CN109821030A - 一种基于utmd的双载药纳米平台及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于UTMD的双载药纳米平台及其制备方法和应用，包括：利用一步水热法合成碳点y‑CDs；在氨基末端的树状大分子上连接抗癌药物TPGS得到G5‑TPGS；将G5‑TPGS与y‑CDs通过非共价作用结合形成纳米杂化材料G5‑TPGS@y‑CDs；负载抗癌药物阿霉素DOX得到(G5‑TPGS@y‑CDs)‑DOX，再结合UTMD技术。本发明简单，易于操作分离，成本低廉，原料来源商品化，具有良好的发展前景。
Description
技术领域
本发明属于功能性杂化纳米材料技术领域，特别涉及一种基于UTMD技术增强的树状大分子/碳点双载药纳米平台及其制备方法和应用。
背景技术
荧光成像作为光学成像中的一种，具有较高的时间/空间分辨率、较高的软组织对比度、成像对比度及与生物分子相关、获得信息丰富且适合多参数复合测量、价格低廉等优点，可用于肿瘤的诊断。碳点(carbon dots，CDs)作为一种新型的生物成像量子点，可以用于荧光成像。由于其具有低毒性、生物相容性好、水溶性好、稳定性高、高度荧光可调性等优异特性，因此在荧光成像方面具有很好的应用前景(Wang W,et al.,Sci.ChinaChem.2014,57(4):522-539)。已有文献报道通过天冬氨酸和葡萄糖合成靶向碳点用于体内脑胶质瘤的精准荧光成像(Zheng,M.,et al.,ACS Nano 2015,9,11455-11461.)。
化疗作为癌症的治疗方式之一，虽然能够有效地减少患者的复发率和死亡率，但是化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时，对正常细胞同样有明显的毒性和高度侵袭性，同时会使肿瘤细胞产生多药耐药性(Multidrug Resistance，MDR)，最终导致化疗的失败(Yun U-J,et al.,Biochem.Pharmacol 2013,85,1441-1453)。MDR是肿瘤细胞表面的药物转运蛋白过量表达而引起，例如P-糖蛋白，这是一种在癌细胞表面过度表达的细胞膜转运蛋白，依赖于腺苷三磷酸(ATP)水解的能量，能够将抗癌药物排出细胞外，从而使肿瘤细胞产生耐药性(Baumert C,et al.,Bioorg.Med.Chem.2013,21,166-177)。在近年来的研究中，越来越多的人选择将药物外排抑制剂与化疗药物结合来克服肿瘤MDR。其中，D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作为维生素E的衍生物，能够抑制P-gp ATP酶的功能，还可以破坏线粒体膜电位，降低细胞中ATP水平，从而克服肿瘤的MDR，增加药物在癌细胞内的积累(Xie J,et al.,ACS Appl.Mater.Interfaces 2017,9,14281-14291)。已有文献报道证明TPGS可以与药物传递载体结合从而抑制P-gp的活性并克服MDR(Cheng W,et al.,Small 2017,13,1700623)。
树状大分子(dendrimer)由于具有精确的核、可修饰的表面官能团和内部空腔，因此作为纳米载体倍受青睐。树状大分子表面可修饰不同的分子实现功能化，还可以在其内部包裹金属纳米颗粒或药物，实现诊断或治疗。目前已有文献报道第五代树状大分子修饰alpha-tos可以有效抑制肿瘤的生长(Jingyi Zhu.,et al.,Colloids Surf.,B 2015,133,36-42)。同时，树状大分子负载碳点也可以用于荧光成像(Matai,I.,et al.,ACSAppl.Mater.Interfaces 2015,7,11423-11435)。通过功能化树状大分子形成的杂化纳米材料不仅表现出树状大分子的特性，同时也表现出修饰的功能性分子特有的性质，在诊疗一体化纳米材料方面有着广泛的用途。
虽然这些载体在生物纳米医学领域的应用范围很广，但是这些载体在增强递送方面的研究仍然相当有限。超声靶向微泡破坏(ultrasound-targeted microbubbledestruction,UTMD)技术是通过在特定部位发射不同声强的超声波，使微泡在超声的作用下破裂，导致血管通透性增加，从而使外源物质通过血管内皮屏障到达特定部位(Jin L-F.,et al.,Int.J.Mol.Sci.2013,14,9737-9750)。目前，已有文献报道UTMD技术能够促进药物的递送，增强药物在局部组织的释放，发挥靶向作用，从而增强治疗效果(Lin L.,etal.,Theranostics 2018,8,1923-1939)。
目前，并没有检索到国内外关于树状大分子结合碳点并负载抗癌药物并结合UTMD技术的文献和专利。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于UTMD技术增强的树状大分子/碳点双载药纳米平台及其制备方法和应用，填补了将碳点与P-糖蛋白抑制剂TPGS连接到树状大分子上并负载药物，同时结合UTMD技术实现树状大分子/碳点双载药纳米平台的构建并实现诊疗一体化的空白。
本发明的一种基于UTMD技术增强的树状大分子/碳点双载药纳米平台，通过碳点y-CDs和功能化树状大分子G5-TPGS反应，并进一步负载盐酸阿霉素DOX·HCl，形成(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米杂化材料，再结合UTMD技术。
本发明还提供了上述基于UTMD技术增强的树状大分子/碳点双载药纳米平台的制备方法，包括：
(1)将4-氨基水杨酸溶解于超纯水中形成悬浊液，水热反应，自然冷却至室温，离心、过滤、冷冻干燥，得到碳点y-CDs；其中4-氨基水杨酸与超纯水的用量比为0.1-0.4g:10mL；
(2)在聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯TPGS溶液中加入N,N'-羰基二咪唑CDI溶液，搅拌反应，然后逐滴加入至第五代聚酰胺-胺树状大分子G5-NH2溶液中，继续搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5-TPGS；其中CDI与TPGS的摩尔比为19-25:1，TPGS与G5-NH2的摩尔比为18-21:1；
(3)向步骤(1)制得的y-CDs溶液中加入步骤(2)制得的G5-TPGS溶液，搅拌反应，离心，冷冻干燥，得到G5-TPGS@y-CDs；其中G5-TPGS与y-CDs的质量比为3-3.2:1；
(4)将DOX·HCl溶于溶剂中，加入三乙胺，逐滴加入到步骤(3)制得的G5-TPGS@y-CDs水溶液中，避光搅拌，离心，冷冻干燥，得到负载阿霉素的药物缓释体系(G5-TPGS@y-CDs)-DOX；其中DOX·HCl与G5-TPGS@y-CDs的质量比为1-1.2:1，三乙胺与溶剂的体积比为1:30-80。
所述步骤(1)中水热反应的工艺参数为：反应温度为170-190℃，反应时间为2-4h。
所述步骤(1)中过滤采用孔径为220nm的微孔滤膜。
所述步骤(2)中TPGS溶液、G5-NH2溶液和CDI溶液的溶剂均为DMSO。
所述步骤(2)中TPGS溶液的浓度为2-5mg/mL；G5-NH2溶液的浓度为1-3mg/mL；浓度为2-4mg/mL。
所述步骤(2)中G5-NH2的分子量为26010g/mol；CDI的分子量为162.15g/mol；TPGS的分子量为1513g/mol。
所述步骤(2)中搅拌反应的工艺参数为：搅拌时间为4-6h，搅拌温度为室温。
所述步骤(2)中继续搅拌反应的时间为2-4天。
所述步骤(2)中透析用截留分子量为5000的纤维素透析膜在超纯水(2L/次，3次/天)中透析3天。
所述步骤(3)中y-CDs溶液和G5-TPGS溶液的溶剂均为超纯水。
所述步骤(3)中y-CDs溶液的浓度为1-4mg/mL；G5-TPGS溶液的浓度为1-4mg/mL。
所述步骤(3)中搅拌反应的工艺参数为：搅拌时间为12-24h，搅拌温度为室温。
所述步骤(4)中溶剂为甲醇。
所述步骤(4)中G5-TPGS@y-CDs水溶液的浓度为1-3mg/mL。
所述步骤(4)中DOX·HCl的分子量为579.99g/mol。
所述步骤(4)中避光搅拌时间为8-12h。
本发明还进一步提供了上述基于UTMD技术增强的树状大分子/碳点双载药纳米平台在制备肿瘤诊疗一体化药物中的应用，具体包括：
(1)利用杂化纳米材料(G5-TPGS@y-CDs)-DOX用于体外耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的荧光成像；
(2)利用杂化纳米材料(G5-TPGS@y-CDs)-DOX用于体外正常乳腺癌细胞MCF-7和耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的逆转MDR的治疗效果，以及结合UTMD后得到化疗增强的效果。
(3)利用杂化纳米材料(G5-TPGS@y-CDs)-DOX结合UTMD技术用于MCF-7/ADR荷瘤鼠模型的体内抗肿瘤研究。
本发明利用一步水热法合成能发射黄绿色荧光的碳点y-CDs；在氨基末端的树状大分子上连接抗癌药物TPGS得到复合物G5-TPGS；将G5-TPGS与y-CDs通过非共价作用结合形成纳米杂化材料G5-TPGS@y-CDs；用纳米杂化材料G5-TPGS@y-CDs负载抗癌药物阿霉素DOX得到(G5-TPGS@y-CDs)-DOX。
本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、Zeta电势、稳态/瞬态荧光光谱等手段表征制备的杂化纳米材料((G5-TPGS@y-CDs)-DOX)。然后利用CCK-8法评价杂化纳米材料((G5-TPGS@y-CDs)-DOX)及相关对比材料的细胞毒性，并对比结合UTMD技术前后的荧光强度。分析并对比连接TPGS的相关材料对细胞内ATP含量变化的影响，同时测定其体外细胞荧光成像性能。最后通过裸鼠体内UTMD增强的化疗实验，考察所制备的杂化纳米材料(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的增强化疗效果。
有益效果
(1)本发明简单，易于操作分离，成本低廉，原料来源商品化，具有良好的发展前景；
(2)本发明利用P-糖蛋白抑制剂(TPGS)增强了肿瘤的抑制效果，在治疗领域具有潜在的应用价值；
(3)本发明制得的双载药纳米平台具有良好的水溶性和生物相容性，结合UTMD技术之后，对肿瘤细胞有明显的抑制效果的同时，可以降低细胞内ATP的水平，阻碍药物泵出，抑制癌细胞MDR。在动物体内，可以增强材料的递送效果，使其在肿瘤部位富集，在克服MDR的同时，更加有效地抑制肿瘤的生长。
附图说明
图1为本发明中纳米杂化材料(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的合成及应用示意图；
图2为实施例1中y-CDs的紫外吸收光谱图和荧光激发光谱图(a)，y-CDs在不同激发波长下的荧光发射光谱图(b)，y-CDs的荧光寿命光谱图(c)，以及4-氨基水杨酸(1)和y-CDs(2)的红外光谱图(d)；
图3为实施例1中y-CDs的TEM图像和粒径分布直方图；
图4为实施例1中G5-TPGS的核磁共振氢谱图；
图5为实施例1制备的G5-TPGS、y-CDs和G5-TPGS@y-CDs的紫外吸收光谱图(a)，以及G5-TPGS、y-CDs和G5-TPGS@y-CDs的荧光发射光谱图(b)；
图6为实施例1制备的G5-TPGS@y-CDs、(G5-TPGS@y-CDs)-DOX和DOX·HCl的紫外吸收光谱图(a)，以及y-CDs、G5-TPGS@y-CDs和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的荧光发射光谱图(b)；
图7为实施例3中体外不同pH条件下DOX从(G5-TPGS@y-CDs)-DOX中的累积释放曲线；
图8为实施例4中经DOX·HCl、y-CDs和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX处理6小时后的MCF-7/ADR细胞荧光显微镜成像图，其中材料DOX浓度为5μg/mL；
图9为实施例5中经y-CDs处理24小时后的MCF-7和MCF-7/ADR细胞活力柱状分析图(a)和经G5-TPGS@y-CDs处理24小时后的MCF-7和MCF-7/ADR细胞活力柱状分析图(b)；
图10为实施例5中经DOX·HCl、(G5-mPEG@y-CDs)-DOX、(G5-TPGS@y-CDs)-DOX和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD处理24小时后的MCF-7(a)和MCF-7/ADR(b)细胞活力柱状分析图；
图11为实施例6中经不同DOX浓度下(G5-mPEG@y-CDs)-DOX，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD处理6小时后的MCF-7/ADR细胞的荧光强度与DOX的浓度之间的柱状图(a)和DOX浓度为5μg/mL时的荧光变化直方图(b)；
图12为实施例7中经(G5-mPEG@y-CDs)-DOX和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX处理6小时、12小时后和24小时后的MCF-7/ADR细胞ATP水平柱状分析图，其中DOX浓度为5μg/mL；
图13为实施例8中经不同浓度的(G5-mPEG@y-CDs)-DOX和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX处理6小时后的MCF-7/ADR细胞内JC-1红/绿荧光的比值柱状图；
图14为实施例10中通过尾静脉注射生理盐水(对照组)、DOX·HCl的生理盐水溶液(5mg/kg，100μL)、(G5-mPEG@y-CDs)-DOX的生理盐水溶液(5mg/kg，100μL)、(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的生理盐水溶液(5mg/kg，100μL)和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD的生理盐水溶液(5mg/kg，100μL)后，经20天治疗后小鼠的相对肿瘤体积(a)、体重(b)和存活率(c)的曲线图；
图15为实施例11中治疗结束之后，通过超声造影(contrast enhanceultrasound，CEUS)来评价治疗之后肿瘤的形态的变化图(a)和灌注情况图(b)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明实施例中采用的材料和仪器：
实施例1
(1)将0.2g的4-氨基水杨酸铵溶解于10mL的超纯水中，然后将混合液转移至聚四氟乙烯反应釜中加热反应，反应温度为180℃，反应时间为3小时，反应体系自然冷却至室温，离心20分钟(4000rpm)去除过度碳化的颗粒，然后通过孔径为220nm的微孔滤膜过滤，最后冷冻干燥得到黄色碳点y-CDs。
(2)在TPGS溶液中(17.73mg，6mL DMSO)加入CDI溶液(43.7mg，15mL DMSO)，室温搅拌6小时，然后向溶液中逐滴加入G5(15.24mg，7mL DMSO)溶液，搅拌反应3天，然后使用截留分子量MWCO为5000的透析袋对水溶液透析(2L/次，3次/天)，冷冻干燥，即得到G5-TPGS。
(3)将y-CDs溶液(4.54mg，4mL)加入到G5-TPGS溶液(13.62mg，7mL)中，室温搅拌24小时，离心，冷冻干燥，得到碳点修饰的树状大分子复合物G5-TPGS@y-CDs。
(4)将G5-TPGS@y-CDs(5.40mg)溶于4mL超纯水中，将盐酸阿霉素DOX·HCl(5.94mg)溶于600μL甲醇溶液中，加入10μL三乙胺中和，然后逐滴加入到G5-TPGS@y-CDs水溶液中，避光敞口搅拌过夜，8000rpm离心20分钟，取上清液冷冻干燥，得到药物缓释体系(G5-TPGS@y-CDs)-DOX。
实施例2
取实施例1中制备的y-CDs溶于超纯水中，测定y-CDs水溶液的紫外-可见光光谱图和荧光激发光谱图如图2a所示，可以观察到y-CDs在282nm处存在特征峰，同时y-CDs的最大激发波长位于490nm处。y-CDs在不同激发波长下的发射光谱如图2b所示，可以观察到y-CDs的最大发射波长为547nm，且发射波长不会随着激发波长的改变而变化。y-CDs的荧光寿命光谱图如图2c所示，可知在激发波长为490nm，发射波长为536nm的条件下，y-CDs的荧光寿命为2.31ns。通过傅里叶变换(FTIR)光谱研究y-CDs的表面官能团，红外光谱图如图2d所示，曲线1代表4-氨基水杨酸，曲线2代表y-CDs，曲线2中3359cm-1和3294cm-1处的峰对应羟基的伸缩振动，与4-氨基水杨酸的振动类似。在1596cm-1和1467cm-1处的峰对应羧基的伸缩振动。
y-CDs的TEM图片和粒径分布直方图如图3所示，可以观察到y-CDs呈均匀的圆形，其尺寸为7.66±2.66nm。
通过使用核磁共振氢谱测试，对制备的G5-TPGS进行表征，结果如图4所示，可知2.0-3.6ppm是树状大分子G5.NH2的亚甲基质子峰，0.7ppm是TPGS的甲基质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个G5-RGD分子上链接了13.4个TPGS分子(其投料摩尔比为G5:TPGS＝1:20)。
实施例1中制备的G5-TPGS、y-CDs和G5-TPGS@y-CDs的紫外-可见光光谱图如图5a所示，可以发现G5-TPGS和y-CDs分别在290nm处和282nm处显示出TPGS的特征峰和y-CDs的特征峰。与此同时，G5-TPGS@y-CDs复合物在280nm-290nm显示出特征峰，而G5-TPGS@y-CDs在230nm处也出现一个小的肩峰，这个特征峰也出现在y-CDs的曲线中，说明G5-TPGS@y-CDs的成功制备。G5-TPGS、y-CDs和G5-TPGS@y-CDs的荧光光谱图如图5b所示，可知G5-TPGS复合物并没有荧光，当其结合y-CDs形成G5-TPGS@y-CDs后，在550nm处出现了明显的特征峰，也说明了G5-TPGS@y-CDs的成功制备。
实施例1中制备的(G5-TPGS@y-CDs)-DOX紫外-可见光谱图如图6a所示，可以观察到(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米杂化材料在490nm、290nm和230nm处显示出三个UV-vis特征峰，与480nm处DOX·HCl的吸收峰相比，表明DOX的成功负载。插图显示G5-TPGS@y-CDs的水溶液呈浅黄色，而(G5-TPGS@y-CDs)-DOX复合物呈红棕色，证实了DOX成功负载到G5-TPGS@y-CDs上。荧光光谱图如图6b所示，可知负载DOX之后，与G5-TPGS@y-CDs和游离的y-CDs相比，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的荧光强度有一定的减弱，但并没有被完全淬灭，荧光仍然较强。DOX的上载效率为40.68％，上载量为17.39％。Zeta电势测定结果(参见表1)表明：碳点电势为-25.63mV左右，连接G5-TPGS后，电势上升到-5.72mV，负载DOX之后，电势继续上升到6.65mV，这样的电势不会对细胞产生明显损伤。
表1实施例1制备的y-CDs、G5-TPGS、G5-TPGS@y-CDs、DOX·HCl和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的表面电势
| 样品 | 表面电势(mV) |
| y-CDs | -25.63±1.95 |
| G5-TPGS | 15.24±0.52 |
| G5-TPGS@y-CDs | -5.72±0.65 |
| DOX·HCl | 7.93±0.57 |
| (G5-TPGS@y-CDs)-DOX | 6.65±1.09 |
实施例3
将实施例1制备的(G5-TPGS@y-CDs)-DOX分别用pH＝7.4和pH＝5.5的缓冲液溶解配制浓度为1mg/mL的溶液，取1mL放入透析袋中固定，置于含有9mL不同pH的缓冲液的容器中，放在37℃摇床中振荡。在不同的时间点取样。每次取透析袋外液体1mL，测量其在480nm处吸光度值，再向透析袋外加入对应的缓冲溶液1mL。用此方法得到体外不同pH条件下DOX从(G5-TPGS@y-CDs)-DOX中释放的动力学曲线，如图7所示，在72小时中，DOX在弱酸性环境中(pH＝5.5)的释放量为52.11％，比在生理环境(pH＝7.4)中释放的36.85％要大。说明这种载药体系具有一定的pH响应性，在肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度比正常组织释放速度快，一定程度上减少了DOX对正常组织的毒性，提高对肿瘤细胞恶性增殖的抑制效果。
实施例4
收集对数生长期MCF-7/ADR细胞，按照每孔5×104个细胞的密度种在24孔板上，置于5％CO2，37℃条件培养过夜。倒掉原培养基，然后加入含有DOX·HCl、y-CDs和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的培养液(最终材料中DOX的浓度为5μg/mL)或PBS(对照组)共培养6小时。之后倒掉培养液，先用PBS洗3次，然后用戊二醛固定，再用PBS溶液洗3次。并用DAPI染色5分钟，结束后用PBS清洗三次，然后用荧光显微镜观察实验结果，如图8所示，可知，经y-CDs和DOX·HCl处理后的细胞分别显示出黄绿色和红色的荧光信号。用(G5-TPGS@y-CDs)-DOX复合物处理后的细胞既可以显示出黄绿色，又可以显示出红色的荧光信号，并且通过共定位，明场中显示出橙色的荧光。说明本发明制备的(G5-TPGS@y-CDs)-DOX能够被细胞吞噬并有效实现荧光成像。
实施例5
收集对数生长期MCF-7和MCF-7/ADR细胞，按照每孔1×104个细胞的密度分别种植于96孔板中，置于5％CO2，37℃条件培养过夜。倒掉原培养基，分别加入含不同材料G5-TPGS@y-CDs、y-CDs、(G5-TPGS@y-CDs)-DOX,(G5-mPEG@y-CDs)-DOX、DOX·HCl和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD的培养液。对于(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组，将孔板里的细胞用胰酶消化处理，离心，去上清，加入含有20％(v/v)SonoVue和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的新鲜培养基之后，置于声空化装置，进行超声辐照(0.4W/cm2，1MHz，1kHz PRF，30s)，处理完之后置于5％CO2和37℃条件下继续培养。DOX的浓度分别为0.125、0.25、1、5、10、15和25μg/mL。孵育24小时后，倒掉培养液，用PBS洗3遍，加入100μL含有10％的CCK-8的培养液，继续孵育3小时。之后用酶标仪上检测各孔在λ＝450nm处的吸光值，并据此计算相应的细胞活力，其中以PBS处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100％。经y-CDs处理24小时后的MCF-7和MCF-7/ADR细胞活力柱状分析结果，如图9a所示，可知即使y-CDs浓度高达1.0mg/mL，也不会影响MCF-7和MCF-7/ADR细胞的活力，这表明y-CDs具有良好的细胞相容性。经G5-TPGS@y-CDs处理24小时后的MCF-7和MCF-7/ADR细胞活力柱状分析结果，如图9b所示，可知随着G5-TPGS@y-CDs浓度的升高，材料对MCF-7和MCF-7/ADR细胞均显示出一定程度的抑制作用。当G5-TPGS@y-CDs浓度为489.1μg/mL时，MCF-7细胞的存活率降到48％，MCF-7/ADR细胞的存活率降为51％，这说明G5-TPGS@y-CDs对细胞具有一定的抑制作用，原因是由于TPGS的活性成分α-TOS作为一种小分子药物，对细胞具有一定的毒性。
经DOX·HCl、(G5-mPEG@y-CDs)-DOX、(G5-TPGS@y-CDs)-DOX和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD处理24小时后的MCF-7细胞活力柱状分析结果，如图10a所示，随着DOX浓度的增加，(G5-mPEG@y-CDs)-DOX对MCF-7细胞的毒性明显增加，但即使DOX在最高浓度25μg/mL的条件下，对MCF-7细胞的抑制作用也非常有限。相比之下，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米杂化材料对MCF-7细胞的抑制作用远远高于(G5-mPEG@y-CDs)-DOX。结合UTMD技术之后，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米杂化材料对MCF-7细胞的抑制作用接近于DOX·HCl。
经DOX·HCl、(G5-mPEG@y-CDs)-DOX、(G5-TPGS@y-CDs)-DOX和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD处理24小时后的MCF-7/ADR细胞活力柱状分析结果，如图10a所示，DOX·HCl和(G5-mPEG@y-CDs)-DOX对MCF-7/ADR细胞虽然也有一定的抑制作用，但是由于耐药性的原因，抑制作用非常有限。相比之下，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米杂化材料对MCF-7/ADR细胞的抑制作用非常明显，当DOX浓度为25μg/mL时，细胞存活率为28％。结合UTMD技术之后，细胞存活率下降到17％，这说明UTMD技术对(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米杂化材料抗肿瘤增殖的作用中起到促进的作用。另一方面，材料的增强性治疗效果主要归因于TPGS克服癌细胞MDR的能力和TPGS的内在治疗效果。具体地说，TPGS作为P-gp抑制剂，可以抑制P-gp ATP酶的活性，导致细胞内DOX的积累，从而诱导细胞凋亡。
实施例6
收集对数生长期MCF-7/ADR细胞，按照每孔2×105个细胞的密度种植于12孔板中，置于5％CO2，37℃条件培养过夜。倒掉原培养基，加入含有不同浓度的(G5-TPGS@y-CDs)-DOX、(G5-mPEG@y-CDs)-DOX、DOX·HCl和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD的新鲜培养液。对于(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组，将孔板里的细胞用胰酶消化处理，离心，去上清，加入含有20％(v/v)SonoVue和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX的新鲜培养基之后，置于声空化装置，进行超声照射(0.4W/cm2，1MHz，1kHz PRF，30s)，处理完之后置于5％CO2和37℃条件下继续培养(DOX的浓度分别为1、5和10μg/mL)。共培养6小时后，倒掉培养液，经PBS洗3次，用胰酶将细胞消化下来，转移到5ml离心管中，1000rpm离心5分钟去除上清液，加PBS 1ml吹匀，放入冰盒，用流式细胞仪对经(G5-TPGS@y-CDs)-DOX、(G5-mPEG@y-CDs)-DOX、DOX·HCl和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD处理过的MCF-7/ADR细胞的进行荧光检测。经不同DOX浓度下(G5-mPEG@y-CDs)-DOX，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD处理6小时后的MCF-7/ADR细胞的荧光强度与DOX的浓度之间的柱状图如图11a所示：在相同浓度下，经过材料(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD处理的MCF-7/ADR细胞比经过材料(G5-TPGS@y-CDs)-DOX和(G5-mPEG@y-CDs)-DOX处理的MCF-7/ADR细胞表现出更高的荧光信号，并伴随着浓度依赖性，从而证实，UTMD技术可以增加纳米材料的递送效果。DOX浓度为5μg/mL时的荧光变化直方图，如图11b所示，曲线1代表PBS，曲线2代表(G5-mPEG@y-CDs)-DOX组，曲线3代表(G5-TPGS@y-CDs)-DOX组，曲线4代表(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组，从图中可以发现荧光变化趋势与图11a结果一致。
实施例7
收集对数生长期MCF-7/ADR细胞，按照每孔5×104个细胞的密度种在24孔板上，置于5％CO2，37℃条件培养过夜。然后加入DOX浓度为5μg/mL的(G5-TPGS@y-CDs)-DOX、(G5-mPEG@y-CDs)-DOX的新鲜培养液或PBS(对照组)孵育6、12和24小时。之后倒掉培养液，先用PBS洗3次，然后加入裂解液裂解细胞，离心取上清液。然后在96黑色孔板中加入100μL ATP检测工作液，放置3-5分钟后在孔中加入20μL样品，混匀后用多功能酶标仪测定RLU值。根据图12可以发现，在孵育6小时、12小时和24小时之后，用(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米杂化材料处理后细胞的ATP水平比经(G5-mPEG@y-CDs)-DOX纳米杂化材料处理后细胞的ATP水平低。在24小时后，经过(G5-TPGS@y-CDs)-DOX和(G5-mPEG@y-CDs)-DOX处理后的细胞中ATP水平分别为36.6％和67.2％(p<0.001)。这证明了在TPGS的帮助下，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米杂化材料可以更有效地降低细胞内ATP的水平，从而更好地抑制细胞膜上P-gp的功能。
实施例8
收集对数生长期MCF-7/ADR细胞，按照每孔5×104个细胞的密度种在24孔板上，置于5％CO2，37℃条件培养过夜。然后加入含有不同浓度的(G5-TPGS@y-CDs)-DOX、(G5-mPEG@y-CDs)-DOX的新鲜培养液孵育24小时(DOX的浓度分别为1、5和10μg/mL)。之后倒掉培养液，用PBS洗3次，然后加入胰酶消化细胞2分钟，加入新鲜培养基终止消化，之后倒掉培养液，用PBS洗3次。在37℃下用JC-1染料染色20分钟，然后离心3分钟(2000rpm)，弃上清，用JC-1缓冲液重悬细胞2次，用流式细胞仪对MCF-7/ADR细胞的进行红色/绿色荧光强度检测。JC-1是一种荧光探针，可以通过荧光颜色的变化来检测线粒体膜电位的变化。当细胞内线粒体膜电位较高时，JC-1会在线粒体基质中聚集，从而发出红色荧光。相反，当线粒体膜电位较低时，JC-1无法在线粒体基质中聚集，从而发出绿色荧光。因此，我们通过JC-1的红/绿荧光强度比来检测到细胞内线粒体膜电位的下降。根据图13可以发现，在相同的DOX浓度下，经过(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米材料处理后细胞中红/绿荧光比例比经(G5-mPEG@y-CDs)-DOX纳米材料处理后细胞的红/绿荧光比例低，这说明细胞经过(G5-TPGS@y-CDs)-DOX材料处理后，有更多的红色荧光向绿色荧光转变，线粒体膜电位降低，证明了TPGS可以诱导线粒体功能障碍。
实施例9
按照4×106细胞/鼠的剂量将MCF-7/ADR细胞接种到裸鼠右后腿，2周之后，肿瘤体积达到10-20mm3时，将裸鼠随机分为5组，每组6只。具体分组如下：对照组(Saline，100μL)、DOX·HCl(5mg/kg，100μL)、(G5-mPEG@y-CDs)-DOX(5mg/kg，100μL)、(G5-TPGS@y-CDs)-DOX(5mg/kg，100μL)和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD(5mg/kg，100μL)。对于(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组，先通过静脉注射(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD溶液，再静脉注射20％(v/v)SonoVue悬液，同时涂抹1cm左右厚度的耦合剂在肿瘤表面，将3.5cm的超声探头置于肿瘤上方进行超声辐照(1MHz，0.4W/cm2，2分钟)。根据之前的研究基础，肿瘤经皮肤超声暴露2分钟可以达到更好的治疗效果，因此本实验动物体内照射时间为2分钟。此时记作实验开始的第0天，每2天记录一次裸鼠的体重和肿瘤的体积，每2天静脉注射一次药物，注射5次，同时每天测量存活率。绘制肿瘤生长曲线，体重变化曲线和生存率曲线。肿瘤体积以及相对肿瘤体积用下面的公式(1)和(2)分别计算。
肿瘤体积(V)＝a×b2/2 (1)
a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
相对肿瘤体积＝V/V0 (2)
V和V0分别代表给药后的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
从图14a可以看出，在治疗20天后，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX组和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组的裸鼠相对肿瘤体积明显比其他三组要小，说明材料(G5-TPGS@y-CDs)-DOX具有良好的治疗效果。与此同时，与(G5-TPGS@y-CDs)-DOX组相比，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组中裸鼠肿瘤体积更小，这证明了UTMD可以进一步促进抗肿瘤的效果。从图14c的存活率曲线可以观察到，在对照组存活率为零后，各组的存活率排序如下：(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组＞(G5-TPGS@y-CDs)-DOX组＞(G5-mPEG@y-CDs)-DOX组＞DOX·HCl组＞Saline组。(G5-TPGS@y-CDs)-DOX组和(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组处理后裸鼠的存活率比其他三组大。同时，在同样的处理时间下，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组的存活率也高于(G5-TPGS@y-CDs)-DOX组。以上这些结果都表明，纳米杂化材料(G5-TPGS@y-CDs)-DOX对耐药肿瘤有很好的抑制作用，而UTMD进一步增强了治疗效果，延长了裸鼠的存活时间。
实施例10
在治疗结束之后，通过超声造影(contrast enhance ultrasound，CEUS)来评价治疗之后肿瘤的灌注情况和形态的变化。从每组小鼠中随机选择3只通过眼眶静脉注射SonoVue(1.18mg/mL，每只小鼠0.1mL)悬液，使用探头进行超声造影，造影的记录时间为2分钟，从而评价治疗后肿瘤组织结构微循环血流灌注情况。经过20天不同材料治疗后的肿瘤超声图像如图15a所示，可以直观的发现，(G5-TPGS@y-CDs)-DOX组和G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组治疗后的裸鼠肿瘤体积远远小于其他三组。同时，与(G5-TPGS@y-CDs)-DOX组相比，G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组裸鼠肿瘤的体积更小，表明结合UTMD后具有更好的治疗效果。另外，治疗后肿瘤的血流灌注情况也是评价治疗效果的一项指标，通过超声造影图像可以实时观察治疗后肿瘤内微小血管的灌注。一定程度的增加血流灌注可以增强药物的渗透性和化疗效果。各组治疗后肿瘤的血管分布以及肿瘤内血流灌注变化结果如图15b所示，可以发现在(G5-TPGS@y-CDs)-DOX组和G5-TPGS@y-CDs)-DOX+UTMD组中都观察到丰富的瘤内血液灌注，表明其具有良好的预后。
对比例1
对照组(G5-mPEG@y-CDs)-DOX的制备方法包括：
在mPEG-COOH溶液(32.62mg，10mLDMSO)中加入EDC溶液(29.70mg，8mLDMSO)，室温搅拌30分钟，然后加入NHS溶液(17.83mg，5mL DMSO)继续搅拌3小时，得到混合溶液；将混合溶液逐滴加入G5溶液中(20.15mg，10mL DMSO)中，搅拌反应时间为3天，然后使用截留分子量MWCO为5000的透析袋对水溶液透析(2L/次，3次/天)，冷冻干燥，即得到G5-mPEG。将y-CDs溶液(5.85mg，3mL)加入到G5-mPEG溶液(17.58mg，6mL)中，室温搅拌24小时，离心，冷冻干燥，得到碳点修饰的树状大分子纳米复合物G5-mPEG@y-CDs。将G5-mPEG@y-CDs(4.21mg)溶于4mL超纯水中，将盐酸阿霉素DOX·HCl(4.31mg)溶于600μL甲醇溶液中，加入10μL三乙胺中和，然后逐滴加入到G5-mPEG@y-CDs水溶液中，避光敞口搅拌过夜，8000rpm离心20分钟，取上清液冷冻干燥，得到药物缓释体系(G5-mPEG@y-CDs)-DOX。其表征方法同实施例1材料。
Claims (10)
1.一种基于UTMD技术增强的树状大分子/碳点双载药纳米平台，其特征在于：通过碳点y-CDs和功能化树状大分子G5-TPGS反应，并进一步负载盐酸阿霉素DOX·HCl，形成(G5-TPGS@y-CDs)-DOX纳米杂化材料，再结合UTMD技术。
2.一种如权利要求1所述的基于UTMD技术增强的树状大分子/碳点双载药纳米平台的制备方法，包括：
(1)将4-氨基水杨酸溶解于超纯水中形成悬浊液，水热反应，自然冷却至室温，离心、过滤、冷冻干燥，得到碳点y-CDs；其中4-氨基水杨酸与超纯水的用量比为0.1-0.4g:10mL；
(2)在聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯TPGS溶液中加入N,N'-羰基二咪唑CDI溶液，搅拌反应，然后逐滴加入至第五代聚酰胺-胺树状大分子G5-NH2溶液中，继续搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到G5-TPGS；其中CDI与TPGS的摩尔比为19-25:1，TPGS与G5-NH2的摩尔比为18-21:1；
(3)向步骤(1)制得的y-CDs溶液中加入步骤(2)制得的G5-TPGS溶液，搅拌反应，离心，冷冻干燥，得到G5-TPGS@y-CDs；其中G5-TPGS与y-CDs的质量比为3-3.2:1；
(4)将DOX·HCl溶于溶剂中，加入三乙胺，逐滴加入到步骤(3)制得的G5-TPGS@y-CDs水溶液中，避光搅拌，离心，冷冻干燥，得到负载阿霉素的药物缓释体系(G5-TPGS@y-CDs)-DOX；其中DOX·HCl与G5-TPGS@y-CDs的质量比为1-1.2:1，三乙胺与溶剂的体积比为1:30-80。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中水热反应的工艺参数为：反应温度为170-190℃，反应时间为2-4h；过滤采用孔径为220nm的微孔滤膜。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中TPGS溶液、G5-NH2溶液和CDI溶液的溶剂均为DMSO；TPGS溶液的浓度为2-5mg/mL；G5-NH2溶液的浓度为1-3mg/mL；CDI溶液的浓度为2-4mg/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中搅拌反应的工艺参数为：搅拌时间为4-6h，搅拌温度为室温；继续搅拌反应的时间为2-4天。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中y-CDs溶液和G5-TPGS溶液的溶剂均为超纯水；y-CDs溶液的浓度为1-4mg/mL；G5-TPGS溶液的浓度为1-4mg/mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中搅拌反应的工艺参数为：搅拌时间为12-24h，搅拌温度为室温。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中溶剂为甲醇；G5-TPGS@y-CDs水溶液的浓度为1-3mg/mL。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中避光搅拌时间为8-12h。
10.权利要求1所述的基于UTMD技术增强的树状大分子/碳点双载药纳米平台在制备肿瘤诊疗一体化药物中的应用。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110354282A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-10-22 | 东华大学 | 一种负载二氧化锰和阿霉素的纳米水凝胶及其制备和应用 |
| CN112121061A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-25 | 重庆医科大学 | 一种多功能中空铈纳米颗粒及中空铈纳米复合物载药体系的构建和应用 |
| CN112294776A (zh) * | 2020-09-24 | 2021-02-02 | 东华大学 | 一种包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇及其制备和应用 |
| CN114196028A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-18 | 浙江工业大学 | Pamam-tpgs及其制备方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106398693A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 山西大学 | 一种氮掺杂黄色荧光碳点的制备方法及应用 |
| CN108743962A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-06 | 东华大学 | 一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法 |
-
2019
- 2019-02-26 CN CN201910141429.5A patent/CN109821030A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106398693A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 山西大学 | 一种氮掺杂黄色荧光碳点的制备方法及应用 |
| CN108743962A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-06 | 东华大学 | 一种基于荧光碳点修饰的树状大分子的双载药靶向纳米平台的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DAN LI ET AL: ""Ultrasound-enhanced fluorescence imaging and chemotherapy of multidrugresistant tumors using multifunctional dendrimer/carbon dot nanohybrids"", 《BIOACTIVE MATERIALS》 * |
| ISHITA MATAI ET AL: ""Self-Assembled Hybrids of Fluorescent Carbon Dots and PAMAM Dendrimers for Epirubicin Delivery and Intracellular Imaging"", 《ACS APPL. MATER. INTERFACES》 * |
| LIZHOU LIN ET AL: ""UTMD-Promoted Co-Delivery of Gemcitabine and miR-21 Inhibitor by Dendrimer-Entrapped Gold Nanoparticles for Pancreatic Cancer Therapy"", 《THERANOSTICS》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110354282A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-10-22 | 东华大学 | 一种负载二氧化锰和阿霉素的纳米水凝胶及其制备和应用 |
| CN110354282B (zh) * | 2019-08-23 | 2021-11-09 | 东华大学 | 一种负载二氧化锰和阿霉素的纳米水凝胶及其制备和应用 |
| CN112121061A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-25 | 重庆医科大学 | 一种多功能中空铈纳米颗粒及中空铈纳米复合物载药体系的构建和应用 |
| CN112294776A (zh) * | 2020-09-24 | 2021-02-02 | 东华大学 | 一种包覆细胞膜的还原响应型碳点载药纳米团簇及其制备和应用 |
| CN114196028A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-03-18 | 浙江工业大学 | Pamam-tpgs及其制备方法与应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190531 |
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