KR101853547B1 - 복합체, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 식품 또는 약학 조성물 - Google Patents

복합체, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 식품 또는 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 로즈힙 함유 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

복합체, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 식품 또는 약학 조성물{COMPLEX, PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF, AND FOOD OR PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}
본 발명은 복합체, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
로즈힙(rose hip)은 허브의 일종으로 건강기능식품의 원료로서 비타민 C가 다량 함유되어 있어 피부 건강에 좋고 관절 건강에도 유용하다고 알려져 있다.
로즈힙이 가진 다양한 효능을 활용하고자 로즈힙을 이용한 식품, 건강보조식품 등의 제품 개발이 진행되고 있다. 한국등록특허 제508759호에는 로즈힙 쨈 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1594137호에는 로즈힙을 포함하는 관절건강 개선용 건강기능식품 조성물이 개시되어 있다. 이러한 제품을 섭취할 경우에는 로즈힙에 의한 우수한 효과를 기대할 수 있으나, 개인마다 체내 흡수율이 상이하여 로즈힙에 의한 효과 또한 상이하게 나타날 수 있다. 따라서, 로즈힙 함유 제품을 섭취하더라도 동일한 효과를 발휘할 수 있도록 로즈힙의 체내 흡수를 높이는 기술 개발이 요구되고 있다. 이때, 로즈힙의 체내 흡수를 높이기 위한 방법으로, 리포좀과 같은 생체 약물 운반체를 이용할 수 있다.
리포좀(liposome)은 지질 이중층으로 구성된 인공적으로 제조된 소포로서, 생체 세포막과 유사한 구조를 갖는다. 상기 리포좀은 생체 세포막의 주요 성분인 인지질로 구성되어 생체 친화적이며, 수용액 상에서 친수성 및 소수성 물질을 리포좀의 지질 이중층으로 둘러싼 캡슐 형태로 존재한다. 이러한 리포좀은 이중층 구조 내에 원하는 유용 물질(약물, 영양물 등)을 저장할 수 있어, 불안정하고 취급이 어려운 물질을 세포내로 운반할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 리포좀은 이러한 장점에도 불구하고 제형이 불안정하고, 포집 효율이 매우 낮다는 등의 문제뿐만 아니라 리포좀 제조에 사용되는 용매, 방부제 등에 합성 물질이 포함되어 인체에 유해할 수 있다는 문제가 있다. 또한, 리포좀의 원료로 사용되는 콜레스테롤은 리포좀의 지질막을 견고하게 형성하여 포집 물질의 방출을 저해할 뿐만 아니라 포집 물질의 세포막 투과율을 낮춘다는 문제점이 있다.
이러한 리포좀의 문제점을 해결하면서 유용한 물질, 즉 로즈힙을 체내로 안정하게 전달하여 흡수율을 높일 수 있는 기술 개발이 여전히 필요한 실정이다.
한국등록특허 제508759호 한국등록특허 제1594137호
본 발명은 안정적인 형태를 가지면서도 생체에 용이하게 투입될 수 있으며 부작용이 적으면서도 우수한 관절건강개선효과 등을 나타내어 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있는 천연 리포좀을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예는 1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 포집 물질로서 로즈힙 분말을 포함하며, 상기 천연 유화제, 상기 천연 유래 용매, 상기 로즈힙 분말을 초음파 처리하여 혼합함으로써 형성되는 로즈힙 함유 천연 리포좀을 제공한다.
본 발명의 다른 일 예는 (a) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합한 후 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하는 제1단계; (b) 상기 제1단계의 혼합물에 인디언 구스베리 분말과 천연 코팅제를 첨가하고 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하여 혼합하는 제2단계; (c) 상기 제2단계의 혼합물에 로즈힙 분말을 첨가하고 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하는 제3단계; 및 (d) 상기 제3단계의 혼합물에 35℃ 내지 80℃로 가온된 천연 유래 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하는 제4단계를 포함하는 로즈힙 함유 천연 리포좀의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 예는 상기 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물, 약학 조성물, 또는 관절 건강 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 천연 리포좀은 생체에 용이하게 투입될 수 있을 뿐 아니라 부작용이 덜하면서도 우수한 관절건강개선효과를 나타내어 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 실시예 1-1, 비교예 1-1 ~ 1-7의 로즈힙 함유 천연 리포좀의 피부 흡수력 그래프를 나타낸다.
도 2a, 2b는 각 샘플의 피부 흡수력 측정 결과를 나타낸다.
도 3a, 3b는 각 샘플의 전자주사현미경 사진을 나타낸다.
도 4a, 4b는 레이저 입도 분석기에 의한 각 샘플의 입자크기 측정 결과 및 입도 분포도를 나타낸다.
도 5a, 5b는 각 샘플의 NO 생성 억제능 측정 결과를 나타낸다.
도 6a, 6b는 각 샘플을 1% 농도로 처리한 경우의 NO 생성 억제능 측정 결과를 나타낸다.
도 7a는 각 샘플을 적용한 경우의 무릎관절의 마이크로-CT (2D) 촬영 사진으로서 측면 촬영 사진이고, 도 7b는 정면 촬영 사진이다.
도 8a, 8b는 무릎관절 조직을 고정하고 염색한 후 각 샘플을 적용한 경우의 현미경 관찰 결과를 나타낸다.
도 9는 각 샘플을 적용한 경우의 무릎관절조직의 연골 함량을, 도 10은 골밀도를 나타낸다.
도 11은 각 샘플을 적용한 경우의 혈중 GAG 함량을 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 천연 리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 식품 또는 약학 조성물을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
< 로즈힙 함유 천연 리포좀 >
본 발명의 일 예에 로즈힙 함유 천연 리포좀은 1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제, 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 천연 유래 포집물질로서 로즈힙 분말과 인디언 구스베리 분말을 포함하며, 상기 천연 유화제, 상기 천연 유래 용매, 상기 로즈힙 분말을 초음파 처리하여 혼합함으로써 형성된다. 이들 각 성분을 살펴본다.
1. 리포좀 구성 물질
본 발명의 리포좀은 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 포함하는 천연 리포좀이다. 이러한 천연 물질로 이루어진 천연 리포좀은 인체에 독성이 없어 무해하며, 섭취 가능하다. 또한, 상기 리포좀은 안정한 인지질 이중층을 형성함으로써, 세포에 포집 물질을 효과적으로 전달할 수 있다.
[천연 유화제]
천연 유화제는 지질 이중층을 구성하는 물질로서, 천연 물질에서 유래된 유화제이다. 상기 천연 유화제는 인지질과 지방산을 포함한다. 천연 유화제에 포함된 인지질은 천연에서 유래한 천연 인지질이며, 지방산 또한 천연에서 유래한 천연지방산이다.
상기 인지질로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딘산(phosphatidic acid), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 및 이들의 수소첨가생성물(예를 들면, 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린(hydrogenated phophatidyl choline - 콩유래))로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 인지질이 사용될 수 있다. 바람직하게는 산화안정성이 우수한 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린이 사용될 수 있다.
상기 지방산으로는 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 지방산이 사용될 수 있다.
상기 천연 유화제는 천연 인지질과 천연 지방산의 합계 합량 100 중량%를 기준으로 천연 인지질 70 내지 90 중량% 및 천연 지방산 10 내지 30 중량%를 포함할 수 있다. 상기 천연 유화제는 기타 용매를 잔량 포함할 수 있다. 용매로는 천연 유래 용매를 사용하는 것이 바람직하고, 증류수를 사용하는 것이 더 바람직하다.
또한, 천연 유화제는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 일례로는 2종의 천연 유화제 또는 3종의 천연 유화제를 혼합하여 사용할 수 있다. 2종의 천연 유화제를 혼합하여 사용할 경우, 예를 들면, 제1 천연 유화제로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)이 사용될 수 있고, 제2 천연 유화제로는 하이드로지네이티드포스파티딜콜린(hydrogenated phosphatidylcholine - 콩 유래)이 사용될 수 있다. 또한, 3종의 천연 유화제를 혼합하여 사용할 경우, 예를 들면, 상기 제1 천연 유화제, 제2 천연 유화제 외에, 제3 천연 유화제로서 세테아릴올리베이트(Cetearylolivate), 소르비탄올리베이트(sorbitanolivate - 올리브유래)가 사용될 수 있다.
또한, 상기 천연 유화제는 천연 지방산을 더 포함할 수 있다. 상기 천연 지방산으로는 바람직하게는 달맞이꽃 오일을 사용할 수 있다. 상기 천연 지방산의 함량은 전체 천연 유화제의 중량을 기준으로 0.1 내지 5 중량%일 수 있다.
천연 유화제의 함량은 전체 천연 리포좀의 중량을 기준으로 0.1 내지 10중량%인 것이 바람직하다.
[용매]
용매로는 천연 유래 용매, 예를 들면, 증류수, 천연 유래의 글리세린, 천연 에탄올, 천연 프로판디올, 천연 글리세린, 발효 주정이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 증류수, 천연 유래의 글리세린, 천연 에탄올이, 더 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다. 용매의 함량은 전체 홍국 함유 천연 리포좀의 중량을 기준으로 천연 유화제, 천연 코팅제, 천연 방부제 및 포집 물질을 제외한 잔량인 것이 바람직하다.
[방부제]
방부제로는 식품 또는 의약품 방부제로 사용될 수 있는 천연 유래 방부제라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면 천연 추출물이 사용될 수 있다. 감귤 추출물, 유자 추출물, 유칼립투스 추출물, 고삼 추출물, 정향 추출물, 자몽 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 바람직하게는 자몽 추출물, 감귤 추출물이 사용될 수 있다. 천연추출물이라는 점에서 통상적으로 식품 방부제로 사용되는 안식향산류, 소르빈산류, 프로피온산류, 데히드로초산류, 파라옥시 안식향산류 등과는 구별된다.
화장품으로 사용될 경우 화장품 방부제로 사용될 수 있는 천연 유래 방부제가 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 초피나무열매 추출물, 할미꽃(백두옹) 추출물, 어스니어 추출물이 사용될 수 있다.
방부제의 함량은 천연 리포좀 전체의 중량을 기준으로 0.001 내지 3 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 0.3 중량% 인 것이 더 바람직하다.
2. 포집물질
본 발명에 따른 포집물질은 상기 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀의 지질 이중층 내부에 포집되는 물질이다. 상기 포집 물질로는 상기 언급한 로즈힙 분말이 사용된다. 또한 포집물질로는 인디언 구스베리 분말이 사용될 수 있다. 인디언 구스베리 분말은 비타민 C 함량이 높아 콜라겐 생성에 도움을 주고 리포좀의 흡수율을 높여주는 역할을 할 것으로 기대된다.
상기 포집물질의 함량은 천연 리포좀 전체의 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%인 것이 바람직하다.
3. 기타
기타 포집물질을 코팅하기 위한 성분으로 코팅제가 추가로 포함될 수 있다. 코팅제로는 천연 코팅제가 바람직하게 사용된다. 코팅제로는 식이섬유, 전분, 다당체 등이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 말토덱스트린, 타피오카, 구아검, 옥수수 전분, 과라나 추출물 등이 사용될 수 있다. 포집물질이 잘 흡수되도록 안정성이 높다는 면에서 말토덱스트린을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 포집물질을 둘러싼 리포좀이 체내에서 흡수가 잘 이루어지도록 돕기 위해서 흡수보조제가 추가로 포함될 수 있다. 흡수보조제로는 카페인이 다량 함유된 식물 추출 분말이 사용될 수 있으며, 예를 들면 과라나 추출 분말 등이 사용될 수 있다. 또한, 인디언 구스베리 추출물도 사용될 수 있다. 천연 흡수보조제를 포함하는 로즈힙 함유 천연 리포좀은 체내에서 포집 물질의 세포 내 흡수율이 높아져 로즈힙에 의한 우수한 효과를 발휘할 수 있다.
이러한 천연 코팅제의, 천연 흡수보조제의 함량은 로즈힙 함유 천연 리포좀의 전체 중량을 기준으로 각각 0.001 내지 3 중량%인 것이 바람직하다.
이와 같이, 본 발명의 로즈힙 함유 천연 리포좀은 입자 크기가 작은 로즈힙 추출물을 지질 이중층이 둘러싼 캡슐 형태로서, 로즈힙 추출물을 세포내로 용이하게 전달할 수 있다. 상기 로즈힙 함유 천연 리포좀이 세포에 전달될 경우에는 리포좀의 지질 이중층과 세포막이 용이하게 결합하면서 로즈힙 추출물의 세포 흡수율이 높아지므로, 로즈힙에 의한 관절 건강 개선 효과를 기대할 수 있다.
4. 로즈힙 함유 천연 리포좀의 제조방법
또한 본 발명의 일 예에 따른 로즈힙 함유 천연 리포좀은 (a) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하는 제1단계; (b) 상기 제1단계의 혼합물에 인디언 구스베리 분말과 천연 코팅제를 첨가하고 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하여 혼합하는 제2단계; (c) 상기 제2단계의 혼합물에 로즈힙 분말을 첨가하고 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하는 제3단계; 및 (d) 상기 제3단계의 혼합물에 천연 유래 용매와 천연 방부제를 첨가하고 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하는 제4단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된다.
상기 (a) 제1단계는 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 35℃ 내지 80℃ 에서 초음파 처리하여 혼합하는 단계이다. 상기 초음파 처리는 천연 유래 용매와 천연 유화제가 혼합된 혼합물을 균질화하기 위한 작업으로, 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid processor)를 이용할 수 있다. 이러한 천연 유래 용매와 천연 유화제를 혼합한 다음, 이를 35℃ 내지 80℃, 바람직하게는 50℃ 내지 75℃, 더 바람직하게는 60℃ 내지 70℃로 가온한 후 초음파 처리함으로써, 천연 유래 용매 내에 천연 유화제의 인지질과 지방산을 균질화할 수 있다. 상기 온도 범위에서 유화제가 리포좀을 안정적으로 형성하기에 유리한 온도 범위이다.
(b) 제2단계는 상기 제1단계의 혼합물에 인디언 구스베리 분말과 천연 코팅제를 첨가하고 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하여 혼합하는 단계이다. 2단계를 통하여 각 성분을 균질하게 혼합할 수 있으며 입자 크기가 작은 리포좀을 형성할 수 있다. 초음파 처리는, 예를 들면, 제1단계의 혼합물에 인디언 구스베리 분말과 천연 코팅제를 첨가하고 35℃ 내지 80℃로 가온하여 혼합한 후 수행될 수 있다. 하지만, 상기 제1단계의 혼합물이 상기 온도 범위를 유지하고 있는 경우에는 별도의 가온 공정 없이 초음파 처리를 할 수 있다.
(c) 제3단계는 상기 제2단계의 혼합물에 로즈힙 분말을 첨가하고 35℃ 내지 80℃ 에서 초음파 처리하는 단계이다. 초음파 처리는, 예를 들면, 제2단계의 혼합물에 로즈힙 분말을 첨가하고 35℃ 내지 80℃로 가온하여 혼합한 후 수행될 수 있다. 하지만, 상기 제2단계의 혼합물이 상기 온도 범위를 유지하고 있는 경우에는 별도의 가온 공정 없이 초음파 처리를 할 수 있다.
(d) 제4단계는 상기 제3단계의 혼합물에 천연 유래 용매와 천연 방부제를 첨가하고 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하는 단계이다. 천연 유래 용매와 천연 방부제를 상기 온도로 미리 가온한 다음 초음파를 수행할 수도 있다.
(b) 제2단계, (c) 제3단계, (d) 제4단계에서 초음파 처리는 35℃ 내지 80℃에서 수행되며, 바람직하게는 60℃ 내지 70℃에서 수행된다.
또한, 제4단계 이후에 온도를 서서히 낮추면서 반복적으로 초음파 처리하는 단계를 수행할 수 있다(제5단계). 제조된 리포좀을 온도를 서서히 낮추면서, 바람직하게는 35℃ 내지 70℃에서, 최종적으로 1 내지 10분, 바람직하게는 3 내지 8분 동안 초음파 처리함으로써, 보다 작고 균일한 최종 함유 천연 리포좀을 제조한다. 상기 초음파 처리는 원하는 입자 크기를 갖는 천연 리포좀을 제조하기 위해 반복적으로 실시될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3회로 실시할 수 있다.
<삼투압 효소 발효물 천연 리포좀 >
본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법은, (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20℃ 내지 50℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0℃ 내지 10℃에서 숙성하는 단계; (c) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (d) 상기 제(c)단계의 생성물에 포집물질로서 (b) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(버섯), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다.
기질로는 버섯을 사용하며, 이들의 종류, 원산지 및 형태는 특별히 한정되지 않는다. 기질로는 표고버섯, 꽃느타리버섯, 새송이버섯, 양송이버섯, 팽이버섯 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 기질로는 표고버섯, 또는 팽이버섯을 사용한다.
버섯은 식이섬유가 풍부하여 장내의 유해물, 노폐물을 배설하고 혈액을 깨끗하게 하며 면역 기능을 높이고 감염이나 암 예방 등에 효능이 있다.
버섯으로부터 유효성분을 추출하는 방법으로는 열수 추출, 가압 추출, 용매 추출 등의 추출법이나 알코올 발효, 젖산 발효, 메탄 발효 등의 발효법을 이용할 수 있으며, 이를 통해 기질인 버섯의 유효성분을 포함하는 추출물을 제조할 수 있다.
그러나 열수 추출이나 가압 추출을 이용할 경우에는 높은 열과 압력에 의해 기질의 유효성분이 파괴될 뿐만 아니라 변성되어 원하는 효능을 발휘하기 어려울 수 있고, 용매 추출을 이용할 경우에는 유효성분의 손실은 막을 수 있으나, 추출물에 잔존하는 비극성 용매, 유기 용매 등으로 인하여 인체에 해로울 수 있다는 문제점이 있다.
표고버섯은 잎, 꽃, 줄기, 뿌리 등을 포함하는 전초를 사용할 수 있다. 표고버섯은 베타글루칸의 함량이 높고, 혈액순환개선, 혈당 조절 등의 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 표고버섯에는 레이다데민이라는 물질이 있어서 혈액 속의 콜레스테롤 수치를 저하시키고 혈압을 떨어뜨린다. 따라서 표고버섯은 고혈압이나 동맥경화 예방, 빈혈 등에 효과적이다. 또한, 표고버섯은 비타민 C 함량이 높고 비타민 D2의 전구체인 에르고스레롤도 함유되어 있다. 이외에 표고버섯은 바이러스 증식 억제, 면역력 증강, 암 전이 억제 등의 작용을 하는 것으로 알려져있다.
팽이버섯은 팽나무, 버드나무 등의 고목에서 발생하는 버섯으로, 항균, 함염증, 항종양, 항바이러스, 면역 조절 효과 등을 가지며 비타민 B와 비타민 C가 풍부하다.
이때, 기질은 유효성분을 용이하게 추출하기 위해, 일정한 크기로 분쇄하거나 압착기를 이용한 착즙 형태일 수 있다.
당으로는 당업계에 공지된 통상적인 당류를 제한 없이 사용할 수 있으며, 백설탕, 황설탕 및 원당(비정제당)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 당으로는 황설탕 또는 원당을 사용하는 것이 바람직하고, 원당을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
접종하는 미생물로는 효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum )을 사용하며, 효모 발효와 유산균 발효가 동시에 진행될 수 있다. 상기 효모로는 사카로마이세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae ) MAB Y1( KCTC 11386BP ), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)(KCTC 7904)를 사용할 수 있으며, 사카로마이세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae ) MAB Y1( KCTC 11386BP)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 유산균으로는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum ) Miev L1106( KCTC 12082BP ), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum )( KCTC 3112)을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum ) Miev L1106( KCTC 12082BP )을 사용할 수 있다. 상기 미생물은 중량비를 기준으로 효모 : 유산균 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합되는 것이 바람직하며, 효모 : 유산균 = 1 : 0.8~1.2로 혼합되는 것이 더 바람직하다.
상기 기질, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 기질의 유효성분을 최대한으로 추출할 수 있다. 상기 기질과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 기질 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 것이 바람직하고, 기질 : 당 = 1 : 0.8~1.2인 것이 더 바람직하다. 상기 미생물의 사용량은 상기 기질과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 3 내지 5 중량% 인 것이 더 바람직하다.
이러한 기질, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 적절한 온도 및 호기 조건을 갖는 인큐베이터(incubator)에서 1차 발효함으로써, 기질의 수분과 함께 유효성분이 용출된 1차 발효물로 제조된다.
1차 발효 온도는 20℃ 내지 50℃인 것이 바람직하고, 25℃ 내지 45℃인 것이 더 바람직하다.
이때, 상기 혼합물이 산소가 차단된 혐기 조건에서 발효할 경우에는 효모에 의한 당 분해시 알코올이 생성되어 미생물의 효소 활성을 저해할 수 있으므로, 산소가 공급되는 호기 조건에서 발효를 진행하는 것이 바람직하다. 예를 들면 부직포로 발효용기의 입구를 산소만 겨우 통과할 정도로 막아 혐기 조건이 되지 않도록 한다.
상기 1차 발효하는 동안에는 일정한 간격으로 1차 발효물의 pH를 측정하여 오염 유무를 확인하고, 액상의 상층에 쌓이는 기포들을 제거한다. BCA assay, Bradford assay 등의 단백질 정량법을 이용하여 생성된 효소량을 추정한다.
상기 1차 발효물의 pH는 3 내지 6인 것이 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우, 효모에 의한 혐기 발효가 일어나거나 접종한 미생물이 아닌 외부 미생물에 의해 오염된 것으로 볼 수 있다. 상기 1차 발효물의 단백질량이 400 내지 1000 ug/ml일 경우에는 효소가 충분히 생성된 것으로, 1차 발효를 종료한다. 이때, 1차 발효 기간은 특별히 한정되지 않으나, 4일 내지 10일 동안 발효할 수 있다.
(b) 숙성 단계
(b) 단계는 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0℃ 내지 10℃에서 숙성하는 단계이다.
숙성을 위하여 상기 (a) 단계에서 제조된 1차 발효물로부터 고형분을 제거한다. 고형분이 제거된 1차 발효액을 숙성한다. 이러한 1차 발효액은 저온 보관하여 숙성함으로써, 미생물에 의한 발효를 정지하면서 1차 발효액에 함유된 성분들이 상호작용할 수 있도록 하여 최종 삼투압 효소 발효물로 제조된다. 상기 숙성 온도는 0℃ 내지 10℃인 것이 바람직하다.
(c) 초음파 처리 단계
이 단계는 1종 이상의 천연 유화제를 천연 용매 일부와 혼합한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 50℃~80℃에서 초음파 파쇄하여 상기 혼합물을 균질화하는 단계이다.
(d) 포집물질 첨가 및 혼합 단계
이 단계는 천연 유화제가 균질화되면 포집물질을 첨가한 후 초음파 파쇄하여 혼합하는 단계이다.
호모게나이저 등을 사용하던 종래기술과 달리, 천연 유화제 균질화 단계와 포집물질 첨가 단계에 초음파 파쇄 처리를 함으로써 유화제와 포집물질의 균질화도를 높이고 입자 크기를 조절할 수 있다.
(e) 기타
유화제와 포집물질이 완전히 균질화되면 40℃~60℃로 가온된 나머지 증류수와 천연추출물(방부제)을 넣고 초음파 파쇄를 통하여 혼합하여 리포좀 형태의 입자를 형성한다. 이후 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분간 초음파 파쇄를 하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 최종적으로 천연 리포좀을 제조한다.
한편, 본 발명의 다른 일 예에 따르면 상기 (a) 단계 이후, (b) 단계 이전에 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20℃ 내지 50℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우 (c) 숙성단계는 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 진행된다.
한편, 본 발명의 또 다른 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법은 (a) (i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20℃ 내지 50℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100℃ 내지 140℃에서 멸균하는 단계; (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (i)당 및 (ii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20℃ 내지 50℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0℃ 내지 10℃에서 숙성하여 버섯함유 삼투압 효소 발효물을 제조하는 단계; (d) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 초음파 처리하는 단계; (e) 상기 (d)단계의 생성물에 포집물질로서 (b) 단계에서 생성된 버섯 함유 삼투압 효소 발효물을 첨가하고 초음파 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 공정 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(버섯), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20℃ 내지 50℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다. (a) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 (a) 단계와 동일한 것으로, 기질의 유효성분 및 미생물의 효소를 함유하는 1차 발효물을 제조한다.
(b-1) 멸균 단계
(b-1) 단계는 1차 발효물에 고형분을 제거한 후 100℃ 내지 140℃에서 멸균하는 단계이다. 상기 (a) 단계에서 제조된 1차 발효물은 미세망(mesh)을 이용하여 고형분을 제거한 후 남은 1차 발효액을 멸균한다. 상기 멸균하는 조건은 특별히 한정되지 않으나, 온도가 100℃ 내지 140℃이고, 시간이 5 내지 30분일 수 있다. 이로 인해, 1차 발효물 20~50%를 기질로 미생물을 재접종하여 2차 발효를 진행할 수 있다. 이때 함유되는 죽은 미생물은 재 발효시에 단백질원이 공급될 수 있다.
(b-2) 2차 발효물 제조 단계
(b-2) 단계는 멸균된 1차 발효물에 당 및 미생물(효모, 유산균)을 첨가한 후 20℃ 내지 50℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계이다. 상기 (b-1) 단계에서 멸균된 1차 발효물은 2차 발효하기 위해 당 및 미생물을 첨가한다.
상기 당 및 미생물로는 상기 (a) 단계에서 사용된 당 및 미생물과 동일하다.
상기 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 1차 발효물에 함유된 유효성분과 미생물에서 생성되는 효소의 반응을 향상시킬 수 있다. 상기 1차 발효물과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 것이 바람직하고, 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.8~1.2 인 것이 더 바람직하다. 상기 미생물의 사용량은 상기 1차 발효물과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량% 인 것이 바람직하고, 3 내지 5 중량% 인 것이 더 바람직하다.
이러한 멸균된 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 상기 (a) 단계의 1차 발효와 동일한 온도 및 호기 조건으로 2차 발효함으로써, 첨가된 미생물이 1차 발효물에 함유된 유효성분뿐만 아니라 죽은 미생물을 단백질원으로 이용하여 효소 반응에 의해 2차 발효물로 제조된다.
(c) 숙성 단계
(c) 단계는 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0℃ 내지 10℃에서 숙성하는 단계이다. (c) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법의 숙성 단계와 동일한 것으로, 최종 삼투압 효소 발효물을 제조한다.
(d), (e) 단계 및 기타 단계는 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 제조방법의 (c), (d) 단계와 동일하다.
이들 천연 리포좀을 이루는 각 성분인 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제로는, 이미 기술된, 로즈힙 함유 천연 리포좀에 사용되는 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제가 사용될 수 있다. 구체적인 성분은 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.
이와 같이, 본 발명에 따라 제조된 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 버섯의 유효성분을 손실 없이 빠르고 균일하게 추출할 수 있으며, 제조된 천연 리포좀은 버섯에 의한 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제, 천연 방부제, 천연 유래 포집물질을 포함하여 합성 성분을 포함하고 있지 않다는 점에서 종래의 합성 리포좀과 구별된다.
<삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 조성물>
본 발명의 일 예는 유효성분으로서 상기 로즈힙 함유 천연 리포좀을 포함하거나, 또는 유효성분으로서 상기 로즈힙 함유 천연 리포좀과 상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 식품 조성물 또는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예에 의한 로즈힙 함유 천연 리포좀은 세포막과 결합하여 로즈힙의 세포 흡수율을 높임으로써, 로즈힙의 기능 성분이 인체 내에서 효과적으로 작용할 수 있도록 한다. 상기 로즈힙 함유 천연 리포좀을 섭취할 경우에는 장에서 흡수된 로즈힙에 의한 효과가 나타날 수 있으므로, 로즈힙 함유 천연 리포좀을 유효성분으로 함유하는 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있다.
상기 식품 또는 약학 조성물은 상기 로즈힙 함유 천연 리포좀과 함께 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 유효성분으로 함유할 수 있다. 상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 리포좀 구성 물질로 1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하고, 포집 물질로 버섯 함유 삼투압 발효물을 포함한다. 상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 입자 크기를 줄이기 위해 초음파 처리하여 사용되며, 이러한 버섯 함유 삼투압 발효물과 천연 유화제, 천연 유래 용매를 함께 초음파 처리하여 균일하게 혼합된 천연 리포좀이 형성된다. 버섯은 항암, 면역증대 효과 등이 있는 것으로 알려져 있어, 상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 섭취할 경우에는 버섯에 의한 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 로즈힙 함유 천연 리포좀과 버섯 함유 삼투압 발효물 천연 리포좀을 함유하는 조성물에서는 로즈힙에 의한 효과뿐만 아니라 버섯에 의한 효과도 나타날 수 있으며, 이들 효과의 상승작용(synergy effect)을 기대할 수 있다.
이러한 조성물의 효과를 더 증강시키기 위해서는 건강기능식품 인증원료인 글루코사민(글루코사민 염산염, N-아세틸글루코사민)을 비롯한 버섯발효추출물, 파프리카발효추출물, 도토리 추출물, 칡 추출물, 백태 추출물, 대두 추출물 및 밀크칼슘분말로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 추출물을 추가로 함유할 수 있다.
천연 리포좀은 생물에서 유래하여 인체에 안전한 물질로서, 체내 투과율이 우수하여 흡수율이 높다. 그러므로, 본 발명에 의한 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 식품, 또는 약학 조성물로 이용될 수 있으며, 화장료 조성물로도 이용될 수 있다. 이때, 상기 조성물들은 면역 및 재생 기능을 증대시켜 항염증, 관절개선, 항알러지, 피부 재생, 항산화 등에 효과적일 수 있으며, 특히, 염증 개선, 골관절염을 포함한 관절 건강 개선에 효과적이다.
상기 로즈힙 함유 천연 리포좀은 동결건조분말 또는 분무건조분말일 수 있고, 상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 동결건조분말 또는 분무건조분말일 수 있다.
또한 상기 식품 조성물 또는 약학 조성물은 버섯 추출물 또는 로즈힙 분말 또는 이들 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우 상기 식품 또는 약학 조성물 전체 중량을 기준으로, 상기 로즈힙 함유 천연 리포좀 O.1 내지 99.8 중량%, 상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀 O.1 내지 99.8 중량%, 상기 버섯 추출물 및/또는 로즈힙 분말 0.1 내지 99.8 중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 본 발명의 식품 조성물은 여러가지 식품류에 사용될 수 있으며, 일반 식품에 첨가물로 사용되거나 건강보조식품으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 음료, 껌, 차, 기능성 음료 등으로 사용될 수 있으며, 비타민 복합제, 기능성 음료, 건강 기능 식품 등의 형태로 사용될 수 있다. 바람직하게는 혈행 개선용, 골 관절염 개선용, 관절 건강 개선용 건강보조식품일 수 있다. 상기 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 천연 식품 및 이의 발효물로 구성된 것이므로, 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다. 이러한 식품 조성물은 당업계에 공지된 식품 첨가제를 포함할 수 있으며, 일례로는 당류, 아미노산류, 비타민류, 광물질(무기염류), 감미제, 풍미제, 향미제, 착색제, 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는, 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능한 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직하게는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 과립제, 에멀전, 시럽, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제로 사용될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있으며, 일례로 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제, 증량제 등을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 구체적으로 설명하나, 하기 실시예는 본 발명의 한 형태를 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1-1] 로즈힙 천연 리포좀의 제조
하기 표 1의 조성에 따라 리포좀을 제조하였다.
구분 순서 원 료 명(Lot No.) 기준량(%)
A
 1 증류수 30.00
2 Lipoid P75
또는 DS-Soya PC60		 2.00
B 3 인디언구스베리분말 0.50
4 말토덱스트린 1.00
C 5 로즈힙분말 1.00
D 6 자몽종자추출물 0.015
7 D.I. Water 65.485
합계 100.00
상기 표 1에 기재된 바와 같이, 천연 유화제로서 Lipoid P75(유화제 전체 100중량%를 기준으로, 포스파티딜콜린 67중량%, 리소포스파티딜콜린 8중량%, 포스파티딜에탄올아민 8 중량%, 팔미트산 3 중량%, 스테아르산 1 중량%, 올레산 3 중량%, 리놀레산 7 중량%, 리놀렌산 3 중량% 포함) 또는 DS-Soya PC60(포스파티딜콜린 60.5%, 리소포스파티딜콜린 1.9%를 함유하는 100% 대두레시틴)을 65℃까지 가온한 다음, 여기에 증류수를 넣고 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid Processor, QSONICA, USA)를 이용하여 65℃에서 초음파 파쇄 하였다.
그런 다음, 초음파 파쇄로 완전히 용해되어 천연 유화제가 균질화되면 여기에 인디언구스베리분말과 말토덱스트린을 첨가한 후 초음파 처리를 통해 혼합하였다.
천연 유화제와 포집물질이 완전히 균질화되면 여기에 로즈힙분말을 혼합한 후 65℃로 가온하고 초음파 처리하여 혼합, 균질화하였다.
이후 증류수와 자몽 종자 추출물을 넣고 65℃에서 초음파 파쇄하여 혼합, 리포좀 형태의 예비 입자를 형성하였다.
온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분 동안 초음파 파쇄하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 최종적으로 로즈힙 분말이 함유된 천연 리포좀(로즈힙 CPS)을 제조하였다.
[ 비교예 1-1] 로즈힙 천연 리포좀의 제조
인디언 구스베리 분말을 포함하지 않았다는 점을 제외하고는 실시예 1-1과 동일하게 로즈힙 천연 리포좀을 제조하였다.
[ 비교예 1-2 ~ 1-7] 로즈힙 천연 리포좀의 제조
인디언 구스베리 분말 대신에 각각 과라나 추출물(비교예 1-2), 식용 건조 효모(비교예 1-3), 건조 효모 분말(비교예 1-4), 해조 분말(비교예 1-5), 강황(비교예 1-6), 아세로라 추출 분말(비교예 1-7)을 사용하였다는 점을 제외하고는 실시예 1-1과 동일하게 로즈힙 천연 리포좀을 제조하였다.
[ 실시예 1-2 ~ 1-4] 로즈힙 천연 리포좀 분말의 제조
실시예 1-1의 로즈힙 분말을 수율 5%로 동결건조하였다는 점(실시예 1-2 : 동결건조), 실시예 1-1의 로즈힙 분말을 원액 900g, 말토덱스트린 100g을 포함하도록 분무건조하였다는 점(실시예 1-3 : 분무건조1), 실시예 1-1의 로즈힙 분말을 원액 900g, 말토덱스티린 230g을 포함하도록 분무건조하였다는 점(실시예 1-4 : 분무건조2)을 제외하고는 실시예 1-1과 동일하게 로즈힙 분말이 함유된 천연 리포좀을 제조하였다.
본 명세서에서는 편의상 생성된 리포좀에 대하여 실시예 1-2은 동결건조된 로즈힙 천연 리포좀, 실시예 1-3은 분무건조1의 로즈힙 천연 리포좀, 실시예 1-4는 분무건조2의 로즈힙 천연 리포좀이라 한다.
[ 실시예 2-1]
<표고버섯 삼투압 효소 발효물의 제조>
기질로서 표고버섯을 흐르는 물로 세척한 후 물기를 완전히 제거한 다음 가로, 세로, 높이 모두 1~2 cm로 일정하게 절단하여 준비하였다. 준비된 기질과 당을 1:1의 중량비로 혼합하였다. 효모, 유산균은 기질과 당의 혼합물 전체 중량을 기준으로 각각 5 중량%의 양으로 상기 혼합물에 접종하였다. 아래 표 2에 사용된 원료 및 함량이 기재되어 있다.
혼합물 함량
기질 표고버섯 50중량%
당 천연당(원당) 50중량%
효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1 (KCTC 11386BP) Seed 배양액 기질과 당의 혼합물 기준
5중량%
유산균 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) MieV L1106 (KCTC 12082BP) Seed 배양액 기질과 당의 혼합물 기준
5중량%
상기 혼합물을 발효용기에 담고, 산소만 겨우 통과하도록 부직포로 발효용기의 입구를 차단한 다음 30℃ 인큐베이터에서 1차 발효하였다. 1차 발효를 시작한 시점을 0일째 샘플로 간주하고, 24시간 간격으로 1차 발효물을 채취하여 pH를 측정하고, 단백질 정량법(BCA assay)으로 효소량을 측정하였다. 1차 발효하는 동안 1차 발효물의 표면에 생성되는 기포를 제거하였다. 약 7일째, 1차 발효물의 효소량이 800 ug/ml인 것을 확인한 후 미세망(300 mesh)을 이용하여 1차 발효물의 고형분을 제거하였다.
고형분이 제거된 1차 발효액을 소독한 새로운 용기에 담고, 4℃에서 숙성함으로써, 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 제조하였다.
<표고버섯 삼투압 효소 발효물을 포함하는 천연 리포좀의 제조>
천연 유화제 Lipoid P75 또는 DS-Soya PC60을 이용하여 65℃까지 가온한 다음, 여기에 증류수를 넣고 초음파 파쇄기로 초음파 파쇄하여 균질화하였다.
그런 다음, 초음파 파쇄로 완전히 용해되어 유화제가 균질화되면 여기에 포집물질로서 이미 제조된 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 첨가한 후 초음파 처리를 통해 혼합하였다.
천연 유화제와 포집물질이 완전히 균질화되면 여기에 65℃로 가온된 말토덱스트린을 첨가하고 초음파 처리하여 혼합, 균질화하였다.
이후 증류수와 자몽 종자 추출물(천연 방부제)을 넣고 65℃에서 초음파 파쇄하여 혼합, 리포좀 형태의 예비 입자를 형성하였다.
온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분동안 초음파 파쇄하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 표고버섯 삼투압 효소 발효물이 함유된 천연 리포좀을 제조하였다. 원료 및 함량은 아래 표 3에 기재된 바와 같다.
원료 함량(중량%)
증류수 30.00
천연 유화제 2.50
표고버섯 삼투압 효소 발효물 5.00
말토 덱스트린 1.00
증류수 61.485
자몽종자추출물 0.015
합계 100.00
[ 실시예 2-2 ~ 2-4] 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 포함하는 천연 리포좀 분말의 제조
실시예 2-1의 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 수율 4%로 동결건조하였다는 점(실시예 2-2), 원액 1kg, 말토덱스트린 145g을 포함하도록 분무건조하였다는 점(실시예 2-3), 원액 900g, 말토덱스티린 230g을 포함하도록 분무건조하였다는 점(실시예 2-4)을 제외하고는 실시예 2-1과 동일하게 표고버섯 삼투압 효소 발효물이 함유된 천연 리포좀을 제조하였다.
[ 실시예 3] 로즈힙 천연 리포좀과 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 포함하는 복합체의 제조
아래 표 4와 같은 원료를 아래 배합비로 배합하여 로즈힙 천연 리포좀과 표고버섯 삼투압 효소 발효물을 포함하는 복합체를 제조하였다.
원료 배합비(중량%)
로즈힙 분말(주 기능성 원료) 70
표고버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀 분말 (실시예 2-3) 3
로즈힙 천연 리포좀 분말(실시예 1-3) 3
밀크칼슘파우더 10
석류추출분말 5
깔라만시추출분말 5
대두분말 3.8
효소처리스테비아 0.2
합계 100
[ 실험예 1] Franz Diffusion cell을 이용한 피부 흡수력
각각의 샘플이 피부 투과 증진에 어떠한 효과를 주는지 확인하기 위해 생체외 투과실험(Franz Diffusion cell)을 이용하여 피부 투과 실험을 진행하였다.
실험에는 돼지의 피부를 이용하였고, 같은 양의 샘플에 대하여 흡수력을 비교하였다. donor와 receptor phase 사이에 멤브레인을 고정하고, 준비된 Franz diffusion cell의 donor에 샘플 1 ml를 투여한 다음, 항온수조를 이용해 온도를 약 37℃로 유지하였다. 샘플링 포트를 통하여 파스퇴로 피펫으로 매 30분 마다 매 회 0.25 ~ 0.5 ml의 receptor phase을 회수한 후 채취하여 튜브에 보관하여 측정하였다.
실시예 1-1, 비교예 1-1 ~ 1-7의 로즈힙 함유 천연 리포좀의 피부 흡수력 측정 결과를 도 1에 나타내었다.
도 2a에는 실시예 1-1의 로즈힙 함유 천연 리포좀, 탈이온수, 로즈힙 용액의 리포좀의 피부 흡수력을 비교한 결과가, 도 2b에는 실시예 2-1의 표고버섯 삼투압 발효물 천연 리포좀과 표고버섯 삼투압 발효물의 피부흡수력을 비교한 결과가 나타나 있다.
[ 실험예 2] 전자주사현미경에 의한 리포좀의 형태 분석
전자주사현미경(Scanning Electron microscope S-1700, Hitachi)을 이용하여 각 샘플의 입자형태와 크기를 분석하였다.
측정은 제조된 시료를 섭씨 -60℃에서 동결 건조한 다음 얇게 펴서 PdPt 혼합촉매로 1회 코팅한 후 이루어졌다. 그 결과를 도 3a, 3b에 나타내었다. 구체적으로 도 3a에는 로즈힙 분말, 실시예 1-1의 로즈힙 천연 리포좀, 실시예 1-2의 로즈힙 동결 건조 천연 리포좀, 실시예 1-3의 로즈힙 분무 건조 1의 천연 리포좀, 실시예 1-4의 로즈힙 분무 건조 2의 천연 리포좀의 SEM 사진이, 도 3b에는 실시예 2-1의 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 실시예 2-2의 동결 건조된 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 실시예 2-3의 분무 건조 1의 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 실시예 2-4의 분무 건조 2의 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 SEM 사진이 제시되어 있다.
[ 실험예 3] 레이저 입도분석기에 의한 리포좀의 크기 분석
레이저 입도분석기(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer ELS-8000, Otsuka)를 이용하여 각 샘플의 입자 크기를 측정하고 입도 분포를 분석하였다. 그 결과를 도 4a, 4b에 나타내었다.
구체적으로, 도 4a에는 로즈힙 분말, 실시예 1-1의 로즈힙 천연 리포좀, 실시예 1-2의 로즈힙 동결 건조 천연 리포좀, 실시예 1-3의 로즈힙 분무 건조 1의 천연 리포좀, 실시예 1-4의 로즈힙 분무 건조 2의 천연 리포좀의 평균 입자 크기 및 입도 분포가 나타나 있고, 도 4b에는 실시예 2-1의 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 실시예 2-2의 동결 건조된 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 실시예 2-3의 분무 건조 1의 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 실시예 2-4의 분무 건조 2의 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 평균 입자크기, 입자 분포가 나타나 있다.
[ 실험예 4] NO 생성 억제 효과
마이크로플레이트(96 well)에 RAW 264.7 세포를 1 X 104 cell/well로 24시간 동안 배양하였다. 배양은, 1% 페니실린-스트렙토마이신과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 고농도 글루코오스 배지(high glucose DMEM; Lonza, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 진행되었다.
상기 세포 배양액에 각 샘플을 0.10%, 0.25%, 0.5%, 1%로 농도를 달리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양한 후 1μg/mL의 LPS를 처리하여 18시간 더 배양하였다.
세포 배양액 50 ul에 1% 술파닐아미드(sulfanilamide), 5% 인산과 0.1% 나프틸에틸에틸렌 디아민(naphthylethylethylene diamine)이 포함된 그리스 시약(Griess reagent)(Sigma chemical Co., USA) 50 ul를 첨가하였다. 10분 간 반응시킨 후 흡광도 측정기(TECAN/infinite M200, Switzerland)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
샘플로는 글루코사민, 로즈힙 분말, 실시예 1-2의 로즈힙 동결 건조 천연 리포좀, 실시예 1-3의 로즈힙 분무 건조 1의 천연 리포좀, 실시예 1-4의 로즈힙 분무 건조 2의 천연 리포좀과, 실시예 2-2의 동결 건조된 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 실시예 2-3의 분무 건조 1의 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀, 실시예 2-4의 분무 건조 2의 표고 버섯 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 사용하였다.
각각의 샘플에 처리한 경우의 흡광도 값을 LPS만을 처리한 경우의 흡광도 값과 비교하여 NO 생성 정도를 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 5a, 5b에 나타내었다.
또한 각 샘플의 농도를 1%로 하여 처리한 경우를 정상군, 대조군 등과 비교한 결과를 도 6a, 6b에 나타내었다.
[ 실험예 5~9] In- Vivo 실험
아래 표 5에 나타난 바와 같이 레트(rat)에 대하여 각각의 샘플을 식이하여 실험을 진행하였다.
샘플 종류 비고 단위(/kg Body weight/day)
정상군/대조군 증류수 10mL
인도메타신 의약품 2mg
글루코사민 건강기능식품
기능성 원료		 200mg
5% 표고버섯 삼투압 효소 발효물 천연리포좀 함유 건조분말 실시예 1 - 3 259mg
로즈힙 분말 기능성 분말 원료 521mg
로즈힙 천연리포좀 분무 건조 분말 실시예 2 - 3 5.21g
5% 표고버섯 삼투압 효소 발효물 천연리포좀 함유 건조분말과 로즈힙 천연 리포좀 분무 건조 분말 함유 조성물 실시예 3 781.25mg
[ 실험예 5] 골관절염 개선 효과 임상 실험
7주령이 된 SD rat에 대하여 1주일간의 적응기간을 거치도록 한다. 50 uL(60mg/mL)의 MIA(monosodium iodoacetate)를 실험용 쥐(rat)의 오른쪽 무릎 관절강 내에 투여하고, 이후 4주 동안 경구투여하였다.
시험기간이 종료된 시점에서, micro-CT를 이용하여 무릎 관절부위를 촬영하고 판독하였다.
각각의 마이크로-CT 사진(2D)을 도 7a, 도 7b에 나타내었다. 구체적으로 도 7a는 무릎 관절 부위의 측면 촬영 사진이고, 도 7b는 정면 촬영 사진이다.
육안 관찰과 X-레이 촬영, micro-CT (2D) 촬영을 통하여 관찰한 결과, 정상군에 비하여 관절염 유발군(Control)에서　연골 파괴가 관찰되어　골관절염이 유도되었음을　확인할 수 있었다. 실시예 1-3의 로즈힙 천연 리포좀, 실시예 2-3의 표고 버섯 삼투압 발효 추출물 천연 리포좀, 실시예 3의 조성물)의 경우 정상군과 유사하게 증상이 호전되었음을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 6] 연골조직의 형태학적 관찰
실험을 위해 희생된 쥐로부터 무릎관절(femur 혹은 tibia)을 적출하였다. 10% (또는 4%) 포르말린 용액에 조직을 담가 조직을 고정하고, 고정한 조직을 5% 포름산에 담가 6일간 탈칼슘화처리 (decalcification)하였다. 조직을 카세트에 옮기고, 증류수가 담긴 비커에 담가 세척하였다.
조직이 담긴 카세트를 농도별 에탄올 용액(70% → 80% → 90% → 95% → 100% → 100%)에 순차적으로 담가 탈수시키고 조직에 남아있는 에탄올을 제거하기 위해 자일렌 용액에 담그었다(3회 반복). 녹인 파라핀 용액에 조직이 담긴 카세트를 담근 다음 카세트로부터 분리한 조직을 포매용 틀에 올려놓았다.
warm bath의 파리핀을 포매용 틀에 적당량 부은 후, cold plate로 옮겨 파리핀을 굳히고, 파리핀이 완전히 굳으면, 포매용 틀을 제거하였다. Microtome 홀더에 파라핀으로 포매된 블록을 끼운 다음, 조직을 3~5 ?m의 두께로 절단하였다. 파라핀 절편을　슬라이드 글라스를 이용해 부유온수조로　옮기고 부유온수조(43)에 띄워 파라핀 절편의 주름을 펴고, 이를 새 슬라이드 글라스에 붙였다.
실온에서 잘 건조시킨 후 슬라이드 글라스를 60 오븐에 넣어 약 하루 정도 탈파라핀을 행하였다. 60 오븐에서 꺼낸 슬라이드를 실온으로 식히고, 슬라이드를 다음의 과정으로 탈파라핀 및 수화하였다.
- 자일렌 → 자일렌 → 100% 알콜 → 95% 알콜 → 80% 알콜 → 70% 알콜 → 증류수
탈파라핀화 시킨 슬라이드를 Safranin O fast green 염색시약으로 염색을 시작하였다.
염색된 조직을 농도별 에탄올 용액(70% → 80% → 90% → 95% → 100% → 100%)에 순차적으로 담가 탈수시키고 자일렌에 침지시켰다. (2회반복)
슬라이드 위에 mounting solution을 떨어뜨려 커버 글라스를 덮어 고정시킨 다음, 슬라이드를 약 2일간 충분히 건조시킨 후 현미경으로 확인하였다.
그 결과를 도 8a, 8b에 도시하였다.
[ 실험예 7] 무릎관절 조직의 연골 함량 및 파괴정도 확인
희생된 쥐를 해부한 후 얻은 무릎관절 부위를 Micro CT를 활용하여 연골량 및 골밀도를 측정하였으며, 이를 통해 연골의 파괴정도를 분석하였다. 연골함량 및 골밀도 측정 결과를 각각 도 9, 도 10에 도시하였다.
[ 실험예 8] 혈중 GAG 함량
GAG 함량은 Sulfated Glycosaminoglycan Assay kit를 이용하여 DMMB (1,9-dimethylmethylene blue) assay로 측정하였다.
간단히 설명하면, 혈청 100μL와 1,9-dimethylmethylene blue 1mL을 첨가하여 30분간 반응시킨 후, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이후 반응하지 않은 dye가 포함된 상등액을 제거하고 GAG-dye complex를 얻은 다음, dissociation 용액 0.5 mL를 첨가하여 용해시킨 후, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 시료를 획득하였다. 각 시료의 상등액 200 μL를 96 웰 플레이트에 넣고 ELISA reader를 이용하여 656nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 GAG 함량은 표준물질로 사용된 bovine chondroitin sulfate의 표준검량선으로부터 계산하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다.

Claims (26)

1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 포집 물질로서 로즈힙 분말과 인디언 구스베리 분말을 포함하며, 상기 천연 유화제, 상기 천연 유래 용매, 상기 로즈힙 분말을 초음파 처리하여 혼합함으로써 형성되는 로즈힙 함유 천연 리포좀과,
(i)기질로서 버섯, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20℃ 내지 50℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 생성되는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물
을 포집물질로서 포함하는 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀을 포함하는 복합체.
제1항에 있어서,
상기 로즈힙 함유 천연 리포좀은, 상기 로즈힙 함유 천연 리포좀 전체 중량을 기준으로, 상기 천연 유화제 0.1 내지 10 중량%, 상기 천연 코팅제 0.001 내지 3 중량%, 상기 천연 방부제 0.001 내지 3 중량%, 상기 포집 물질 0.1 내지 30 중량% 및 상기 천연 유래 용매 잔량을 포함하는 복합체.
제1항에 있어서,
관절 건강 개선용 복합체.
(a) 1종 이상의 천연 유화제를 천연 유래 용매와 혼합하고 35℃ 내지 80℃에서 초음파 처리하는 제1단계;
(b) 상기 제1단계의 혼합물에 인디언 구스베리 분말과 천연 코팅제를 첨가하고 35℃ 내지 80℃ 에서 초음파 처리하여 혼합하는 제2단계;
(c) 상기 제2단계의 혼합물에 로즈힙 분말을 첨가하고 35℃ 내지 80℃ 에서 초음파 처리하는 제3단계; 및
(d) 상기 제3단계의 혼합물에 천연 유래 용매와 천연 방부제를 첨가하고 35℃ 내지 80℃ 에서 초음파 처리하는 제4단계
를 포함하는 제1항 및 제3항 중 어느 한 항의 복합체의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 제4단계 이후에 온도를 서서히 낮추면서 반복적으로 초음파 처리하는 제5단계를 추가로 포함하는 복합체의 제조방법.
유효성분으로서,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 식품 조성물.
제6항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질을 포함하는 것인 식품 조성물.
제6항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 상기 천연 유화제, 상기 천연 유래 용매, 상기 천연 코팅제 및 상기 천연 방부제를 초음파 처리하여 혼합함으로써 형성되는 것인 식품 조성물.
제6항에 있어서,
상기 로즈힙 함유 천연 리포좀은 동결건조분말 또는 분무건조분말인 식품조성물.
제6항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 동결건조분말 또는 분무건조분말인 식품조성물.
제6항에 있어서,
버섯 추출물 및 로즈힙 분말로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 식품 조성물.
제11항에 있어서,
상기 식품 조성물 전체 중량을 기준으로, 상기 로즈힙 함유 천연 리포좀과 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀의 합을 0.1 내지 99.8 중량% 포함하는 식품 조성물.
제6항에 있어서,
관절건강 개선용 식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀에 포함되는 천연 유화제와 로즈힙 함유 천연 리포좀에 포함되는 천연 유화제는 서로 동일하거나 상이하며,
상기 천연 유화제는 레시틴, 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 하이드로지네이티드포스파티딜콜린, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및 이들의 수소첨가 생성물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 인지질을 포함하는 것인 식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀에 포함되는 천연 유화제와 로즈힙 함유 천연 리포좀에 포함되는 천연 유화제는 서로 동일하거나 상이하며,
상기 천연 유화제는 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 지방산을 포함하는 것인 식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀에 포함되는 천연 유래 용매와 로즈힙 함유 천연 리포좀에 포함되는 천연 유래 용매는 서로 동일하거나 상이하며,
상기 천연 유래 용매는 증류수, 부틸렌 글리콜, 프로판디올, 글리세린 및 발효주정으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매인 것인 식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀에 포함되는 천연 코팅제와 로즈힙 함유 천연 리포좀에 포함되는 천연 코팅제는 서로 동일하거나 상이하며,
상기 천연 코팅제는 인디언 구스베리 추출물 및 덱스트린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인 식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀에 포함되는 천연 방부제와 로즈힙 함유 천연 리포좀에 포함되는 천연 방부제는 서로 동일하거나 상이하며,
상기 천연 방부제는 감귤 추출물, 유자 추출물, 유칼립투스 추출물, 고삼 추출물, 정향 추출물, 자몽 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 추출물인 것인 식품 조성물.
유효성분으로서,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제19항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 1종 이상의 천연 유화제, 천연 유래 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질을 포함하는 것인 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제19항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 상기 천연 유화제, 상기 천연 유래 용매, 상기 천연 코팅제 및 상기 천연 방부제를 초음파 처리하여 혼합함으로써 형성되는 것인 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제19항에 있어서,
상기 로즈힙 함유 천연 리포좀은 동결건조분말 또는 분무건조분말인 관절염 예방 또는 치료용 약학조성물.
제19항에 있어서,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀은 동결건조분말 또는 분무건조분말인 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물
제19항에 있어서,
버섯 추출물 및 로즈힙 분말로 이루어진 군에서 하나 이상을 더 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제24항에 있어서,
상기 약학 조성물 전체 중량을 기준으로,
상기 로즈힙 함유 천연 리포좀 O.1 내지 99.8 중량%,
상기 버섯 함유 삼투압 효소 발효물 천연 리포좀 O.1 내지 99.8 중량%,
상기 버섯 추출물 또는 로즈힙 분말 또는 이들의 혼합물 0.1 내지 99.8 중량%를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
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