CN108815133A - 一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，以抗肿瘤治疗剂、细胞膜以及免疫细胞为原料，提取免疫细胞膜包封抗肿瘤治疗剂，形成带有凋亡基团的纳米颗粒后，与免疫细胞共培养，免疫细胞吞噬纳米颗粒，使抗肿瘤治疗剂间接包封进入免疫细胞，制备得到仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂。与现有技术相比，本发明通过利用带有凋亡基团的细胞膜包封抗肿瘤治疗剂，提高免疫细胞对抗肿瘤治疗剂的吞噬量，制备出满足各种不同需要的细胞载体，避免了传统负载方法带来的治疗剂无规律释放以及吞噬量低的问题，同时减少了药物对细胞载体的毒性。

Description

一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法
技术领域
本发明属于纳米医学领域，尤其是涉及一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法。
背景技术
活细胞递送药物在生物医学工程、材料学、制药学等多领域都有着广泛应用前景，在过去的几年里，活细胞递送主要通过活细胞与载药的纳米颗粒或药物共孵育形成。如Jinhyang Choi等利用小鼠巨噬细胞负载造影诊断剂；Wen-Chia Huang等用单核巨噬细胞负载载有化疗药的纳米颗粒。这种负载方法一方面对细胞产生较多毒性，另一方面，负载量相对较低。
长期以来，抗肿瘤治疗剂一般采用脂质体、聚合物纳米颗粒等高分子材料包封，以降低其毒副作用并解决一些难溶性药物的溶解度问题。例如，光敏材料Ce6难溶于水，且分子间容易形成共轭结构，导致分散性差，与细胞共孵育后细胞对材料的吞噬量少；细胞吞噬这些治疗性材料后，进入体内并不能有效的控制材料的无规律释放，对机体造成一定的毒性。免疫细胞之间存在着凋亡与吞噬过程，例如免疫细胞可以通过识别凋亡细胞表面的凋亡基团磷脂酰丝氨酸(PS)而将之吞噬清除。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，通过利用带有凋亡基团的细胞膜包封抗肿瘤治疗剂，提高免疫细胞对抗肿瘤治疗剂的吞噬量，制备出满足各种不同需要的细胞载体，避免了传统负载方法带来的治疗剂无规律释放以及吞噬量低的问题，同时减少了药物对细胞载体的毒性。抗肿瘤治疗剂被包裹于细胞膜中形成脂质体内核，而脂质体被免疫细胞内吞到细胞当中，该仿自噬的方法在生物医学领域特别是药物包封以及递送方面具有广阔的应用前景。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，以抗肿瘤治疗剂、细胞膜以及免疫细胞为原料，提取免疫细胞膜包封抗肿瘤治疗剂，形成带有凋亡基团的纳米颗粒后，与免疫细胞共培养，免疫细胞吞噬纳米颗粒，使抗肿瘤治疗剂间接包封进入免疫细胞，制备得到仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂，具体包括以下步骤：
(1)将细胞用Tris-MgCl2buffer多次冻融，通过mini-extruder(40nm-100nm)，加入0.5～1M Sucrose(终浓度0.125～0.25M)，离心(800～2000g，5～15min)，取上层，再次离心(2000～3000g，30～40min)，取下层，并加入Tris～MgCl2buffer(含0.125～0.25Msucrose)洗涤，再用二次H2O洗，收集得到冻干样细胞膜碎片；
(2)称量步骤(1)中冻干样细胞膜碎片溶于PBS(1X)，将光敏剂Ce6加入到上述细胞膜悬液中，超声粉碎，超声结束后，取出溶液常温下对二次H2O透析，冻干；
(3)将步骤(2)得到的冻干样溶于PBS，加入800～1000万免疫细胞，在培养箱中培养0.5～2h，吸去上层液体，得到仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂。
步骤(1)中所述细胞包括红细胞、白细胞、上皮细胞、干细胞或巨噬细胞。
步骤(1)中所述冻干样细胞膜碎片带有磷脂酰丝氨酸基团。
步骤(2)中冻干样细胞膜碎片与光敏剂Ce6的质量比为3～4:8～10。
步骤(2)中超声粉碎时控制超声功率为80～150W，每次超声5～10s，超声总时长5～10min。
步骤(3)中所述免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、白细胞或树突状细胞。
本发明首先提取细胞的细胞膜，并用来制备包裹有Ce6的脂质体，再与免疫细胞共培养，通过识别载有Ce6的纳米颗粒表面带有的凋亡基团磷脂酰丝氨酸，将纳米颗粒吞噬。我们所利用的免疫细胞吞噬细胞膜包裹光敏剂Ce6的方法，一方面解决了细胞靶向抗肿瘤疗法中治疗性材料负载效率低的问题，另一方面脂质体包封也解决了治疗性材料无序释放的问题，为细胞靶向治疗提供了一个新的指导策略。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)通过调整提取细胞膜，制备生物体来源的脂质体材料。
(2)由于疏水相互作用，难溶于水的Ce6在脂质体形成的过程中能被包裹于脂质体磷脂双分子层间。
(3)包裹有Ce6的脂质体带有凋亡信号基团磷脂酰丝氨酸，与免疫细胞共孵育，被免疫细胞识别作为凋亡的细胞吞噬，从而提高了对Ce6的负载，通过使用脂质包封较好地避免了Ce6的泄露。
(4)制备的细胞载体可以被用作疏水性药物的载体，在体外模拟释药实验中显示具有良好药物缓释行为，在细胞实验中显示该细胞载体有较好的迁移能力，可以很容易地迁移至靶细胞，并且流式分析同等条件下，该法比传统方法显著提高了材料的负载量，暗示了该细胞载体在生物医学领域特别是靶向给药方面广阔的应用前景。
附图说明
图1为负载Ce6的免疫细胞膜纳米脂质在水相中的粒径分布图；
图2为免疫细胞膜膜脂质纳米颗粒的透射电镜照片；
图3为实验步骤3吞噬效率比较图；
图4为实验步骤3吞噬效率的定性比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，采用以下步骤：
(1)将一定数量的巨噬细胞用Tris-MgCl2buffer多次冻融，通过mini-extruder(40nm-100nm)，加入0.5～1M Sucrose(终浓度0.125～0.25M)，离心(800～2000g，5～15min)，取上层，再次离心(2000～3000g，30～40min)，取下层，并加入Tris～MgCl2buffer(含0.125～0.25M sucrose)洗涤，再用二次H2O洗，收集冻干。
(2)称量步骤(1)中冻干样3～4mg细胞膜碎片溶于PBS(1X)；取8～10mg Ce6，加入细胞膜悬液中，超声粉碎(控制功率为80～150W，每次超声5～10s，超声总时长5～10min)。超声结束后，取出溶液常温下对二次H2O透析，冻干。
(3)免疫细胞的获取(以小鼠腹腔来源的巨噬细胞为例)：对小鼠腹腔注射硫基乙酸营养液刺激小鼠。将洗涤液注入腹腔，摇匀吸出，离心，收集底部细胞，加培养基重旋置于培养皿，培养箱中培养0.5～12h，取出洗掉上层液体，洗涤，即得到贴壁的免疫细胞。取(2)中冻干样3～5mg溶于PBS，加入培养皿800～1000万免疫细胞，在培养箱中培养0.5～2h，吸去上层液体，收集培养皿底部细胞即为仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂，流式测定。
(4)取步骤(1)中制备的部分冻干样溶于PBS中，AnnexinV-FITC染色，测定流式。
图1为负载Ce6的免疫细胞膜纳米脂质在水相中的粒径分布图，粒径较为均一，尺寸约为60nm；图2为免疫细胞膜膜脂质纳米颗粒的透射电镜照片，颗粒具备较为规则的形状；图3为实验步骤(3)吞噬效率比较图，从左到右依次是空白对照的细胞，游离Ce6以及负载Ce6的脂质体纳米颗粒；图4为实验步骤3吞噬效率的定性比较图，载Ce6的脂质体纳米颗粒被细胞吞噬效率约4倍，大于游离Ce6组。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，其特征在于，以抗肿瘤治疗剂、细胞膜以及免疫细胞为原料，提取免疫细胞膜包封抗肿瘤治疗剂，形成带有凋亡基团的纳米颗粒后，与免疫细胞共培养，免疫细胞吞噬纳米颗粒，使抗肿瘤治疗剂间接包封进入免疫细胞，得到仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂。
2.根据权利要求1所述的一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)将细胞用Tris-MgCl2buffer多次冻融，加入0.5～1M的蔗糖，离心处理后取上层，再次离心后取下层，并加入含0.125～0.25M蔗糖的Tris～MgCl2buffer洗涤，再用二次H2O洗，收集得到冻干样细胞膜碎片；
(2)称量步骤(1)中冻干样细胞膜碎片溶于PBS(1X)，将光敏剂Ce6加入到上述细胞膜悬液中，超声粉碎，超声结束后，取出溶液常温下对二次H2O透析，冻干；
(3)将步骤(2)得到的冻干样溶于PBS，加入800～1000万免疫细胞，在培养箱中培养0.5～2h，吸去上层液体，得到仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂。
3.根据权利要求2所述的一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述细胞包括红细胞、白细胞、上皮细胞、干细胞或巨噬细胞。
4.根据权利要求2所述的一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述冻干样细胞膜碎片带有磷脂酰丝氨酸基团。
5.根据权利要求2所述的一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中冻干样细胞膜碎片与光敏剂Ce6的质量比为3～4:8～10。
6.根据权利要求2所述的一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中超声粉碎时控制超声功率为80～150W，每次超声5～10s，超声总时长5～10min。
7.根据权利要求2所述的一种仿自噬的免疫细胞负载抗肿瘤治疗剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、白细胞或树突状细胞。
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