CN113648415A - 一种用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒及其制备方法，属于载药颗粒制备技术领域。本发明的有机金属纳米载药颗粒，由金属锌纳米骨架、缺氧激活前药、声敏剂和同源肿瘤细胞膜构成，其中缺氧激活前药是替拉扎明，声敏剂是二氢卟吩e6。本发明利用包裹同源肿瘤细胞膜的特点，靶向运送纳米载药系统到达肿瘤部位。有机金属纳米骨架在肿瘤部位纳米骨架酸响应性裂解，释放出其装载的药物。超声二氢卟吩e6释放活性氧后，杀死肿瘤细胞。同时，加剧了肿瘤环境的缺氧，进一步诱导替拉扎明杀死肿瘤细胞，从而实现对肿瘤的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及载药颗粒制备技术领域，尤其涉及一种用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒及其制备方法。
背景技术
全世界每年诊断出超过一百万例新的胃癌病例，胃癌已成为全球第五大最常见的癌症。胃癌的死亡率很高，被诊断时通常已经是晚期，因此，胃癌已成为全球死亡率排名第四的癌症。胃癌的治疗方案包括手术，新辅助化疗，放疗，放化疗，免疫治疗和分子靶向治疗等。尽管如此，其5年的总生存率仍然很低，在世界上大多数国家中，这一比例约为20％。因此，探索一种新的靶向治疗胃癌的策略对胃癌的治疗具有重大意义。
有机金属锌纳米骨架(ZIF-8)具有高比表面积，可调节的孔隙率，具有化学稳定性和热稳定性等优点，被广泛应用于癌症治疗的研究。并且它具有pH响应结构，在酸性环境中易于降解。因此可根据其对酸性肿瘤微环境pH值的响应，用作装载药物和靶向药物释放的纳米框架。
二氢卟吩e6(Ce6)是一种低副作用的有机声敏剂，可以很好地积聚在肿瘤中，也可以更快地从生物体中清除。它能被超声波激活释放活性氧(ROS)，抑制肿瘤细胞的生长。然而，Ce6具有疏水性。并且在长期的血液循环中，它也可以更快地被清除和降解。因此使其更难以完全发挥作用。
由于实体瘤内部属于低氧环境，低氧可以抑制抗肿瘤药物的作用，减弱抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用。替拉扎明(TPZ)是一种缺氧激活的药物，在缺氧状态下，TPZ可以还原为可诱导细胞DNA断裂的有毒自由基，杀死肿瘤细胞。
然而，如何准确、高效的将Ce6/TPZ靶向运送到肿瘤部位，是我们目前迫切需要解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒，利用包裹同源肿瘤细胞膜的特点，靶向运送纳米载药系统到达肿瘤部位，纳米骨架酸响应性裂解，释放出其装载的药物杀死肿瘤细胞，从而实现对肿瘤的治疗作用。
本发明的目的是提供一种用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒，由金属锌纳米骨架(ZIF-8)、缺氧激活前药、声敏剂和同源肿瘤细胞膜构成，其中：
所述缺氧激活前药是替拉扎明；
所述声敏剂是二氢卟吩e6。
本发明的另一目的是提供一种用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将六水合硝酸锌溶于甲醇得到六水合硝酸锌甲醇溶液；
(2)将1,2-二甲基咪唑溶于甲醇得到1,2-二甲基咪唑甲醇溶液；
(3)将步骤(2)制备的1,2-二甲基咪唑甲醇溶液加入到步骤(1)制备的六水合硝酸锌甲醇溶液中，在30℃温度下，以转速150rpm/min搅拌2～5min，搅拌均匀得到金属锌纳米骨架；
(4)在步骤(3)制备的金属锌纳米骨架中加入缺氧激活前药甲醇溶液和声敏剂甲醇溶液，再继续搅拌3～10min后，室温下静置3～4h得到沉淀，离心，洗涤，获得沉淀，得到金属锌纳米骨架/缺氧激活前药/声敏剂混合物(ZTC)；
(5)取步骤(4)制备的金属锌纳米骨架/缺氧激活前药/声敏剂混合物与同源肿瘤细胞膜分别溶于纯水，然后按体积比1：1混合均匀，震荡1-4h，以12000r/min的转速离心10～15min获得沉淀，得到所述有机金属纳米载药颗粒(ZTC@M)。
优选的，步骤(1)所述六水合硝酸锌甲醇溶液中，六水合硝酸锌与甲醇的质量体积比为0.1～0.5g：40～50mL。
优选的，步骤(2)所述1,2-二甲基咪唑甲醇溶液中，1,2-二甲基咪唑与甲醇的体积质量比为0.1～0.2g：40～50mL。
优选的，步骤(3)所述1,2-二甲基咪唑甲醇溶液与六水合硝酸锌甲醇溶液的体积比为1：1。
优选的，步骤(4)所述离心过程的转速为12000rpm/min，时间为10～12min，温度为22℃。
优选的，步骤(4)所述洗涤为用甲醇和二甲基亚砜分别洗涤2次。
优选的，步骤(4)所述缺氧激活前药溶液中，缺氧激活前药与溶剂甲醇的质量体积比为8～10mg：1～1.5mL。
优选的，步骤(4)所述声敏剂溶液中，声敏剂与甲醇的质量体积比为1～2mg：200～250μL。
优选的，步骤(5)中所述金属锌纳米骨架/缺氧激活前药/声敏剂混合物溶于纯水的浓度为1.5～2.5mg/mL，同源肿瘤细胞膜溶于纯水的浓度为3.5～4.5mg/mL，其体积配比为1：1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用包裹同源肿瘤细胞膜的特点，靶向运送纳米载药系统到达肿瘤部位。利用ZIF-8有机金属纳米骨架pH敏感性的特点，在肿瘤部位纳米骨架酸响应性裂解，释放出其装载的药物。超声刺激Ce6释放ROS后，杀死肿瘤细胞。同时，加剧了肿瘤环境的缺氧，进一步诱导TPZ杀死肿瘤细胞，从而实现对肿瘤的治疗作用。本系统已经在小鼠上试验成功，进一步可探讨该系统抗肿瘤作用的机制，从而可以为在人体抗肿瘤临床实验奠定基础，提供一种临床抗肿瘤的新方案，尤其是实体肿瘤。
附图说明
图1为发明实施制备的ZTC@M有机金属纳米载药颗粒的TEM表征图；
图2为在不同酸性和中性pH下，有机金属纳米载药颗粒体外靶向性验证的共聚焦显微镜图；
图3为在不同酸性和中性pH下，有机金属纳米载药颗粒体外靶向性验证的红色荧光强度比率柱状图；
图4为超声刺激下体外细胞释放ROS验证结果的显微镜图；
图5为超声刺激下体外细胞释放ROS验证结果的绿色荧光强度柱状图；
图6为ROS释放后加重体外细胞缺氧的验证结果的显微镜图；
图7为ROS释放后加重体外细胞缺氧的验证结果的绿色荧光强度比率柱状图；
图8为有机金属纳米载药颗粒杀伤肿瘤细胞的体外验证结果的显微镜图；
图9为有机金属纳米载药颗粒杀伤肿瘤细胞的体外验证结果的红色荧光强度百分比柱状图；
图10为用有机金属纳米载药颗粒治疗后，肿瘤组织切片用H&E染色后的显微镜观察结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒，由金属锌纳米骨架、缺氧激活前药替拉扎明、声敏剂二氢卟吩e6和同源肿瘤细胞膜构成，其中：
该有机金属纳米载药颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.3g六水合硝酸锌溶于40mL甲醇得到六水合硝酸锌甲醇溶液；
(2)将0.17g 1,2-二甲基咪唑溶于40mL甲醇得到1,2-二甲基咪唑甲醇溶液；
(3)将步骤(2)制备的1,2-二甲基咪唑甲醇溶液加入到步骤(1)制备的六水合硝酸锌甲醇溶液中，在30℃温度下，在磁力搅拌器以转速150rpm/min搅拌2min，搅拌均匀得到金属锌纳米骨架；
(4)取缺氧激活前药替拉扎明(tirapazamine，TPZ)8mg溶于1mL甲醇中，配成替拉扎明溶液；取声敏剂二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)1mg溶于200μL甲醇中，配成二氢卟吩e6溶液；然后将替拉扎明溶液和二氢卟吩e6溶液加入步骤(3)制备的金属锌纳米骨架中，再继续搅拌5min后，室温下静置4h得到沉淀，在22℃的温度下以12000rpm/min的转速离心10min，用甲醇和二甲基亚砜分别洗涤2次，获得沉淀，根据Zn2+与药物之间相互作用，得到金属锌纳米骨架/替拉扎明/二氢卟吩e6混合物(Zn2+/TPZ/Ce6，ZTC)；
(5)取步骤(4)制备的ZTC加入到纯水中，配成浓度为2mg/mL的混合物溶液，取同源肿瘤细胞膜，加入到纯水中，配成浓度为4mg/mL的细胞膜溶液，按体积比1：1混合均匀，震荡2h，以12000r/min的转速离心15min获得沉淀，得到所述有机金属纳米载药颗粒(Zn2+/TPZ/Ce6+cytomembrane，ZTC@M)。
对实施例1制备的ZTC@M进行TEM表征，如图1，从图中可以看出，该ZTC@M的形貌为多边形，粒径在200nm左右。
有机金属纳米载药颗粒体外靶向性研究
将胃癌AGS细胞(1×105/孔)接种在共聚焦培养皿中并孵育过夜。向共聚焦培养皿加入含ZTC@M纳米颗粒(TPZ 12μg/mL和Ce6 2μg/mL)的培养基，终浓度为20μg/mL，将其分别在pH＝7.4(中性)和pH＝5.5(酸性)条件下培养4小时。然后将细胞用PBS洗涤三次，用DAPI染色10min，并使用激光共聚焦显微镜观察细胞摄取情况。并且，Ce6自带红色荧光，可以在共聚焦显微镜下根据它的荧光强度来判定摄入纳米颗粒的量。
共聚焦显微镜观察细胞摄入情况结果如图2所示，红色荧光强度比率柱状图如图3所示。从图2和图3可以看出，相较于中性pH环境，酸性环境下细胞红色荧光强度明显高于中性环境细胞内红色荧光强度(P<0.05)，说明在酸性环境下细胞对纳米颗粒的摄入更多。同时，在包裹细胞膜后，细胞内红色荧光强度明显强于没有包裹细胞膜的(P<0.0001)。这个结果说明，包裹了同源肿瘤细胞膜后，增加了肿瘤细胞对纳米载药颗粒的摄入，增加了纳米载药颗粒的靶向性。
注：CON组：未经任何处理的AGS细胞；ZTC组：用金属锌纳米骨架/替拉扎明/二氢卟吩e6混合物(ZTC)处理AGS细胞；ZTC@M组：用包裹了细胞膜的金属锌纳米骨架/替拉扎明/二氢卟吩e6混合物(ZTC@M)处理AGS细胞。Ce6：共聚焦显微镜下观察到的Ce6自带的红色荧光。DAPI：共聚焦显微镜下观察到细胞核染色试剂DAPI将细胞核染为蓝色的荧光。Merge：将Ce6自带的红色荧光与细胞核的蓝色荧光合并形成的图片。
超声刺激下体外细胞释放ROS验证
使用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)来检测活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)水平，绿色荧光越强表示产生的ROS越多。将AGS细胞接种在6孔板中并孵育24小时。将含有ZTC@M的培养基添加到六孔板中，并在黑暗中孵育4小时，其中一组用超声照射3min(1.0MHz，1.5W/cm2)。然后除去培养基，并用PBS洗涤三次。然后将细胞与DCFH-DA一起孵育30min。最后使用使用荧光显微镜观察ROS生成情况，其显微镜图如图4所示，绿色荧光强度柱状图如图5所示。绿色荧光越强表示产生的ROS越多。从图4和图5可以看出，在CON、ZTC、ZTC@M组绿色荧光没有或者很少，说明ROS很少。在ZTC@M+US组，绿色荧光明显增多，说明用超声照射后，ce6被激发，释放ROS。表明在超声刺激后，细胞内绿色荧光明显增加，说明纳米载药颗粒在超声刺激下释放了ROS。
注：CON组：观察未经任何处理的AGS细胞产ROS情况；ZTC组：观察用ZTC处理AGS细胞后细胞内ROS水平；ZTC@M组：观察用ZTC@M处理AGS细胞后细胞内ROS水平。ZTC@M+US组：观察用ZTC@M+超声处理AGS细胞后细胞内ROS水平。
ROS释放后加重体外细胞缺氧的验证
Image-iTTM绿色低氧试剂用于检测细胞缺氧水平，绿色荧光越强说明缺氧程度越高。将AGS细胞接种在共聚焦培养皿中并孵育24小时。将细胞与不同的纳米颗粒孵育4小时并用US(1.0MHz，1.5W/cm2，3min)照射后，将细胞用PBS洗涤三次。然后，将Image-iTTM绿色低氧试剂原液(5μM)添加到细胞中，然后孵育30分钟。然后将细胞用DAPI染色10分钟，并使用激光共聚焦显微镜观察细胞荧光情况，显微结果结果如图6所示，绿色荧光强度比率柱状图如图7所示。
图6和图7展示了不同处理组细胞内缺氧情况，Hypoxia为绿色荧光，是缺氧探针在共聚焦显微镜下观察到的荧光，DAPI为细胞核的蓝色荧光，Merge为将绿色荧光与蓝色荧光合并后的图片。绿色荧光强度越高表明缺氧情况越严重。
从图6和图7可以看出，CON组绿色荧光最弱，ZTC组、ZTC@M组次之，ZTC@M+US组绿色荧光最强，说明经过超声刺激后，细胞内氧气被进一步消耗，加重了细胞内的缺氧，从而能够激活TPZ，进一步杀死肿瘤细胞。
注：CON组：观察未经任何处理的AGS细胞内缺氧情况；ZTC组：观察用ZTC处理AGS细胞后细胞内缺氧情况；ZTC@M组：观察用ZTC@M处理AGS细胞后细胞内缺氧情况。ZTC@M+US组：观察用ZTC@M+超声处理AGS细胞后细胞内缺氧情况。Hypoxia：缺氧探针的绿色荧光；DAPI：共聚焦显微镜下观察到细胞核染色试剂DAPI将细胞核染为蓝色的荧光；Merge：将绿色荧光及蓝色荧光合并后的图片。
有机金属纳米载药颗粒杀伤肿瘤细胞的细胞验证
使用钙黄绿素/PI活/死活力/细胞毒性测定试剂盒分析纳米载药颗粒对肿瘤细胞的杀伤情况。将AGS细胞(1×105细胞/孔)接种到12孔板中，孵育24小时。用PBS洗涤细胞三次后，分别将含有ZTC和ZTC@M的培养基添加到细胞中，终浓度为20μg/mL。其中一个ZTC@M组用超声(1.0MHz，1.5W/cm2，3min)照射。将细胞培养4小时后，将1mL检测缓冲液与1μL钙黄绿素和1μLPI一起添加到细胞中，孵育30分钟后荧光显微镜下观察AGS细胞的荧光。死细胞被染成红色，带红色荧光；活细胞被染成绿色，带绿色荧光，计算红色荧光强度所占百分比，统计不同处理组细胞存活情况。
其显微结果如图8所示，红色荧光强度百分比柱状图如图9所示，从图8和图9可以看出，红色荧光强度从强到弱依次为：ZTC@M+超声组、ZTC@M组及ZTC组，差异有统计学意义(P<0.05)。CON组主要都是绿色荧光，红色荧光很弱，ZTC组、ZTC@M组绿色荧光强度次之，有少许红色荧光，说明纳米材料对肿瘤细胞有杀伤作用。ZTC@M+US组绿色荧光很少，红色荧光强度明显比前面3组高，说明死细胞明显增多，证明超声刺激后纳米药物对肿瘤细胞的杀伤作用明显增强，并且在超声刺激释放ROS后，纳米载药颗粒对肿瘤细胞的杀伤作用进一步增强。
注：CON组：观察不经任何处理的AGS细胞存活情况；ZTC组：观察用ZTC处理AGS细胞后细胞存活情况；ZTC@M组：观察用ZTC@M处理AGS细胞后细胞存活情况。ZTC@M+US组：观察用ZTC@M+超声处理AGS细胞后细胞存活情况。
对有机金属纳米载药颗粒治疗抗肿瘤作用的研究
将AGS细胞注射到裸鼠右前腋皮下，建立移植瘤模型。当肿瘤长到80–100mm3时，将荷瘤裸鼠随机分为4组，每组5只，每3天通过尾静脉将含有不同纳米颗粒(200μL，10mg/kgCe6和40mg/kg TPZ)的PBS注入小鼠，共3次。注射6小时后使用超声(1.5W/cm2，3分钟)照射第(4)组裸鼠肿瘤。观察小鼠20天后处死所有裸鼠，并收集肿瘤组织，然后进行H&E染色。
用实施例1制备的纳米载药颗粒治疗后，肿瘤组织切片用H&E染色后的显微镜观察结果如图10。
图10中：(1)CON组：裸鼠尾静脉注射PBS；(2)ZTC组：裸鼠尾静脉注射溶于PBS的ZTC；(3)ZTC@M组：裸鼠尾静脉注射溶于PBS的ZTC@M；(4)ZTC@M+US组：裸鼠尾静脉注射溶于PBS的ZTC@M，然后对肿瘤进行超声处理。
图10结果表明纳米材料对小鼠肿瘤的治疗作用。治疗后，CON组及ZTC组未观察到明显的坏死组织，ZTC@M组及ZTC@M+US观察到坏死组织，说明纳米材料对小鼠肿瘤具有治疗作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒，其特征在于，由金属锌纳米骨架、缺氧激活前药、声敏剂和同源肿瘤细胞膜构成，其中：
所述缺氧激活前药是替拉扎明；
所述声敏剂是二氢卟吩e6。
2.根据权利要求1所述的用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将六水合硝酸锌溶于甲醇得到六水合硝酸锌甲醇溶液；
(2)将1,2-二甲基咪唑溶于甲醇得到1,2-二甲基咪唑甲醇溶液；
(3)将步骤(2)制备的1,2-二甲基咪唑甲醇溶液加入到步骤(1)制备的六水合硝酸锌甲醇溶液中，在30℃温度下，以转速150rpm/min搅拌2～5min，搅拌均匀得到金属锌纳米骨架；
(4)在步骤(3)制备的金属锌纳米骨架中加入缺氧激活前药甲醇溶液和声敏剂甲醇溶液，再继续搅拌3～10min后，室温下静置3～4h得到沉淀，离心，洗涤，获得沉淀，得到金属锌纳米骨架/缺氧激活前药/声敏剂混合物；
(5)取步骤(4)制备的金属锌纳米骨架/缺氧激活前药/声敏剂混合物与同源肿瘤细胞膜分别溶于纯水，然后按体积比1：1混合均匀，震荡1-4h，以12000r/min的转速离心10～15min获得沉淀，得到所述有机金属纳米载药颗粒。
3.根据权利要求2所述的用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述六水合硝酸锌甲醇溶液中，六水合硝酸锌与甲醇的质量体积比为0.1～0.5g：40～50mL。
4.根据权利要求2所述的用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述1,2-二甲基咪唑甲醇溶液中，1,2-二甲基咪唑与甲醇的体积质量比为0.1～0.2g：40～50mL。
5.根据权利要求2所述的用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述1,2-二甲基咪唑甲醇溶液与六水合硝酸锌甲醇溶液的体积比为1:1。
6.根据权利要求2所述的用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述离心过程的转速为12000rpm/min，时间为10～12min，温度为22℃。
7.根据权利要求2所述的用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述洗涤为用甲醇和二甲基亚砜分别洗涤2次。
8.根据权利要求2所述的用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述缺氧激活前药溶液中，缺氧激活前药与溶剂甲醇的质量体积比为8～10mg：1～1.5mL。
9.根据权利要求2所述的用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述声敏剂溶液中，声敏剂与甲醇的质量体积比为1～2mg：200～250μL。
10.根据权利要求2所述的用于靶向治疗肿瘤的有机金属纳米载药颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述金属锌纳米骨架/缺氧激活前药/声敏剂混合物溶于纯水，浓度为1.5～2.5mg/mL，同源肿瘤细胞膜溶于纯水，浓度为3.5～4.5mg/mL，其体积配比为1:1。
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