度接种，正常细胞以4×10⁴个细胞/mL的密度接种)，接种体积为100μL，以DMEM(10％FBS，1％双抗，100单位/mL青霉素，50单位/mL链霉素)为细胞培养基，置于培养箱中培养(37℃、5％CO₂、95％相对湿度)。待细胞贴壁培养24小时后，分别加入系列浓度(以DMEM培养基配制)的不同条件下合成的孢子油纳米乳GLSO@TW80(1b、2b、3b)和普通灵芝孢子油GLSO孵育细胞，继续观察细胞生长状态，待72小时观察期结束后，通过MTT法检测细胞存活率。从表3可以看出，不同条件下合成的孢子油纳米乳GLSO@TW80(1b、2b、3b)对MGC803人胃腺癌细胞具有强效的生长抑制作用(半数抑制浓度分别为0.16、014、0.11μL/mL)，T921人膀胱癌细胞的存活抑制作用稍强(半数抑制浓度分别为0.27、0.21、0.16μL/mL)；但是同时从表中可以看出，GLOS@TW纳米体系中的吐温-80(TW-80)对细胞也具有不可忽略的毒性影响。此外，试验组1b，2b和3b对肿瘤细胞的半数抑制浓度都明显小于实施例3制备的孢子油纳米乳GLSO@P188/PEG₄₀₀，提示实施例8所述方法合成的纳米粒子具有更显著的抗肿瘤活性。

结果如表3所示：

表3半数抑制浓度(μL/mL)

表格中所示GLSO的半数抑制浓度均为≥1，表示为在最大加药浓度(以孢子油含量计，1μL/mL)情况下，以GLSO处理的细胞仍然存活状态良好，细胞存活率均高于50％，以至于检测不到与实施例3所述的GLSO@P188/PEG₄₀₀相同处理情况下细胞的半数抑制浓度。

从表3结果可看出，用吐温制备得到的孢子油纳米乳的抗肿瘤效果强，但是毒性也较强，综合考虑，泊洛沙姆和PEG₄₀₀制备得到的孢子油纳米乳B在保证安全的前提下，还具有较好的抗肿瘤效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种灵芝孢子油纳米乳，其特征在于由如下成分组成：灵芝孢子油、乳化剂、助乳化剂和水；其中，灵芝孢子油的含量为体积百分比8～12%，乳化剂的含量为质量体积比2%，助乳化剂的含量为体积百分比0.1～0.3%，水为余量；

所述的乳化剂为泊洛沙姆188；

所述的助乳化剂为聚乙二醇400；

所述的灵芝孢子油纳米乳通过如下步骤制备得到：

（1-A）先用水溶解乳化剂，得到的乳化剂溶液；

（1-B）将乳化剂溶液和助乳化剂混匀，得到乳化体系；

（1-C）往乳化体系中加入灵芝孢子油，混合均匀，再往其中加入水，得到初乳溶液；

（1-D）将初乳溶液进行均质，得到均一稳定的灵芝孢子油纳米乳；

步骤（1-B）中所述的混匀的条件为：搅拌混合，搅拌速率为200～800转/分，搅拌时间为1～10分钟；

步骤（1-C）中所述的混合均匀的条件为：通过搅拌混合，搅拌速率为600～900转/分，搅拌时间为2～20分钟；

步骤（1-D）中所述的均质条件为：初步均质压力为100 ～300 bar，均质时间为1～10分钟；接着高压均质，高压均质压力为800～1300 bar，均质时间为5～60分钟。

2.权利要求1所述的灵芝孢子油纳米乳的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1-A）先用水溶解乳化剂，得到的乳化剂溶液；

（1-B）将乳化剂溶液和助乳化剂混匀，得到乳化体系；

（1-C）往乳化体系中加入灵芝孢子油，混合均匀，再往其中加入水，得到初乳溶液；

（1-D）将初乳溶液进行均质，得到均一稳定的灵芝孢子油纳米乳；

步骤（1-B）中所述的混匀的条件为：搅拌混合，搅拌速率为200～800转/分，搅拌时间为1～10分钟；

步骤（1-C）中所述的混合均匀的条件为：通过搅拌混合，搅拌速率为600～900转/分，搅拌时间为2～20分钟；

步骤（1-D）中所述的均质条件为：初步均质压力为100 ～300 bar，均质时间为1～10分钟；接着高压均质，高压均质压力为800～1300 bar，均质时间为5～60分钟。

3.根据权利要求2所述的灵芝孢子油纳米乳的制备方法，其特征在于：所述的灵芝孢子油纳米乳为乳白色，呈规整圆球形，粒径为20～150 nm。

4.权利要求1所述的灵芝孢子油纳米乳在制备抗肿瘤药物或抗氧化剂中的应用，其特征在于：

所述的肿瘤为胃腺癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌或乳腺癌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的抗氧化剂包括抗自由基制剂，自由基为脂质过氧化物、超氧阴离子、羟基自由基或单线态氧。

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