CN110711249A - 一种溶酶体膜包覆纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种溶酶体膜包覆纳米颗粒的制备方法。在巨噬细胞驱动的作用下，合成活性溶酶体膜包覆的纳米颗粒。具体为首先用脂多糖活化巨噬细胞，刺激巨噬细胞中溶酶体相关蛋白酶分泌并增强其酶活性，其次，利用巨噬细胞的吞噬能力，将制备好的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育，使巨噬细胞吞噬纳米颗粒，将纳米颗粒内化于巨噬细胞溶酶体中，最终利用溶酶体提取试剂盒提取溶酶体而得到具有溶酶体膜包覆的纳米颗粒。该方法与传统脂膜包被纳米颗粒的制备方法相比，一方面制备方法简单，无需考虑压力或电击对膜本身造成的损伤。另一方面，以巨噬细胞为驱动力，所制备出的溶酶体膜包覆纳米颗粒保存了溶酶体内水解酶的活性。

Description

一种溶酶体膜包覆纳米颗粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及溶酶体包覆功能性纳米药物的制备技术和方法，在巨噬细胞驱动的作用下，合成活性溶酶体膜包覆的纳米颗粒。具体为首先用脂多糖活化巨噬细胞，刺激巨噬细胞中溶酶体相关蛋白酶分泌并增强其酶活性，其次，利用巨噬细胞的吞噬能力，将制备好的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育，使巨噬细胞吞噬纳米颗粒，将纳米颗粒内化于巨噬细胞溶酶体中，最终利用溶酶体提取试剂盒提取溶酶体而得到具有溶酶体膜包覆的纳米颗粒。
背景技术：
由于肿瘤的多样性、异质性和复发性，单纯依靠传统的手术以及放化疗难以有效地抑制肿瘤复发和转移。一直以来，提高药物的靶向性与疗效是研究人员不断努力的方向。高靶向性以及高递送率是治疗癌症的第一步，研究人员利用生物膜作为被膜来提高化疗药物长循时间，降低药物生物毒性，实现主动靶向以及高效递送。例如红细胞(RBCs)作为自然界的长期运载工具被广泛研究。从纳米工程的角度来看，通过对天然生物膜的应用，膜表面复杂的结构以及功能可以得到最大程度保留，实现近乎完美的的仿生功能，同时利于对其功能实现主观控制。这些研究结果突出了天然生物膜包覆药剂的显著优势。
传统方法中，研究者普遍选择首先对生物膜进行提取，再对药物进行包裹。该过程不可避免地对膜部分功能以及活性蛋白等造成损伤，此外许多胞内活性成分无法保留。其中溶酶体是最具代表性的含大量活性物质的囊泡结构。溶酶体中含有大量水解酶(蛋白酶、磷酸酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、糖苷酶和硫酸酯酶)，参与细胞自噬以及多种降解凋亡途径。已有研究表明，溶酶体膜透化(LMF)可以启动细胞死亡途径。溶酶体将其内容物释放到胞质溶胶中，不加区分地对细胞组分进行降解。另外，大量溶酶体分解可诱导胞质酸化，继而诱导细胞凋亡，利用溶酶体破裂释放多种水解酶，促使病灶细胞自发性凋亡坏死是一种机具前景的策略。
提高药物疗效是有效治疗癌症的关键一步。众所周知，化疗药物的耐药性随着病患的长期使用而日趋严峻。如何提高药物的治疗效果仍然困扰着广大学者。近年来，随着交叉学科的发展，大量非特异性抗癌制剂如纳米制剂被广泛研究。基于纳米制剂优异的理化特性，如光热性能、光动力性能、类酶活性以及声动力性能等，多种治疗模式包括光热治疗(PTT)、光动力治疗(PDT)、化学动力疗法(CDT)以及声动力疗法(SDT)被广泛研究报导。其中SDT由于其安全性高、组织穿透度深等优点备受瞩目。
声动力治疗通过声能引起机械压力迅速增大，促进组织流体中产生微泡并崩解从而诱导病灶组织细胞损伤达到治疗的目的。除此之外，声化学效应对病灶组织细胞杀伤也起着重要作用。在空化的过程中，微泡的破裂会产生高温高压，形成极大的剪切力和冲击波，从而引起声化学反应，产生活性氧(ROS)(自由基和单线态氧)，ROS可以引起膜脂过氧化而使细胞对剪切波和超声损伤更为敏感。一旦自由基大量积累，就会引起线粒体膜电位减少、细胞骨架收缩、染色质浓缩、膜破损以及DNA断裂，引起细胞凋亡的发生。
传统声敏剂大多数来源光敏剂它们通常是由卟啉及其衍生物组成的有机分子，如原卟啉IX、血卟啉单甲基乙醚等，但是这些有机声敏剂化学性质不稳定，易产生光毒副作用，靶向性差，另外，这些声敏剂通常不溶于水，在血液循环中极易被清除，靶向性差，有效利用率低，严重影响SDT的治疗效果限制其临床应用。与传统的有机声敏剂相比，纳米声敏剂具有以下优势：提高有机声敏剂性能的能力；延长材料在血液中的循环时间，实现其在肿瘤部位的富集；通过增强的渗透和保留效应或活性靶向配体修饰来提高治疗效果。根据我们之前的研究，我们设计合成的基于含卟啉锌中心的单分散中孔碳纳米球 (PMCS)[1]由于其类卟啉大环化合物、高比表面积和多孔结构，使其与超声结合具有高 SDT效率，产生杀伤细胞的ROS，是一种新型的可有效治疗肿瘤的声敏剂。
如今，随着声动力在肿瘤治疗方面的发展，利用天然生物膜包覆声敏剂在主动靶向以及高效递送等多方面方面展现了巨大的潜力。脂膜包被的声敏剂，在超声的介导下发生破膜行为从而促进声敏剂的原位释放，发挥声动力治疗潜力进而提高疗效的策略。然而，就目前所报导制备的膜被纳米药物方法，并没有最大限度地开发膜结构在治疗中的作用。在膜提取的过程中对膜结构以及功能的破坏无法有效避免。如何有效地将膜结构包覆于纳米制剂表面而尽可能避免对膜结构及功能造成的损伤，仍然是一大挑战。
传统的脂膜包被方法包括：物理挤压法、微流体电穿孔和微孔膜挤压法等。所涉及到的生物膜系统包括红细胞膜、癌细胞膜、巨噬细胞膜、单核细胞膜、中性粒细胞膜、白细胞膜、血小板膜以及细菌膜。这些被动包覆方法包载效率低，易对膜结构以及生物活性蛋白造成损伤及损耗。溶酶体作为巨噬细胞中承担分解外来以及胞内物质的囊泡结构细胞器，能够主动内化纳米制剂。此外，巨噬细胞吞噬能力强，溶酶体数量多，溶酶体酶活性大，还可以利用脂多糖刺激溶酶体活化内吞。这样基于巨噬细胞驱动的主动内化制备的膜被纳米制剂不仅能够保留溶酶体内大量蛋白，而且能够保证纳米颗粒的内吞效率。该种制备方法有望为生物膜仿生体系提供一种新的制备思路，促进纳米仿生诊疗体系的发展。
基于溶酶体自身对病灶细胞的促凋亡特性，我们构建一种巨噬细胞溶酶体酶-声动力疗法联合治疗平台。这里我们利用巨噬细胞通过三个步骤合成溶酶体膜包覆的纳米颗粒，保留了溶酶体内酶活性，同时使纳米颗粒内化于溶酶体内。第一步：合成声敏剂纳米颗粒PMCS；第二步：利用脂多糖刺激活化巨噬细胞，促进巨噬细胞溶酶体酶表达。第三步：将声敏剂PMCS与巨噬细胞共孵育，使PMCS内化于巨噬细胞溶酶体中，最后利用溶酶体提取试剂盒提取巨噬细胞中含有PMCS的溶酶体。通过简单制备得到天然生物酶-声敏剂体系。
发明内容：
本发明的溶酶体包覆纳米颗粒的制备方法是利用巨噬细胞吞噬能力，通过脂多糖刺激溶酶体内化并激活溶酶体内酶活性，将纳米颗粒与巨噬细胞共孵育，最终提取出溶酶体。该溶酶体内含有活性溶酶体酶以及功能性纳米颗粒，纳米颗粒为具有声动力性能的PMCS。该方法与传统脂膜包被纳米颗粒的制备方法相比，一方面制备方法简单，无需考虑压力或电击对膜本身造成的损伤。另一方面，以巨噬细胞为驱动力，所制备出的溶酶体膜包覆纳米颗粒保存了溶酶体内水解酶的活性。
本发明中的溶酶体膜结构内部包含具有生动力的纳米颗粒以及溶酶体酶，尺寸均一，包载效率高。借助纳米颗粒的声动力特性，在超声波的刺激下产生机械波辅助破膜释放活性酶诱导病灶细胞启动凋亡程序，从而联合声动力治疗肿瘤。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种活性溶酶体膜包覆的纳米颗粒，所述的纳米颗粒包括溶酶体膜、溶酶体酶以及功能性纳米颗粒；所述的溶酶体来自于巨噬细胞；所述的纳米颗粒为预先制备的具有声动力性能的PMCS纳米颗粒分布于所提取溶酶体内部。
1.一种溶酶体包覆纳米颗粒的制备方法，其特征在于，利用巨噬细胞驱动溶酶体内化特性，将制备好的功能性纳米颗粒以终浓度为5～1000μg/mL的浓度与终浓度为0.5～80万个巨噬细胞每毫升浓度的巨噬细胞共孵育处理，通过巨噬细胞的吞噬能力，将纳米颗粒内化于溶酶体内，利用溶酶体提取试剂盒提取溶酶体，最终得到具有溶酶体膜包覆的纳米颗粒。
2.所述的溶巨噬细胞没有经过脂多糖刺激活化或经过脂多糖刺激活化，刺激活化时间0.5～12h，脂多糖浓度为1～100μg/mL。
3.进一步，所述的纳米颗粒以及脂多糖溶剂为细胞培养液或磷酸缓冲盐溶液。
4.进一步，溶酶体膜包覆纳米颗粒结构中包含溶酶体酶以及功能性纳米颗粒。
5.进一步，所述的纳米颗粒尺寸为5～500nm的纳米颗粒。
6.进一步，溶酶体提取方法根据市售溶酶体提取试剂盒说明书进行，试剂盒型号为BB-3603。
7.进一步，巨噬细胞接种于细胞培养孔板中，待细胞贴壁后与纳米颗粒共孵育。
本发明中巨噬细胞溶酶体尺寸为0.025～0.8μm，PMCS粒径为50～400nm。电位采用动态光散射进行测定。形貌及尺寸采用透射电镜TEM进行测定。
本发明中溶酶体膜包覆的纳米颗粒，其中PMCS浓度选择5～1000μg/mL。溶酶体与PMCS共同孵育12、18、24、36h，内化量达到最大时间点为24h，从经1～100μg/mL 脂多糖活化0.5～12h后的巨噬细胞中提取的溶酶体膜包覆纳米颗粒相比于未经脂多糖活化的纳米颗粒，具有更高的抑瘤效果。
溶酶体包覆纳米颗粒PMCS制备过程，包括如下步骤：
(1)将巨噬细胞在含有体积分数为10％胎牛血清的培养基中培养，在细胞培养板中以0.5～80万个细胞/mL的浓度每孔接种0.1～5mL的细胞悬液。将培养板在37℃培养箱预培养，细胞自动贴壁，然后将旧培养基去除，以终浓度为1～100μg/mL的脂多糖加入0.1～5mL刺激活化巨噬细胞0.5～12h。然后，向培养板中加入5-1000μg/mL分散在培养基中的PMCS纳米颗粒0.1～2mL并于培养箱中继续孵育。而后离心收集巨噬细胞，并用PBS离心洗涤。
(2)取步骤(1)1×105～1×108个巨噬细胞，离心，去掉上清，收集细胞；用预冷 PBS洗涤两次，去除上清液。最后利用溶酶体提取试剂盒提取内化PMCS的溶酶体。
本发明合成的溶酶体膜包覆的纳米颗粒PMCS形貌均一，内部含有多种活性水解酶，同时含有声敏剂。在超声作用下，PMCS发挥声动力性能，通过产生活性氧ROS以及通过空化作用等致使溶酶体外膜破裂，从而释放内部多种水解酶，对实体肿瘤产生抑制效果。本发明制备得到的溶酶体膜包覆纳米颗粒，合成方法简单，经济节约，可重复性高。溶酶体酶-声动力结合用于肿瘤治疗，在体内外实验中均证明具有极好的效果。该制备方法有效地提供了一种新型脂膜包覆纳米颗粒的方法，有效地保留天然生物膜的完整性以及生物活性，能够最大限度地实现其在肿瘤治疗领域的实际应用价值。
附图说明：
图1是本发明中所制备PMCS纳米颗粒透射电镜图。
图2是本发明中涉及巨噬细胞溶酶体透射电镜图。
图3是巨噬细胞吞噬PMCS纳米颗粒并内化于溶酶体的生物透射电子显微镜图。
图4是溶酶体膜包覆PMCS纳米颗粒电镜图。
图5是PMCS，溶酶体以及溶酶体膜包覆PMCS纳米颗粒的电位。
图6是不同浓度PMCS纳米颗粒与巨噬细胞孵育不同时的细胞毒性。
图7是不同孵育时间溶酶体内化PMCS量检测。
图8是溶酶体膜包覆PMCS纳米颗粒破膜检测。
图9是溶酶体膜包覆PMCS纳米颗粒不同条件下溶酶体内酶活性检测。
图10是体内抑瘤实验。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
<测试方法>
1、粒径的测试
溶酶体膜包覆纳米颗粒的形貌，粒径以及电位采用日本电子JEM-1011场发射透射电子显微镜(TEM)以及动态光散射(DLS)测定。
2、细胞毒性测定
纳米颗粒PMCS对于巨噬细胞的毒性通过细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8试剂盒)检测。
3、溶酶体内化PMCS量
巨噬细胞吞噬PMCS在溶酶体中内化量达到最大时间点通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测裂解后的溶酶体悬液中含有的Zn元素含量确定。
4、溶酶体膜包覆纳米颗粒的超声破膜
溶酶体膜包覆纳米颗粒超声破膜实验通过DLS检测超声前后溶液中颗粒尺寸变化。
实施例1
纳米颗粒PMCS透射电镜图1所示，PMCS纳米颗粒尺寸为140nm。溶酶体透射电镜图如图2所示，溶酶体尺寸为450nm。
实例2
巨噬细胞吞噬PMCS纳米颗粒并内化于溶酶体的观察。首先将巨噬细胞以40万个细胞每孔的浓度接种于6孔板中，培养箱孵育。用50μg/mL分散于DMEM中的PMCS纳米颗粒替换6孔板中的旧培养基培养。用PBS缓冲液洗涤细胞，并离心收集细胞。PBS洗两次。将沉淀固定在体积分数为2.5％戊二醛和4％多聚甲醛的PBS溶液中。生物透射电镜图如图4所示，提取的溶酶体膜包覆纳米颗粒PMCS外部为单层膜结构类囊泡颗粒，颗粒粒径为450nm，内部含有PMCS纳米颗粒。此外PMCS，溶酶体以及溶酶体膜包覆纳米颗粒PMCS三者电位如图5所示。分别为：-5.6mV，-24.7mV，-23.2mV。
实施例3
(1)将巨噬细胞在含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM中培养，在96孔板中配置100μL的细胞悬液，以5000个细胞每孔铺板。将培养板在培养箱预培养。待细胞贴壁，以终浓度为10μg/mL的脂多糖100μL刺激活化巨噬细胞1h。然后去掉培养液。
(2)向培养板加入100μL不同浓度(6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL)的纳米颗粒PMCS。
(3)继续孵育24h，向每孔加入100μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育 1.5h，用酶标仪测定吸光度，处理数据。如图6所示，当PMCS浓度大于50μg/mL，孵育时间为24h，巨噬细胞活性低于60％，在保证巨噬细胞活性的前提下，使巨噬细胞尽可能多的内吞PMCS，这里推荐使用PMCS浓度为50μg/mL。
实施例4
定量不同内化时间提取的溶酶体膜包覆纳米颗粒中PMCS的浓度，用50μg/mL PMCS纳米颗粒分别孵育细胞12、18、24、36h后，使用体积分数为1％Triton100裂解液裂解提取含有PMCS纳米颗粒的溶酶体，用1mL王水消解24h后，离心去除杂质取上清稀释定容，采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测Zn元素的浓度含量。如图7所示，随着时间增长，Zn元素的浓度增大，当PMCS与巨噬细胞共孵育24h后，溶酶体内化量达到最大，随后减小。最终，推荐使用的纳米颗粒与巨噬细胞共孵育时间为24h，该条件下能保证纳米颗粒最大效率地内化于溶酶体。
实施例5
通过DLS检测在超声前后溶酶体膜包覆纳米颗粒的粒径变化，如图8所示，在超声前，溶酶体膜包覆纳米颗粒的水合粒径分布在600nm。而超声之后，水合粒径主要分布在170nm。这说明超声前的溶酶体膜纳米颗粒外膜完整，而在超声作用后，PMCS纳米颗粒发挥声动力特性，使得溶酶体膜破裂，纳米颗粒PMCS被释放出来，同时证明溶酶体酶能够从破裂的膜结构中释放出来，为后续肿瘤治疗提供可能性。
实例6
溶酶体酶活性检测
(1)提取不同材料里的溶酶体酶溶液，并进行适当稀释，材料分别为：超声或不加超声条件(1.0MHz，1.5W/cm2)下的单独提取的溶酶体、经脂多糖活化巨噬细胞后提取的溶酶体、未经脂多糖活化巨噬细胞后提取的溶酶体膜包覆纳米颗粒、经脂多糖活化巨噬细胞后提取的溶酶体膜包覆纳米颗粒。如图9所示，经脂多糖活化后的溶酶体在超声作用下溶酶体酶仍然保留较高的酶活性，此外，在PMCS的介导下，超声后的溶酶体酶释放量远高于单独溶酶体。因此，活性溶酶体膜包覆声动力纳米颗粒，能够促进溶酶体酶的释放。
实施例7
以CT26荷瘤小鼠为模型评估溶酶体膜包覆纳米颗粒的体内溶酶体酶-声动力治疗效果。SPF BALB/c雌性小鼠(5周)皮下注射1×106个CT26细胞将实验小鼠随机分为五组，分别为：PBS-US组、PMCS组、PMCS-US组、溶酶体组、溶酶体-US组、溶酶体膜包覆PMCS组、溶酶体膜包覆PMCS-US组。从第7天开始，每隔3天测量一次体重和肿瘤大小。分别在第7、10和13天经尾静脉给药。肿瘤体积由：体积＝宽2×长度/2的方程确定。抑瘤效率按：肿瘤抑制率(％)＝(1-V/V0)×100(其中V0和V为对照组及其他各组肿瘤体积)计算。如图10所示，与对照组PBS-US相比，PMCS-US组、溶酶体-US 组、溶酶体膜包覆PMCS-US组均体现出明显地抑制肿瘤效果。
[1]Wang S,Shang L,Li L,et al.Metal–Organic–Framework–DerivedMesoporous Carbon Nanospheres Containing Porphyrin–Like Metal Centers forConformal Phototherapy. Advanced Materials,28,8379-8387(2016).

Claims (7)

1.一种溶酶体包覆纳米颗粒的制备方法，其特征在于，利用巨噬细胞驱动溶酶体内化特性，将制备好的功能性纳米颗粒以终浓度为5～1000μg/mL的浓度与终浓度为0.5～80万个巨噬细胞每毫升浓度的巨噬细胞共孵育处理，通过巨噬细胞的吞噬能力，将纳米颗粒内化于溶酶体内，利用溶酶体提取试剂盒提取溶酶体，最终得到具有溶酶体膜包覆的纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的具有溶酶体膜包覆的纳米颗粒，其特征在于，所述的溶巨噬细胞没有经过脂多糖刺激活化或经过脂多糖刺激活化，刺激活化时间0.5～12h，脂多糖浓度为1～100μg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纳米颗粒以及脂多糖溶剂为细胞培养液或磷酸缓冲盐溶液。
4.根据权利要求1所述的具有溶酶体膜包覆的纳米颗粒，其特征在于，溶酶体膜包覆纳米颗粒结构中包含溶酶体酶以及功能性纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的具有溶酶体膜包覆的纳米颗粒，其特征在于，所述的纳米颗粒尺寸为5～500nm的纳米颗粒。
6.根据权利要求1所述的方法中，其特征在于，溶酶体提取方法根据市售溶酶体提取试剂盒说明书进行，试剂盒型号为BB-3603。
7.根据权利要求1所述的方法中，其特征在于，巨噬细胞接种于细胞培养孔板中，待细胞贴壁后与纳米颗粒共孵育。
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