KR101796368B1 - 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물{OSMOTIC ENZYME FERMENTATION NATURAL LIPOSOME CONTAINING HELIANTHUS TUBEROSUS, PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF, AND COSMETIC, FOOD OR PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}
본 발명은 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
돼지감자(학명: Helianthus tuberosus L.)는 국화과 해바라기속의 다년생 식물로서 뚱딴지라고도 불리며 생약명으로는 국우(菊芋)라고 불리우며 한방의 주요 약재로 활용되어 왔다. 원산지는 북아메리카이며, 우리나라에서도 전국에 자생하고 있으며 일부 농가에 의해 재배되고 있다.
돼지감자의 뿌리에는, 식이섬유의 일종으로서 천연 고부가 다당류의 일종인 이눌린(inulin)이 다량 함유되어 있다.
이눌린은 체내에서 사람의 소화효소에 의하여 잘 분해되지 않고 장까지 도달, 장내 미생물에 의하여 발효되어 장내 환경을 쾌적하게 유지시켜주는 기능을 한다.
즉, 이눌린은 췌장에서 발생하는 호르몬인 글루카곤이 간장에 저장된 글리코겐을 포도당으로 분해하는 것을 억제하여 혈당을 상승시키지 않고 오히려 떨어뜨려 안정화시키는 역할을 한다. 이눌린의 기능 중 또 다른 중요한 기능은 당뇨 합병증의 원인인 당화혈색소(HbA1c)의 수치를 낮추는 것이다. 따라서, 이눌린은 당뇨병 치료 및 합병증 예방에 탁월한 효과가 있으며, 현재 세계적으로 알려진 식물 가운데 이눌린을 15% 이상 함유하고 있는 것은 오직 돼지감자뿐이다. 또한 이눌린은 혈당을 증가시키지 않고, 열량이 낮아 비만개선에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 돼지감자는 최근 그 추출물에 다량의 페놀성 화합물이 함유되어 강력한 항산화효과를 갖는 것으로 규명된 바 있다.
돼지감자와 같은 천연 식물소재는 다양한 생리활성 물질과 항산화 물질을 함유하고 있어 항당뇨, 항노화, 항암, 항염, 면역 기능 개선 등 다양한 효과를 나타낸다.
이러한 다양한 효능을 갖는 돼지감자는 자연 그대로 섭취하거나 가공하여 식품 등으로 이용할 수 있고, 돼지감자에 의한 효능을 향상시키기 위해 유효성분만을 추출하여 이용할 수도 있다. 이때, 유효성분을 추출하는 방법으로는 열수 추출, 가압 추출, 용매 추출 등의 추출법이나 알코올 발효, 젖산 발효, 메탄 발효 등의 발효법을 이용할 수 있으며, 이를 통해 돼지 감자의 유효성분을 포함하는 추출물을 제조할 수 있다. 그러나, 열수 추출이나 가압 추출을 이용할 경우에는 높은 열과 압력에 의해 기질의 유효성분이 파괴될 뿐만 아니라 변성되어 원하는 효능을 발휘하기 어려울 수 있고, 용매 추출을 이용할 경우에는 유효성분의 손실은 막을 수 있으나, 추출물에 잔존하는 비극성 용매, 유기 용매 등으로 인하여 인체에 해로울 수 있다는 문제점이 있다.
따라서 최근에는 천연 추출물을 안정화시키거나, 독성을 줄이거나, 안정한 유도체로 전환시켜 효과를 높이려는 시도가 많이 진행되고 있다. 또한 그 일환으로 미생물이나 효소를 이용한 생물학적 전환 방법이 개발되고 있으며, 대표적 방법으로 발효를 예로 들 수 있다. 그러나, 미생물을 이용하여 발효할 경우에는 접종 미생물이 생장하기 적합한 온도, 습도, 산소 농도 등의 조건을 일정하게 유지하기 어려우며, 접종하지 않은 다른 미생물의 오염으로 인해 원하는 발효가 일어나지 않을 수 있다.
이러한 추출법 및 발효법의 단점을 개선하기 위한 방법으로, 당장법을 이용할 수 있다. 당장법은 고농도의 당을 첨가하여 삼투압 현상에 의해 기질 내 수분과 함께 유효성분을 용출하는 방법이다. 당장법에 의하여 열 또는 압력에 의한 유효성분의 손실을 줄이면서 유효성분을 용이하게 얻을 수 있지만, 당장법은 추출법과 발효법에 비해 추출물을 얻는데 장시간이 소요될 뿐만 아니라 기질에 존재하는 미생물의 상태, 종류에 따라 반복적으로 균일한 추출물을 얻기 어려울 수 있다.
한편, 리포좀(liposome)은 생체 세포막의 주요 성분인 인지질로 구성되어 생체 친화적이며, 이중층 구조 내에 원하는 물질(약물, 영양물 등)을 저장할 수 있어, 불안정하고 취급이 어려운 물질을 세포내로 운반할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 리포좀은 이러한 장점에도 불구하고 제형이 불안정하고, 포집 효율이 매우 낮을 뿐 아니라 리포좀 제조에 사용되는 용매, 방부제 등이 피부 자극을 유발한다는 등의 문제가 있다.
돼지감자 추출물을 포함하는 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료용 조성물 및 건강식품이 공개특허 제2007-0005317호, 제2006-0041438호, 제2003-0026384호 및 등록특허 제591539호, 제594520호 등에 개시되어 있으나, 본 발명에서 개시하는 바와 같이 돼지감자 추출물을 삽투압 발효시킨 다음 이를 천연 리포좀화한 물질은 지금까지 존재하지 않았다.
공개특허 제2007-0005317호, 공개특허 제2006-0041438호, 공개특허 제2003-0026384호 등록특허 제591539호, 등록특허 제594520호
본 발명은 안정적인 형태를 가지면서도 생체에 용이하게 투입될 수 있으며부작용이 적으면서도 우수한 항당뇨병 효과 등을 나타내어 화장료, 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있는 천연 리포좀을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예는 (a) (i)기질로서 돼지감자, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; (c) 상기 2차 발효물을 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계; (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 형성되는 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 제공한다.
본 발명의 다른 일 예는 (a) (i)기질로서 돼지감자, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계; (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; (c) 상기 2차 발효물을 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계; (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 형성되는 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 제공한다.
본 발명의 또다른 일 예는 상기 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물, 식품 조성물, 약학 조성물, 또는 항당뇨 조성물을 제공하며, 상기 천연 리포좀의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 생체에 용이하게 투입될 수 있을 뿐 아니라 부작용이 덜하면서도 우수한 항당뇨병 개선효과를 나타내어 화장료, 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 당뇨병치료제와 돼지감자 등을 원료로 한 삼투압 효소 발효물의 알파-아밀라제 저해 활성 그래프를 나타낸다.
도 2는 당뇨병치료제와 돼지감자 등을 원료로 한 삼투압 효소 발효물의 알파 글루코시다아제 저해율 그래프를 나타낸다.
도 3은 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 전자주사현미경 사진을 나타낸다.
도 4는 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 레이저 입도 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 피부 흡수력 실험 결과 그래프를 나타낸다.
도 6은 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등을 주입한 경우의 공복 혈당 검사 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등을 주입한 경우의 당화혈 색소 측정 결과를 나타낸다.
도 8a는 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 수크로스 활성 억제 결과를 나타낸다. 도 8b는 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 말타아제 활성 억제 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 GLUT4 발현 억제율을 나타낸다.
도 10은 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 OGTT 검사 결과를 나타낸다.
도 11은 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 혈장 인슐린 검사 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 혈장 아디포넥틴 측정 결과를 나타낸다.
도 13은 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등의 G6Pase 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 14는 실시예 1, 비교예 1의 리포좀 등을 적용한 경우 췌장의 면역조직학적 관찰결과를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
<삼투압 효소 발효물의 제조방법>
본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법은, (a) (i)기질로서 돼지감자, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; (c) 상기 2차 발효물을 0 내지 10℃에서 숙성하여 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계; (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 제(d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함한다.
이하, 상기 제조방법을 각 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(돼지감자), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다.
기질로는 돼지감자를 사용한다.
이때, 기질은 유효성분을 용이하게 추출하기 위해, 일정한 크기로 분쇄하거나 압착기를 이용한 착즙 형태일 수 있다.
당으로는 당업계에 공지된 통상적인 당류를 제한 없이 사용할 수 있으며, 백설탕, 황설탕 및 원당(비정제당)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 당으로는 황설탕 또는 원당을 사용하는 것이 바람직하고, 원당을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
접종하는 미생물로는 효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae )와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum )을 사용하며, 효모 발효와 유산균 발효가 동시에 진행될 수 있다. 상기 효모로는 사카로마이세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1( KCTC 11386BP ), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae )( KCTC 7904)를 사용할 수 있으며, 사카로마이세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae ) MAB Y1( KCTC 11386BP )를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 유산균으로는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106( KCTC 12082BP ), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)(KCTC 3112)을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum ) Miev L1106( KCTC 12082BP )을 사용할 수 있다. 상기 미생물은 중량비를 기준으로 효모 : 유산균 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합되는 것이 바람직하며, 효모 : 유산균 = 1 : 0.8~1.2로 혼합되는 것이 더 바람직하다.
상기 기질, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 기질의 유효성분을 최대한으로 추출할 수 있다. 상기 기질과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 기질 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 것이 바람직하고, 기질 : 당 = 1 : 0.8~1.2인 것이 더 바람직하다. 상기 미생물의 사용량은 상기 기질과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 3 내지 5 중량% 인 것이 더 바람직하다.
이러한 기질, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 적절한 온도 및 호기 조건을 갖는 인큐베이터(incubator)에서 1차 발효함으로써, 기질의 수분과 함께 유효성분이 용출된 1차 발효물로 제조된다.
1차 발효 온도는 20 내지 50 ℃인 것이 바람직하고, 25 내지 45 ℃ 인 것이 더 바람직하다.
이때, 상기 혼합물이 산소가 차단된 혐기 조건에서 발효할 경우에는 효모에 의한 당 분해시 알코올이 생성되어 미생물의 효소 활성을 저해할 수 있으므로, 산소가 공급되는 호기 조건에서 발효를 진행하는 것이 바람직하다. 예를 들면 부직포로 발효용기의 입구를 산소만 겨우 통과할 정도로 막아 혐기 조건이 되지 않도록 한다.
상기 1차 발효하는 동안에는 일정한 간격으로 1차 발효물의 pH를 측정하여 오염 유무를 확인하고, 액상의 상층에 쌓이는 기포들을 제거한다. BCA assay, Bradford assay 등의 단백질 정량법을 이용하여 생성된 효소량을 추정한다.
상기 1차 발효물의 pH는 3 내지 6인 것이 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우, 효모에 의한 혐기 발효가 일어나거나 접종한 미생물이 아닌 외부 미생물에 의해 오염된 것으로 볼 수 있다. 상기 1차 발효물의 단백질량이 400 내지 1000 ug/ml일 경우에는 효소가 충분히 생성된 것으로, 1차 발효를 종료한다. 이때, 1차 발효 기간은 특별히 한정되지 않으나, 4일 내지 10일 동안 발효할 수 있다.
(b) 2차 발효 단계
(b) 단계는 1차 발효가 완료된 후, 매쉬를 이용하여 고형분을 걸러내고 당 및 미생물(효모, 유산균)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계이다. 이 단계는 각종 효소에 의한 집중 발효기간이다. 상기 당, 미생물로는 상기 (a) 단계에서 사용된 당, 미생물과 동일한 것이 사용될 수 있다.
상기 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 1차 발효물에 함유된 유효성분과 미생물에서 생성되는 효소의 반응을 향상시킬 수 있다. 상기 1차 발효물과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 것이 바람직하고, 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.8~1.2 인 것이 더 바람직하다. 상기 미생물의 사용량은 상기 1차 발효물과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량% 인 것이 바람직하고, 3 내지 5 중량% 인 것이 더 바람직하다.
1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 상기 (a) 단계의 1차 발효와 동일한 온도 및 호기 조건으로 2차 발효함으로써, 첨가된 미생물이 1차 발효물에 함유된 유효성분뿐만 아니라 죽은 미생물을 단백질원으로 이용하여 효소 반응에 의해 2차 발효물로 제조된다.
2차 발효시간에는 제한이 없으나 5일 ~ 18일 동안 발효시키는 것이 바람직하다. 2차 발효를 통하여 집중 발효가 이루어진다.
(c) 숙성 단계(3차 발효, 숙성)
(c) 단계는 2차 발효물을 0 내지 10 ℃에서 냉장보관하여 숙성하는 단계이다. 2차 발효물을 저온 보관하여 숙성함으로써, 미생물에 의한 발효를 정지시키면서 2차 발효물에 함유된 성분들이 상호작용할 수 있도록 한다. 그 결과 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물이 제조된다. 상기 숙성 온도는 0 내지 10 ℃인 것이 바람직하다.
(d) 초음파 처리 단계
이 단계는 1종 이상의 천연 유화제를 천연 용매 일부와 혼합한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 50~80℃에서 초음파 파쇄하여 상기 혼합물을 균질화하는 단계이다.
(e) 포집물질 첨가 및 혼합 단계
이 단계는 천연 유화제가 균질화되면 포집물질을 첨가한 후 초음파 파쇄하여 혼합하는 단계이다.
호모게나이저 등을 사용하던 종래기술과 달리, 천연 유화제 균질화 단계와 포집물질 첨가 단계에 초음파 파쇄 처리를 함으로써 유화제와 포집물질의 균질화도를 높이고 입자 크기를 조절할 수 있다.
(f) 기타
유화제와 포집물질이 완전히 균질화되면 40~60℃로 가온된 나머지 증류수와 천연추출물(방부제)을 넣고 초음파 파쇄를 통하여 혼합하여 리포좀 형태의 입자를 형성한다. 이후 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분간 초음파 파쇄를 하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 최종적으로 천연 리포좀을 제조한다.
한편, 본 발명의 또다른 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법은 (a) (i)기질로서 돼지감자, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계; (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 돼지감자함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계; (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (b) 단계에서 생성된 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 공정 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(돼지감자), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다. (a) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 (a) 단계와 동일한 것으로, 기질의 유효성분 및 미생물의 효소를 함유하는 1차 발효물을 제조한다.
(b-1) 멸균 단계
(b-1) 단계는 1차 발효물에 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계이다. 상기 (a) 단계에서 제조된 1차 발효물은 미세망(mesh)을 이용하여 고형분을 제거한 후 남은 1차 발효액을 멸균한다. 상기 멸균하는 조건은 특별히 한정되지 않으나, 온도가 100 내지 140 ℃이고, 시간이 5 내지 30 분일 수 있다. 이로 인해, 1차 발효물 20~50%를 기질로 미생물을 재접종하여 2차발효를 진행할 수 있다. 이때 함유되는 죽은 미생물은 재 발효시에 단백질원이 공급될 수 있다.
(b-2) 2차 발효물 제조 단계
(b-2) 단계는 멸균된 1차 발효물에 당 및 미생물(효모, 유산균)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계이다. 상기 (b-1) 단계에서 멸균된 1차 발효물은 2차 발효하기 위해 당 및 미생물을 첨가한다.
상기 당 및 미생물로는 상기 (a) 단계에서 사용된 당 및 미생물과 동일하다.
상기 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 1차 발효물에 함유된 유효성분과 미생물에서 생성되는 효소의 반응을 향상시킬 수 있다. 상기 1차 발효물과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 것이 바람직하고, 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.8~1.2 인 것이 더 바람직하다. 상기 미생물의 사용량은 상기 1차 발효물과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량% 인 것이 바람직하고, 3 내지 5 중량% 인 것이 더 바람직하다.
이러한 멸균된 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 상기 (a) 단계의 1차 발효와 동일한 온도 및 호기 조건으로 2차 발효함으로써, 첨가된 미생물이 1차 발효물에 함유된 유효성분뿐만 아니라 죽은 미생물을 단백질원으로 이용하여 효소 반응에 의해 2차 발효물로 제조된다.
(c) 숙성 단계
(c) 단계는 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계이다. (c) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법의 숙성 단계와 동일한 것으로, 최종 삼투압 효소 발효물을 제조한다.
(d), (e) 단계 및 기타 단계는 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법의 (c), (d) 단계와 동일하다.
이와 같이, 본 발명에 따라 제조된 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 돼지감자의 유효성분을 손실 없이 빠르고 균일하게 추출할 수 있으며, 제조된 천연 리포좀은 돼지감자에 의한 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 천연 유화제, 천연 용매, 천연 방부제, 천연 유래 포집물질을 포함하여 합성 성분을 포함하고 있지 않다는 점에서 종래의 합성 리포좀과 구별된다. 이들 각 성분을 살펴본다.
[천연 유화제]
천연 유화제는 지질 이중층을 구성하는 물질로서, 천연 물질에서 유래된 유화제이다. 상기 천연 유화제는 인지질과 지방산을 포함한다. 천연 유화제에 포함된 인지질은 천연에서 유래한 천연 인지질이며, 지방산 또한 천연에서 유래한 천연지방산이다. 상기 인지질로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 또는 이들의 수소첨가생성물(예를 들면, 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린(hydrogenated phophatidylcholine - 콩유래))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 인지질이 사용될 수 있다. 바람직하게는 산화안정성이 우수한 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린이 사용될 수 있다.
상기 지방산으로는 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 지방산이 사용될 수 있다.
상기 천연 유화제는 천연 인지질과 천연 지방산의 합계 합량 100 중량%를 기준으로 천연 인지질 70 내지 90 중량% 및 천연 지방산 10 내지 30 중량%를 포함할 수 있다. 상기 천연 유화제는 기타 용매를 잔량 포함할 수 있다. 용매로는 천연 유래 용매를 사용하는 것이 바람직하고, 증류수를 사용하는 것이 더 바람직하다.
또한 천연 유화제는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 일례로는 2종의 천연 유화제 또는 3종의 천연 유화제를 혼합하여 사용할 수 있다. 2종의 천연 유화제를 혼합하여 사용할 경우, 예를 들면, 제1 천연 유화제로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)이 사용될 수 있고, 제2 천연 유화제로는 하이드로지네이티드포스파티딜콜린(hydrogenated phosphatidylcholine - 콩 유래)이 사용될 수 있다. 또한, 3종의 천연 유화제를 혼합하여 사용할 경우, 예를 들면, 상기 제1 천연 유화제, 제2 천연 유화제 외에, 제3 천연 유화제로서 세테아릴올리베이트(Cetearylolivate), 소르비탄올리베이트(sorbitanolivate - 올리브유래)가 사용될 수 있다.
천연 유화제의 함량은 전체 천연 리포좀의 중량을 기준으로 0.1 내지 10중량%인 것이 바람직하다.
[포집물질]
리포좀의 인지질층 내부에 포집될 수 있는 포집물질로는 상기 언급한 삼투압 효소 발효물이 사용될 수 있다. 상기 포집물질의 함량은 천연 리포좀 전체의 중량을 기준으로 1 내지 50 중량%이다.
[용매]
용매로는 천연 유래 용매, 예를 들면 증류수, 천연 유래의 글리세린, 천연 에탄올, 천연 프로판디올, 천연 글리세린, 발효 주정이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 증류수, 천연 유래의 글리세린, 천연 에탄올이, 더 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다. 용매의 함량은 유화제, 포집물질, 방부제의 함량의 잔량이다.
[방부제]
방부제로는 식품 방부제로 사용될 수 있는 천연유래 방부제라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면 천연 추출물이 사용될 수 있다. 바람직하게는 자몽 추출물, 감귤 추출물이 사용될 수 있다. 천연추출물이라는 점에서 통상적으로 사용되는 방부제인 안식향산류, 소르빈산류, 프로피온산류, 데히드로초산류, 파라옥시 안식향산류 등과는 구별된다. 방부제는 천연 리포좀 전체의 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량% 포함될 수 있다.
[기타]
기타 포집물질을 코팅하기 위한 성분으로 코팅제가 추가로 포함될 수 있다. 코팅제로는 식이섬유, 전분, 다당체 등이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 말토덱스트린, 타피오카, 구아검, 옥수수 전분 등이 사용될 수 있다. 포집물질이 잘 흡수되도록 안정성이 높다는 면에서 말토덱스트린을 사용하는 것이 바람직하다.
또한 체내 흡수를 돕기 위해서 흡수보조제가 추가로 포함될 수 있다. 흡수보조제로는 카페인이 다량 함유된 식물 추출 분말이 사용될 수 있으며 예를 들면 과라나 추출 분말 등이 사용될 수 있다.
<삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 화장료 , 식품, 약학 조성물>
본 발명에 의한 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 생물에서 유래하여 인체에 안전한 물질로서, 체내 투과율이 우수하여 흡수율이 높다. 그러므로 본 발명에 의한 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 화장료, 식품, 약학 조성물로 이용될 수 있다. 이때, 상기 조성물들은 혈당을 조절하여 항당뇨에 효과적일 수 있다.
구체적으로, 상기 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 오일, 파우더, 에어졸, 연고 등의 형태로 이용될 수 있으며, 화장료 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물은 샴푸, 린스, 토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스 등 모발용 화장료 조성물로 사용되거나 바디샤워, 바디로션, 바디오일, 바디미스트, 파운데이션, 세안제, 미스트 등 안면 또는 전신용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 음료, 건강기능식품 등의 형태로 이용될 수 있으며, 식품 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제, 외용제, 좌제, 주사용제 등의 형태로 이용될 수 있으며, 약품 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 구체적으로 설명하나, 하기 실시예는 본 발명의 한 형태를 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1-1] 돼지감자 삼투압 효소 발효물
기질로서 돼지감자를 흐르는 물로 세척한 후 물기를 완전히 제거한 다음 가로, 세로, 높이 모두 1~2 cm로 일정하게 절단하여 준비하였다. 준비된 기질과 당을 1:1의 중량비로 혼합하였다. 효모, 유산균은 기질과 당의 혼합물 전체 중량을 기준으로 각각 5 중량%의 양으로 상기 혼합물에 접종하였다. 하기 표 1에 사용된 원료 및 함량이 기재되어 있다.
혼합물 함량
기질 돼지감자 50중량%
당 천연당 (원당) 50중량%
효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1 (KCTC 11386BP) Seed 배양액 기질과 당의 혼합물 기준 5중량%
유산균 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MieV L1106 (KCTC 12082BP) Seed 배양액 기질과 당의 혼합물 기준 5중량%
상기 혼합물을 발효용기에 담고, 산소만 겨우 통과하도록 부직포로 발효용기의 입구를 차단한 다음 30 ℃ 인큐베이터에서 1차 발효하였다. 1차 발효를 시작한 시점을 0일째 샘플로 간주하고, 24시간 간격으로 1차 발효물을 채취하여 pH를 측정하고, 단백질 정량법(BCA assay)으로 효소량을 측정하였다. 1차 발효하는 동안 1차 발효물의 표면에 생성되는 기포를 제거하였다. 약 7일째, 1차 발효물의 효소량이 800 ug/ml인 것을 확인한 후 미세망(300 mesh)을 이용하여 1차 발효물의 고형분을 제거하였다.
고형분이 제거된 1차 발효액을 소독한 새로운 용기에 담고, 20~50℃ 배양기에서 발효시켜 인버테이스(Invertase) 환원당량이 4.0 mg/ml이하가 될 때까지 발효를 진행하였다. 그런 다음 상기 발효물을 4 ℃에서 숙성함으로써, 돼지감자 삼투압 효소 발효물을 제조하였다.
[실시예 1-2] 돼지감자 삼투압 효소 발효물을 포함하는 천연 리포좀
천연 유화제로서 Lipoid P75(유화제1 전체 100중량%를 기준으로, 포스파티딜콜린 67중량%, 리소포스파티딜콜린 8중량%, 포스파티딜에탄올아민 8 중량%, 팔미트산 3 중량%, 스테아르산 1 중량%, 올레산 3 중량%, 리놀레산 7 중량%, 리놀렌산 3 중량% 포함)와 65℃도로 가열한 증류수를 혼합하여 Lipoid P75를 용해시키고 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid Processor, QSONICA, USA)를 이용하여 초음파 처리하면서 스푼으로 저어주었다.
그런 다음, Lipoid P75가 증류수에서 균질화되면 포집물질로서 실시예 1-1에서 제조된 돼지감자 삼투압 효소 발효물을 첨가한 후 초음파 처리하며 저어주면서 분산시켰다. 천연 유화제와 포집물질이 균질화되면 65℃로 가열된 천연 유화제-포집 물질 상에 말토덱스트린을 첨가하고 초음파 처리하여 균질화하였다.
그런 다음, 65℃로 가온된 증류수와 자몽 종자 추출물(천연 방부제)을 넣고 초음파 처리하여 리포좀 형태의 예비 입자를 형성하였다. 이후 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분동안 초음파 파쇄하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 돼지감자 삼투압 효소 발효물이 함유된 천연 리포좀을 제조하였다. 원료 및 함량은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
원료 함량(중량%)
증류수 30.00
천연 유화제 2.50
돼지감자 삼투압 효소 발효물 10.00
말토 덱스트린 1.00
증류수 56.485
자몽종자추출물 0.015
합계 100.00
[비교예 1] 돼지감자 삼투압 효소 발효물 합성 리포좀
비교예 1에서는 돼지감자 삼투압 효소 발효물, 레시틴, 콜레스테롤, 에탄올, 포타슘소르베이트 등이 포함된 종래의 합성 리포좀을 제조하였다.
용매로서 증류수를 사용하고 여기에 합성 유화제로서 레시틴, 콜레스테롤, 프로필렌글리콜과 에탄올을 호모게나이저를 이용하여 13000 rpm, 섭씨 50도에서 10분동안 교반하면서 혼합하였다. 이후 합성 유화제가 완전히 균질화되면 돼지감자 삼투압 효소 발효물을 첨가한 후 다시 호모게나이저(homogenizer)로 교반하면서 혼합하여 균질화하였다. 혼합이 완료되면 잔량의 증류수와 말토덱스트린, 방부제(포타슘소르베이트 0.1%)를 넣어 합성 리포좀 예비 입자를 형성하고 이를 초음파 파쇄하여 균질화함으로써 최종적으로 합성 리포좀 입자를 제조하였다. 사용된 함량은 하기 표 3과 같다.
조성물 함량 (중량%)
합성 유화제 레시틴 10.0
콜레스테롤 0.2
에탄올 5.0
프로필렌글리콜 10.0
용매 증류수 63.7
천연 코팅제 말토덱스트린 1.0
합성 방부제 포타슘소르베이트 0.1
포집 물질 돼지감자삼투압 효소 발효물 10.0
[실험예 1] 알파-아밀라제 저해율
항당뇨 효과가 우수한 기질을 확인하기 위하여 알파-아밀라제 저해 활성을 측정하였다. 알파-아밀라제 저해율이 높은 경우 탄수화물의 소화속도를 조절하여 식후 혈당상승을 억제하는 것으로 볼 수 있기 때문이다. 실험은 다음과 같은 방법으로 진행되었다.
1. 당뇨치료제로 사용되는 아카보즈 대조군(1mg/mL)과 여주, 더덕, 도라지, 돼지감자, 생강을 각각 삼투압효소발효법으로 발효시킨 발효액 40 ㎕에 1 unit/mL의 인간 타액 기원 유래 ?-amylase 50 ㎕를 넣고 기질인 1.0% 전분 100 ㎕를 혼합하였다.
2. 상기 혼합물을 20에서 3분간 반응시켰다.
3. 상기 혼합물에 48 mM DNS 발색시약(3,5-dinitrosalicylic acid and 30% sodium potassium tartaratein 0.5 M NaOH) 500 mL를 첨가하였다.
4. 그 후 100에서 15분 동안 가열하여 발색시킨 후 충분히 냉각시켰다.
5. 상기 반응액에 상기 반응액의 3배 가량의 증류수를 가하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
6. 양성대조군인 acarbose로 동일한 과정을 수행하였다.
7. 저해율 계산 방법은 다음과 같다.
저해율(%)=1－{(반응구의 흡광도－반응구의 blank의 흡광도)/(대조구의 흡광도-대조구의 blank의 흡광도)}?100
실험결과를 도 1에 나타내었다. 실험결과 돼지감자 삼투압 발효물이 항당뇨 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다.
[실험예 2] 항 당뇨 기초 생리활성 실험
제2형 당뇨는 인슐린 합성 및 분비 장애 (beta-cell 기능 저하)에 의해 체내 에너지원인 포도당이 이용되지 못하고 혈중 내 포도당 농도를 증가시켜 발생되는 질병이다. α-글루코시다아제(glucosidase)는 소장의 brush-border membrane에 존재하는 소화 효소로서 이당류나 다당류를, 탄수화물이 소화 흡수되기 위한 상태인 단당류로 가수분해하는 역할을 한다. 소장 내 α-글루코시다아제에 의한 탄수화물의 흡수는 대개 소장 상부에서 신속하게 이루어져 식후 혈당치의 급격한 상승을 초래한다. 정상인의 경우 소장 내에 말타아제나 수크로스와 같은 α-글루코시다아제를 적절히 억제함으로써 식후에 급격한 혈당상승을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 α-글루코시다아제를 적절히 억제함으로써 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시켜 혈당을 떨어뜨려 항당뇨 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다. 실험방법은 아래와 같다.
1. 여주, 더덕, 도라지, 돼지감자, 생강 각각의 삼투압효소 발효물(10 mg/mL) 50㎕에, 그리고, 아카보즈(당뇨병 치료제) 50 ㎕에, 각각 α-glucosidase 100㎕를 넣고 여기에 기질(40 mM 말토스) 500 ㎕를 첨가하였다.
2. 싱기 혼합물을 37℃에서 30분 동안 반응시켰다.
3. 100℃에서 5분간 중탕하면서 반응을 정지시켰다.
4. 반응액 중에서 100 ㎕를 24 well-plate에 넣은 후 글루코스 키트 효소 시약 1 mL을 첨가하였다.
5. 37°C에서 5분 동안 발색시켰다.
6. 500nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
7. 저해율을 다음과 같이 계산하였다.
저해율(%)＝1－{(반응구의 흡광도－반응구의 blank의 흡광도)/ (대조구의 흡광도－대조구의 blank의 흡광도)}×100
실험결과를 도 2에 나타내었다. 실험결과 돼지감자 삼투압 발효물이 α-글루코시다아제를 저해하여 항당뇨 효과가 있는 것으로 나타났다.　
[실험예 3] 전자주사현미경에 의한 리포좀의 형태 분석
전자주사현미경(Scanning Electron Microscope S-1700, Hitachi)을 이용하여 돼지감자 삼투압 효소 발효물(MOF), 돼지감자 열수 추출물, 실시예 1의 천연 리포좀(돼지감자 MOF CPS), 비교예 1의 합성 리포좀(돼지감자 MOF 합성 리포좀)의 입자형태와 크기를 분석하였다. 측정은 제조된 시료를 섭씨 -60℃에서 동결 건조한 다음 얇게 펴서 PdPt 혼합촉매로 1회 코팅한 후 이루어졌다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. SEM 분석 결과, 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 크기가 가장 작고 모양 또한 동그랗고 일정한 것으로 나타났다.
[실험예 4] 레이저 입도분석기에 의한 리포좀의 크기 분석
레이저 입도분석기(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer ELS-8000, Otsuka)를 이용하여 샘플의 입자 크기를 측정하고 입도 분포를 분석하였다.
측정한 돼지감자 삼투압 효소 발효물, 돼지감자 열수 추출물, 실시예 1의 천연 리포좀, 비교예 1의 합성 리포좀의 평균 입자크기, 입자 분포도를 도 4에 나타내었다. 입도 분석 결과, 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 입자 크기가 가장 작고 균일하게 분포되어 있는 것으로 나타났다.
[실험예 4] Franz Diffusion cell을 이용한 피부 흡수력
각각의 샘플이 피부 투과 증진에 어떠한 효과를 주는지 확인하기 위하여 흡수력 비교 실험을 진행하였다. 실험은 Franz diffusion cell을 이용한 피부 투과 실험으로 진행되었다.
돼지피부를 이용하여 동일한 양의 샘플에 대한 흡수력을 측정하였다. 샘플로는 돼지감자 삼투압 효소 발효물, 실시예 1의 천연 리포좀, 비교예 1의 합성 리포좀이 사용되었다. donor와 receptor phase 사이에 멤브레인을 고정하고 준비된 Franz diffusion cell의 donor에 각각의 샘플 1ml를 투여한 다음, 항온수조를 이용해 온도를 약 37로 유지하였다. 30분 간격으로 매 회 0.25~0.5ml의 receptor phase을 sampling port를 통해 채취하여 튜브에 보관한 후 측정하였다.
실험 결과를 도 5에 나타내었다. 흡수력 실험 결과, 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소발효물 천연 리포좀의 흡수력이 다른 물질 보다 유의적으로 높은 것으로 나타났다.
[실험예 5] 공복 혈당 검사
5주령이 된 db/db 마우스에게 적응기 1주를 둔 후 5주 동안 실험 식이를 제공하였다. 정상군(Normal, db/db wild type mouse), 대조군(db/db mouse), 일반적인 혈당치료제로 사용되는 아카보즈(acabose, 25mg/kg Body Weight) 식이군, 돼지감자열수추출물, 돼지감자열수발효추출물, 돼지감자 삼투압효소 발효물(MOF)와 돼지감자 삼투압효소발효물 천연리포좀(MOF CPS)와 돼지감자 삼투압효소발효물(MOF) 합성리포좀을 각각 300μL/kg Body weight로 경구투여 하였다. 공복 혈당 측정을 위해 음식 공급을 중단시킨 후 공복혈당을 검사하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
1. db/db 마우스를 12시간동안 절식시켰다.
2. 실험동물의 눈을 가린 상태에서 움직이지 않도록 고정시켰다.
3. 란셋을 이용하여 꼬리 정맥을 찔러 혈액을 채취하고 혈당측정기로 혈당을 측정하였다.
실험결과를 도 6에 나타내었다. 초기 시작 혈당과 6주간 샘플 경구투여 후 혈당 변화를 살펴본 결과, 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 경우 초기에는 높은 혈당을 나타냈지만 시간이 지난 후 정상 혈당에 가까워진 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6] 당화혈색소 검사
혈액 중에 글루코스의 함량이 높으면 적혈구 헤모글로빈에 당이 비효소적 방법으로 결합되어 당화 혈색소(glycosylated hemoglobin)가 생성되는데, 이를 HbA1C라 부른다. 일반적으로 적혈구의 수명이 8~12주이므로, HbA1C를 측정하면 현재를 기준으로 4~6주 전후의 혈액내의 글루코스 농도가 반영된 지난 8~12주간의 평균 혈당치를 측정할 수 있다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
- 실험 기기 : Afinion AS100
- 카트리지 : Afinion HbA1c
1. 검체준비 : 12시간 공복한 후 전혈을 채취한 다음 전혈 60㎕를 EDTA(항응고제)가 들어있는 튜브에 옮겨 담고 조심스럽게 흔들어 주었다. 그런 다음 냉장(2~8℃) 보관하였다.
2. 채취한 전혈을 샘플링 디바이스에 채웠다.
3. 샘플링 디바이스를 카트리지에 장착하고 카트리지를 다시 기기에 장착한 다음 기기의 리드를 닫고 검사를 시작하였다.
4. 검사 완료 후 수치를 기록하였다.
검사 결과를 도 7에 나타내었다. 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀 경구투여군은 대조군에 비해 당화혈색소가 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 특히, 당뇨치료제 투여군에 비해서도 감소된 것으로 나타났다.
[실험예 7] 효소 활성 억제 측정
이당류 가수분해 효소는 소장에서 탄수화물을 분해하여 혈중 당 농도를 높이는 역할을 한다. 이러한 이당류 가수분해 효소로서 수크로스와 말타아제의 활성 억제율을 측정하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
1. 마우스의 소장 점막을 긁어서 무게를 측정한 다음 생리식염수를 넣어 균질화하였다.
2. 상기 균질화된 용액을 원심분리하여 상층액을 취하였다.
3. 분리한 상층액 50ul와 수크로스 또는 말타아제 50ul를 혼합하였다.
4. 상기 혼합물을 37에서 60분 동안 반응시켰다.
5. Glucose reagent 1.5ml을 넣고 37에서 60분 반응시켰다.
6. 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
7. 흡광도는 다음과 같은 방식으로 계산하였다.
Volumeactivity＝(15*Esample/Estandard)*[F{(4+점막세포무게)*희석배수}/60*0.05*n*180]
수크로스 측정 결과를 도 8a에 말타아제 측정 결과를 8b에 나타내었다. 실험 결과, 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀에서 소장 내 이당류가수분해 효소인 수크로스와 말타아제의 활성이 가장 낮은 것으로 나타났다.
[실험예 8] 단백질 발현 억제
Glucose transporter type 4 (GLUT4)는 인슐린 자극에 의해 세포질에서 세포막으로 전위(translocation)하여 글루코스가 세포내로 유입되는 글루코스 흡수과정을 조절한다. 인슐린 신호전달의 이상은 인슐린 저항성을 동반하고 더불어 GLUT4를 통한 세포의 글루코스 흡수기능을 저하시켜 혈당량을 증가시킴으로써 당뇨병을 초래한다. 그러므로 당뇨병 조절을 위해서는 인슐린 신호전달과 더불어 GLUT4의 전위를 조절하는 것이 중요하다는 것이 알려져 있다. 이에 따라 제2형 당뇨 실험동물에 대하여 각각의 샘플을 제공한 후 GLUT4 발현량을 측정하는 실험을 수행하였다. 구체적인 실험 방법은 아래와 같다.
1. 일정량의 간 조직을 lysis하여, 단백질을 추출하고 정량하였다.
2. 정량한 단백질 샘플을 SDS-아크릴아미드 겔에 충전하고, 전기영동하였다.
3. 맴브레인으로 옮겼다.
4. 맴브레인을 blocking buffer로 상온에서 3시간 동안 흔들어 섞어주었다.
5. TBST로 10분 동안 세정하였다(3회 반복).
6. Primary antibody (GLUT4)를 넣고 4℃에서 흔들어 섞어주었다(overnight).
7. TBST로 10분 동안 세정하였다(3회 반복).
8. Secondary antibody를 상온에서 1시간 정도 흔들어 섞어주었다.
9. TBST(또는 PBST)로 15분 동안 세정하였다(4회 반복).
10. ECL 용액을 맴브레인에 뿌리고, 카세트에 넣어 암실에서 감광시켰다.
그 결과를 도 9에 나타내었다. 실험결과, 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 섭취한 제2형 당뇨 실험동물의 GLUT4 발현량이 증대되는 것을 확인하였다.
[실험예 9] 내당능(OGTT) 검사
OGTT는 연속적 혈당 측정법으로 금식 후 공복 혈당 검사를 수행한 다음, 일정량의 포도당을 섭취하도록 하고 일정시간마다 채혈하여 혈당을 측정하는 방법이다. OGTT는 고혈당 혹은 저혈당을 감지하고, 당뇨를 진단하고, 당뇨환자를 모니터링하기 위하여 사용된다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
1. 2g/Kg body weight 농도로 글루코스 용액을 만들었다.
2. db/db 마우스를 12시간 이상 절식시켰다.
3. 준비해 둔 글루코스 용액을 개체 무게에 따라 적정량을 계산하여 경구투여하였다.
4. 글루코스를 투여한 즉시(0 분) 혈당을 측정하였다.
5. 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 시간대 별로 혈당을 측정하였다.
측정 결과를 도 10에 나타내었다. 경구 포도당 부하검사 결과 실시예 1의 돼지감자 삼투압 발효물 천연 리포좀을 섭취한 실험군이 당뇨치료제인 acarbose 경구투여군 보다 혈당 수치가 더 빨리 감소하는 것으로 나타났다.
[실험예 10] 혈장 인슐린 검사
인슐린 저항성이 나타나면 췌장에서는 인슐린 분비가 정상적으로 이루어지나 말초조직에서는 당을 대사하지 못하게 되어 혈중에 인슐린이 높아지는 고인슐린혈증(hyperinsulinemia)이 나타나게 된다. 따라서, 항당뇨 소재를 공급한 db/db 마우스의 혈중 인슐린을 측정하여 이를 당뇨조절에 관한 바이오마커로 활용할 수 있다. 구체적인 검사 방법은 다음과 같다.　
1. 분석 시약, 분석 시료, blank, standard를 준비하였다.
2. 마이크로플레이트의 각 well을 세척하였다.
3. 각 well에 Biotin conjugated anti-Insulin을 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다.
4. HRP-conjugated streptavidin solution을 첨가한 후, 상온에서 30분 동안 반응시켰다.
5. 이를 세척하였다.
6. Substrate chromogen reagent를 첨가한 후, 상온에서 30분간 반응시켰다.
7. Stop solution를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
8. 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
검사 결과를 도 11에 나타내었다. 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀 경구투여군은 대조군에 비해 혈중 인슐인 농도가 유의적으로 감소된 것으로 나타나 인슐린 저항성이 개선되었음을 알 수 있었다.
[실험예 10] 혈장 아디포넥틴 측정
인슐린 저항성이 나타나면 지방세포에서 아디포넥틴(adiponectin)이 분비되어 근육, 간, 혈관과 같은 말초조직에서 인슐린 작용을 향상시킨다고 알려져 있다. 많은 동물연구들이 혈중 아디포넥틴 농도의 감소와 인슐린 저항성 증가가 강한 상관관계를 가지고 있음을 보이고 있다. 임상적으로도 비만이나 제2형 당뇨병 환자에서의 아디포넥틴의 혈중 농도가 정상인들에 비해 낮다는 점이 보고되었고, 저아디포넥틴혈증이 제2형당뇨병을 포함한 대사성질환의 발생에 있어 중요한 인자라는 점이 보고되었다. 이에 따라 각 샘플을 투여한 경우의 혈장 아디포넥틴값을 측정하였다. 측정방법은 다음과 같다.
1. 분석시약과 혈장을 준비하였다.
2. 마이크로플레이트의 각 well을 세척하였다.
3. 마이크로플레이트의 각 well에 혈장 및 표준물질을 첨가한 후, 상온에서 1시간 반응시켰다.
4. 이를 세척하였다.
5. 2차 antibody를 첨가한 후, 상온에서 1시간 반응시켰다.
6. 이를 세척하였다.
7. Substrate solution을 첨가한 후, 상온에서 15분 반응시켰다.
8. Stop solution을 첨가하여 반응을 정지시켰다.
9. 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 12에 나타내었다. 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 투여한 군의 혈청 아디포넥틴 함량이 대조군에 비해 높게 나타났다. 이를 통하여 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀이 당뇨에 의해 감소된 혈청 아디포넥틴 농도를 회복시키는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
[실험예 11] G6Pase 활성 측정
Glucose-6-phosphatase (G6Pase)는 혈중 글루코스 수치 유지에 매우 중요한 효소이다. G6Pase 활성 측정 방법은 다음과 같다.
1. 간조직과 차가운 sample diluent를 넣고 균질화하여3000 rpm에서 원심분리한 후 깨끗한 상층액을 취하여 샘플을 준비하였다.
2. 테스트 튜브에 37℃의 NADP 용액을 넣고 37℃ 항온수조에 넣었다.
3. 균질화한 샘플을 넣었다.
4. 기질용액을 넣었다.
5. 잘 섞은 후 cuvette에 옮겼다.
6. 340nm에서 5분간 흡광도의 변화를 측정하였다.
7. 활성 계산법은 다음과 같다.
Glucose-6-phosphatase activity (nM/min/mg) = (AA340/min)/(6.22*10-3)*희석배수
활성값을 도 13에 나타내었다. 정상군에 비해 대조군에서 G6Pase활성이 유의적으로 증가하였으나 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀 투여군은 대조군에 비해 G6Pase활성이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통하여 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀에 의해 효소 활성이 감소되는 것을 알 수 있었다.
[실험예 12] 췌장조직의 조직면역학적 관찰
인슐린을 분비하는 췌장조직의 조직 면역학적 관찰을 통해 인슐린을 분비하는 베타세포를 함유하는 랑게르한스섬을 확인 할 수 있다. 조직면역학적 관찰결과는 인슐린 분비능을 확인할 수 있는 중요한 데이타이다.
1. 실험을 위해 희생된 마우스로부터 췌장을 적출하였다.
2. 10% (또는 4%) 포르말린 용액에 조직을 담가 조직을 고정하였다.
3. 고정한 조직을 10% 옮기고, 증류수가 담긴 비커에 담가 세척하고, 조직이 담긴 카셋트가 증류수에 충분히 잠기도록 하며, 흐르는 물을 이용해 새로운 물이 유입되도록 하였다.
4. 조직이 담긴 카셋트를 농도별 에탄올 용액(70% →→ 80% →→ 90% →→ 95% →→ 100% →→ 100%)에 순차적으로 담가 탈수시켰다. 에탄올 농도를 순차적하지 않으면, 조직성분의 변형과 위축을 가져올 수 있다.
5. 조직에 남아있는 에탄올을 제거하기 위해 Xylene 용액에 담궈주는 것을 3회 반복하였다. Xylene은 투명제로서 조직에서 에탄올을 제거하고, 침투제인 파라핀과 잘 혼합될 수 있도록 하였다.
6. 녹인 파라핀 용액에 조직이 담긴 카셋트를 담궜다. 카셋트가 녹인 파라핀 용액에 충분히 잠기도록 하였다.
7. 카셋트로부터 분리한 조직을 포매용 틀에 올려놓았다.
8. warm bath의 파리핀을 포매용 틀에 적당량 부은 후, cold plate로 옮겨 파리핀을 굳혔다. 파라핀의 특성상 고체가 되면서 부피가 줄어 드는데, 완전히 굳기 전에 추가적으로 파라핀을 첨가하여 부피를 유지하였다.
9. 파리핀이 완전히 굳으면, 포매용 틀을 제거하였다.
10. Microtome 홀더에 파라핀으로 포매된 블록을 끼우고, 조직을 3~5 μm의 두께로 잘랐다.
11. 파라핀 절편을　 슬라이드 글라스를 이용해 부유온수조로　 옮겼다.
12. 부유온수조(43℃)에 띄워 파라핀 절편의 주름을 펴고, 이를 새 슬라이드 글라스에 붙이고 실온에서 잘 건조시켰다. 건조된 슬라이드 글라스를 60℃ 오븐에 넣어 약 하루 정도 탈파라핀을 행하였다. 60℃ 오븐에서 꺼낸 슬라이드를 실온으로 식혔다. 슬라이드를 Xylene →→ Xylene →→ 100% alcohol →→ 95% alcohol →→ 80% alcohol →→ 70% alcohol →→ 증류수의 과정으로 탈파라핀 및 수화하였다.
13. Hematoxylin solution에 10분간 침지한 후, 증류수로 5분간 세척하였으며, 1% HCl-EtOH에 5~10번 담갔다가 증류수로 3분간 세척하였다. Eosin solution 2분 동안 침지한 후 염색된 조직을 농도별 에탄올 용액(70% →→ 80% →→ 90% →→ 95% →→ 100% →→ 100%)에 순차적으로 담가 탈수시켰다.
14. Xylene에 침지를 2회 실시하였다. 슬라이드 위에 mounting solution을 떨어뜨려 커버 글라스를 덮어 고정시켰다.
15. 슬라이드를 건조시킨 후 약 2일 동안 충분히 건조시켰다. 현미경으로 100배 배율에서 췌장조직을 촬영하였다.
췌장의 면역조직학적 관찰결과를 도 14에 나타내었다. 도시된 바와 같이 정상군에 비해 대조군에서 인슐린을 분비하는 베타세포를 함유하는 랑케르한스섬이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 실시예 1의 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀 투여군은 대조군에 비해 정상군에 가까운 것으로 나타났다. 이를 통하여 돼지감자 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 제2형 당뇨에서 인슐린 분비능을 정상화시킨다는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (26)

  1. (a) (i)기질로서 돼지감자, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계;
    (c) 상기 2차 발효물을 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계;
    (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계;
    (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계
    를 포함하는 방법에 의하여 형성되며,
    1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질을 포함하는 감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀으로서,
    상기 천연 유화제는 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 대두 포스파티딜콜린, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시롤, 및 이들의 수소첨가 생성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 인지질과, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산(콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 지방산을 포함하며,
    상기 천연 유래 용매는 증류수, 부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 프로판디올, 글리세린, 에탄올, 발효주정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 용매이고,
    상기 천연 방부제는 천연 유래 추출물인,
    돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  2. (a) (i)기질로서 돼지감자, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
    (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계;
    (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계;
    (c) 상기 2차 발효물을 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계;
    (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계;
    (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계
    를 포함하는 방법에 의하여 형성되며,
    1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질을 포함하는 감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀으로서,
    상기 천연 유화제는 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 대두 포스파티딜콜린, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시롤, 및 이들의 수소첨가 생성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 인지질과, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산(콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 지방산을 포함하며,
    상기 천연 유래 용매는 증류수, 부틸렌 글리콜, 프로필렌글리콜, 프로판디올, 글리세린, 에탄올, 발효주정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 용매이고,
    상기 천연 방부제는 천연 유래 추출물인,
    돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 당은 백설탕, 황설탕, 원당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  4. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1(KCTC 11386BP)인 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  5. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106(KCTC 12082BP)인 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  6. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효모 및 유산균은 중량비를 기준으로 효모 : 유산균 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합되는 것인 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  7. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 기질과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 기질 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  8. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 효모 및 유산균의 사용량은 기질과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  9. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1차 발효 및 2차 발효는 호기 조건에서 진행되는 것인 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 천연 방부제는 자몽 추출물 또는 감귤 추출물을 포함하는 천연 유래 추출물인 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  15. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 천연 유래 용매는 증류수인 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  16. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 천연 유화제는 1종 이상의 지방산과 1종 이상의 인지질을 함유하는 제1 천연 유화제와 1종 이상의 인지질을 함유하는 제2 천연 유화제를 포함하는 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  17. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 천연 리포좀 전체 중량을 기준으로 천연 유화제 0.1 내지 10 중량%, 천연 방부제 0.01 내지 5 중량%, 포집물질 1 내지 50 중량% 및 용매 잔량을 포함하는 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  18. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    말토덱스트린, 구아검, 옥수수 전분, 타피오카 중 하나 이상을 추가로 포함하는 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀.
  19. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
  20. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
  21. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 약학 조성물.
  22. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항의 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 항당뇨 조성물.
  23. (a) (i)기질로서 돼지감자, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
    (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계;
    (c) 상기 2차 발효물을 0 내지 10 ℃에서 숙성하여 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계;
    (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계,
    (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (c) 단계에서 생성된 돼지감자함유 삼투압 효소 발효물을 첨가한 후 초음파 처리하여 혼합하는 단계,
    (f) 상기 (e)단계의 생성물에 40~60℃로 가온된 증류수와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하여 리포좀을 형성하는 단계
    를 포함하는 제1항의 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제(f)단계 이후에 온도를 서서히 낮추면서 초음파 처리하는 단계
    를 추가로 포함하는 돼지감자 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법.
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