KR20170044815A - 연화된 해산물의 제조방법 및 이의 방법에 따라 제조된 연화된 해산물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 a) 해산물연화효소 및 유화제를 혼합한 후 균질화하여 해산물용 나노 리포좀을 제조하는 단계; b) 해산물을 상기 a) 단계에서 제조한 해산물용 나노 리포좀에 침지한 다음, 100 내지 200 mmHg의 압력으로 3 내지 8분 동안 감압처리한 후 압력을 상압으로 승압시키고, 다시 80 MPa 내지 120 MPa 압력에서 3 내지 8분 동안 가압처리하는 단계; 및 c) 상기 감압-가압처리된 해산물을 1 내지 7℃의 온도에서 2 내지 8시간 동안 정치시켜 해산물 내부로 해산물용 나노 리포좀을 함침시키는 단계를 포함하는 연화된 해산물의 제조방법에 관한 것으로, 상기 감압-가압처리는 감압 또는 가압처리에 비해 해산물 내료 침투되는 연화효소의 양을 약 1.2 내지 2배 향상시켜 해산물의 경도를 3,000 내지 4,000 g로 감소시키므로 별도의 분쇄나 연하, 저작 등을 도와주는 보조식품 등을 첨가하지 않아도 저작, 연하, 소화기능 등이 저하된 고령자 및 환자, 또는 치아의 발달이 미숙한 유아 등이 쉽게 씹거나 삼킬 수 있으며, 상온에서 보관하면 해산물이 쉽게 부패하지만 저온 보관함에 따라 해산물 본래의 색도, pH 등은 그대로 유지하므로 해산물 고유의 풍미, 영양소 등을 그대로 느낄 수 있는 이점이 있다.
Description
본 발명은 연화된 해산물의 제조방법 및 이의 방법에 따라 제조된 연화된 해산물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 해산물용 나노 리포좀 및 감압-가압 함침법을 이용하여 연화 또는 저작 등이 용이한 물성을 가지는 연화된 해산물의 제조방법 및 이의 방법에 따라 제조된 해산물에 관한 것이다.
최근 생활수준의 향상과 보건의료 기술의 발달로 노인인구의 증가에 따라 노인문제가 점차 사회문제로 인식되고 있으며, 특히 노인의 영향, 건강 및 삶의 질에 대한 관심이 더욱 중요하게 인식되기 시작하였다.
노인이 건강한 생활을 유지하게 위해서는 건강이 가장 중요하며, 건강은 균형 잡힌 영양소 섭취가 주요 인자로 작용하고 있다. 하지만, 노인이 되면 생리적 기능의 저하, 활동량의 감소, 맛에 대한 감각의 둔화, 치아상태의 불량, 소외감, 우울감, 심리적인 위축감, 경제적 곤란, 흡연, 음주 등의 문제로 식품섭취에 있어 양적, 질적인 제한을 받게 된다(Walls et al., Mech Ageing Dev, 2004; Marshall et al., J. Am Dent Assoc, 2002; Mumma et al., J Dent Res, 1970; Farrell, Br Dent J, 1956; Bae and Lee, Yeungnam Univ. J Med, 2004; Lee, Korean J Community Living Sci, 2011; Lexomboon et al., J Am Geriatr Soc, 2012). 또한, 노인 인구가 증가함과 더불어 우리나라에서는 핵가족화가 급속히 진행되면서 노인 부부가구 및 독신가구가 점차 증가하고 있다. 그 결과 식사준비 및 조리 등의 가사 노동은 노인 자신의 몫이 되고 있다. 최근에는 취미 활동이나 봉사활동을 하는 경우가 많아지고 노인복지시설, 노인전용식당, 경로당 등의 사회시설 및 기관시설 확장으로 이어져, 앞으로는 일상적 식사는 물론 노인용 간식이나 음식의 개발 등 다양한 노인용 식품에 대한 개발이 요구되어지고 있다.
현재 국내에서 개발된 고령자용 식품은 치아 보조식, 연하 보조식 정도로, 상기 고령자용 식품은 유동성의 물성, 고형의 음식을 갈거나 다진 형태로 제공되어 음식의 고유한 풍미와 영양소 상실 및 식감을 저하시키고 식욕을 떨어뜨리게 되는 문제가 있다. 이에 식물성 또는 동물성 식재료 세포내로 효소를 함침시켜 식품의 고유한 식감, 형태 등을 유지하면서 저작 또는 연하작용이 용이한 식품가공기술에 대한 연구가 진행되고 있다(일본 등록특허 제4403210호; 일본 등록특허 제5145471호; 일본 공개특허 제2010-051209호). 그러나 상기 일부 선행문헌의 가압처리 방법은 식품의 내부까지 효소의 함침이 충분히 이루어지지 않으며, 장시간의 가열조리, 또는 동결 및 해동의 반복에 의해 영양분이 감소하거나 색소 저하 등의 품질 저하 가능성이 있다. 따라서 단시간 내에 효율적으로 효소가 식재료 세포내로 함침시킬 수 있는 기술의 개발이 필요한 상황이다.
한편, 나노기술(Nanotechnology, NT)은 나노 크기(10-9m)의 원자 · 분자를 적절하게 결합시켜 새로운 미세한 구조를 만들어 신물질과 기능을 창출하는 것을 가능하게 하는 초미세 극한기술을 말한다. 최근 10년 동안 나노기술의 발전은 전폭적인 국가적인 지원과 함께 화학공학, 생명공학, 전자공학, 재료공학 등 다양한 분야에서 핵심 기술로 발전되어 왔고, 이를 통해 나노바이오기술(nano-bio-technology)의 개발, 의약, 국방, 에너지, 운송, 통신, 컴퓨터 및 교육 등 전반적인 산업분야의 시장으로 점차 확대될 것으로 전망되고 있다. 특히, 제약 분야에서는 이와 같은 나노바이오기술을 응용하여 약물전달시스템에 적용하고자 하는 많은 연구가 이루어지고 있다.
약물전달시스템(drug delivery system, DDS)은 약물의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시킴으로써 필요한 양의 약물을 효율적으로 기관과 조직세포에 전달할 수 있는 시스템이다. 구체적으로, 기능성은 좋으나 물질자체의 이취 또는 이미 등으로 인하여 사용에 제한이 있는 지질생리활성 물질이나 온도, 산화, 빛, 소화관 내에서의 효소, pH 및 다른 영양분에 의한 분해 등에 의해 유용성분이 파괴되어 활성이 감소하는 물질 등의 사용상 한계를 극복하기 위해 고체 분산체(solid dispersions), 마이크로-리포좀(micro-emulsions), 나노-리포좀(nano-emulsion), 리포좀(liposomes), 펠렛(pellets), 매트릭스정제(matrix tablets) 등을 사용하여 물질의 보존성 향상, 용출속도 조절, 취식에 문제가 되는 냄새 및 맛을 차단시키는 등 기능성 물질을 직접 섭취가 가능하도록 하는 나노크기를 갖는 전달체에 대한 연구가 진행되고 있다.
감압-가압 함침법(vacuum-pressure infusion)이란 식품을 효소, 영양분, 기능성 성분, 동결 보호제 등이 들어 있는 함침액에 넣고 진공상태의 압력(감압)을 가한 후 대기압 이상의 압력을 가해 식품 재료의 중심으로 함침액의 침투력을 향상시키는 기술을 말한다. 구체적으로, 압력을 낮춰 진공을 잡아주게 되면 식품 내부에 존재하는 기체가 확장되어 부분적으로 식품 내에서 외부로 움직이게 된다. 이후 압력을 대기압 이상의 압력으로 승압시켜주면 압력차가 큰 폭으로 생성되어 상대적으로 함침액이 균일하고 깊게 침투되어 공정과정을 단축시킬 수 있다. 하지만 식품의 종류에 따라 외형이 손상되는 문제가 있으므로, 식품의 종류에 따라 최적의 처리 조건을 확립하여야 하는 실정이다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하면서 나노기술 및 감압-가압 함침법을 이용하여 연화 및 저작이 용이한 물성을 가지는 연화된 해산물을 제조하는 방법을 제공하고자 노력하던 중, 외부 환경으로부터 효소의 저장 안정성을 가지는 나노 리포좀에 해산물을 침지하고 감압-가압처리한 후 일정시간 정치시켜 효소반응을 일으킴으로써 해산물 내 조직이 연화되어 섭취자의 소화흡수력 또는 저작능을 개선할 수 있는 연화된 해산물을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 해산물용 나노 리포좀과 감압-가압 함침법을 이용한 연화된 해산물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법에 따라 제조된 연화된 해산물을 제공하는데 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 해산물용 나노 리포좀과 감압-가압 함침법을 이용한 연화된 해산물을 제조하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 a) 해산물연화효소 및 유화제를 혼합한 후 균질화하여 해산물용 나노 리포좀을 제조하는 단계; b) 해산물을 상기 a) 단계에서 제조한 해산물용 나노 리포좀에 침지한 다음, 100 내지 200 mmHg의 압력으로 3 내지 8분 동안 감압처리한 후 압력을 상압으로 승압시키고, 다시 80 MPa 내지 120 MPa 압력에서 3 내지 8분 동안 가압처리하는 단계; 및 c) 상기 감압-가압처리된 해산물을 1 내지 7℃의 온도에서 2 내지 8시간 동안 정치시켜 해산물 내부로 해산물용 나노 리포좀을 함침시키는 단계;를 포함하는 연화된 해산물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 연화된 해산물의 제조방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
a) 해산물용 나노 리포좀을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 본 발명의 a) 단계는 해산물연화효소와 유화제를 혼합한 후 균질화시켜 해산물연화효소가 유화제 내에 포집된 형태의 해산물용 나노 리포좀을 제조하는 단계로서, 해산물연화효소의 포집은 통상의 방법에 따라 수득될 수 있다. 하나의 구체적 예로, 해산물연화효소를 유화제와 혼합한 후 9,000 내지 14,000 rpm, 바람직하게는 10,000 내지 13,000 rpm, 보다 바람직하게는 12,000 rpm의 속도로 1 내지 5분, 바람직하게는 2 내지 4분, 보다 바람직하게는 3분 동안 균질화한 다음 초음파 기계를 이용하여 150 내지 250W, 바람직하게는 180 내지 220 W, 보다 바람직하게는 200 W의 강도로 1 내지 5분, 바람직하게는 2 내지 4분, 보다 바람직하게는 3분 동안 초음파 처리하여 해산물용 나노 리포좀을 제조할 수 있다. 이때, 상기 유화제는 1.5 내지 2.5%의 농도, 바람직하게는 1.8 내지 2.2%의 농도로 희석된 것을 사용하는 것이 좋다. 상기 범위 이외의 농도의 유화제를 사용하는 경우 나노 리포좀의 크기가 증가하거나 전하값이 낮아 입자간의 결합이 약해져 안정성이 감소하는 문제가 있다.
상기 해산물연화효소는 해산물 내부로 함침되어 해산물의 단백질, 식이섬유, 탄수화물 등을 가수분해하여 해산물의 연화도를 향상시키는 것이라면 어느 것이나 사용가능하며, 예를 들어, 프로테아제, 키티나아제, 브로멜라인, 아밀라아제, 포스파타제, 파파인, 리파아제 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프로테아제이다.
상기 유화제는 해산물소화효소를 포집하여 원형 또는 타원형의 폐쇄된 막구조를 형성하는 물질이라면 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 디스테로일-sn-포스파티딜에탄올 아민, 디팔미토일 포스파티딜에탄올 아민, 포스파티딜에탄올 아민, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 콜린, 디팔미토일, 포스파티딜 세린, 디팔미토일 포스파티딜 글리세롤 및 디팔미토일 포스파티딜 콜린으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 또는 이들의 혼합물, 또는 인지질을 포함하는 천연원으로부터 추출된 인지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 인지질을 포함하는 천연 추출물, 보다 바람직하게는 대두 및 난황 등으로부터 분리한 레시틴 또는 유청 단백질, 보다 더 바람직하게는 대두 및 난황 등으로부터 분리한 레시틴인 것을 특징으로 한다.
상기 유화제를 포함하는 용액은 수성용매, 바람직하게는 물, PBS(phosphate buffer saline), TBS(tris buffered saline) 또는 초산완충용액이다.
선택적으로 ,본 발명의 해산물용 나노 리포좀은 해산물연화효소 이외에 조미제, 영양제, 탄수화물, 단백질 및 향미제 등의 성분을 추가적으로 함유할 수 있다. 상기 조미제로는 소금, 간장, 설탕, 환원 물엿, 화학조미료, 식초, 주류 등을 사용할 수 있고, 영양소로는 비타민류(비타민 A, B, C, D 및 E), 미네랄류(카로틴, Mg, 칼륨 등), 폴리페놀, DHA, EPA, 리시친, 타우린, 코린 등을 사용할 수 있다. 상기 탄수화물은 모노사카라이드(포도당 및 과당 등), 디사카라이드(말토스, 수크로스 및 올리고당 등), 폴리사카라이드(덱스트린 및 사이클로덱스트린 등) 및 당알콜(자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등)을 사용할 수 있다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해산물용 나노 리포좀은 유화제를 이용하여 해산물연화효소의 외부에 막이 형성된 상태이므로 유화제가 코팅된 해산물연화효소라고도 표현한다.
b) 해산물용 나노 리포좀에 해산물을 침지한 다음 감압-가압처리하는 단계이다.
구체적으로, 상기 b) 단계의 감압-가압처리는 진공상태의 압력(감압)을 가한 후 대기압 이상의 압력을 가해 해산물 조직의 중심으로 해산물연화효소를 침투시키기 위한 것으로, 해산물을 상기 a) 단계에서 제조한 해산물용 나노 리포좀에 침지한 다음, 100 내지 200 mmHg, 바람직하게는 120 내지 180 mmHg, 보다 바람직하게는 140 내지 170 mmHg, 보다 더 바람직하게는 160 mmHg의 압력으로 3 내지 8분, 바람직하게는 4 내지 7분, 보다 바람직하게는 5분 동안 감압처리한 후, 압력을 상압으로 승압시키고, 다시 80 내지 120 MPa, 바람직하게는 90 내지 110 MPa, 보다 바람직하게는 100 MPa의 압력에서 3 내지 8분, 바람직하게는 4 내지 7분, 보다 바람직하게는 5분 동안 가압처리하여 이루어질 수 있다. 여기서, 상기 상압은 특별히 압력을 줄이거나 높이지 않을 때의 압력으로 보통의 대기압과 같은 0.1 MPa 정도의 압력을 말한다.
상기 감압압력이 200 mmHg를 초과하거나 처리시간이 3분 미만인 경우 해산물용 나노 리포좀이 해산물 내부로 침투되지 못하며, 감압압력이 100 mmHg 미만이거나 처리시간이 8분을 초과하는 경우 그 이상의 감압압력 또는 그 이하의 처리시간에 비하여 해산물용 나노 리포좀이 침투되는 양의 증가가 미비하여 비효율적이다. 또한, 상기 가압압력이 80 MPa 미만이거나 처리시간이 3분 미만인 경우 해산물용 나노 리포좀의 침투의 양이 증가되지 않아 해산물의 연화가 이루어지지 않으며, 가압압력이 120 MPa를 초과하거나 처리시간이 8분을 초과하는 경우 그 이하의 조건에 비하여 해산물용 나노 리포좀이 침투되는 효율의 증가가 미비하거나 해산물의 품질이 저하되는 문제가 있다.
상기 해산물용 나노 리포좀에 해산물을 침지하는 방법은 해산물 내부로 해산물용 나노 리포좀을 함침시키는 방법이라면 어느 것이나 사용 가능하다.
하나의 예로, 본 발명에 따라 제조된 해산물용 나노 리포좀을 해산물의 높이 이상, 또는 해산물이 완전히 잠기도록 부어 침지시킬 수 있다. 이때, 상기 해산물 섭취하기 전 조리하거나 섭취하기 좋은 크기, 예를 들어 가로×세로×높이가 2 내지 5cm×0.5 내지 2cm×0.5 내지 2cm의 크기로 절단된 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 감압-가압 처리는 감압 또는 가압처리에 비해 해산물 내료 침투되는 연화효소의 양을 약 1.2 내지 2배 향상시키는 이점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 감압-가압처리된 해산물은 필요에 따라 냉동공정, 건조공정, 동결건조공정, 효소실활공정 또는 조리 및 조미공정을 추가하여 제조할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 해산물은 어류, 연체동물, 절지동물, 극피동물, 후구동물 및 미색동물 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 일 수 있다. 상기 어류는 명태, 고등어, 광어, 우럭, 꽁치, 농어, 청어 등이고, 연체동물은 오징어, 문어, 낙지, 꼴뚜기, 조개, 소라, 전복, 말미잘 등일 수 있다. 상기 절지동물은 투구게, 게, 가재 등이고, 극피동물은 성게 등일 수 있다. 또한, 상기 후구동물은 해삼 등이고, 미색동물은 멍게, 미더덕 등일 수 있다.
c) 해산물 내부로 해산물용 나노 리포좀을 함침시키는 단계이다.
본 발명의 c) 단계는 b) 단계에서 감압-가압처리된 해산물을 1 내지 7℃, 바람직하게는 3 내지 6℃, 보다 바람직하게는 5℃의 온도에서 2 내지 8시간, 바람직하게는 3 내지 6시간 동안 정치시켜 이루어지는 것이 식품의 연화효과와 부패를 방지하는데 바람직하다. 상기 온도가 1℃ 미만인 경우 해산물 내 수분이 얼음입자로 바뀌기 시작하여 해산물 내 조직이 수축되므로 해산물의 연화가 고르게 이루어지지 않으며, 온도가 7℃를 초과하는 경우 해산물이 부패되기 시작하여 품질이 현저히 떨어지는 문제가 있다. 또한, 상기 정치시간이 2시간 미만인 경우 해산물 내부로 함침된 효소의 활성이 이루어지지 않아 해산물의 연화가 이루어지지 않으며, 상기 정치시간이 8시간을 초과하는 경우 그 이하의 시간에 따라 정치시킨 해산물에 비하여 경도의 저하가 미미하여 비효율적인 문제가 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 연화된 해산물은 별도의 찌기, 삶기, 볶기 등의 조리, 또는 연하, 저작 등을 도와주는 보조식품 등을 첨가하지 않아도 저작, 연하, 소화기능 등이 저하된 고령자 및 환자, 또는 치아의 발달이 미숙한 유아 등의 섭취자가 쉽게 씹거나 삼킬 수 있으며, 해산물 본래의 색, pH 등을 유지하고 있어 해산물 고유의 풍미, 영양소 및 식감 등을 그대로 느낄 수 있다. 아울러, 선택적으로 해산물용 나노 리포좀은 해산물연화효소 이외에 조미제, 영양소, 탄수화물, 단백질 및 향미제 등의 기능성 성분을 첨가하여 관능성 및 건강상태를 증진시킬 수 있는 건강기능성 식품으로 제공될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "건강상태 증진"이란 인체의 각 기관계(器官系)의 생리적 기능, 영양결핍증 등을 예방 또는 개선하여 영양, 체력 등의 수준이 향상되는 것을 의미한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 해산물용 나노 리포좀을 포함하는 연화된 해산물을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 해산물용 나노 리포좀이 해산물 내부로 침투하여 해산물의 조직이 분해 또는 연화된 것을 특징으로 하는 연화된 해산물을 제공하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 연화된 해산물은 상술한 제조방법에 의하여 제조되며, 해산물용 나노 리포좀, 해산물 및 해산물연화효소의 종류, 감압-가압처리 조건, 제조과정 등의 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 연화된 해산물은 해산물용 나노 리포좀이 해산물의 조직 내로 침투하여 3,000 내지 4,000 g의 경도를 나타내는 해산물을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 연화된 해산물은 별도의 찌기, 삶기, 볶기 등의 조리, 또는 연하, 저작 등을 도와주는 보조식품 등을 첨가하지 않아도 저작, 연하, 소화기능 등이 저하된 고령자 및 환자, 또는 치아의 발달이 미숙한 유아 등이 쉽게 씹거나 삼킬 수 있으며, 해산물 본래의 색도, pH 등은 그대로 유지하므로 해산물 고유의 풍미, 영양소 등을 그대로 느낄 수 있다. 아울러, 선택적으로 상기 해산물용 나노 리포좀은 해산물연화효소 이외에 조미제, 영양소, 탄수화물, 단백질 및 향미제 등의 기능성 성분을 첨가할 수 있으므로, 본 발명의 연화된 해산물은 관능성 및 건강상태를 증진시킬 수 있는 건강기능성 식품으로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 감압-가압처리는 감압 또는 가압처리에 비해 해산물 내료 침투되는 연화효소의 양을 약 1.2 내지 2배 향상시켜 해산물의 경도를 3,000 내지 4,000 g로 감소시키므로 별도의 분쇄나 연하, 저작 등을 도와주는 보조식품 등을 첨가하지 않아도 저작, 연하, 소화기능 등이 저하된 고령자 및 환자, 또는 치아의 발달이 미숙한 유아 등이 쉽게 씹거나 삼킬 수 있으며, 상온에서 보관하면 해산물이 쉽게 부패하지만 저온 보관함에 따라 해산물 본래의 색도, pH 등은 그대로 유지하므로 해산물 고유의 풍미, 영양소 등을 그대로 느낄 수 있는 이점이 있다.
아울러, 해산물연화효소가 포집된 해산물용 나노 리포좀은 선택적으로 해산물연화효소 이외의 조미제, 영양소, 탄수화물, 단백질 등의 기능성 성분을 포집할 수 있으므로, 본 발명의 해산물용 나노 리포좀을 이용하여 관능성이 향상되거나 각 기관계의 생리적 기능, 혈중 콜레스테롤, 영양결핍증 등을 예방 또는 개선하여 건강을 증진시킬 수 있는 기능성 식물을 제공할 수 있다.
도 1은 프로테아제의 농도 및 코팅 유두에 따라 제조된 리포좀의 입자크기, 제타전위 및 다분산 지수(PdI)를 측정한 결과이다.
도 2는 감압조건에 따라 오징어 내부로 함침된 아스코브르산의 함량을 측정한 그래프이다.
도 3은 가압 조건에 따라 오징어 내부로 함침된 아스코브르산의 함량을 측정한 그래프이다.
도 4는 감압-가압 조건에 따라 오징어 내부로 함침된 아스코브르산의 함량을 측정한 그래프이다.
도 5는 오징어와 코팅 또는 비코팅된 프로테아제를 혼합하고 감압-가압처리된 오징어의 색도의 변화를 측정한 그래프이다.
도 6은 오징어와 코팅 또는 비코팅된 프로테아제를 혼합하고 감압-가압처리된 오징어의 경도를 측정한 그래프이다.
도 7은 오징어와 코팅 또는 비코팅된 프로테아제를 혼합하고 감압-가압처리된 오징어의 pH를 측정한 그래프이다.
도 8은 오징어와 코팅 또는 비코팅된 프로테아제를 혼합하고 감압-가압처리된 오징어의 단백질 프로파일을 SDS-PAGE로 확인한 그림이다.
도 2는 감압조건에 따라 오징어 내부로 함침된 아스코브르산의 함량을 측정한 그래프이다.
도 3은 가압 조건에 따라 오징어 내부로 함침된 아스코브르산의 함량을 측정한 그래프이다.
도 4는 감압-가압 조건에 따라 오징어 내부로 함침된 아스코브르산의 함량을 측정한 그래프이다.
도 5는 오징어와 코팅 또는 비코팅된 프로테아제를 혼합하고 감압-가압처리된 오징어의 색도의 변화를 측정한 그래프이다.
도 6은 오징어와 코팅 또는 비코팅된 프로테아제를 혼합하고 감압-가압처리된 오징어의 경도를 측정한 그래프이다.
도 7은 오징어와 코팅 또는 비코팅된 프로테아제를 혼합하고 감압-가압처리된 오징어의 pH를 측정한 그래프이다.
도 8은 오징어와 코팅 또는 비코팅된 프로테아제를 혼합하고 감압-가압처리된 오징어의 단백질 프로파일을 SDS-PAGE로 확인한 그림이다.
이하, 제조예, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예, 실시예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 제조예, 실시예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예
1 :
해산물연화효소
준비
해산물의 조직을 연화시키기 위한 해산물연화효소로 프로테아제(protease)를 선정하고, 이들을 시그마(sigma-aldrich, St, Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
그 다음, 상기 프로테아제(protease) 완충용액과 혼합하여 각각 1 및 2%의 농도의 효소용액으로 제조하여 준비하였다.
제조예 2 : 천연 고분자 용액 제조
대표적인 친수성 성분을 코팅할 수 있는 입자인 리포좀을 제조하기 위해 대두 레시틴(Soy bean, Lipoids GmbH, Ludwigshafen, Switzerland)을 0.5M 아세테이트 버퍼(acetate buffer, pH 3) 100ml에 1~2 g을 첨가한 후 700rpm에서 30분 동안 교반한 후 여과필터(4~7㎛)에 여과하여 레시틴 용액을 제조하였다. 그 다음 상기 제조된 레시틴 용액을 중량%로 희석시켜 준비하였다.
실시예
1 :
해산물연화효소가
함유된 나노
리포좀
제조 실험
상기 제조예 1에서 준비한 1% 또는 2% 프로테아제(protease)와 상기 제조예 2에서 준비한 2% 레시틴 용액을 혼합하였다. 그 다음 초고속 교반기(Ultra-Turrax® T25, KIA labotechnik, staufen, germany)를 이용하여 12,000 rpm에서 3분 동안 초고속으로 균질화시켰다. 그 다음 200 W, 54% 세기로 3분 동안 초음파 처리하여 레시틴으로 코팅된 1% 또는 2%의 프로테아제 리포좀을 제조하였다. 제조 후 나노입도분석기(Zeta-sizer®)를 이용하여 리포좀의 입자크기를 측정하였으며, 임계미셀농도(critical micelle concentration, CMC)의 측정하여 제타전위를 확인하였다. 대조군으로는 레시틴으로 코팅되지 않은 프로테아제를 사용하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보듯이, 프로테아제의 경우 레시틴으로 코팅하지 않은 프로테아제(1% pro, 2% por)의 입자크기는 약 340nm로, 레시틴으로 코팅된 프로테아제 리포좀(1% coating, 2% coating; 약 250nm)에 비해 다소 크게 나타냄을 확인할 수 있었다.
또한, 레시틴으로 코팅된 프로테아제 리포좀(1% CP, 2% CP)의 제타전위 값은 레시틴으로 코팅되지 않은 프로테아제의 제타전위 값과 유사하게 절대값 15 mV 부근에서 값을 나타냄을 확인할 수 있었다.
즉, 레시틴의 경우 연화효소를 나노크기의 입자로 포집할 수 있는 장점이 있고, 프로테아제를 모두 포집 가능하여 입자 개발에 용이하게 사용할 수 있음을 알 수 있었으며, 실제 실험을 통해 프로테아제의 경우 240nm의 크기의 나노입자 함침액 코팅 입자를 형성함을 확인하였다.
따라서, 이하 실험에서는 레시틴으로 코팅 또는 비코팅된 프로테아제를 해산물의 연화 작용에 관여하는 효소로 사용하기로 하였다.
실시예 2 : 코팅 또는 비코팅된 효소 제조
2-1. 코팅된 효소 준비
상기 제조예 2에서 제조한 2% 레시틴(lecithin)에 상기 제조예 1에서 준비한 1% 또는 2%의 프로테아제가 포함되도록 혼합한 후 10,000 rpm으로 3분 동안 초고속으로 균질화시켰다. 그 다음 200 W, 54% 세기로 3분 동안 초음파 처리하여 레시틴으로 코팅된 1% 프로테아제 리포좀, 2% 프로테아제 리포좀을 제조하여 준비하였다.
2-2. 비코팅된 효소 준비
상기 제조예 1에서 구입한 프로테아제를 완충용액에 1% 또는 2% 농도로 희석하여 1% 프로테아제, 2% 프로테아제를 준비하였다.
실험예 1: 함침기술에 따른 해산물 내부로의 효소 침투력 비교실험
1-1. 가압 또는 감압 처리에 따른 해산물 내부로의 함침액 침투력 실험
먼저, 해산물 식재로 오징어를 선정하여 ㈜아워홈으로부터 오징어몸통(국내산)을 공급받았고, 오징어의 껍질을 제거한 후 흐르는 물에 세척하고, 가로 3cm, 세로 1cm 및 두께 0.5cm로 잘라 준비하였다. 그 다음, 투명 파우치에 상기 준비한 오징어와 오징어 무게 대비 2배 부피의 10% 아스코르브산 용액을 넣어 준비하였다. 그 다음 오징어와 아스코르브산이 담긴 파우치를 진공주입(vacuum pressure impregnation, VPI) 장치내 챔버에 넣은 후 하기 표 1에 제시된 함침조건에 따라 처리하였다. 그 다음, 상기 함침 처리된 오징어를 꺼낸 후 분쇄기(blender)를 이용하여 분쇄하였다. 상기 분쇄된 오징어 10g과 추출용매(5% metaphosphricacid 30 mL + EDTA 1 mg/mL) 1mL을 혼합한 후 10분 동안 원심분리하였다. 그 다음 상기 원심분리한 오징어를 여과지(whatman filter paper, No.5)와 0.45㎛ 실린지 필터(syringe filter)에 순차적으로 여과한 후 증류수로 각각 20배 희석하여 HPLC 분석을 실시하였다. HPLC 분석 조건은 하기 표 2에 나타내었다. 대조군(control)으로는 아스코르브산 용액을 침지하지 않은 오징어를 분쇄하여 사용하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
| 함침기술 | 처리 압력 | 처리시간 | 처리온도 |
| 감압 | 160, 360, 560 mmHg | (감압) 5 min→(상압) 5 min | 25℃ |
| 가압 | 50, 100, 150, 200 MPa | (가압) 5 min |
| HPLC 분석 조건 | |
| HPLC 기기 | NANOSPACE SI-2 (Shiseido, Japan) |
| UV-VIS Detector | 254 nm |
| Column | CAPCELL PAC C18 MG (4.6 mmI.D x 250 mm, 5 μm, Shiseido, Japan) |
| Mobile Phase | 0.05 M KH2PO4 |
| Flow rate | 1 mL/min |
| Injection Volume | 10 μL |
| Column Temperature | 40℃ |
도 2에서 보듯이, 감압 조건에 따라 10% 아스코브르산을 처리한 오징어는 내부로 아스코브르산이 함침되어 아스코브르산을 나타내는 피크(peak)가 대조군에 비해 상승하였으며, 560 mmHg을 처리한 또는 오징어보다 360 mmHg, 160 mmHg를 처리한 오징어에서 피크(peak)의 높이가 높아지는 것으로 보아 고진공일수록 오징어 내부로 아스코브르산의 침투량이 증가함을 알 수 있었다.
도 3에서 보듯이, 가압 조건에 따라 10% 아스코브르산을 처리한 오징어는 내부로 아스코브르산이 함침되어 아스코브르산을 나타내는 피크(peak)가 대조군에 비해 상승하였다. 가압 조건에 따른 아스코브르산의 함량은 50 MPa 처리한 오징어에 비해, 100 MPa로 처리하였을 때 피크(peak)가 더 높게 확인되었으며, 그 이상의 압력인 150 MPa와 200 MPa로 처리한 오징어는 100 MPa로 처리하였을 때와 큰 차이를 나타내지 않았다.
이에 본 발명자들은 가압 조건을 100 MPa로 고정시키고, 감압 조건을 변경하여 감압-가압 처리 실험을 진행하였다.
1-2. 감압-가압 처리 조건에 따른 해산물 내부로의 함침액 침투력 실험
투명 파우치에 상기 1-1에서 준비한 오징어와 오징어 무게 대비 2배 부피의 10% 아스코르브산 용액을 넣어 준비하였다. 그 다음 오징어와 아스코르브산이 담긴 파우치를 진공주입(vacuum pressure impregnation, VPI) 장치 내 챔버에 넣은 후 하기 표 3에 제시된 조건에 따라 처리하였다. 그 다음, 상기 감압-가압 처리된 오징어 내 아스코르브산 함량을 상기 1-1과 동일한 방법으로 측정하였다. 대조군(control)으로는 아스코르브산 용액을 침지하지 않은 오징어를 분쇄하여 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
| 함침기술 | 처리 압력 | 처리시간 | 처리온도 |
| 가압-가압 | 160 mmHg-100 MPa, 360 mmHg-100 MPa, 560 mmHg-100 MPa |
(감압) 5 min→(상압) 5 min →(가압) 5 min |
25℃ |
도 4에서 보듯이, 감압-가압 처리에 따른 오징어의 피크(peak)는 감압 처리군의 피크 경향과 유사하게 감압 조건이 고진공일수록 피크가 높게 나타났으며, 감압 또는 가압 처리만 한 오징어에 비해 피크가 높게 나타났음을 확인하였다.
특히, 감압, 가압, 또는 감압-가압 조건 중 160 mmHg-100 MPa으로 감압-가압 처리한 오징어의 피크(peak)가 가장 높게 나타났음을 확인하였다.
상기한 결과를 바탕으로 이하 실험에서는 160 mmHg 감압, 100 MPa의 가압 조건을 기계 함침의 조건으로 선택하여 사용하기로 하였다.
실험예 2 : 코팅 또는 비코팅된 효소의 침지에 따른 해산물의 이화학적 특성 관찰
2-1. 해산물 준비
㈜아워홈으로부터 오징어몸통(국내산)을 공급받았고, 오징어의 껍질을 제거한 후 흐르는 물에 세척하고, 가로 3cm, 세로 1cm 및 두께 0.5cm로 잘라 준비하였다.
2-2. 감압-가압 처리에 따라 코팅 또는 비코팅된 효소가 함침된 해산물 제조
상기 2-1에서 준비한 오징어와 상기 실시예 2에서 제조한 레시틴으로 코팅된 1% 프로테아제 리포좀 또는 코팅되지 않은 1% 프로테아제를 넣어 준비하였다. 그 다음 상기 오징어와 효소가 담긴 파우치를 진공주입(vacuum pressure impregnation, VPI) 장치 내 챔버에 넣어 160 mmHg의 감압조건에서 5분, 상압조건에서 5분 동안 처리한 다음, 100 MPa의 가압조건에서 5분 동안 처리하였다. 이때 온도는 25℃±3℃를 유지하였다.
2-3. 코팅 또는 비코팅된 효소의 침지시간에 따른 해산물의 색도 변화 관찰
상기 2-2의 오징어와 프로테아제가 담긴 파우치를 5℃에서 8시간 동안 정치시켜 오징어 내로 프로테아제를 함침시키면서 1, 2, 4 또는 8시간째에 오징어의 색도를 측정하였다. 색도는 색차계(chroma meter, CR-200, KONICA MINOLTA, Tokyo, Japan)를 사용하여 명도(Lightness, CIE L * -value), 적색도(Redness, CIE a * -value) 및 황색도(Yellowness, CIE b * -value)를 3회 반복 측정하였다. 이때 비교시료는 생 오징어의 값을 기준으로 비교분석하였다. 프로테아제를 처리한 오징어의 색도 변화는 하기 수학식 1에 대입하여 색도차를 산출하였다. 대조군으로는 프로테아제 대신 증류수를 사용하여 감압-가압처리한 오징어를 사용하였다. 그 결과를 표 4 및 도 5에 나타내었다.
[실험식 1]
색도차(ΔE ) = 
| 침지 시간 |
색도 | |||
| L* | a* | b* | ||
| DW | 0 | 71.23±0.02 | -0.68±0.05 | 8.40±0.02 |
| 1 | 71.43±0.34 | -0.82±0.21 | 8.39±0.13 | |
| 2 | 71.83±0.10 | -0.79±0.03 | 8.40±0.02 | |
| 4 | 72.31±0.20 | -0.66±0.10 | 8.40±0.02 | |
| 8 | 72.63±0.25 | -0.71±0.14 | 8.79±0.10 | |
| 1% non- coating |
0 | 67.65±0.23 | 0.14±0.16 | 9.13±0.21 |
| 1 | 68.00±0.03 | 0.27±0.22 | 9.59±0.10 | |
| 2 | 68.46±0.02 | 0.74±0.17 | 9.88±0.10 | |
| 4 | 68.59±0.05 | 0.57±0.09 | 9.67±0.02 | |
| 8 | 68.50±0.09 | 0.68±0.33 | 9.57±0.10 | |
| 1% coating | 0 | 67.11±0.01 | 1.40±0.06 | 9.39±0.01 |
| 1 | 67.43±0.03 | 1.36±0.02 | 9.27±0.04 | |
| 2 | 68.01±0.10 | 1.59±0.14 | 9.58±0.04 | |
| 4 | 68.01±0.04 | 1.47±0.05 | 9.77±0.05 | |
| 8 | 68.11±0.05 | 1.46±0.04 | 9.50±0.19 | |
도 5에서 보듯이, 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 총 색차(△E) 값은 침지시간이 경과함에 따라 증가하는 경향을 나타내었으며, 비코팅 및 코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 색차는 2시간 까지 증가하다가 이후 유지되는 결과를 나타내었지만, 증류수에 함침하여 감압-가압처리한 오징어(DW)의 색차는 침지시간이 증가함에 따라 증가하는 값을 나타내었다.
또한, 상기 표 4에서 보듯이, 증류수에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 명도는 침지시간이 증가함에 따라 침지 0시간의 값과 비슷하거나 높게 나타났다. 반면에 비코팅 및 코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 경우 증류수에 함침하여 감압-가압처리한 오징어(DW)에 비해 감소한 값을 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
증류수 또는 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 적색도는 침지시간이 경과함에 따라 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 다만, 증류수에 함침하여 감압-가압처리한 오징어에 비해 비코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 적색도가 일관되게 높게 나타났고, 코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 적색도는 증류수 및 비코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 적색도 값보다 높게 측정되었다.
증류수 또는 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 황색도 역시 침지시간이 경과함에 따라 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 다만, 증류수에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 황색도에 비해 비코팅 및 코팅된 프라테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 황색도가 전반적으로 높은 값을 나타내었으며, 침지시간이 지남에 따라 황색도가 증가하였다.
2-4. 코팅 또는 비코팅된 효소의 침지시간에 따른 해산물의 물성 측정
상기 2-2의 오징어와 프로테아제가 담긴 파우치를 5℃에서 8시간 동안 정치시켜 오징어 내로 프로테아제를 함침시키면서 1, 2, 4, 6 또는 8시간째에 오징어의 물성을 측정하였다. 상기 물성은 식품 물성 측정기(texture analyzer, CT3-1000, Brookfield Engineering Laboratories, Inc. Stoughton, MA, USA)를 사용하여 경도(hardness)를 측정하였다. 물성분석에서 목표값(target value)은 5.0 mm이었으며, 작동되는 힘은 100 g, 측정 속도는 2.5 mm/s의 속도로 측정하였다. 각 시료의 측정치는 5회 이상 반복 실험하여 평균값과 표준편차로 표시하였다. 경도는 오징어의 형태를 변형시키는데 필요한 힘으로 첫 번째 압착(First force)에 의한 곡선의 최고점 높이로 측정하였다. 대조군으로는 프로테아제 대신 증류수에 침지한 오징어를 사용하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보듯이, 500 unit(A) 및 1,000 unit(B)의 효소 활성을 가진 코팅 및 비코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 경도값은 대조군인 증류수에 함침하여 감압-가압처리한 오징어에 비해 현저히 적은 값을 나타내었으며, 코팅 및 비코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어간의 경도값은 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
2-5. 코팅 또는 비코팅된 효소의 침지시간에 따른 해산물의 pH 측정
상기 2-2의 오징어와 프로테아제가 담긴 파우치를 5℃에서 12시간 동안 정치시켜 오징어 내로 프로테아제를 함침시키면서 1, 2, 4, 8 또는 12시간째에 오징어의 pH를 측정하였다. 상기 pH는 오징어와 증류수 1:9의 비율로 넣어 Homogenizer(SMT PH91, SMT, Tokyo, Japan)로 10,000 rpm으로 2분 동안 균질화 시킨 후 사용하였다. 균질 후 pH meter(Orion 3-star, Thermo scientific, Waltham, MA, USA)로 3회 반복 측정하였다. 대조군으로는 프로테아제 대신 증류수에 침지한 오징어를 사용하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보듯이, 증류수 또는 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어의 pH는 전반적으로 시간의 경과에 따라 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 증류수, 비코팅 및 코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어들간에도 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
2-6. 코팅 또는 비코팅된 효소의 침지시간에 따른 해산물의 근섬유 분해정도 관찰
상기 2-2의 오징어와 프로테아제가 담긴 파우치를 5℃에서 24시간 동안 정치시켜 오징어 내로 프로테아제를 함침시키면서 0, 24시간째에 오징어의 근원섬유 분해 정도를 측정하기 위해 SDS-PAGE를 실시하였다.
구체적으로, 상기 2-2에서 감압-가압시킨 오징어 2g에 오징어 무게 대비 6 배의 용출용액(20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, pH 7.6, 5 mM EDTA)을 넣고 균질화 한 후 4℃ 조건에서 1000 x g의 속도로 10분 동안 원심분리 하였다. 그 다음 원심분리된 펠렛을 상기 용출용액으로 재부유시킨 후 동일 조건에서 원심분리하는 과정을 5회 반복한 후 마지막 원심분리한 펠렛은 펠렛의 무게 대비 5배의 용출용액으로 재부유시켰다. 그 다음, 상기 재부유시킨 시료를 나일론 메시(nylon mesh)에 통과시켜 결체조직을 제거한 후 동일조건에서 원심분리를 실시하였다. 그 다음, 상기 원심분리된 펠렛에 100 mM KCl을 넣어 재부유시킨 후 원심분리하고, 상층액을 제거한 다음, 100 mM KCl, 1 mM NaN3 용액에 100 mg/ml의 농도로 희석하여 SDS-PAGE 샘플로 사용하였다.
상기 준비한 SDS-PAGE 샘플을 sample buffer(277.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 44.4% (v/v) glycerol, 4.4% LDS, 0.02% bromophenol blue, Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)에 용해시킨 후 95℃에서 5분 동안 반응시켰다. 그 다음 반응이 끝난 샘플을 1000xg에서 5분 동안 원심분리하여 불용성 잔류물(insoluble residue)을 침전시켰다. 그 후 상기 원심분리한 샘플의 상층액을 Any kDTM Mini-PROTEAN(R) TGXTM Precast Protein Gel (Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)에 로딩하여 전기영동하였다. 그 다음 상기 겔을 쿠마시브릴리언트블루 염색 용액(Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)으로 1 시간 동안 염색 후 탈색 용액(destaining solution; acetic acid:methanol:water=15:30:55)으로 1-2 시간 동안 탈색시켜 근원섬유 분해 정도를 관찰하였다. 대조군으로는 프로테아제 대신 증류수에 침지한 오징어를 사용하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보듯이, 생 오징어나 증류수에 함침하여 감압-가압처리한 오징어에서는 고분자대에 밴드가 많고 나타났지만, 코팅 및 비코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어에서는 그 함량이 적어 band intensity가 옅어 지는 것을 확인 할 수 있었다. 대신에 저분자대에서는 증류수에 함침하여 감압-가압처리한 오징어에서 확인되지 않은 band의 intensity가 진해져 코팅 및 비코팅된 프로테아제에 함침하여 감압-가압처리한 오징어에서는 고분자는 적어지고 저분자는 많아진 것을 확인할 수 있었다.
Claims (4)
- a) 해산물연화효소 및 유화제를 혼합한 후 균질화하여 해산물용 나노 리포좀을 제조하는 단계; b) 해산물을 상기 a) 단계에서 제조한 해산물용 나노 리포좀에 침지한 다음, 100 내지 200 mmHg의 압력으로 3 내지 8분 동안 감압처리한 후 압력을 상압으로 승압시키고, 다시 80 MPa 내지 120 MPa 압력에서 3 내지 8분 동안 가압처리하는 단계; 및 c) 상기 감압-가압처리된 해산물을 1 내지 7℃의 온도에서 2 내지 8시간 동안 정치시켜 해산물 내부로 해산물용 나노 리포좀을 함침시키는 단계;를 포함하는 연화된 해산물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 해산물연화효소는 프로테아제, 키티나아제, 브로멜라인, 아밀라아제, 포스파타제, 파파인, 리파아제 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 연화된 해산물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 연화된 해산물은 3,000 내지 4,000 g의 경도를 나타내는 것을 특징으로 하는 연화된 해산물의 제조방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되며, 3,000 내지 4,000 g의 경도를 나타내는 것을 특징으로 하는 연화된 해산물.
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