KR101750616B1 - 홍삼 함유 천연 리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 식품, 약학 또는 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 천연 유화제, 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 포집 물질로서 홍삼 추출물을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 포집 물질로서 홍삼 추출물을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 포집 물질로서 홍삼 추출물을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 홍삼 함유 천연 리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 식품, 약학 또는 화장료 조성물에 관한 것이다.
인삼은 오가과 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서, 인삼에 함유된 사포닌이 약효를 나타낸다고 알려져 있다. 특히, 인삼을 가공한 홍삼에 함유된 사포닌은 약성이 매우 온화하고 과량 투여에 의한 독성이 없을 뿐만 아니라 피로회복에 도움을 주고 면역 기능 조절, 항산화 등 다양한 효능이 있다.
인삼에 함유된 사포닌은 일반적인 식물에서 발견되는 사포닌과 화학구조 및 약효가 상이하여 진세노사이드(ginsenoside)라고도 불린다. 이러한 인삼 사포닌은 분자량이 커서 섭취하여도 생체 소화 효소에 의해 거의 분해되지 않고, 장내 미생물에 의해 분해된 후 흡수된다고 알려져 있다. 그러나, 인삼 또는 인삼 사포닌을 섭취할 경우에는 섭취하는 사람마다 장내 미생물의 종류, 농도, 활성에 개인 차이가 있기 때문에 사포닌에 의한 약효를 균일하게 얻을 수 없다.
최근에는 인삼 사포닌의 체내 흡수를 높이기 위해, 리포좀과 같은 약물 운반체를 이용한 연구가 활발히 진행 중이다.
리포좀(liposome)은 지질 이중층으로 구성된 인공적으로 제조된 소포로서, 생체 세포막과 유사한 구조를 가진다. 상기 리포좀은 생체 세포막의 주요 성분인 인지질로 구성되어 생체 친화적이며, 수용액 상에서 친수성 및 소수성 물질을 리포좀의 지질 이중층으로 둘러싼 캡슐 형태로 존재한다. 이러한 리포좀은 이중층 구조 내에 원하는 유용 물질(약물, 영양물 등)을 저장할 수 있어, 불안정하고 취급이 어려운 물질을 세포내로 운반할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 리포좀은 이러한 장점에도 불구하고 제형이 불안정하고, 포집 효율이 매우 낮다는 등의 문제뿐만 아니라 리포좀 제조에 사용되는 용매, 방부제 등이 피부 자극을 유발한다는 문제가 있다. 또한, 리포좀의 원료로 사용되는 콜레스테롤은 리포좀의 지질막을 견고하게 형성하여 포집 물질의 방출을 저해할 뿐만 아니라 포집 물질의 세포막 투과율을 낮춘다는 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 홍삼 추출물(사포닌)을 함유하는 리포좀에 대해 많은 연구가 이루어지고 있다. 예를 들면, 한국공개특허 제2012-0023876호에는 홍삼 또는 인삼 유래 진세노사이드 Re와 Rh2 복합체를 함유하는 화장료 조성물 및 그 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 한국공개특허 제2003-0060017호에는 나노유화기술에 의해 진세노사이드 F1을 함유하는 미세유화 입자 및 이를 사용한 피부 외용제 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 상기 선행문헌들에는 합성 리포좀을 포함하는 화장료 조성물이 기재되어 있을 뿐, 천연 물질로 이루어진 리포좀은 개시되어 있지 않으며, 더욱이 이를 포함하는 식품 또는 약학 조성물은 전혀 개시되어 있지 않다.
상기한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 인체에 무해하면서 홍삼 추출물의 세포 흡수율을 높일 수 있는 홍삼 함유 천연 리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 식품, 약학 또는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 천연 유화제, 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 포집 물질로서 홍삼 추출물을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 천연 유화제를 용매와 혼합한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제1단계; (b) 상기 제1단계의 혼합물에 홍삼 추출물을 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제2단계; (c) 상기 제2단계의 혼합물에 천연 코팅제를 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제3단계; 및 (d) 상기 제3단계의 혼합물에 35 내지 80 ℃로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하는 제4단계를 포함하는 상기 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 홍삼 함유 천연 리포좀을 포함하는 식품 또는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 포집 물질로서 홍삼 추출물을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 천연 유화제를 용매와 혼합한 후 35 내지 80 에서 초음파 처리하는 제1단계; (b) 상기 제1단계의 혼합물에 홍삼 추출물을 첨가한 후 35 내지 80 에서 초음파 처리하는 제2단계; 및 (c) 상기 제2단계의 혼합물에 35 내지 80 로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하는 제3단계를 포함하는 상기 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 홍삼 함유 천연 리포좀을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 홍삼 함유 천연 리포좀은 피부나 장내 세포에 대한 홍삼 추출물의 흡수율을 증가시켜 홍삼 추출물에 의해 나타나는 약효 또한 향상시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 홍삼 함유 천연 리포좀을 포함하는 식품, 약학 또는 화장료 조성물은 홍삼의 유효 성분을 체내로 흡수시켜 우수한 항산화, 항염증, 지질 조성 개선 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법의 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 실험예 1에 따른 입자 크기를 확인한 그래프이고, 도 2b는 본 발명의 실험예 1에 따른 입자 크기 및 형태를 확인한 이미지이다.
도 3은 본 발명의 실험예 2에 따른 세포 투과성을 확인한 그래프이다.
도 4a, 도 4b 및 도 4d는 본 발명의 실험예 3에 따른 항산화 효과를 확인한 그래프이고, 도 4c는 본 발명의 실험예 3에 따른 항산화 효과를 확인한 이미지이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 실험예 4에 따른 항염증 효과를 확인한 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 실험예 5에 따른 간 조직의 지질 과산화를 확인한 그래프이고, 도 6c는 본 발명의 실험예 5에 따른 마우스의 체중 변화를 확인한 그래프이고, 도 6d는 본 발명의 실험예 5에 따른 간 조직의 지질 과산화를 확인한 그래프이다.
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 실험예 5에 따른 간 조직을 확인한 이미지이다.
도 8a는 본 발명의 실험예 6에 따른 간 조직을 확인한 이미지이고, 도 8b 내지 도 8d는 본 발명의 실험예 6에 따른 혈액 분석을 확인한 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 실험예 6에 따른 조직별 과산화를 확인한 그래프이고, 도 9c 및 9d는 본 발명의 실험예 6에 따른 조직별 글루타치온을 확인한 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 실험예 6에 따른 간 조직을 확인한 이미지이고, 도 10b는 본 발명의 실험예 6에 따른 분변 내 지질 함량을 확인한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실험예 7에 따른 혈중 진세노사이드를 확인한 이미지이다.
도 2a는 본 발명의 실험예 1에 따른 입자 크기를 확인한 그래프이고, 도 2b는 본 발명의 실험예 1에 따른 입자 크기 및 형태를 확인한 이미지이다.
도 3은 본 발명의 실험예 2에 따른 세포 투과성을 확인한 그래프이다.
도 4a, 도 4b 및 도 4d는 본 발명의 실험예 3에 따른 항산화 효과를 확인한 그래프이고, 도 4c는 본 발명의 실험예 3에 따른 항산화 효과를 확인한 이미지이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 실험예 4에 따른 항염증 효과를 확인한 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 실험예 5에 따른 간 조직의 지질 과산화를 확인한 그래프이고, 도 6c는 본 발명의 실험예 5에 따른 마우스의 체중 변화를 확인한 그래프이고, 도 6d는 본 발명의 실험예 5에 따른 간 조직의 지질 과산화를 확인한 그래프이다.
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 실험예 5에 따른 간 조직을 확인한 이미지이다.
도 8a는 본 발명의 실험예 6에 따른 간 조직을 확인한 이미지이고, 도 8b 내지 도 8d는 본 발명의 실험예 6에 따른 혈액 분석을 확인한 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 실험예 6에 따른 조직별 과산화를 확인한 그래프이고, 도 9c 및 9d는 본 발명의 실험예 6에 따른 조직별 글루타치온을 확인한 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 실험예 6에 따른 간 조직을 확인한 이미지이고, 도 10b는 본 발명의 실험예 6에 따른 분변 내 지질 함량을 확인한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실험예 7에 따른 혈중 진세노사이드를 확인한 이미지이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 홍삼 함유 천연 리포좀, 그의 제조방법 및 이를 포함하는 식품, 약학 또는 화장료 조성물을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
<홍삼 함유 천연 리포좀>
본 발명의 일 예에 따른 리포좀은 천연 유화제, 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 포집 물질로서 홍삼 추출물을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀을 제공한다.
1. 리포좀 구성 물질
본 발명의 리포좀은 천연 유화제, 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 포함한다. 이러한 천연 물질로 이루어진 리포좀은 인체에 독성이 없어, 섭취 가능하다. 또한, 상기 리포좀은 안정한 인지질 이중층을 형성함으로써, 포집 물질을 안정하게 장까지 운반하여 장내 세포 안으로 전달할 수 있다.
(1) 천연 유화제
천연 유화제는 천연 물질에서 유래된 인지질과 지방산을 포함한 것으로, 지질 이중층을 구성한다.
상기 인지질로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린(hydrogenated phophatidylcholine - 콩유래), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol) 및 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 바람직하게는 산화안정성이 우수한 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린이 사용될 수 있다.
상기 지방산으로는 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다.
상기 천연 유화제는 전체 천연 유화제의 중량을 기준으로 인지질 70 내지 90 중량% 및 지방산 1 내지 5 중량%일 수 있다.
이러한 천연 유화제는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 일례로는 2종의 천연 유화제 또는 3종의 천연 유화제를 혼합할 수 있다. 이때, 제1 천연 유화제로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)이 사용될 수 있고, 제2 천연 유화제로는 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린(hydrogenated phosphatidylcholine - 콩 유래)이 사용될 수 있고, 상기 제3 천연 유화제로는 세테아릴올리베이트(cetearylolivate) 및 소르비탄올리베이트(sorbitanolivate - 올리브유래)이 사용될 수 있다.
또한, 상기 천연 유화제는 천연 지방산을 더 포함할 수 있다. 상기 천연 지방산으로는 달맞이꽃 오일을 사용할 수 있다. 상기 천연 지방산은 전체 천연 유화제의 중량을 기준으로 0.1 내지 5 중량%일 수 있다.
이러한 천연 유화제의 함량은 전체 홍삼 함유 천연 리포좀의 중량을 기준으로 0.1 내지 10 중량%인 것이 바람직하다.
(2) 용매
용매는 상기 천연 유화제의 지질 이중층이 포집 물질을 둘러싼 캡슐 형태가 되도록 한다.
상기 용매로는 증류수, 천연 유래의 부틸렌글리콜, 프로판디올, 글리세린 및 발효 주정으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 바람직하게는 증류수, 글리세린이 사용될 수 있고, 더 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다.
이러한 용매의 함량은 전체 홍삼 함유 천연 리포좀의 중량을 기준으로 천연 유화제, 천연 코팅제, 천연 방부제 및 포집 물질을 제외한 잔량인 것이 바람직하다.
(3) 천연 코팅제
천연 코팅제는 포집 물질을 둘러싼 지질 이중층의 캡슐 형태를 유지하기 위해 리포좀의 표면을 코팅하는 물질이다. 천연 코팅제로 코팅된 홍삼 함유 천연 리포좀을 섭취할 경우에는 장내 효소에 의해 천연 코팅제가 분해되면서 지질 이중층이 세포막과 결합하여 포집 물질이 세포에 흡수된다.
상기 천연 코팅제로는 장내 효소에 의해 분해되는 다당류로서, 말토덱스트린, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 코팅제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 말토덱스트린이 사용될 수 있다.
이러한 천연 코팅제의 함량은 전체 홍삼 함유 천연 리포좀의 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%인 것이 바람직하다.
(4) 천연 방부제
천연 방부제는 리포좀 구성 물질(천연 유화제, 용매, 천연 코팅제)과 리포좀 내에 존재하는 포집 물질의 부패를 방지하여 최종 홍삼 함유 천연 리포좀의 안정을 유지한다.
상기 천연 방부제로는 식품에 첨가할 수 있는 천연 방부제로서, 감귤 추출물, 유자 추출물, 유칼립투스 추출물, 고삼 추출물, 정향 추출물 및 자몽 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 추출물이 사용될 수 있다. 상기 천연 방부제는 통상적으로 식품 보존료로 사용되는 데히드로초산, 소르빈산, 안식향산, 파라옥시안식향산에스테르류, 프로피온산 및 그 염류 등 화학 방부제와 구별되며, 독성이 없어 인체에 무해하다.
이러한 천연 방부제의 함량은 전체 홍삼 함유 천연 리포좀의 중량을 기준으로 0.001 내지 3 중량%인 것이 바람직하다.
2. 포집 물질
본 발명에 따른 포집 물질은 상기 천연 유화제, 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀의 지질 이중층 내부에 포집되는 물질이다. 상기 포집 물질로는 인삼, 홍삼, 백삼, 수삼 등에서 유래된 삼 추출물을 이용할 수 있다.
상기 삼 추출물은 항암, 항알레르기, 항염증 외에 중추억제 및 정신안정, 진통, 기억력 개선, 단백질 및 신장 사구체 비대억제, 항당뇨, 항산화 활성물질 생성 촉진, 면역조절, 혈소판 응집억제, 만성신부전증의 치료 효과 등 약효가 우수한 것으로 알려져 있다. 특히, 인삼을 가공한 홍삼은 일반 삼에 비해 약효 물질인 사포닌의 종류가 다양하며 사포닌의 양이 높게 함유되어 있다. 홍삼은 체내에서 지질 조성 개선, 면역 기능 조절, 항산화, 항염증 등 다양한 약효를 나타낸다. 따라서, 포집 물질은 홍삼 추출물인 것이 바람직하다. 이때, 상기 홍삼 추출물은 약효 물질이 파괴되는 것을 방지하면서 체내 흡수율을 높이기 위해, 초음파 처리하여 분자크기를 줄일 수 있다.
이러한 홍삼 추출물의 함량은 전체 홍삼 함유 천연 리포좀의 중량을 기준으로 0.1 내지 30 중량%인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 또 다른 일 예에 따른 리포좀은 천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및 포집 물질로서 홍삼 추출물을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀을 제공한다.
상기 천연 유화제, 용매 및 포집 물질로는 상기 본 발명의 일 예에 따른 리포좀의 천연 유화제, 용매 및 포집 물질과 동일할 수 있다.
상기 천연 방부제는 화장료에 첨가할 수 있는 천연 방부제로서, 초피나무열매 추출물, 할미꽃 추출물 및 어니어스 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 추출물이 사용될 수 있다. 상기 천연 방부제는 통상적으로 화장료 방부제로 사용되는 벤조산, 파라옥시벤조산 에스테르, 메틸클로로이소티아졸리논의 혼합물, 페녹시 에탄올 등 화학 방부제와 구별되며, 독성이 없어 인체에 무해하다.
이러한 홍삼 함유 천연 리포좀은 전체 중량을 기준으로 천연 유화제 0.1 내지 10 중량%, 천연 방부제 0.001 내지 3 중량%, 홍삼 추출물 0.1 내지 30 중량% 및 용매 잔량을 포함하는 것이 바람직하다.
이와 같이, 본 발명의 홍삼 함유 천연 리포좀은 약효가 있는 저분자의 홍삼 추출물을 지질 이중층이 둘러싼 캡슐 형태로서, 홍삼 추출물을 세포내로 용이하게 전달할 수 있다. 상기 홍삼 함유 천연 리포좀이 세포에 전달될 경우에는 리포좀의 지질 이중층과 세포막이 용이하게 결합하면서 홍삼 추출물의 세포 흡수율이 높아지므로, 홍삼에 의한 항산화, 항염증 및 지질 조성 개선 효과를 기대할 수 있다.
<홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법>
본 발명은 초음파 파쇄기, 유화장비 등을 이용한 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법을 제공한다. 그러나, 이러한 제조방법에 의해서만 한정되는 것은 아니며, 필요에 따라 각 공정의 단계가 변형되거나 또는 선택적으로 혼용되어 수행될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 바람직한 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법은 도 1에 도시된 바와 같이, (a) 천연 유화제를 용매와 혼합한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제1단계; (b) 상기 제1단계의 혼합물에 홍삼 추출물을 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제2단계; (c) 상기 제2단계의 혼합물에 천연 코팅제를 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제3단계; 및 (d) 상기 제3단계의 혼합물에 35 내지 80 ℃로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하는 제4단계를 포함할 수 있다. 상기 제4단계 이후, 온도를 서서히 낮추면서 반복적인 초음파 처리하는 제5단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 공정 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
제1단계: 1종 이상의 천연 유화제를 용매와 혼합한 후 35 내지
80 ℃에서
초음파 처리한다.
상기 천연 유화제로는 천연 물질에서 유래된 인지질과 지방산을 포함하는 1종 이상의 천연 유화제를 사용할 수 있다.
상기 용매로는 증류수, 천연 유래의 부틸렌글리콜, 프로판디올, 글리세린, 발효 주정 등을 사용할 수 있다.
상기 초음파 처리는 천연 유화제와 용매가 혼합된 혼합물을 균질화하기 위한 작업으로, 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid processor)를 이용할 수 있다.
이러한 천연 유화제와 증류수를 혼합한 다음, 이를 35 내지 80 ℃, 바람직하게는 40 내지 70 ℃로 가온한 후 초음파 처리함으로써, 증류수 내에 천연 유화제의 인지질과 지방산을 균질화한다.
제2단계: 상기 제1단계의 혼합물에 홍삼 추출물을 첨가한 후 35 내지
80 ℃에서
초음파 처리한다.
상기 홍삼 추출물은 약효 성분이 파괴되지 않는 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 이때, 홍삼 추출물을 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 추출 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 일례로는 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 열수 추출 등의 추출 방법을 사용하여 액상 또는 분말 형태의 추출물을 얻을 수 있다.
상기 홍삼 추출물은 추출 용매와 혼합된 상태일 수 있다. 상기 추출 용매로서 증류수를 사용할 경우, 홍삼 추출물과 증류수의 혼합비율은 중량비 기준으로 홍삼 추출물 : 추출 용매 = 0.1 ~ 5 : 1이고, 바람직하게는 1 : 1이다.
이러한 홍삼 추출물과 상기 제1단계의 혼합물을 혼합한 다음, 이를 35 내지 80 ℃, 바람직하게는 40 내지 60 ℃로 가온한 후 초음파 처리함으로써, 홍삼 추출물의 크기를 작게 줄이면서 이를 함유하는 리포좀을 형성한다.
제3단계: 상기 제2단계의 혼합물에 천연 코팅제를 첨가한 후 35 내지
80 ℃에서
초음파 처리한다.
상기 천연 코팅제는 상기 제2단계에서 형성된 홍삼 추출물을 함유하는 지질 이중층의 형태가 안정하도록 코팅하며, 최종 홍삼 함유 천연 리포좀의 홍삼 추출물이 장내 세포에서만 흡수되도록 한다.
이러한 천연 코팅제와 상기 제2단계의 혼합물을 혼합한 다음, 이를 35 내지 80 ℃, 바람직하게는 40 내지 60 ℃로 가온한 후 초음파 처리함으로써, 홍삼 추출물을 함유한 지질 이중층의 표면을 코팅한다.
제4단계: 상기 제3단계의 혼합물에 35 내지
80 ℃로
가온된
용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리한다.
상기 용매로는 상기 제1단계에서 사용된 용매와 동일한 것을 사용할 수 있다.
상기 천연 방부제는 리포좀 구성 물질(천연 유화제, 용매, 천연 코팅제)과 리포좀 내에 존재하는 포집 물질의 부패를 방지하여 홍삼 함유 천연 리포좀의 안정을 유지한다. 또한, 상기 천연 방부제는 천연 물질에서 유래되어 독성이 없고, 인체에 무해하며, 홍삼 함유 천연 리포좀을 손상시키지 않는다.
이러한 천연 방부제와 상기 제3단계의 혼합물을 혼합한 다음, 이를 35 내지 80 ℃, 바람직하게는 40 내지 60 ℃로 가온한 용매와 혼합한 후 초음파 처리함으로써, 홍삼 추출물을 함유하는 지질 이중층의 천연 리포좀 입자를 형성한다.
제5단계: 상기 제4단계 이후에 온도를 서서히 낮추면서 반복적인 초음파 처리한다.
상기 제조방법으로 제조된 홍삼 함유 천연 리포좀은 온도를 서서히 낮추면서, 바람직하게는 35 내지 70 ℃에서 최종적으로 1 내지 10 분, 바람직하게는 3 내지 8 분 동안 초음파 처리함으로써, 상기 제4단계에서 형성된 입자를 보다 작고 균일한 최종 홍삼 함유 천연 리포좀을 제조한다.
상기 초음파 처리는 원하는 입자 크기의 홍삼 함유 천연 리포좀을 제조하기 위해 반복적으로 실시할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3 회로 실시할 수 있다.
한편, 본 발명의 또 다른 일 예에 따른 바람직한 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법은 (a) 천연 유화제를 용매와 혼합한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제1단계; (b) 상기 제1단계의 혼합물에 홍삼 추출물을 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제2단계; 및 (c) 상기 제2단계의 혼합물에 35 내지 80 ℃로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하는 제3단계를 포함할 수 있다. 상기 제3단계 이후, 온도를 서서히 낮추면서 반복적인 초음파 처리하는 제4단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제조방법의 각 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법의 각 단계와 동일할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법은 저분자 홍삼 추출물을 함유하는 천연 리포좀을 형성하여 세포에 대한 홍삼 추출물의 흡수율을 높일 수 있다.
<홍삼 함유 천연
리포좀을
포함하는 식품, 약학 또는
화장료
조성물>
본 발명에 의한 홍삼 함유 천연 리포좀은 세포막과 결합하여 홍삼 추출물의 세포 흡수율을 높임으로써, 홍삼 추출물의 약효 성분이 인체 내에서 효과적으로 작용할 수 있도록 한다.
본 발명의 일 예에 따른 홍삼 함유 천연 리포좀을 섭취할 경우에는 장에서 흡수된 홍삼 추출물에 의해 약효 성분이 나타날 수 있어 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있다.
구체적으로, 상기 홍삼 함유 천연 리포좀을 포함하는 조성물은 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품류 등과 같은 식품 조성물로 이용될 수 있다.
또한, 상기 홍삼 함유 천연 리포좀을 포함하는 조성물은 세포실험 및 동물실험을 통해 항산화, 항염증, 지질 조성 개선 효과가 우수한 것으로 확인되어, 약학 조성물로 이용될 수 있다.
이러한 홍삼 함유 천연 리포좀을 포함하는 식품 또는 약학 조성물은 동맥경화를 예방하거나 진행중인 동맥경화 증상을 완화하는데 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 또 다른 일 예에 따른 홍삼 함유 천연 리포좀을 피부에 도포할 경우에는 피부에서 흡수된 홍삼 추출물에 의해 항산화, 항염증 효과가 나타날 수 있어 화장료 조성물로 이용될 수 있다.
구체적으로, 상기 홍삼 함유 천연 리포좀을 함유하는 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 파운데이션, 스프레이 등과 같은 화장료 조성물로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 구체적으로 설명하나, 하기 실시예는 본 발명의 한 형태를 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
1] 홍삼 함유 천연
리포좀
하기 표 1의 조성에 따라 홍삼 함유 천연 리포좀을 제조하였다.
먼저, 천연 유화제(Lipoid s75, Lipoid GMBH)를 증류수와 혼합하여 65℃로 가온한 후 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid Processor)를 이용하여 파쇄하였다. 홍삼 추출물과 증류수를 1:1 중량비로 혼합하여 포집 물질을 준비한 다음, 상기 천연 유화제가 균질화되면 준비된 포집 물질을 첨가하여 다시 초음파 파쇄하여 혼합하였다. 상기 천연 유화제와 포집 물질이 완전히 균질화되면 말토덱스트린을 첨가하고 다시 초음파 파쇄하여 균질화 작업을 수행하였다. 이후 50℃로 가온된 나머지 증류수와 자몽 추출물을 넣고 초음파 파쇄하여 리포좀 형태의 입자를 형성하였다. 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 2분 30초 동안, 3회 초음파 파쇄를 반복하여 균질화함으로써, 홍삼 함유 천연 리포좀을 제조하였다.
조성물 | 함량 (중량%) | |
천연 유화제 | Lipoid s75 | 2.5 |
용매 | 증류수 | 91.485 |
천연 코팅제 | 말토덱스트린 | 1.0 |
천연 방부제 | 자몽 추출물 | 0.015 |
포집 물질 | 홍삼 추출물 | 5.0 |
[비교예 1] 홍삼 추출물
홍삼 추출물은 실시예 1에서 사용된 홍삼 추출물을 이용하였다.
[비교예 2] 홍삼 함유 합성 리포좀
하기 표 2의 조성에 따라 홍삼 함유 합성 리포좀을 제조하였다.
먼저, 합성 유화제로서 레시틴, 콜레스테롤, 에탄올, 프로필렌글리콜을 증류수 일부와 혼합하였다. 상기 합성 유화제를 유화장비(homomixer)를 이용하여 1300rpm, 50℃에서 10분 동안 교반하여 혼합하였다. 이후, 합성 유화제가 균질화되면 홍삼 추출물을 첨가한 후 다시 유화장비를 이용하여 교반하면서 혼합하였다. 합성 유화제와 홍삼 추출물의 혼합이 종료되면 나머지 증류수, 말토덱스트린, 포타슘소르베이트를 넣어 합성 리포좀을 제조하였다. 제조된 합성 리포좀을 초음파 파쇄하여 균질화함으로써, 홍삼 함유 합성 리포좀을 제조하였다.
조성물 | 함량 (중량%) | |
합성 유화제 | 레시틴 | 10.0 |
콜레스테롤 | 0.2 | |
에탄올 | 5.0 | |
프로필렌글리콜 | 10.0 | |
용매 | 증류수 | 68.7 |
천연 코팅제 | 말토덱스트린 | 1.0 |
합성 방부제 | 포타슘소르베이트 | 0.1 |
포집 물질 | 홍삼 추출물 | 5.0 |
[
실험예
1] 특성 분석
(1) 레이저 입도 분석기를 이용한 입자 크기 분석
레이저 입도분석기를 이용하여 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀의 입자 크기를 측정하였고, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)이 홍삼 추출물(비교예 1), 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)에 비해 입자 크기가 작은 것으로 나타났다.
(2)
전자주사현미경을
이용한 입자 크기 및 형태 분석
전자주사현미경(Scanning Electron Microscope)을 이용하여 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀의 입자 크기 및 형태를 분석하였다. 상기 실시예 1 및 비교예 1, 2에서 제조된 각각 시료를 -70℃에서 냉동고(Deep freezer)에 2시간 동안 냉동 후 동결건조기를 사용하여 동결 건조시켰다. 그 다음, 이를 얇게 펴서 PdPt 촉매로 1회 코팅한 후 전자주사현미경으로 그 표면과 단면을 관찰하였고, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
도 2b에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)이 홍삼 추출물(비교예 1), 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)에 비해 입자 크기가 작고, 형태가 균일하며 둥근 것으로 나타났다.
(3)
포집
효율 측정
실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀 2ml을 각각 필터(0.45um, 25mm syringe filter)에 여과하여 리포좀 내 포집되지 않은 물질을 제거하였다. 포집 되지 않은 물질을 제거한 후 제거된 양만큼의 증류수로 상기 천연 리포좀 또는 합성 리포좀을 채워 이를 원심분리 필터에 담아 5000RCF에서 40분 동안 원심분리하였다. 상층에 분리된 포집물에 대해 다시 증류수를 채운 후 이를 회수하여 홍삼 추출물의 최대 흡수파장인 280nm에서 흡광도를 측정하였다. 포집 전 물질의 초기 농도와 포집된 물질의 농도의 측정값을 확인하여 포집 효율을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
(포집 효율(%) = 필터를 통한 홍삼 함유 리포좀의 흡광도/처음 넣어준 홍삼 함유 리포좀의 흡광도 × 100)
실시예 1 | 비교예 2 | |
포집율 (%) | 97.47 | 81.52 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)이 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)에 비해 포집 효율이 높은 것으로 나타났다.
[
실험예
2] 세포 투과성 확인
인체의 장내 흡수율을 예측하기 위해서 세포 투과성 테스트(permeability test)를 실시하였다.
트랜스웰(Transwell, 12 well)의 투과막에 콜라겐을 코팅하고 건조되면 인간 대장상피세포인 Caco-2 세포를 2×105cells/well로 분주하였다. 14일 동안 세포를 배양하여 단층이 형성되면 배지를 제거하고 수송 배지(transport medium)로 교체하였다. 수송 배지를 30분 동안 유지한 후 각 well의 상단 챔버(apical chamber)에 각각 증류수, 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물을 처리하였다. 2시간 경과 후에 하단 챔버(basolateral chamber)에서 배지를 회수하여 홍삼의 최대 흡수 파장(280nm)에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 처리한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 처리한 경우에 비해 세포 투과율이 현저하게 높은 것으로 나타났다.
[
실험예
3] 항산화 효과 확인
(1) 과산화물제거효소(Super Oxide
Dismutase
, SOD) 생성량 확인
과산화물제거효소(SOD)는 초과산화이온을 산소와 과산화수소로 전환하는 반응에 촉매작용을 하는 효소이다. 상기 과산화물제거효소는 산소에 노출되는 거의 모든 세포에서 항산화방어기작을 하는 것으로 알려져 있으며, 활성산소를 억제하는 대표적인 항산화 물질이다.
마이크로플레이트(Microplate, 48 well)에 Caco-2 세포 10×104개를 분주하고, 24시간 뒤에 새 배지로 교체한 후 각각 2% 농도의 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀을 24시간 동안 처리하였다. 이후, 세포를 수거하고, 여기에 증류수 300ul를 넣어 세포 용해(cell lysis)한 뒤, BCA 방법에 의하여 단백질을 정량하였다. 세포 추출물을 SOD 효소활성측정 실험에 사용하였다.
SOD는 피로갈롤(pyrogallol)의 자동 산화율이 억제되는 양을 측정하는 방법으로, UV/VIS 흡광도 측정기(Spectrophotometer)(UV-2401PC, Shimadzu)를 이용해 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성은 세포가 첨가되지 않은 증류수를 기준으로 하여 피로갈롤 발색반응 억제반응을 %로 환산하여 SOD 활성으로 나타내었고, 그 결과를 도 4a에 나타내었다.
도 4a에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 처리한 경우가 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 처리한 경우에 비해 과산화물제거효소를 약 2배 더 많이 분비하는 것으로 나타났다.
(2) 카탈라아제(
Catalase
) 활성 측정
과산화수소(H2O2)의 분해에 따라 감소하는 흡광도를 측정하는 방법을 이용하여 카탈라아제 활성을 측정하였다.
합성산화방지제(dibutyl hydroxyl toluene, BHT)를 처리한 경우를 추가한 것을 제외하고는, 실험예 3의 (1)과 동일한 방법으로 세포 추출물을 추출하였다. 상기 세포 추출물에서 정량을 통해 200ug의 단백질을 취하고, 10mM 포스페이트버퍼, 0.015M 과산화수소(pH 7.0)를 가한 후 240nm에서 3분 동안 흡광도 감소를 측정하였다. 효소 활성은 기질인 과산화수소를 1umol/min의 속도로 감소시키는 것을 1unit으로 나타내었고, 그 결과를 도 4b에 나타내었다.
(카탈라아제 활성(U/mg) = OD × 1000 / 43.6 × 단백질양(mg))
도 4b에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 처리한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 처리한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 처리한 경우에 비해 카탈라아제 활성이 높은 것으로 나타났다.
(3) SA-β-gal 활성
SA-β-gal(senescence associated β-gal)는 세포가 노화될수록 과발현되는 효소로, 세포 노화를 확인하는 마커이다.
Caco-2 세포를 분주한 후 각각 증류수, 합성산화방지제(BHT), 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀을 각각 처리하여 하룻밤 동안 배양한다. 세포 배양이 끝난 뒤, PBS로 세포를 1~2회 세척하였다. 그 후, 상온에서 3% 포름알데하이드로 3~5분간 세포를 고정시켰다. 이산화탄소가 존재하지 않는 37℃ 배양기(incubator)에서 SA-β-gal 용액으로 고정된 세포를 염색하였다. SA-β-gal이 파란색으로 염색된 세포를 광학현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 4c에 나타내었다.
도 4c에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 처리한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 처리한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 처리한 경우에 비해 노화 진행이 느린 것으로 나타났다.
(4) 아데노신
3인산
(Adenosine Triphosphate, ATP) 활성 확인
아데노신 3인산(ATP)은 세포내 에너지 대사에 사용되는 것으로, ATP 한 분자는 가수분해를 통해 다량의 에너지를 방출한다.
BNL CL.2(마우스 간 세포)를 사용한 것을 제외하고는, 실험예 3의 (1)과 동일한 방법으로 실험하여 간 세포내 ATP 활성을 확인하였고, 그 결과를 도 4d에 나타내었다.
도 4d에 도시된 바와 같이, 홍삼 추출물(비교예 1)을 처리한 경우는 간세포 내 ATP 활성에 도움을 주지 못하는 것으로 나타났다. 또한, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 처리한 경우는 정상(무처리)과 비슷한 수준으로 ATP 활성을 가지는 것으로 나타났다.
[
실험예
4] 항염증 효과 확인
(1) 지방산화효소(
Lipoxidase
) 저해효과 확인
지방산화효소활성을 저해하는 인도메타신(indomethacin), 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀 각각 100ul에 보레이트 버퍼(Borate Buffer) 1ml를 첨가한 후, 리놀레산 2ml을 첨가하고, 지방산화효소를 첨가하여 25℃에서 10분 동안 반응하였다. 이후, 234nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 5a에 나타내었다.
도 5a에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 처리한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 처리한 경우에 비해 지방산화효소 저해효과가 약 4.3배 높은 것으로 나타났다. 반면, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 처리한 경우는 지방산화효소 저해효과가 없는 것으로 나타났다
(2) NO 생성량 분석
마이크로플레이트(96 well)에 1×104 cell/well의 RAW 264.7 세포를 배양하여 세포를 well에 부착시킨 후 FBS를 뺀 DMEM 배지로 48시간 배양하였다. 각각 인도메타신(indomethacin), 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀을 1%의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 배양한 후 LPS 1ug/ml를 처리하여 18시간 배양하였다. 세포 배지 50ul에 1% 술파닐아미드(sulfanilamide), 5% 인산과 0.1% 나프틸에틸에틸렌 디아민(naphthylethylethylene diamine)이 포함된 그리스 시약(Griess reagent)(Sigma chemical Co., USA) 50ul를 첨가하여 10분 동안 반응시킨 후 흡광도 측정기(TECAN/infinite M200, Switzerland)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 무처리군의 흡광도 값과 비교하여 NO 생성 정도를 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 5b에 나타내었다.
도 5b에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 처리한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 처리한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 처리한 경우에 비해 NO 생성 저해 효과가 높은 것으로 나타났다.
[
실험예
5] 마우스를 이용한 동물실험
마우스를 이용한 동물실험을 통해, 지질 과산화 정도를 확인하였다.
(1)
CCL4
유발
6주령 ICR 마우스 수컷 6마리씩 무처리, 대조군, 처리군으로 나눴다. 대조군과 처리군은 사염화탄소:올리브유를 1:1로 혼합한 혼합물을 체중 100g당 0.1ml로 4주 동안 경구투여하였다. 4주 후, 해부 이틀 전부터 24시간 간격으로 사염화탄소를 각 1회씩 복강 주사하였다. 대조군은 일반 사료를 식이하였고, 처리군은 2주차부터 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀이 각각 3% 함유된 사료를 식이하였다(하기 표 4 참조).
식이구성 (%) | 무처리 | 대조군 | 처리군 | ||
비교예 1 | 비교예 2 | 실시예 1 | |||
카제인(casein) | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
옥수수전분(cornstarch) | 15 | 15 | 12 | 12 | 12 |
설탕(sucrose) | 45 | 45 | 45 | 45 | 45 |
섬유소(cellulose) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
옥수수 유(corn oil) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
미네랄 혼합물(mineral mixture) | 3.5 | 3.5 | 3.5 | 3.5 | 3.5 |
타타르산수소콜린(choline bitartrate) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
DL-메티오닌(methionine) | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
비교예 1 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 |
비교예 2 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 |
실시예 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 |
합계 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
해부 이후, 간 조직을 적출하고 초음파를 이용하여 분쇄 전처리한 다음, 이를 실험샘플로 사용하였다. 지질 과산화 정도는 치오바르비투르산염 반응성 물질(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)의 형성으로 평가하였다. 즉, 세포 추출물(단백질농도 5mg/ml)에 TBA-삼염화아세트산-HCL 용액(0.375% TBA/15% TCA in 0.25M HCl) 1ml를 첨가하여 95℃ 수욕상에서 30분간 가열하여 발색시킨 후 냉각시켰다. 이후 2000rpm, 10분간 원심분리한 다음 상등액을 취하여 생성된 말론디알데히드(malondialdehyde, MDA)의 양을 532nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 6a에 나타내었다.
도 6a에 도시한 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)를 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 지질 과산화가 더 억제된 것으로 나타났다.
(2) 콜레스테롤 유발
사염화탄소 처리 대신 콜레스테롤을 식이조성표(Research Diets inc; Product D12336)에 따라 식이한 것을 제외하고는, 실시예 5의 (1)과 동일한 방법으로 실험하였다.
해부 전 24시간 동안 절식을 실시하고 해부 이후, 간 조직을 적출하여 초음파를 이용한 분쇄 전처리 후, 이를 실험샘플로 사용하였다. 생성된 말론디알데히드(MDA)의 양을 532nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 6b에 나타내었다.
도 6b에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 지질 과산화가 더 억제된 것으로 나타났다.
(3) 체중 측정
실시예 5의 (2)에서 콜레스테롤을 식이하기 전에 난계법으로 분류한 각각의 실험군의 체중을 측정하고, 약 5주 동안 식이한 이후의 체중을 측정하였고, 그 결과를 도 6c에 나타내었다.
도 6c에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 체중이 감소된 것으로 나타났다.
(4)
글루타치온
(
Glutathione
,
GSH
) 함량 측정
마이크로플레이트(6 well)에 세포를 1×106cells/well로 분주하여 하룻밤 동안 배양한 후, 각각 증류수, 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀을 처리하였다. 이후, PBS로 세포를 2회 세척한 뒤, 스크래퍼(scraper)로 세포를 수거하였다. 모아진 세포 펠렛에 냉각된 10% TCA와 0.01N HCl를 각각 250ul씩 넣었다. 이를 혼합(voltexing)한 후 얼음에서 15분 동안 배양하고, 12000g, 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. TCA를 제거하기 위해 디에틸 에테르(diethyl ether)로 세포 상층액(supernant)을 6번 세척하였다. 먼저 GSH 농도를 확인하기 위해, 1) 0.1M PBS-0.5mM EDTA(pH 7.5) 700ul, 2) 10mM 티오티오니트로 벤조산(thithionitro benzoic acid) 50ul, 3) GR (4U/ml) 100ul을 앞서 분리한 액 100ul와 혼합하였다. 그리고 여기에 NaHCO3-NADPH 용액(4mM NADPH in 5% NaHCO3)을 50ul씩 넣어 반응을 진행하였다. 이를 마이크로플레이트(96 well)에 넣어 ELISA 측정기를 이용하여 412nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 6d에 나타내었다.
도 6d에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 글루타치온의 생성량이 가장 높은 것으로 나타났다.
(5) 간 조직 확인
실험예 5의 (2)와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
간 조직을 적출하여 바로 동결절편용 포매제(OCT compound)에 포매(embedding)하고 -80℃에서 냉각하였다. 냉각된 간 조직을 저온유지장치인 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 7um 크기로 절편하였다. 염색(staining) 후, 슬라이드를 실온에서 30분간 공기 중에서 건조(air dry)하였다. 건조된 슬라이드를 10% 포르말린에 5분간 담근 후 얼음 위에서 여과한 증류수로 슬라이드를 3번 세척하였다. 85% 프로필렌 글리콜로 5분 동안 60℃에서 헹군 후 여과한 증류수로 다시 세척하고, 20% 글리세롤 PBS를 사용하여 봉입(mounting)하였다. 현미경으로 붉은색으로 염색된 지방구의 크기와 면적을 관찰하였고, 그 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다.
도 7a에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우는 무처리한 경우와 간 색상이 유사한 것으로 나타났다.
또한, 도 7b에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 생성된 지질이 거의 없는 것으로 나타났다.
[
실험예
6]
랫트를
이용한 동물실험
마우스 대신 6주령 SD 랫트(Rat) 수컷을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 5의 (2)와 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 분변을 채취하고, 혈액 샘플을 채취하기 24시간 전 식이를 중단한 후, 해부하였다. 채취한 혈액을 5000rpm에서 10분 동안 상온에서 원심분리하여 생성된 상층액인 혈청부분만을 실험에 사용하였다.
(1) 간 색상 확인
도 8a에 도시된 바와 같이, 무처리한 경우를 제외하고는 지방 축적으로 인해 간 색상이 변한 것으로 나타났다. 또한, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 지방 축적이 적은 것으로 나타났다.
(2) 혈액 분석
혈청을 이용하여 지질, 미네랄 함량, 간 손상 지표를 측정하였고, 그 결과를 도 8b 내지 도 8d에 나타내었다.
도 8b에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼(비교예 1)을 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 총 지질, 총 콜레스테롤, 총 중성지방, LDL이 낮고, HDL이 높은 것으로 나타나, 지질 조성이 개선된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 8c에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 ALT, AST가 낮은 것으로 나타나, 간 손상이 적은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 8d에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 미네랄인 아연과 철의 함량이 높은 것으로 나타났다.
(3) 조직별 지질과산화 분석
실험예 5의 (2)와 동일한 방법으로 해부한 조직에서 말론디알데히드(MDA)를 측정하였고, 그 결과를 도 9a 및 9b에 나타내었다.
도 9a 및 9b에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 간, 소포체, 미토콘드리아, 고환에서 지질과산화가 억제된 것으로 나타났다.
(4) 조직별
글루타치온
(
GSH
) 함량 분석
실험예 5의 (4)와 동일한 방법으로 해부한 조직에서 글루타치온의 양을 측정하였고, 그 결과를 도 9c 및 도 9d에 나타내었다.
도 9c 및 도 9d에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 추출물(비교예 1)을 식이한 경우, 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 간, 비장, 고환, 신장, 혈청, 심장에서 글루타치온의 함량이 높은 것으로 나타났다.
(5) 간 조직 확인
실험예 5의 (5)와 동일한 방법으로 간 조직을 확인하였고, 그 결과를 도 10a에 나타내었다.
도 10a에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우는 생성된 지질이 거의 없는 것으로 나타났다.
(6)
분변
내 지질 함량 분석
분변을 이용하여 일반적인 총 콜레스테롤 및 총 유리콜레스테롤 측정방법에 따라 측정하였고, 그 결과를 도 10b에 나타내었다.
도 10b에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우가 홍삼 함유 합성 리포좀(비교예 2)을 식이한 경우에 비해 분변으로 배출된 총 콜레스테롤 함량, 총 유리콜레스테롤 함량이 더 높은 것으로 나타났다.
[
실험예
7] 혈중 진세노사이드 확인
6주령 SD 랫트 수컷을 이용하여 실험 전 24시간 동안 수분공급을 제외한 식이를 중단하고 실험을 실시하였다. 각각 실시예 1의 홍삼 함유 천연 리포좀, 비교예 1의 홍삼 추출물, 비교예 2의 홍삼 함유 합성 리포좀을 체중대비 1%의 양으로 구강으로 투여하고 3시간 뒤 채혈하였다. 표준시료로는 엠보연구소에서 구매한 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rg3, Compound K를 사용하였고, 총 10ul를 점적하였다. 전개용매로는 클로로포름:메탄올:정제수를 65:35:10의 비율로 혼합한 후 아래층(down phase)만을 분리한 것을 사용하였다. 10% 황산용액을 분무하여 110℃에서 10분 동안 가열하여 발색하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 도시된 바와 같이, 홍삼 함유 천연 리포좀(실시예 1)을 식이한 경우는 혈액에서 진세노사이드 Rb2가 검출된 것으로 나타났다.
Claims (18)
- 천연 유화제를 용매와 혼합한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제1단계; 및 상기 제1단계의 혼합물에 홍삼 추출물을 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제2단계를 포함하는 방법에 의해 형성되는 천연 리포좀으로서,
천연 유화제, 용매, 천연 코팅제 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및
포집 물질로서 홍삼 추출물
을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀. - 제1항에 있어서,
상기 천연 유화제는 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 하이드로지네이티드 포스파티딜콜린, 포스파티딜산, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및 이들의 수소첨가 생성물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 인지질을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀. - 제1항에 있어서,
상기 천연 유화제는 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 지방산을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀. - 제1항에 있어서,
상기 용매는 증류수, 천연 유래의 부틸렌 글리콜, 프로판디올, 글리세린 및 발효주정으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매를 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀. - 제1항에 있어서,
상기 천연 코팅제는 말토덱스트린, 셀룰로오스 및 펙틴으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 코팅제를 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀. - 제1항에 있어서,
상기 천연 방부제는 감귤 추출물, 유자 추출물, 유칼립투스 추출물, 고삼 추출물, 정향 추출물 및 자몽 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 천연 추출물을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀. - 제1항에 있어서,
상기 홍삼 함유 천연 리포좀은 전체 중량을 기준으로 천연 유화제 0.1 내지 10 중량%, 천연 코팅제 0.01 내지 5 중량%, 천연 방부제 0.001 내지 3 중량%, 홍삼 추출물 0.1 내지 30 중량% 및 용매 잔량을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀. - 제1항에 있어서,
항산화용 또는 항염증용 홍삼 함유 천연 리포좀. - 제1항에 있어서,
지질 조성 개선용 홍삼 함유 천연 리포좀. - (a) 천연 유화제를 용매와 혼합한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제1단계;
(b) 상기 제1단계의 혼합물에 홍삼 추출물을 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제2단계;
(c) 상기 제2단계의 혼합물에 천연 코팅제를 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제3단계; 및
(d) 상기 제3단계의 혼합물에 35 내지 80 ℃로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하는 제4단계
를 포함하는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법. - 제10항에 있어서,
상기 제4단계 이후에 온도를 서서히 낮추면서 반복적으로 초음파 처리하는 제5단계를 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 홍삼 함유 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 홍삼 함유 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는, 동맥경화증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 천연 유화제를 용매와 혼합한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제1단계; 및 상기 제1단계의 혼합물에 홍삼 추출물을 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제2단계를 포함하는 방법에 의해 형성되는 천연 리포좀으로서,
천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질; 및
포집 물질로서 홍삼 추출물
을 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀. - 제14항에 있어서,
항산화용 또는 항염증용 홍삼 함유 천연 리포좀. - (a) 천연 유화제를 용매와 혼합한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제1단계;
(b) 상기 제1단계의 혼합물에 홍삼 추출물을 첨가한 후 35 내지 80 ℃에서 초음파 처리하는 제2단계; 및
(c) 상기 제2단계의 혼합물에 35 내지 80 ℃로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하는 제3단계
를 포함하는 제14항 및 제15항 중 어느 한 항의 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법. - 제16항에 있어서,
상기 제3단계 이후에 온도를 서서히 낮추면서 반복적으로 초음파 처리하는 제4단계를 포함하는 홍삼 함유 천연 리포좀의 제조방법. - 제14항 및 제15항 중 어느 한 항의 홍삼 함유 천연 리포좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
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