KR101794419B1 - 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물{OSMOTIC ENZYME FERMENTATION NATURAL LIPOSOME CONTAINING MUSHROOM, PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF, AND COSMETIC, FOOD OR PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}
본 발명은 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
버섯은 담자균류와 자낭균류의 고등균류를 통틀어 일컫는다. 버섯은 주로 그늘진 땅이나 썩은 나무에서 자라며, 홀씨로 번식한다. 버섯에는 식용버섯과 독버섯이 있으며 식용버섯으로는 송이버섯, 양송이버섯, 표고버섯, 느타리버섯, 싸리버섯, 능이버섯, 팽이버섯 등이 있다.
버섯은 식이섬유가 풍부하여 장내의 유해물, 노폐물을 배설하고 혈액을 깨끗하게 하며 면역 기능을 높이고 감염이나 암 예방 등에 효능이 있다.
이러한 다양한 효능을 갖는 버섯은 자연 그대로 섭취하거나 가공하여 식품, 음료수, 주류 등으로 이용할 수 있고, 버섯에 의한 효능을 향상시키기 위해 유효성분만을 추출하여 이용할 수도 있다. 이때, 유효성분을 추출하는 방법으로는 열수 추출, 가압 추출, 용매 추출 등의 추출법이나 알코올 발효, 젖산 발효, 메탄 발효 등의 발효법을 이용할 수 있으며, 이를 통해 기질인 버섯의 유효성분을 포함하는 추출물을 제조할 수 있다.
그러나 열수 추출이나 가압 추출을 이용할 경우에는 높은 열과 압력에 의해 기질의 유효성분이 파괴될 뿐만 아니라 변성되어 원하는 효능을 발휘하기 어려울 수 있고, 용매 추출을 이용할 경우에는 유효성분의 손실은 막을 수 있으나, 추출물에 잔존하는 비극성 용매, 유기 용매 등으로 인하여 인체에 해로울 수 있다는 문제점이 있다.
특허공개공보 제2012-0087408호에는 미생물을 이용하여 발효시켜 얻어진 버섯 발효추출물 및 이를 함유하는 화장료 조성물이 개시되어 있다. 그러나 미생물을 이용하여 발효할 경우에는 접종 미생물이 생장하기 적합한 온도, 습도, 산소 농도 등의 조건을 일정하게 유지하기 어려우며, 접종하지 않은 다른 미생물의 오염으로 인해 원하는 발효가 일어나지 않을 수 있다.
이러한 추출법 및 발효법의 단점을 개선하기 위한 방법으로, 당장법을 이용할 수 있다. 당장법은 고농도의 당을 첨가하여 삼투압 현상에 의해 기질 내 수분과 함께 유효성분을 용출하는 방법이다. 당장법에 의하여 열 또는 압력에 의한 유효성분의 손실을 줄이면서 유효성분을 용이하게 얻을 수 있지만, 당장법은 추출법과 발효법에 비해 추출물을 얻는데 장시간이 소요될 뿐만 아니라 기질에 존재하는 미생물의 상태, 종류에 따라 반복적으로 균일한 추출물을 얻기 어려울 수 있다.
한편, 리포좀(liposome)은 생체 세포막의 주요 성분인 인지질로 구성되어 생체 친화적이며, 이중층 구조 내에 원하는 물질(약물, 영양물 등)을 저장할 수 있어, 불안정하고 취급이 어려운 물질을 세포 내로 운반할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 리포좀은 이러한 장점에도 불구하고 제형이 불안정하고, 포집 효율이 매우 낮을 뿐 아니라 리포좀 제조에 사용되는 용매, 방부제 등이 피부 자극을 유발한다는 등의 문제가 있다.
특허공개공보 제2012-0087408호
본 발명은 안정적인 형태를 가지면서도 생체에 용이하게 투입될 수 있으며 부작용이 적으면서도 우수한 항염 및 관절건강개선효과 등을 나타내어 화장료, 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있는 천연 리포좀을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예는 (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계; (c) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (d) 상기 (c)단계의 생성물에 포집물질로서 (b) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 형성되는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 제공한다.
본 발명의 다른 일 예는 (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계; (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 형성되는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 예는 (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계; (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계; (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 형성되는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 제공한다.
본 발명의 또다른 일 예는 상기 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물, 식품 조성물, 약학 조성물, 항염 조성물, 또는 관절 건강 개선용 조성물을 제공하며, 상기 천연 리포좀의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 생체에 용이하게 투입될 수 있을 뿐 아니라 부작용이 덜하면서도 우수한 항염 및 관절건강개선효과를 나타내어 화장료, 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 각 샘플의 포집율 그래프를 나타낸다.
도 2는 각 샘플의 전자주사현미경 사진을, 도 3은 각 샘플의 레이저 입도 분석기에 의한 입자크기 측정 결과 및 입도 분포도를 나타낸다.
도 4는 각 샘플의 피부 흡수력 그래프를 나타낸다.
도 5, 도 6은 각 샘플의 NO 생성 억제능 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 각 샘플의 PGE2 생성 억제능 측정 결과를, 도 8은 TNF-α 분비 억제 측정 결과를 나타낸다.
도 9는 각 샘플의 COX-2 단백질 발현 억제 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 각 샘플을 적용한 경우의 X-레이 촬영 결과를, 도 11, 도 12는 각각 무릎관절의 마이크로-CT (2D) 촬영 결과, 마이크로-CT (3D) 촬영 결과를 나타낸다.
도 13은 각 샘플을 적용한 경우의 무릎관절의 현미경 관찰 결과를 나타낸다.
도 14는 각 샘플을 적용한 경우의 무릎관절조직의 연골 함량을, 도 15는 각 샘플을 적용한 경우의 무릎관절조직의 골밀도를 나타낸다.
도 16은 각 샘플을 적용한 경우의 IL-1β 분비 억제 효과를, 도 17은 IL-6 분비 억제 효과를, 도 18은 TNF-α 분비 억제 측정 결과를 나타낸다.
도 19는 각 샘플을 적용한 경우의 혈중 GAG 함량을, 도 20은 각 샘플을 적용한 경우의 뒷다리 근육 COX-2 함량을 측정한 결과를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
<삼투압 효소 발효물의 제조방법>
본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법은, (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계; (c) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (d) 상기 제(c)단계의 생성물에 포집물질로서 (b) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(버섯), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다.
기질로는 버섯을 사용하며, 이들의 종류, 원산지 및 형태는 특별히 한정되지 않는다. 기질로는 표고버섯, 꽃느타리버섯, 새송이버섯, 양송이버섯, 팽이버섯 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 기질로는 표고버섯, 또는 팽이버섯을 사용한다.
표고버섯은 잎, 꽃, 줄기, 뿌리 등을 포함하는 전초를 사용할 수 있다. 표고버섯은 베타글루칸의 함량이 높고, 혈액순환개선, 혈당 조절 등의 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 표고버섯에는 레이다데민이라는 물질이 있어서 혈액 속의 콜레스테롤 수치를 저하시키고 혈압을 떨어뜨린다. 따라서 표고버섯은 고혈압이나 동맥경화 예방, 빈혈 등에 효과적이다. 또한 표고버섯은 비타민 C 함량이 높고 비타민 D2의 전구체인 에르고스레롤도 함유되어 있다. 이외에 표고버섯은 바이러스 증식 억제, 면역력 증강, 암 전이 억제 등의 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
팽이버섯은 팽나무, 버드나무 등의 고목에서 발생하는 버섯으로, 항균, 함염증, 항종양, 항바이러스, 면역 조절 효과 등을 가지며 비타민 B와 비타민 C가 풍부하다.
이때, 기질은 유효성분을 용이하게 추출하기 위해, 일정한 크기로 분쇄하거나 압착기를 이용한 착즙 형태일 수 있다.
당으로는 당업계에 공지된 통상적인 당류를 제한 없이 사용할 수 있으며, 백설탕, 황설탕 및 원당(비정제당)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 당으로는 황설탕 또는 원당을 사용하는 것이 바람직하고, 원당을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
접종하는 미생물로는 효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae )와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum )을 사용하며, 효모 발효와 유산균 발효가 동시에 진행될 수 있다. 상기 효모로는 사카로마이세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1( KCTC 11386BP ), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae )( KCTC 7904)를 사용할 수 있으며, 사카로마이세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae ) MAB Y1( KCTC 11386BP )를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 유산균으로는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106( KCTC 12082BP ), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)(KCTC 3112)을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum ) Miev L1106( KCTC 12082BP )을 사용할 수 있다. 상기 미생물은 중량비를 기준으로 효모 : 유산균 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합되는 것이 바람직하며, 효모 : 유산균 = 1 : 0.8~1.2로 혼합되는 것이 더 바람직하다.
상기 기질, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 기질의 유효성분을 최대한으로 추출할 수 있다. 상기 기질과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 기질 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 것이 바람직하고, 기질 : 당 = 1 : 0.8~1.2인 것이 더 바람직하다. 상기 미생물의 사용량은 상기 기질과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 3 내지 5 중량% 인 것이 더 바람직하다.
이러한 기질, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 적절한 온도 및 호기 조건을 갖는 인큐베이터(incubator)에서 1차 발효함으로써, 기질의 수분과 함께 유효성분이 용출된 1차 발효물로 제조된다.
1차 발효 온도는 20 내지 50 ℃인 것이 바람직하고, 25 내지 45 ℃ 인 것이 더 바람직하다.
이때, 상기 혼합물이 산소가 차단된 혐기 조건에서 발효할 경우에는 효모에 의한 당 분해시 알코올이 생성되어 미생물의 효소 활성을 저해할 수 있으므로, 산소가 공급되는 호기 조건에서 발효를 진행하는 것이 바람직하다. 예를 들면 부직포로 발효용기의 입구를 산소만 겨우 통과할 정도로 막아 혐기 조건이 되지 않도록 한다.
상기 1차 발효하는 동안에는 일정한 간격으로 1차 발효물의 pH를 측정하여 오염 유무를 확인하고, 액상의 상층에 쌓이는 기포들을 제거한다. BCA assay, Bradford assay 등의 단백질 정량법을 이용하여 생성된 효소량을 추정한다.
상기 1차 발효물의 pH는 3 내지 6인 것이 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우, 효모에 의한 혐기 발효가 일어나거나 접종한 미생물이 아닌 외부 미생물에 의해 오염된 것으로 볼 수 있다. 상기 1차 발효물의 단백질량이 400 내지 1000 ug/ml일 경우에는 효소가 충분히 생성된 것으로, 1차 발효를 종료한다. 이때, 1차 발효 기간은 특별히 한정되지 않으나, 4일 내지 10일 동안 발효할 수 있다.
(b) 숙성 단계
(b) 단계는 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계이다.
숙성을 위하여 상기 (a) 단계에서 제조된 1차 발효물로부터 고형분을 제거한다. 고형분이 제거된 1차 발효액을 숙성한다. 이러한 1차 발효액은 저온 보관하여 숙성함으로써, 미생물에 의한 발효를 정지하면서 1차 발효액에 함유된 성분들이 상호작용할 수 있도록 하여 최종 삼투압 효소 발효물로 제조된다. 상기 숙성 온도는 0 내지 10 ℃인 것이 바람직하다.
(c) 초음파 처리 단계
이 단계는 1종 이상의 천연 유화제를 천연 용매 일부와 혼합한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 50~80℃에서 초음파 파쇄하여 상기 혼합물을 균질화하는 단계이다.
(d) 포집물질 첨가 및 혼합 단계
이 단계는 천연 유화제가 균질화되면 포집물질을 첨가한 후 초음파 파쇄하여 혼합하는 단계이다.
호모게나이저 등을 사용하던 종래기술과 달리, 천연 유화제 균질화 단계와 포집물질 첨가 단계에 초음파 파쇄 처리를 함으로써 유화제와 포집물질의 균질화도를 높이고 입자 크기를 조절할 수 있다.
(e) 기타
유화제와 포집물질이 완전히 균질화되면 40~60℃로 가온된 나머지 증류수와 천연추출물(방부제)을 넣고 초음파 파쇄를 통하여 혼합하여 리포좀 형태의 입자를 형성한다. 이후 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분간 초음파 파쇄를 하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 최종적으로 천연 리포좀을 제조한다.
한편, 본 발명의 다른 일 예에 따르면 상기 (a) 단계 이후, (b) 단계 이전에 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우 (c) 숙성단계는 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 진행된다.
한편, 본 발명의 또 다른 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법은 (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계; (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 버섯함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계; (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (b) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 공정 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(버섯), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다. (a) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 (a) 단계와 동일한 것으로, 기질의 유효성분 및 미생물의 효소를 함유하는 1차 발효물을 제조한다.
(b-1) 멸균 단계
(b-1) 단계는 1차 발효물에 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계이다. 상기 (a) 단계에서 제조된 1차 발효물은 미세망(mesh)을 이용하여 고형분을 제거한 후 남은 1차 발효액을 멸균한다. 상기 멸균하는 조건은 특별히 한정되지 않으나, 온도가 100 내지 140 ℃이고, 시간이 5 내지 30 분일 수 있다. 이로 인해, 1차 발효물 20~50%를 기질로 미생물을 재접종하여 2차발효를 진행할 수 있다. 이때 함유되는 죽은 미생물은 재 발효시에 단백질원이 공급될 수 있다.
(b-2) 2차 발효물 제조 단계
(b-2) 단계는 멸균된 1차 발효물에 당 및 미생물(효모, 유산균)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계이다. 상기 (b-1) 단계에서 멸균된 1차 발효물은 2차 발효하기 위해 당 및 미생물을 첨가한다.
상기 당 및 미생물로는 상기 (a) 단계에서 사용된 당 및 미생물과 동일하다.
상기 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 1차 발효물에 함유된 유효성분과 미생물에서 생성되는 효소의 반응을 향상시킬 수 있다. 상기 1차 발효물과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 것이 바람직하고, 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.8~1.2 인 것이 더 바람직하다. 상기 미생물의 사용량은 상기 1차 발효물과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량% 인 것이 바람직하고, 3 내지 5 중량% 인 것이 더 바람직하다.
이러한 멸균된 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 상기 (a) 단계의 1차 발효와 동일한 온도 및 호기 조건으로 2차 발효함으로써, 첨가된 미생물이 1차 발효물에 함유된 유효성분뿐만 아니라 죽은 미생물을 단백질원으로 이용하여 효소 반응에 의해 2차 발효물로 제조된다.
(c) 숙성 단계
(c) 단계는 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계이다. (c) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법의 숙성 단계와 동일한 것으로, 최종 삼투압 효소 발효물을 제조한다.
(d), (e) 단계 및 기타 단계는 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법의 (c), (d) 단계와 동일하다.
이와 같이, 본 발명에 따라 제조된 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 버섯의 유효성분을 손실 없이 빠르고 균일하게 추출할 수 있으며, 제조된 천연 리포좀은 버섯에 의한 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 일예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 천연 유화제, 천연 용매, 천연 방부제, 천연 유래 포집물질을 포함하여 합성 성분을 포함하고 있지 않다는 점에서 종래의 합성 리포좀과 구별된다. 이들 각 성분을 살펴본다.
[천연 유화제]
천연 유화제는 지질 이중층을 구성하는 물질로서, 천연 물질에서 유래된 유화제이다. 상기 천연 유화제는 인지질과 지방산을 포함한다. 천연 유화제에 포함된 인지질은 천연에서 유래한 천연 인지질이며, 지방산 또한 천연에서 유래한 천연지방산이다. 상기 인지질로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 또는 이들의 수소첨가생성물(예를 들면, 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린(hydrogenated phophatidylcholine - 콩유래))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 인지질이 사용될 수 있다. 바람직하게는 산화안정성이 우수한 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린이 사용될 수 있다.
상기 지방산으로는 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 지방산이 사용될 수 있다.
상기 천연 유화제는 천연 인지질과 천연 지방산의 합계 합량 100 중량%를 기준으로 천연 인지질 70 내지 90 중량% 및 천연 지방산 10 내지 30 중량%를 포함할 수 있다. 상기 천연 유화제는 기타 용매를 잔량 포함할 수 있다. 용매로는 천연 유래 용매를 사용하는 것이 바람직하고, 증류수를 사용하는 것이 더 바람직하다.
또한, 천연 유화제는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 일례로는 2종의 천연 유화제 또는 3종의 천연 유화제를 혼합하여 사용할 수 있다. 2종의 천연 유화제를 혼합하여 사용할 경우, 예를 들면, 제1 천연 유화제로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)이 사용될 수 있고, 제2 천연 유화제로는 하이드로지네이티드포스파티딜콜린(hydrogenated phosphatidylcholine - 콩 유래)이 사용될 수 있다. 또한, 3종의 천연 유화제를 혼합하여 사용할 경우, 예를 들면, 상기 제1 천연 유화제, 제2 천연 유화제 외에, 제3 천연 유화제로서 세테아릴올리베이트(Cetearylolivate), 소르비탄올리베이트(sorbitanolivate - 올리브유래)가 사용될 수 있다.
또한, 상기 천연 유화제는 천연 지방산을 더 포함할 수 있다. 상기 천연 지방산으로는 바람직하게는 달맞이꽃 오일을 사용할 수 있다. 상기 천연 지방산의 함량은 전체 천연 유화제의 중량을 기준으로 0.1 내지 5 중량%일 수 있다.
천연 유화제의 함량은 전체 천연 리포좀의 중량을 기준으로 0.1 내지 10중량%인 것이 바람직하다.
[포집물질]
리포좀의 인지질층 내부에 포집될 수 있는 포집물질로는 상기 언급한 삼투압 효소 발효물이 사용될 수 있다. 상기 포집물질의 함량은 천연 리포좀 전체의 중량을 기준으로 1 내지 50 중량%이다.
[용매]
용매로는 천연 유래 용매, 예를 들면 증류수, 천연 유래의 글리세린, 천연 에탄올, 천연 프로판디올, 천연 글리세린, 발효 주정이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 증류수, 천연 유래의 글리세린, 천연 에탄올이, 더 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다. 용매의 함량은 유화제, 포집물질, 방부제의 함량의 잔량이다.
[방부제]
방부제로는 식품 방부제로 사용될 수 있는 천연유래 방부제라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면 천연 추출물이 사용될 수 있다. 바람직하게는 자몽 추출물, 감귤 추출물이 사용될 수 있다. 천연추출물이라는 점에서 통상적으로 사용되는 방부제인 안식향산류, 소르빈산류, 프로피온산류, 데히드로초산류, 파라옥시 안식향산류 등과는 구별된다. 방부제는 천연 리포좀 전체의 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량% 포함될 수 있다.
[기타]
기타 포집물질을 코팅하기 위한 성분으로 코팅제가 추가로 포함될 수 있다. 코팅제로는 식이섬유, 전분, 다당체 등이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 말토덱스트린, 타피오카, 구아검, 옥수수 전분 등이 사용될 수 있다. 포집물질이 잘 흡수되도록 안정성이 높다는 면에서 말토덱스트린을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 체내 흡수를 돕기 위해서 흡수보조제가 추가로 포함될 수 있다. 흡수보조제로는 카페인이 다량 함유된 식물 추출 분말이 사용될 수 있으며 예를 들면 과라나 추출 분말 등이 사용될 수 있다.
<삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 화장료 , 식품, 약학 조성물>
본 발명에 의한 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 생물에서 유래하여 인체에 안전한 물질로서, 체내 투과율이 우수하여 흡수율이 높다. 그러므로 본 발명에 의한 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 화장료, 식품, 약학 조성물로 이용될 수 있다. 이때, 상기 조성물들은 면역 및 재생 기능을 증대시켜 항염증, 관절개선, 항알러지, 피부 재생, 항산화 등에 효과적일 수 있다.
구체적으로, 상기 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 오일, 파우더, 에어졸, 연고 등의 형태로 이용될 수 있으며, 화장료 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물은 샴푸, 린스, 토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스 등 모발용 화장료 조성물로 사용되거나 바디샤워, 바디로션, 바디오일, 바디미스트, 파운데이션, 세안제, 미스트 등 안면 또는 전신용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 음료, 건강기능식품 등의 형태로 이용될 수 있으며, 식품 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제, 외용제, 좌제, 주사용제 등의 형태로 이용될 수 있으며, 약품 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 구체적으로 설명하나, 하기 실시예는 본 발명의 한 형태를 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1-1] 표고버섯 삼투압 효소 발효물
기질로서 표고버섯을 흐르는 물로 세척한 후 물기를 완전히 제거한 다음 가로, 세로, 높이 모두 1~2 cm로 일정하게 절단하여 준비하였다. 준비된 기질과 당을 1:1의 중량비로 혼합하였다. 효모, 유산균은 기질과 당의 혼합물 전체 중량을 기준으로 각각 5 중량%의 양으로 상기 혼합물에 접종하였다. 하기 표 1에 사용된 원료 및 함량이 기재되어 있다.
혼합물 함량
기질 표고버섯 50중량%
당 천연당 (원당) 50중량%
효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1 (KCTC 11386BP) Seed 배양액 기질과 당의 혼합물 기준 5중량%
유산균 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MieV L1106 (KCTC 12082BP) Seed 배양액 기질과 당의 혼합물 기준 5중량%
상기 혼합물을 발효용기에 담고, 산소만 겨우 통과하도록 부직포로 발효용기의 입구를 차단한 다음 30 ℃ 인큐베이터에서 1차 발효하였다. 1차 발효를 시작한 시점을 0일째 샘플로 간주하고, 24시간 간격으로 1차 발효물을 채취하여 pH를 측정하고, 단백질 정량법(BCA assay)으로 효소량을 측정하였다. 1차 발효하는 동안 1차 발효물의 표면에 생성되는 기포를 제거하였다. 약 7일째, 1차 발효물의 효소량이 800 ug/ml인 것을 확인한 후 미세망(300 mesh)을 이용하여 1차 발효물의 고형분을 제거하였다.
고형분이 제거된 1차 발효액을 소독한 새로운 용기에 담고, 4 ℃에서 숙성함으로써, 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 제조하였다.
[ 실시예 1-2] 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 포함하는 천연 리포좀
천연 유화제(Lipoid P75; 유화제1 전체 100중량%를 기준으로, 포스파티딜콜린 67중량%, 리소포스파티딜콜린 8중량%, 포스파티딜에탄올아민 8 중량%, 팔미트산 3 중량%, 스테아르산 1 중량%, 올레산 3 중량%, 리놀레산 7 중량%, 리놀렌산 3 중량%)와 증류수를 혼합한 후 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid Processor, QSONICA, USA)를 이용하여 65℃에서 초음파 파쇄시켜 균질화하였다. 그런 다음, 균질화된 천연 유화제에 포집물질로서 실시예 1-1에서 제조된 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 첨가한 후 초음파 파쇄하여 혼합하였다. 천연 유화제와 포집물질이 완전히 균질화되면 65℃로 가열한 말토덱스트린을 첨가하여 혼합하고 초음파 파쇄시켜 균질화하였다. 그런 다음 증류수와 자몽 종자 추출물(천연 방부제)을 넣고 65℃에서 초음파 파쇄하여 혼합, 리포좀 형태의 예비 입자를 형성하였다. 이후 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분동안 초음파 파쇄하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 표고버섯 삼투압 효소 발효물이 함유된 천연 리포좀을 제조하였다. 원료 및 함량은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
원료 함량(중량%)
증류수 30.00
천연 유화제 2.50
표고버섯 삼투압 효소 발효물 5.00
말토 덱스트린 1.00
증류수 61.485
자몽종자추출물 0.015
합계 100.00
[ 실시예 2~6] 표고버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀
실시예 2에서는 말토 덱스트린과 함께 과라나 추출분말을 사용하였다는 점, 실시예 3에서는 말토 덱스트린 대신 구아검을 사용하였다는 점, 실시예 4에서는 말토덱스트린과 함께 대두레시틴을 사용하였다는 점, 실시예 5, 6에서는 말토 덱스트린 대신 각각 옥수수 전분, 타피오카를 사용하였다는 점을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 천연 리포좀을 제조하였다.
실시예 1 내지 실시예 6에서 사용된 원료 및 함량을 하기 표 3에 나타내었다.
번호 (단위: 중량%) 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6
1 D. I. WATER 30.0 30.0 30.0 30.0 30.0 30.0
P75 2.5 2.5 2.5 　 2.5 2.5
대두레시틴 　 　 　 10.0 　 　
2 버섯MOF 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
D. I. WATER 　 　 　 　 　 　
3 말토덱스트린 1.0 1.0 　 1.0 　 　
타피오카 　 　 　 　 　 1.0
구아검 　 　 1.0 　 　 　
옥수수전분 　 　 　 　 1.0 　
4　 자몽종자추출물 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015
과라나
추출분말		 　 1.0 　 　 　 　
D. I. WATER 61.485 60.485 61.485 53.485 61.485 61.485
[ 실시예 7] 팽이버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀
표고 버섯 대신 팽이 버섯을 원료로 사용하였다는 점을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 천연 리포좀을 제조하였다.
[ 실시예 8] 팽이버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀
표고 버섯 대신 팽이 버섯을 원료로 사용하였다는 점을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 천연 리포좀을 제조하였다.
[ 비교예 1] 표고버섯 삼투압 효소 발효물 합성 리포좀
비교예 1에서는 표고버섯 삼투압 효소 발효물, 레시틴, 콜레스테롤, 에탄올, 포타슘소르베이트 등이 포함된 종래의 합성 리포좀을 제조하였다.
용매로서 증류수를 사용하고 여기에 합성 유화제로서 레시틴, 콜레스테롤, 프로필렌글리콜과 에탄올을 혼합하였다. 합성 유화제가 완전히 균질화되면 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 첨가한 후 호모게나이저(homogenizer)로 균질화하였다. 잔량의 증류수와 말토덱스트린, 방부제(포타슘소르베이트 0.1%)를 혼합하여 합성 리포좀 예비 입자를 형성하고 이를 초음파 파쇄하여 균질화함으로써 최종적으로 합성 리포좀 입자를 제조하였다. 사용된 함량은 하기 표 4와 같다.
조성물 함량 (중량%)
합성 유화제 레시틴 10.0
콜레스테롤 0.2
에탄올 5.0
프로필렌글리콜 10.0
용매 증류수 68.7
천연 코팅제 말토덱스트린 1.0
합성 방부제 포타슘소르베이트 0.1
포집 물질 표고버섯MOF 5.0
[ 비교예 2] 팽이버섯 삼투압 효소 발효물 합성 리포좀
표고버섯 삼투압 효소 발효물 대신 팽이버섯 삼투압 효소 발효물을 사용하였다는 점을 제외하고는 비교예1과 동일한 방식으로 합성 리포좀을 제조하였다.
[ 실험예 1] 포집율 측정
실시예 1~6의 표고버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀 현탁액, 비교예 1의 합성 리포좀 2ml을 취하고 10ml syringe에 1.2㎛ syringe filter(GVS, USA)를 결합하여 리포좀 내 포집되지 않은 물질을 제거하였다. 그런 다음 에탄올을 이용하여 리포좀 막을 파괴하였다. 각각의 리포좀의 최대 흡수파장에서 흡광도를 측정하였다. 포집된 리포좀의 포집율은 아래 식에 대입하여 확인하였다.
Entrapment efficiency (%) = Ye/Yi x 100 (%)
Ye : 포집된 물질의 농도(encapsulated concentration)
Yi : 포집 전 물질의 초기 농도(Initial concentration)
포집율을 도 1에 나타내었다.
[ 실험예 2] 전자주사현미경에 의한 리포좀의 형태 분석
전자주사현미경(Scanning Electron microscope S-1700, Hitachi)을 이용하여 표고버섯 삼투압 효소 발효물(표고 MOF), 실시예 1~2의 리포좀, 비교예 1의 리포좀의 입자형태와 크기를 분석하였다. 측정은 제조된 시료를 섭씨 -60도에서 동결 건조한 다음 얇게 펴서 PdPt 혼합촉매로 1회 코팅한 후 이루어졌다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
[ 실험예 3] 레이저 입도분석기에 의한 리포좀의 크기 분석
레이저 입도분석기(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer ELS-8000, Otsuka)를 이용하여 샘플의 입자 크기를 측정하고 입도 분포를 분석하였다. 표고버섯 삼투압 효소 발효물(표고 MOF), 실시예 1~3의 천연 리포좀, 비교예 1의 합성 리포좀의 평균 입자크기, 입자 분포도를 도 3에 나타내었다.
[ 실험예 4] Franz Diffusion cell을 이용한 피부 흡수력
실시예 1, 2, 4의 천연 리포좀, 비교예 1의 합성 리포좀이 피부 투과 증진에 어떠한 효과를 주는지 확인하기 위해 생체외 투과실험(Franz Diffusion cell)을 이용하여 피부 투과 실험을 진행하였다. 실험에는 닭의 피부 조직을 털을 제거하여 사용하였다. 같은 양의 리포좀의 흡수력을 비교하였다. donor와 receptor phase 사이에 닭의 피부를 고정하고, 준비된 Franz diffusion cell의 donor에 1ml의 시료를 투여한 다음, 항온수조를 이용해 온도를 약 36.5℃로 유지하였다. 0시간, 1시간, 3시간, 6시간이 될 때 각각 매 회 0.25ml의 receptor phase을 회수한 후 동일한 양의 증류수를 공급하였다.
실시예 1, 실시예 2, 실시예 4, 비교예 1의 리포좀의 피부 흡수력을 비교한 결과를 도 4에 나타내었다.
[ 실험예 1~4] In-Vitro 실험
[ 실험예 1] 항염증 효과
(1) 표고 버섯류에 대한 NO 생성 억제 효과
마이크로플레이트(96 well)에 RAW 264.7 세포를 1 X 104 cell/well로 24시간 동안 배양하였다. 배양은, 1% 페니실린-스트렙토마이신과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 고농도 글루코오스 배지(high glucose DMEM; Lonza, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 진행되었다.
상기 세포 배양액에 실시예 1의 표고버섯의 삼투압 효소 발효물 천연리포좀, 실시예 2의 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 비교예 1의 표고버섯 합성 리포좀, 인도메타신, 표고버섯 열수 추출물, 표고버섯 삼투압 효소 발효물(MOF), 천연 리포좀(CPS)을 각각 1% 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양한 후 1μg/mL의 LPS를 처리하여 18시간 더 배양하였다.
세포 배양액 50 ul에 1% 술파닐아미드(sulfanilamide), 5% 인산과 0.1% 나프틸에틸에틸렌 디아민(naphthylethylethylene diamine)이 포함된 그리스 시약(Griess reagent)(Sigma chemical Co., USA) 50 ul를 첨가하였다. 10분 간 반응시킨 후 흡광도 측정기(TECAN/infinite M200, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 시료에 처리한 경우의 흡광도 값을 LPS만을 처리한 경우의 흡광도 값과 비교하여 NO 생성 정도를 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
(2) 팽이 버섯류에 대한 NO 생성 억제 효과
세포 배양액에 실시예 1의 표고버섯의 삼투압 효소 발효물 천연리포좀 대신, 실시예 7의 팽이버섯의 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 실시예 8의 팽이버섯의 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 비교예 2의 팽이버섯 합성 리포좀을 각각 1% 처리하였다는 점을 제외하고는 (1)과 같이 실험을 하여 각각의 NO 생성 정도를 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
[ 실험예 2] PGE2 생성 억제능 확인
(1) 세포 배양
RAW 264.7 세포가 배양 플라스크 면적의 70~80%를 차지하면 계대 배양을 하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. Trypsin처리하여 세포를 제거한 후, 배지를 첨가하였다. 세포를 튜브에 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 새 배지를 첨가하였다. 세포현탁액을 배지와 적정 비율로 섞어 배양 플레이트에 넣고, 골고루 잘 퍼지도록 하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
(2) LPS 자극에 의한 raw264.7 세포의 염증 유도
RAW 264.7 cell을 60 mm dish에 1.5 × 106 농도로 각기 분주하여 24시간 배양하였다. 세포현탁액과 tryphan blue를 1:1의 비율로 섞어 사용하였다. Raw 264.7 세포에 LPS (500ng/mL)를 시간대 별로 처리하였다.
(3) PGE2 측정
Media를 모은 후 원심분리하여 상층액을 취하였다. R&D Systems의 ELISA kit을 이용하여 prostaglandin E2의 양을 측정하였다.
(4) ELISA kit을 이용한 측정
200 μL의 calibrator diluent를 non-specific binding (NSB)에 넣었다. 50 μL의 calibrator diluent를 zero standard (B0) wells에 넣었다. 150 μL의 standard, control, sample을 남아있는 wells에 넣었다. 50 μL의 primary antibody solution 을 각 well에 넣었다. (NSB wells은 제외함). 플레이트 실러(plate sealer)를 이용하여 플레이트를 봉한 후 실온에서 horizontal orbital microplate shaker로 1시간 동안 반응시켰다. 50 μL의 conjugate를 각 well에 넣었다. 플레이트 실러를 이용하여 플레이트를 봉한 후 실온에서 horizontal orbital microplate shaker를 사용하여 2시간 동안 반응시켰다. 각 well의 버퍼(buffer)를 제거하고 총 4번 씻어 냈다. 200 μL의 substrate solution을 각 well에 넣었다. 새로운 플레이트 실러를 이용하여 봉한 후, 실온 (빛을 차단)에서 30분간 반응시켰다. 100 μL의 stop solution을 각 well에 넣었다. PGE2의 농도 측정을 위해 450 nm에서 30분 이내에 흡광도 측정하여 대조군의 흡광도 값 대비 환산하여 % 농도로 표현하였다. 측정 결과를 도 7에 나타내었다.
[ 실험예 3] TNF -α 분비 억제
(1) 세포배양
raw264.7 세포가 배양 플라스크 면적의 70~80% 정도 차지하면 계대배양을 하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. Trypsin처리하여 세포를 제거한 후, 배지를 첨가하였다. 세포를 tube에 모아 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 새 배지를 첨가하였다. 세포현탁액을 배지와 적정 비율로 섞어 배양 플레이트에 넣고, 골고루 잘 퍼지도록 하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
(2) LPS 자극에 의한 raw264.7 세포의 염증 유도
RAW 264.7 cell을 60 mm dish에 1.5 × 106 농도로 각기 분주하여 24시간 배양하였다. Raw 264.7 세포에 LPS (500ng/mL)를 시간대 별로 처리하였다.
(3) TNF-α Cytokine 측정
Cell Media를 모은 후 원심분리를 하여 상층액을 취하였다. R&D Systems의 ELISA kit을 이용하여 TNF-α 의 양을 측정하였다. 50 μL의 Assay Diluent를 blank well에 넣었다. 50 μL의 Standard 또는 실험군을 나머지 well에 넣었다. 플레이트 실러를 이용하여 플레이트를 봉한 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 각각의 well의 버퍼를 제거하고 총 5번 씻어내었다. 100 μL의 Conjugate를 각각 well에 넣었다. 새로운 플레이트 실러를 이용하여 봉한 후, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 버퍼를 제거하고 5번 씻어냈다. 100 μL의 substrate 용액을 각각 well에 넣어준 후, 암실에서 30분간 반응 시켰다. 100 μL의 Stop solution을 각각 well에 넣은 후, 450 nm에서 30분 이내로 측정하였다.
측정 결과를 도 8에 나타내었다.
[ 실험예 4] COX-2 단백질 발현 억제
(1) 세포배양
raw264.7 세포가 배양 플라스크 면적의 70~80% 정도 차지하면 계대배양을 하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. Trypsin처리하여 세포를 뗀 후, 배지를 첨가하였다. 세포를 튜브에 모아 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 새 배지를 첨가하였다. 세포현탁액을 배지와 적정 비율로 섞어 배양 플레이트에 넣고, 골고루 잘 퍼지도록 하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
(2) LPS 자극에 의한 raw264.7 세포의 염증 유도
RAW 264.7 cell을 60 mm dish에 1.5 × 106 농도로 각기 분주하여 24시간 배양하였다. Raw 264.7 세포에 LPS (500ng/mL)를 시간대 별로 처리하였다.
(3). Western blot
세포에서 단백질을 추출하고, Bradford assay를 이용하여 정량하였다. 단백질 농도를 30 μg으로 맞추어 시료를 준비하였다. Gel unit을 장치하였다. 10% acrylamide separating gel solution(D.W. 4.3 ml, 40% acrylamide mix 3 ml, 1.5 M Tris(pH8.8) 2.5 ml, 10% SDS 10 0μl, 10% APS 100 μl, TEMED 4 μl; 전체 부피 10 ml)을 준비하였다. 준비한 separating solution을 유리판 사이에 주입하고 Water-saturated n-부탄올을 조심스럽게 seperating gel 위에 뿌리고, 약 20~30분간 방치하여 gel을 굳혔다. Water-saturated n-butanol을 버리고 D.W로 여러 번 씻어준 후 물기를 제거하였다.
5% stacking gel solution (D.W. 3.6075 ml, 40% acrylamide mix 622.5 μl, 1.5 M Tris(pH6.8) 630 μl, 10% SDS 50 μl, 10% APS 50 μl, TEMED 5 μl; total volume 5 ml)을 준비하여 seperating gel 위에 붓고, comb를 꽂은 다음, 약 10~20분간 방치하여 응고시켰다. Gel이 응고되면 comb를 조심스럽게 제거하고 주변 장치도 제거한 다음 Well 사이를 물로 씻어내고, 유리판에 묻은 gel도 제거하였다.
Gel이 굳어있는 유리판을 전기영동장치에 고정시켰다. 유리판과 전기영동장치 사이에 running buffer를 가득 채우고, tank에도 buffer를 넣어서 백금선이 닿도록 하였다. 각 well에 정량한 단백질과 marker를 loading하고 100 volt로 90분 동안 전기영동을 한 후, gel을 장치와 유리판에서 조심스럽게 분리하여 transfer buffer에 침지시켰다.
Gel을 멤브레인 위에 얹고 다음과 같이 장치한 후, transfer buffer를 transfer kit에 채웠다. 탱크에 transfer buffer를 채운 뒤, 350 mA, 2시간 정도 transfer하였다. Transfer가 끝난 뒤 멤브레인을 실온에서 2시간동안 5% skim milk/TBST로 Blocking하였다. 상온에서 TBST로 15분, 5분, 5분간 shaking하면서 세척하였다. Primary antibody(COX-2)을 TBST로 1,000배 희석한 용액에 멤브레인에 넣고 4℃에서 shaking하면서 overnight하였다. TBST로 15분, 5분, 5분씩 shaking하여 세척하고, Secondary antibody을 TBST로 10,000배 희석한 용액에 멤브레인에 넣고 상온에서 2시간동안 shaking하였다. TBST로 15분, 5분, 5분씩 shaking하여 세척하고 Cassette에 멤브레인을 넣고, ECL solution을 뿌렸다. 그런 다음, 암실에서 X-ray 필름에 15분간 감광시킨 후 카세트를 열어 필름을 꺼내 developer에 넣고 현상되어 나오는 필름을 확인하였다.
그 결과를 도 9에 도시하였다.
[ 실험예 5~9] In- Vivo 실험
[ 실험예 5] 골관절염 개선 효과 임상 실험
7주령이 된 SD rat에 대하여 1주일간의 적응기간을 거치도록 한다. 50 μL(60mg/mL)의 MIA(monosodium iodoacetate)를 rat의 오른쪽 무릎 관절강 내에 투여하고, 이후 4주 동안 경구투여하였다. 시험기간이 종료된 시점에서, micro-CT (또는 X-ray　 등)를 이용하여 무릎 관절부위를 촬영하고 판독하였다. 동물병원에서 관절염 유발 부위에 X-ray 촬영을 통해 의사소견을 받았다.
각각의 X-레이 사진을 도 10에, 마이크로-CT 사진(2D)을 도 11에, 마이크로-CT 사진(3D)을 도 12에 도시하였다.
육안 관찰과 X-레이 촬영, micro-CT (2D, 3D) 촬영을 통하여 관찰한 결과, 정상군에 비하여 관절염 유발군(Control)에서　연골 파괴가 관찰되어　골관절염이 유도되었음을　확인할 수 있었다. 실시예 1의 표고 버섯 삼투압 발효 추출물 천연 리포좀(MOF CPS)의 경우 정상군과 유사하게 증상이 호전되었음을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 6] 연골조직의 형태학적 관찰
실험을 위해 희생된 쥐로부터 무릎관절(femur 혹은 tibia)을 적출하였다. 10% (또는 4%) formalin solution에 조직을 담가 조직을 고정하고, 고정한 조직을 5% 포름산에 담가 6일간 탈칼슘화처리 (decalcification)하였다. 조직을 카세트에 옮기고, 증류수가 담긴 비커에 담가 세척하였다.
조직이 담긴 카세트를 농도별 에탄올 용액(70% → 80% → 90% → 95% → 100% → 100%)에 순차적으로 담가 탈수시키고 조직에 남아있는 에탄올을 제거하기 위해 자일렌 용액에 담그었다(3회 반복). 녹인 파라핀 용액에 조직이 담긴 카세트를 담근 다음 카세트로부터 분리한 조직을 포매용 틀에 올려놓았다.
warm bath의 파리핀을 포매용 틀에 적당량 부은 후, cold plate로 옮겨 파리핀을 굳히고, 파리핀이 완전히 굳으면, 포매용 틀을 제거하였다. Microtome 홀더에 파라핀으로 포매된 블록을 끼운 다음, 조직을 3~5 μm의 두께로 절단하였다. 파라핀 절편을　슬라이드 글라스를 이용해 부유온수조로　옮기고 부유온수조(43)에 띄워 파라핀 절편의 주름을 펴고, 이를 새 슬라이드 글라스에 붙였다.
실온에서 잘 건조시킨 후 슬라이드 글라스를 60℃ 오븐에 넣어 약 하루 정도 탈파라핀을 행하였다. 60℃ 오븐에서 꺼낸 슬라이드를 실온으로 식히고, 슬라이드를 다음의 과정으로 탈파라핀 및 수화하였다.
- 자일렌 → 자일렌 → 100% 알콜 → 95% 알콜 → 80% 알콜 → 70% 알콜 → 증류수
탈파라핀화 시킨 슬라이드를 Safranin O fast green 염색시약으로 염색을 시작하였다.
염색된 조직을 농도별 에탄올 용액(70% → 80% → 90% → 95% → 100% → 100%)에 순차적으로 담가 탈수시키고 자일렌에 침지시켰다. (2회반복)
슬라이드 위에 mounting solution을 떨어뜨려 커버 글라스를 덮어 고정시킨 다음, 슬라이드를 약 2일간 충분히 건조시킨 후 현미경으로 확인하였다.
그 결과를 도 13에 도시하였다.
[ 실험예 7] 무릎관절 조직의 연골 함량 및 파괴정도 확인
희생된 쥐를 해부한 후 얻은 무릎관절 부위를 Micro CT를 활용하여 연골량 및 골밀도를 측정하였으며, 이를 통해 연골의 파괴정도를 분석하였다. 연골함량 및 골밀도 측정 결과를 각각 도 14, 도 15에 도시하였다.
[ 실험예 8] IL- 1β 분비 억제 효과
IL-1β 표준물질을 0, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000 pg/ml의 각 농도별로 준비하였다. Rat IL-1β antibody가 코딩된 microplate에 Assay Diluent RD1-21 50 μl를 넣었다. 각 well에 혈청, 표준물질 50 μl를 넣고, 플레이트 커버를 덮은 후, 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. Well로부터 용액을 제거하였다. Washing buffer 400 μl를 넣고 세척하였다 (5번 반복).
Rat IL-1 beta Conjugate를 각 well에 100 μl씩 넣었다. 플레이트 커버를 씌운 후 1시간동안 상온에서 반응시켰다. Well에서 용액을 제거하였다. Washing buffer 400 μl를 넣고 세척하였다 (5번 반복). Substrate solution을 100 μ씩 넣고, 상온에서 30분간 반응시켰다. Stop solution 100 μ를 각 well에 넣고 30분 이내에 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
그 결과를 도 16에 도시하였다.
[ 실험예 9] IL-6 분비 억제 효과
IL-6 표준물질을 0, 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000 pg/ml로 각 농도별로 준비하였다. Rat IL-6 antibody가 코딩된 microplate에 Assay Diluent RD1W 50 μl를 넣었다. 각 well에 혈청, 표준물질 50 μl를 넣었다. Plate cover를 덮은 후, 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. Well에서 용액을 제거하였다. Washing buffer 400 μl를 넣고 세척하였다(5번 반복).
Rat IL-6 Conjugate를 각 well에 100 μl씩 넣고 플레이트 커버를 씌운 후 2시간동안 상온에서 반응시켰다. Well에서 용액을 제거하였다. Washing buffer 400 μl를 넣고 세척하였다(5번 반복). Substrate solution 100 μ씩 넣고, 상온에서 30분간 반응시켰다. Stop solution 100 μ를 각 well에 넣고 30분 이내에 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
그 결과를 도 17에 나타내었다.
[ 실험예 10] TNF -α 분비 억제
모든 시약을 분석하기 전에 미리 상온에 꺼내두었다. TNF 알파 표준물질을 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800 ng/ml로 농도별로 준비하였다. Rat TNF alpha 항체가 코딩된 마이크로플레이트에 Assay Diluent RD1-41을 50 μl 넣었다. 각 well에 혈청, 표준물질 50 μl를 넣고 플레이트 커버를 ?萱? 후 덮은 후, 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. Well에 있는 용액을 제거하였다.
Washing buffer 400 μl를 넣고 세척하였다(5회 반복). 각 well에 Rat TNF alpha Conjugate를 100 μl씩 넣었다. 플레이트 커버를 씌운 후 2시간동안 상온에서 반응시켰다.
Well에 있는 용액을 제거하였다.
Washing buffer 400 μl를 넣고 세척하였다(5회 반복).
Substrate solution 100 μ씩 넣고, 상온에서 30분간 반응시켰다. Stop solution 100 μ를 각 well에 넣었다. 30분 이내에 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도 값을 읽었다. 측정 결과를 도 18에 나타내었다.
[ 실험예 11] 혈중 GAG 함량
GAG 함량은 Sulfated Glycosaminoglycan Assay kit를 이용하여 DMMB (1,9-dimethylmethylene blue) assay로 측정하였다.
간단히 설명하면, 혈청 100μL와 1,9-dimethylmethylene blue 1mL을 첨가하여 30분간 반응시킨 후, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이후 반응하지 않은 dye가 포함된 상등액을 제거하고 GAG-dye complex를 얻은 다음, dissociation 용액 0.5 mL를 첨가하여 용해시킨 후, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 시료를 획득하였다. 각 시료의 상등액 200 μL를 96 웰 플레이트에 넣고 ELISAreader를 이용하여 656 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 GAG 함량은 표준물질로 사용된 bovine chondroitin sulfate의 표준검량선으로부터 계산하였다.
그 결과를 도 19에 나타내었다.
[ 실험예 12] 뒷다리 근육 COX-2 함량
뒷다리 근육에서 단백질을 추출하고, BCA법을 이용하여 정량하였다. 단백질 농도를 90 μg으로 맞추어 시료를 준비하였다. Gel unit을 장치하였다(상세한 방법은 [SOP A13101. Western blotting]를 참조하였다.)
10% acrylamide separating gel solution(D.W. 4.3 ml, 40% acrylamide mix 3 ml, 1.5 M Tris(pH8.8) 2.5 ml, 10% SDS 10 0μl, 10% APS 100 μl, TEMED 4 μl; total volume 10 ml)을 준비하였다. 준비한 separating solution을 유리판 사이에 주입하였다. Water-saturated n-butanol을 조심스럽게 seperating gel 위에 뿌리고, 약 20~30분간 방치하여 겔을 굳게 하였다. Water-saturated n-butanol을 버리고 D.W로 여러번 세척하고 물기를 제거하였다.
5% stacking gel solution (D.W. 3.6075 ml, 40% acrylamide mix 622.5 μl, 1.5 M Tris(pH6.8) 630 μl, 10% SDS 50 μl, 10% APS 50 μl, TEMED 5 μl; total volume 5 ml)을 준비하여 seperating gel 위에 붓고, comb를 꽂았다. 약 10~20분간 방치하여 응고시킨 다음 Gel이 응고되면 comb를 조심스럽게 제거하고 주변 장치도 제거하였다. Well 사이를 물로 씻어내고, 유리판에 묻은 gel도 제거하였다.
Gel이 굳어있는 유리판을 전기영동장치에 고정시킨 다음 유리판과 전기영동장치 사이에 running buffer를 가득 채우고, tank에도 buffer를 넣어서 백금선이 닿도록 하였다.
각 well에 정량한 단백질과 marker를 충전한 다음 전기영동하고(100 volt, 90분), 전기영동이 끝난 후, gel을 장치와 유리판에서 조심스럽게 분리하여 transfer buffer에 침지시켰다. Gel를 멤브레인 위에 얹고 장치한 후, transfer buffer를 transfer kit에 채웠다. COX-2 함량을 측정한 결과를 도 20에 나타내었다.

Claims (29)

  1. (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계;
    (c) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계;
    (d) 상기 (c)단계의 생성물에 포집물질로서 (b) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계
    를 포함하는 방법에 의하여 형성되며,
    1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질을 포함하는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀으로서,
    상기 천연 유화제는 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 대두 포스파티딜콜린, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시롤, 및 이들의 수소첨가 생성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 인지질과, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산(콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 지방산을 포함하고,
    상기 천연 유래 용매는 증류수, 부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 프로판디올, 글리세린, 에탄올, 발효주정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 용매이고,
    상기 천연 방부제는 천연 유래 추출물인,
    버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  2. (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계;
    (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계;
    (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계;
    (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계
    를 포함하는 방법에 의하여 형성되며,
    1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질을 포함하는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀으로서,
    상기 천연 유화제는 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 대두 포스파티딜콜린, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시롤, 및 이들의 수소첨가 생성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 인지질과, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산(콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 지방산을 포함하고,
    상기 천연 유래 용매는 증류수, 부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 프로판디올, 글리세린, 에탄올, 발효주정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 용매이고,
    상기 천연 방부제는 천연 유래 추출물인,
    버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  3. (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
    (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계;
    (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계;
    (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계;
    (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계;
    (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계
    를 포함하는 방법에 의하여 형성되며,
    1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질을 포함하는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀으로서,
    상기 천연 유화제는 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 대두 포스파티딜콜린, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시롤, 및 이들의 수소첨가 생성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 인지질과, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산(콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 지방산을 포함하고,
    상기 천연 유래 용매는 증류수, 부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 프로판디올, 글리세린, 에탄올, 발효주정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 용매이고,
    상기 천연 방부제는 천연 유래 추출물인,
    버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 버섯이 표고버섯 또는 팽이버섯인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 당은 백설탕, 황설탕, 원당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1(KCTC 11386BP)인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106(KCTC 12082BP)인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효모 및 유산균은 중량비를 기준으로 효모 : 유산균 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합되는 것인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 기질과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 기질 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 효모 및 유산균의 사용량은 기질과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1차 발효 및 2차 발효는 호기 조건에서 진행되는 것인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  12. 삭제
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  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 천연 방부제는 자몽 추출물 또는 감귤 추출물을 포함하는 천연 유래 추출물인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 천연 유래 용매는 증류수인 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 천연 유화제는 1종 이상의 지방산과 1종 이상의 인지질을 함유하는 제1 천연 유화제와 1종 이상의 인지질을 함유하는 제2 천연 유화제를 포함하는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 천연 리포좀 전체 중량을 기준으로 천연 유화제 2 내지 9 중량%, 천연 방부제 0.01 내지 5 중량%, 포집물질 0.01 내지 5 중량% 및 용매 잔량을 포함하는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    말토덱스트린, 구아검, 레시틴, 옥수수, 타피오카 중 하나 이상을 추가로 포함하는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 관절건강개선용 약학 조성물.
  24. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물.
  25. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 관절건강개선용 조성물.
  26. (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당, 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계;
    (c) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계,
    (d) 상기 (c)단계의 생성물에 포집물질로서 상기 (b) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가한 후 초음파 처리하여 혼합하는 단계,
    (e) 상기 (d)단계의 생성물에 40~60℃로 가온된 증류수와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하여 리포좀을 형성하는 단계
    를 포함하는 제1항의 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 제(e)단계 이후에 온도를 서서히 낮추면서 초음파 처리하는 단계
    를 추가로 포함하는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법.
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