CN116077658B - 一种卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卟啉‑磷腈‑沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。首先分别将2‑甲基咪唑和ZnAc溶解在甲醇中，然后将两种溶液搅拌混合得到纳米尺度的沸石咪唑酯骨架材料；将对羟基苯甲醛溶解在丙酸和DMSO的混合溶剂中，加入丙酸溶解的新鲜蒸馏吡咯，反应得到四羟基苯基卟啉；将六氯环三磷腈、沸石咪唑酯骨架材料和四羟基苯基卟啉溶于甲醇中，滴加三乙胺，得到卟啉‑磷腈‑沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒。本发明制备的产物可减少因光穿透纳米材料造成的损失，在肿瘤部位有效富集，提高光疗效果；吸收激光的能量并转化为热能和活性氧，从而实现光热治疗和光动力治疗的联合肿瘤治疗。

Description

一种卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒及其制备 方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

被动靶向制剂是指利用特定组织、器官的生理结构特点，使药物在体内能够产生自然的分布差异，从而实现靶向效应。其中最广为人知的是EPR效应，其基于实体肿瘤与正常组织中微血管结构的不同：正常微血管内皮间隙致密、结构完整，大分子及大尺寸颗粒不易透过血管壁；而实体瘤组织中的新生血管较多且血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失。这种差异造成直径在100nm上下的大分子类药物或颗粒物质更易于聚集在肿瘤组织内部，从而实现靶向效果；除此之外，利用肿瘤部位特殊的pH、酶环境，以及细胞内的还原环境等，也可以实现药物在特定部位的释放，达到靶向给药的目的。

近红外光疗治疗剂是指利用在近红外光区具有较高光热转换效率及可将氧气转变为单线态氧的试剂，将其通过血管注射入生物内部，利用靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近，并在近红外光的照射下将光能转化为热能及生成细胞毒性活性氧来杀死癌细胞的一种治疗试剂。但是目前的光疗治疗剂的靶向性差、近红外区吸收能力差、光能利用率低、单一的激发波长无法同时产生光热及活性氧等特点，限制了光热治疗剂在临床中的应用。因此需要一种合成方法简单、稳定性好，可用激发光引发光热和光动力治疗，且具有良好的靶向性及生物安全性的治疗剂。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明制备的卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒可以利用纳米金属有机框架的纳米效应，有效延长其血液循环时间，充分发挥被动靶向作用，使光敏剂有效富集到肿瘤部位。另一方面，卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒不同于传统的光敏剂多孔载入的方法，本发明的方法将光敏剂直接共价生长到纳米材料的表面，减少了光穿透多孔载体过程的损失，提高对光能的利用率。到达肿瘤组织后，在激光的照射下，此复合物可以有效吸收激光的能量并转化为热能和活性氧，从而实现光热治疗和光动力治疗的联合肿瘤治疗。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）分别将2-甲基咪唑和醋酸锌（ZnAc）溶解在甲醇中，然后将两种溶液搅拌混合，离心后洗涤、干燥，得到的白色粉末为沸石咪唑酯骨架材料；所述2-甲基咪唑溶解在甲醇中的浓度为0.2857g/mL；所述醋酸锌溶解在甲醇中的浓度为0.0933g/mL；

（2）将对羟基苯甲醛溶解在丙酸和二甲基亚砜（DMSO）的混合溶剂中，搅拌加热，同时缓慢加入丙酸溶解的新鲜蒸馏吡咯，将混合物加热至回流进行反应，反应结束冷却至室温，加入无水乙醇过滤，干燥后得到蓝色粉末为四羟基苯基卟啉；所述对羟基苯甲醛、混合溶剂和新鲜蒸馏吡咯的加入量之比为3.0g：53mL：1.8 mL；所述混合溶剂中丙酸和DMSO的体积比为50：3；所述丙酸溶解的新鲜蒸馏吡咯中，丙酸和新鲜蒸馏吡咯的体积比为24：1.8；

（3）将步骤（1）制备的沸石咪唑酯骨架材料分散于甲醇中得到沸石咪唑酯骨架材料溶液；将六氯环三磷腈、步骤（2）制备的四羟基苯基卟啉溶于甲醇中得到卟啉-磷腈溶液，将两溶液混合，连续搅拌下加入三乙胺，然后洗涤、干燥，得到的深绿色粉末为卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒；所述沸石咪唑酯骨架材料溶液的浓度为5mg/mL；所述卟啉-磷腈溶液中六氯环三磷腈的浓度为7.0mg/mL、四羟基苯基卟啉的浓度为15.75mg/mL；所述沸石咪唑酯骨架材料、四羟基苯基卟啉、六氯环三磷腈和三乙胺的加入量之比为400mg：630mg：280mg：740 μL。

优选的，步骤（1）中，所述搅拌为磁力搅拌，所述搅拌的时间为4h。

优选的，步骤（1）中，所述离心的速度为11000 rpm，时间为15min。

优选的，步骤（1）中，所述洗涤为：用无水乙醇洗涤三次；所述干燥为真空干燥12h。

优选的，步骤（2）中，所述丙酸溶解的新鲜蒸馏吡咯的滴加速度为2.0mL/min。

优选的，步骤（2）中，所述反应的时间为6h；所述无水乙醇的加入量与反应体系的体积相同；所述干燥为真空干燥，时间为12h。

优选的，步骤（3）中，所述连续搅拌的时间为6h；所述洗涤为无水乙醇洗涤三次；所述干燥为真空干燥12h。

本发明的第二方面，提供上述制备方法得到的卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒，所述卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒在体外638nm激光照射5min可达53.1℃，体内638nm激光照射5min可达50.2℃。

本发明的第三方面，提供卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒在制备靶向肿瘤药物中的应用。

所述靶向肿瘤药物为具有光热治疗和光动力治疗的药物；

所述靶向肿瘤药物为靶向治疗非小细胞肺癌的药物。

本发明的有益效果：

（1）本发明为了提高抗肿瘤药物的靶向性和在体内的肿瘤抑制效率，设计了一种卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒，兼具纳米材料的靶向性和光敏剂的光活性，可实现高效的光热-光动力联合治疗。本发明制备的药物具有被动靶向能力，可有效富集到肿瘤部位；到达肿瘤组织后，在激光的照射下，复合材料可以吸收激光的能量并转化为热能和产生活性氧，体内外光热性能优越：体外638nm激光照射5min可以达到53.1℃；体内638nm激光照射5min可达到50.2℃，在此过程中经过细胞实验等验证了活性氧的产生，从而实现光热治疗和光动力治疗的联合肿瘤治疗。

（2）本发明制备的卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒具有毒性低、绿色环保、研制成本低、可生物相容、可靶向肿瘤微环境等优点，是一种制备新型光热治疗剂的理想材料。

附图说明

图1：卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的¹³C的固态核磁图；

图2：（a）单体及卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的红外图；（b）单体及卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的X射线衍射图；（c）-（e）沸石咪唑酯骨架材料纳米颗粒的透射电镜；（f）-（h）卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的透射电镜;（i）卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的元素映射图；

图3：卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的热重分析；

图4：卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的体外光热性能：（a）裸ZIF-8NPs和卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的紫外可见吸收带；（b）不同浓度下（62.5,125,250,500µg/mL）卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒在638 nm激光照射下的温度变化(1.5W/cm²,5 min)；（c）不同光强638 nm激光照射5 min下卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒（250μg/mL）的温度变化；（d）卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒（250µg/mL）的升温-冷却曲线；（e）卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒（250µg/mL）的光热转换的线性拟合；（f）638nm激光照射下卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒)的温度变化；（g）卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒（250μg/mL）在638nm激光照射下的温度变化（1.5W/cm²，5 min）；

图5：沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的细胞摄取实验：用FITC标记的卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒分散溶液（1：1，其中FITC和卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒分散液的浓度各为5μg/mL）处理A549细胞不同时间（1小时、4小时、8小时）的荧光图像（比例尺：200μm）；

图6：卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的体外光动力性能研究：（a）卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒分散溶液中加入1,3-二苯基异苯并呋喃在激光（638 nm，1.5 W/cm²）不同时间（0、1、2、3、3、4、5 min）照射下紫外-可见吸收光谱的变化；（b）卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒在PBS中1,3-二苯基异苯并呋喃的归一化吸光度(638 nm，1.5W/cm²)在不同的条件下，包括1,3-二苯基异苯并呋喃 +激光，卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒+ 1,3-二苯基异苯并呋喃 +激光，以及卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒 +1,3-二苯基异苯并呋喃 +激光+ 维生素C；（c）A549细胞在不同的处理组（PBS、PBS+激光、卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒、卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒+激光+维生素C、卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒+激光）进行2’，7’-二氯荧光素二氢二乙酸酯染色，分析细胞内ROS产生和分析细胞内ROS产生；（d）A549细胞处理不同卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒分散溶液（100,150,200μg/mL）染色2’，7’-二氯荧光素二氢二乙酸酯检测细胞内活性氧生产水平，通过倒置荧光显微镜观察，并量化荧光强度，分析细胞内ROS产生和分析细胞内ROS产生；（比例尺：200μm)；

图7：卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的溶血实验及细胞毒性实验：（a）不同浓度下（12.5,50,100,200,400μg/mL）卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒对溶血率的影响；（b）不同卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒分散浓度（100-1000μg/mL）处理后L929细胞和A549细胞的细胞活力；（c）不同处理组（卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒、卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒+激光+冷却、卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒+激光+维生素C、卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒+激光）和不同卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒分散浓度（50, 100, 150, 200μg/mL）在激光（638nm，1.5W/cm²）照射下的细胞活力；（d）不同处理组（PBS, PBS+激光, 卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒, 卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒+激光+冷却, 卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒+激光+维生素C，卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒+激光, 卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的分散浓度为150μg/mL）在638nm、1.5 W/cm²的激光照射5分钟后进行活/死细胞试验（比例尺：200μm）；

图8：流式细胞术检测A549细胞的凋亡率（卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒分散体浓度：150μg/mL，NIR：638nm 1.5 W/cm²，时间：5 min）；将上述结果重复3次，并取均值和标准差；

图9：卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的体内生物学分布及光热性能：（a）在不同给药时间（6、12、24 h)收集的小鼠中，POP@ZIF-8 NPs的生物分布；（b）PBS、卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒分别用638nm 1.5W/cm²激光照射小鼠5分钟后的热成像；（c）相应温度变化曲线；

图10：卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的体内抗肿瘤治疗疗效评价：（a）不同治疗组在治疗14天后的肿瘤解剖图；（b）14天内各组小鼠肿瘤体积；（c）14天内各组小鼠体重变化；（d）第14天对肿瘤组织的H&E染色；

图11：主要器官的H&E染色的组织学切片；所有比例尺均为200μm；

图12：卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的制备原理和作用原理图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所述，目前的光疗治疗剂的靶向性差、近红外区吸收能力差、光能利用率低、单一的激发波长无法同时产生光热及活性氧等特点，限制了光热治疗剂在临床中的应用。

基于此，本发明提供一种卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明通过模板-辅助的策略，利用纳米化的沸石咪唑酯骨架材料作为模板，将具有特定反应活性的光敏剂与交联剂通过反应共价涂覆到沸石咪唑酯骨架纳米材料的表面，得到光敏剂表面生长的复合纳米颗粒。该复合纳米颗粒是高受热面积的热敏性材料，减少了内部负载光敏剂法在光穿透多孔载体过程中的光能损失；同时利用复合材料的纳米特性，使得光敏剂具有被动靶向能力，可有效富集到肿瘤部位。到达肿瘤组织后，在激光的照射下，复合材料可以吸收激光的能量并转化为热能和产生活性氧，体内外光热和光动力性能优越：在638nm激光照射下，通过体外实验验证了卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒可以生成ROS；而卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒在体外638nm激光照射5min可以达到53.1℃，体内638nm激光照射5min可达到50.2℃，正因为纳米材料在靶向到肿瘤部位并接受638nm激光照射后，可引起肿瘤部位的快速升温，当温度大于41℃时便可引起细胞的死亡，所以可以适当减少照光时间，从而减轻患者的痛苦。温度的升高可以加速血液循环，促进肿瘤部位的氧供，增强光动力治疗效果，从而实现光热治疗和光动力治疗的联合抗肿瘤治疗。

本发明用混合策略开发了稳定、高效的纳米级光敏剂。混合体通过对现成材料的简单集成实现，为合理设计和合成具有复杂和前所未有的超结构和功能的先进材料铺平了新的道路，可作为多功能治疗纳米平台。在此基础上，开发了一种新型的生物安全杂交体（卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒），在单一波长下用于光热-光动力协同治疗NSCLC癌，并以沸石咪唑脂骨架材料为模板。卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒是通过共价包覆卟啉基聚合物制备的沸石咪唑脂骨架材料表面。卟啉基有机聚合物是一种新兴的多维多孔材料，通过不同几何和拓扑的有机构件之间的强共价连接。共价涂层策略不仅能最大限度地提高其稳定性，避免提前泄漏，而且还能最大限度地保持光敏剂的光敏性。本发明制备的卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的形态和大小与模板相似。体外和体内实验表明，卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒在相同激光波长下具有增强联合光热-光动力的抗肿瘤效果，明显优于单模光热或光动力。本发明的混合策略可以作为一种通用和有效的合成高效光敏剂的方法，作为一种很有前途的非小细胞肺癌治疗纳米平台。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

说明：实施例1中的新鲜蒸馏吡咯是利用减压蒸馏装置在60℃下减压蒸馏得到的。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒（以下简称POP@ZIF-8 NPs）的制备

1）ZIF-8的合成：将2-甲基咪唑（20.0 g）和ZnAc（2.8 g）分别溶解在70 mL和30 mL的甲醇中。然后将两种溶液用磁力搅拌器搅拌4小时，离心（11000 rpm，15 min），用无水乙醇洗涤三次，然后在真空烘箱中干燥12小时。得到的白色粉末为沸石咪唑酯骨架材料复合材料。

2）5, 10, 15, 20-四（4-羟基苯基）卟啉的合成：将对羟基苯甲醛（3.0 g）溶解在丙酸（50 mL）和DMSO（3 mL）的混合溶剂中，搅拌加热至140 ℃，同时将丙酸（24 mL）溶解的新鲜蒸馏吡咯（1.8 mL）以2.0mL/min的速度滴加至对羟基苯甲醛的混合溶液中。将混合物加热至回流，并连续反应6h。然后，冷却至室温，加入相同体积的无水乙醇。过滤3次，放入真空干燥箱中12 h，得到蓝色粉末是四羟基苯基卟啉。

3）POP@ZIF-8 NPs的合成：将400mg步骤1）合成的沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒超声分散于80mL甲醇中，将630mg步骤2）合成的四羟基苯基卟啉和、280mg六氯环三磷腈溶于40mL甲醇中，上述两溶液混合在一起，搅拌5分钟后，加入740 μL三乙胺并连续搅拌6小时。用无水乙醇洗涤三次后，将其放入真空干燥箱中12小时，得到最终的深绿色粉末，称为POP@ZIF-8 NPs。¹³C NMR (400 MHz, DMSO):150.65, 124.27, 44.43, 13.44。

实施例2：表征

本发明通过具有活泼羟基的光敏剂与六氯环三磷腈发生聚合化学反应的同时，将ZIF-8 NPs包覆在里面（见图12），得到卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒。图1为POP@ZIF-8 NPs的核磁共振碳谱图，同先前所报道的各单体对应的结果一致。

傅里叶变换红外光谱(FT-IR)由图2（a）所示，POP@ZIF-8 NPs的FT-IR综合了ZIF-8和POPs的特征，其中ZIF-8 NPs的吸收峰明显(Zn-N在424 cm^-1处的拉伸峰，咪唑环在681、758、993 cm^-1处的平面拉伸峰，咪唑C-H键在2955、2919 cm^-1处的拉伸振动峰，与C=N在1581cm^-1处的拉伸振动)，以及卟啉宏观环的特征振动(包括在1146和995 cm^-1处的C=N拉伸和弯曲振动，在1567 cm^-1处的C=N拉伸振动，在1550和1581 cm^-1处的芳香骨架振动)同时观测到。同时，O-H特征峰在3200 ~ 3600 cm^-1处减弱，-P-O-Ph-和P=N特征吸收峰在952和1184cm^-1处出现，进一步证实了杂化体的形成。

所有合成样品的x射线粉末衍射图如图2（b）所示。可以看出，与纯POPs的无特征衍射不同，POP@ZIF-8 NPs的XRD可以明确观察到ZIF-8 NPs在7.3°、10.4°、12.7°、14.7°、16.4°和18.1°的典型峰，表明POPs包覆在ZIF-8 NPs的外侧并不影响模板（ZIF-8 NPs）的晶型及结构。

通过透射电镜观察ZIF-8 NPs和POP@ZIF-8 NPs的形貌，图2（c）到图2（e）显示ZIF-8 NPs具有典型的多面体形态，边缘清晰光滑，平均尺寸为90 nm。而如图2（f）到图2（h）所示，ZIF-8 NPs的光滑多面体表面在POP生长后变得粗糙，其直径增大到约190 nm。这一结果验证了该聚合物成功地包覆在ZIF-8 NPs表面。能谱分析(EDS)和TEM元素映射结果表明，O、Zn、N、C和P在整个多面体基体上分布均匀，这与POP@ZIF-8 NPs的化学组成一致，见图2（i）。同时，可以清楚地观察到聚合物特异性P主要位于MOF特异性Zn的表面，说明聚合物在MOF上的包覆。

图3所示的POP@ZIF-8 NPs热重分析结果来看，在100℃以下的温度下几乎没有失重，在800℃的高温下，其重量可以保持52.2%，表明其优异的热稳定性，在光照情况下不易自身分解。

实施例3：体外光热特性评估

（1）图4（a）结果显示，与裸ZIF-8无特征的紫外可见吸收波段不同，POP@ZIF-8 NPs在400 - 800 nm之间具有较宽的吸收，表明POP@ZIF-8 NPs可以作为潜在的光敏剂。与短波长光相比，长波红色或近红外光具有更好的组织穿透性和安全性，可以有效克服生物组织的自吸收、折射和散射。因此，后续实验使用638 nm激光器。同时，POPs包覆在光敏剂的外侧可以避免光敏剂的相互聚集，有效地防止了活性氧的自猝灭。为了验证这一点，通过改变激光功率或样品浓度，以纯水为对照，测试了POP@ZIF-8 NPs在638 nm激光照射下的光热性能。从 图4（g）可以明显看出，与纯水的温度变化较小(ΔT=2.5℃)不同，在POP@ZIF-8 NPs分散浓度为250μg/mL时，照射(1.5 W/cm²) 5分钟后，温度达到53.1℃ (ΔT=23.1℃)。随着纳米粒子浓度的增加，温度升高更为明显，见图4（b）。此外，还研究了激光功率对光热活性的影响，见图4（c）。可以看出，POP@ZIF-8 NPs的最终色散温度也随着激光功率密度的升高而升高。

（2）如图4（f）所示， POP@ZIF-8 NPs在激光照射下连续三个开关循环后，POP@ZIF-8 NPs的温度位移曲线变化不明显，表明POP@ZIF-8 NPs具有良好的光热稳定性，证明其具有重复治疗的效果。

（3）研究POP@ZIF-8 NPs的光热转换效率(η)的高低，可以说明纳米材料的光热性能的好坏。光热转换效率越高，单位时间内光能转换为热能的量越多，也就是可以用少量的光便可达到抗肿瘤的治疗温度，从而提高了治疗效果、减轻了对组织的伤害。

通过冷却曲线得到的冷却时间与-lnθ的关系图，可以很好地观察到线性关系，得到了POP@ZIF-8 NPs水分散液的传热时间常数（图4（e））。

利用一下方程计算光热转换效率：

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其中“h”是传热系数，“A”是容器的表面积，“T_max”是辐照5分钟后的最高温度（53.1℃），“T_surr”是环境温度（30℃），“Q_Dis”是溶剂吸收的光产生的热量（25.03mW），“I”是638 nm连续波激光功率（1.5 W/cm²），A638是POP@ZIF-8 NPs水溶液在638 nm处的吸光度（0.5408），m_D为质量（1mg），C_D为水溶剂的热容（4.2 J/g），τ_s为样品系统时间常数（174.55），θ定义为∆T和∆Tmax的比值。根据所得到的数据和方程，得出了POP@ZIF-8 NPs的光热转换效率为49.69%。

实施例4：体外纳米粒子细胞摄取实验

细胞对纳米颗粒的摄取取决于其大小、形状、弹性模型、表面化学性质、纳米颗粒与细胞相互作用的动力学以及其他因素。因此，使用激光共聚焦显微镜（CSLM）观察POP@ZIF-8对细胞的吸收。将POP@ZIF-8 NPs与FITC按1：1的质量比搅拌过夜，离心去上清，用PBS清洗2次，用1640培养基配置成FITC浓度为5μg/mL的溶液。按时间段（1 h、4 h、8h）取出在6孔板中呈对数期生长的A549细胞的原完全培养基，加入配置好的溶液，让荧光标记的纳米材料与细胞共孵育。孵育结束后，弃去培养基，PBS洗涤3次，4% 多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，用PBS冲洗3次后用1 μg/mL的DAPI对A549细胞进行15 min染色。最后用PBS冲洗3次除掉多余染料。放置在载玻片上，封片，使用共聚焦显微镜进行荧光成像。如图5可以明显地检测到，随着共孵育时间的延长，FITC标记的POP@ZIF-8 NPs呈现出的绿色荧光强度（λex= 495 nm，λem= 520 nm）逐渐增加，用DAPI（λex= 340 nm，λem= 488nm）覆盖蓝色染色的细胞核。结果显示，随着共孵育时间的延长，FITC标记的POP@ZIF-8 NPs逐渐被细胞吸收。

实施例5：体外光动力特性评估

ROS作为PDT的关键组成部分，具有强大的细胞毒性，可能破坏癌细胞的氧化还原平衡，导致肿瘤凋亡和坏死。因此，使用DPBF作为ROS探针检测了POP@ZIF-8 NPs在激光激发下体外产生ROS的效率，该探针可以与单线态氧（¹O₂）相互作用，导致~420 nm波长处的吸收降低。维生素C（Vc）作为一种强大的还原剂，可以与ROS进行氧化还原反应，消除ROS。

从图6（a）和图6（b）可以看出，加入POP@ZIF-8（2.5μg/mL）后，随着暴露时间（638nm，1.5 W/cm²）和功率的增加，DPBF在420 nm处的吸收值逐渐降低。相比之下，DPBF和POP@ZIF-8 NPs + Vc组在638 nm激光下没有发现显著的变化。这些结果证实了POP@ZIF-8 NPs可以有效地产生体外PDT的¹O₂。此外，DCFH可以穿透DCFH-DA的细胞膜，是一种用于检测ROS的试剂，在倒置荧光显微镜下检测绿色荧光DCF。

因此，对数生长的A549细胞分别用PBS、PBS +激光、POP、POP@ZIF-8 NPs +激光+Vc和POP@ZIF-8 NPs +激光处理6h（POP@ZIF-8NPs浓度为150μg/mL），然后激光照射5 min（638 nm，1.5 W/cm²）。如图6（c）所示，对照组(PBS、PBS +激光和PBS+激光+Vc组）的A549细胞没有或只检测到非常弱的绿色荧光，这种结果表明，仅在上述因素下就不能产生ROS。而PTT + PDT组（POP@ZIF-8 NPs + Laser）检测到亮绿色荧光，表明了ROS的产生。如图6（d）所示，随着POP@ZIF-8 NPs分散溶液浓度的增加，荧光强度逐渐增加。

实施例6：溶血实验和细胞毒性实验

为了验证POP@ZIF-8 NPs在未来可能的生物医学应用中的生物相容性，进行溶血分析和细胞活力试验。根据破裂红细胞释放的血红素在可见波段吸收最大的原理，用分光光度法测定了POP@ZIF-8 NPs的血液相容性。首先，取小鼠适量的新鲜血液，用离心机（2000rpm，10 min）离心，从全血中分离出红细胞，然后用PBS洗涤3次，稀释至4%。PBS和水分别为阴性和阳性对照组，以不同浓度（12.5、50、100、200、400μg/mL）的POP@ZIF-8 NPs溶液作为实验组，同时对红细胞进行处理。最后，将各组溶液在37℃培养箱中反应3小时离心，上清液置于96孔板的微量滴度孔中，测定540 nm处的吸光度。溶血率由下式确定：

从图7（a）可以明显看出，不同浓度的POP@ZIF-8NPs（12.5-400μg/mL）孵育后的红细胞悬液上清液仍然清楚，其溶血率与阳性对照组相比可忽略不计，说明POP@ZIF-8 NPs具有良好的血流相容性。

（2）细胞毒性测试步骤如下：将人肺腺癌细胞（A549，来自美国组织培养库）及小鼠上皮样成纤维细胞（L929，来自美国组织培养库）分别以8000个/孔的密度接种到标准96孔板中，在5% CO₂的培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁。用完全培养基将不同浓度的材料按梯度配置好，向每孔中加入100 μL配置好的材料分散液（每个浓度3个复孔），空白组加入100 μL完全培养基，37 ℃条件下孵育12 h。孵育完成后，弃去培养基，向每孔中加入15 μLMTT溶液（5 mg/mL，溶剂为1640培养基），于37 ℃下孵育4 h，弃去培养基，向每孔中加入150μL DMSO，轻轻震荡10 min，用酶标仪测定490 nm处的吸光度值。细胞的相对存活率（VR）计算公式如下：

其中A_s为实验组的吸光度，A_c为对照组的吸光度，A_b为空白样品的吸光度。

如图7（b）所示，L929细胞与POP@ZIF-8NPs（100~1000μg/mL）孵育24 h后，L929细胞和A549细胞的细胞活力可维持在90%以上，表明纳米颗粒单独对正常细胞和肿瘤细胞的损伤可以忽略不计。然而，在激光照射（638 nm，1.5 W/cm²,5 min）后，POP@ZIF-8 NPs对A549细胞的毒性增加到84.5%（150 μg/mL）。此外，随着纳米颗粒浓度的增加，细胞毒性逐渐增加。单模态PTT（POP@ZIF-8NPs+激光+Vc）和PDT（POP@ZIF-8NPs+激光+冷却）处理的A549细胞凋亡率分别为80.03%和50.29%，低于双模态PTT和PDP（POP@ZIF-8NPs+激光）结果。这一结果进一步证明了PDT与PTT联合治疗可获得更好的抗肿瘤效果，见图7（c）

为了观察POP@ZIF-8在光疗过程中的光细胞毒性，分别对活死A549细胞用碘化丙啶（PI）和钙黄绿素-AM进行染色。图7（d）中倒置的荧光图像显示，POP@ZIF-8 NPs具有良好的生物相容性，具有较强的绿色荧光，与PBS和PBS+激光组相似。而在低浓度（150 μg/mL）的POP@ZIF-8 NPs分散溶液受到激光照射后，发现PDT（POP@ZIF-8+激光+冷却），PTT（POP@ZIF-8+激光+ Vc)，以及PTT+PDT（POP@ZIF-8+激光)组有明显的红色荧光，且三组的细胞损伤强度逐渐增加。这一结果进一步说明了PDT联合PTT具有较好的抗肿瘤治疗效果。

使用流式细胞术对POP@ZIF-8纳米颗粒光疗产生的细胞毒性进行了进一步的研究。图8显示，PDT、PTT和PDT + PTT中凋亡细胞的比例逐渐增加，分别为47.3%、58.7%和68.4%。同时，位于Q2的晚期凋亡细胞的比例也逐渐增加。此外，对照组的细胞凋亡率可忽略不计。这与MTT和活/死染色方法的实验结果一致，进一步说明在单一激光刺激下联合治疗对肿瘤治疗更有效。

实施例7：体内荧光成像与热成像实验

将POP@ZIF-8NPs分散溶液与荧光剂Cy5.5NHS酯（非磺化）染料避光搅拌24小时后，离心去上清，用无菌的PBS重悬（其中POP@ZIF-8：100ug，150ul），通过腹腔注射进去小鼠体内，测定其靶向性和生物安全性。用小动物成像仪观察不同时间点（6 h、12 h、24 h）下纳米颗粒的代谢情况。如图9（a）所示，POP@ZIF-8 NPs的荧光信号遍布小鼠全身，说明NPs迅速被血液吸收并在血液中循环。值得注意的是，注射12小时后，POP@ZIP-8NPs的荧光信号主要集中在肿瘤部位，此时肿瘤部位的荧光信号最强。计算出约有2.78%的纳米颗粒靶向于肿瘤部位，这与靶向于同一类型的肿瘤部位的纳米颗粒的数量相似。随后，随着NPs的持续代谢，荧光信号逐渐减弱，直到肿瘤部位24小时后的荧光信号消失，表明POP@ZIF-8 NPs完全代谢出体外，避免了NPs在小鼠体内的积累，从而证明了纳米材料的生物安全性。为了进一步评价纳米粒子在体内的光热性能，将腹腔注射（5 mg/kg,100μL）的纳米颗粒溶液成功注射到荷瘤小鼠体内。如图9（b）和（c）所示，12 h后，用光热成像仪记录了温度的变化。结果可见，PTT组高温升高18.3℃，明显高于对照组（6.7℃），反映了POP@ZIF-8 NPs在体内也具有优越的光热性能。

实施例8：体内抑瘤实验

为了评估ZIF-TAPP-DOX 复合物的体内治疗效果，构建了小鼠肿瘤模型。以A549注射到小鼠体内所长出的肿瘤块作为异种移植瘤，接种14天后肿瘤的平均体积达到100 mm³。此时将30只A549荷瘤裸鼠随机分为6组，记为实验I组~实验VI组：

实验I组：PBS：用量为100μL；

实验II组：与实验I组用量相同，施加638 nm激光照射；

实验III组：实施例1制备的POP@ZIF-8 NPs：用量为5mg/Kg，100μL；

实验IV组：实施例1制备的POP@ZIF-8 NPs+冷却：施加638 nm激光照射；

实验V组：实施例1制备的POP@ZIF-8 NPs+Vc：施加638 nm激光照射；Vc：用量为25μmol/Kg；

实验VI组：实施例1制备的POP@ZIF-8 NPs+Laser；施加638 nm激光照射；

随后，采取腹腔给药的方式每隔一天分别按照实验I组~实验VI组给药一次，每隔一天记录一次小鼠肿瘤的长径和短径，评估抗肿瘤疗效，同时记录小鼠体重以判断纳米复合物的安全性。14天治疗完成后，将小鼠施以安乐死之后解剖拍照，所得结果见图10和图11。

将POP@ZIF-8 NPs溶液注射到小鼠体内。根据小动物活体成像结果，在注射纳米粒子12小时后给予激光照射，触发小鼠体内POP@ZIF-8 NPs的一系列反应，以实现纳米颗粒体内光疗效果的研究。在POP@ZIF-8 NPs +激光+ Vc组，Vc和纳米粒子同时注入小鼠抑制体内活性氧的生产，而在POP@ZIF-8 NPs +激光+冷却组，治疗温度控制在40℃以下，以避免PTT引起的温度上升。

如图10（a）和（b）所示，PBS + Laser和POP@ZIF-8 NPs小鼠的肿瘤生长速率和最终体积与PBS组相似，表明激光和纳米颗粒单独对肿瘤的影响可以忽略不计。POP@ZIF-8 NPs+激光+冷却和POP@ZIF-8 NPs + Laser + Vc组小鼠的最终肿瘤体积明显小于对照组。POP@ZIF-8 NPs + Laser组小鼠肿瘤体积减少最为明显，甚至小于治疗开始时的肿瘤体积（200mm³）。这些结果表明，PDT和PTT联合治疗的抗肿瘤治疗效果最好，甚至可以完全消除肿瘤。POP@ZIF-8 NPs对动物的全身不良影响可以通过测量体重变化来评估。

从图10（c）可以看出，治疗期间小鼠的体重没有明显变化，说明小鼠具有良好的安全性。为了进一步证实联合抗肿瘤治疗的优越性，对上述各组的肿瘤组织切片进行了H&E染色，数据与体外实验结果一致。PDT和PTT联合治疗导致的肿瘤细胞死亡比例最高（伊红染色面积超过95%），充分证明了其具有良好的抗肿瘤作用，见图10（d）。同时，小鼠的心脏、肝、脾、肺和肾活检显示了可忽略不计的病理损伤，再次显示了生物安全性（图11）。本试验结果证实了POP@ZIF-8 NPs具有高质量的体内光疗效果，在肿瘤光疗中具有相对广阔的应用前景。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分别将2-甲基咪唑和醋酸锌溶解在甲醇中，然后将两种溶液搅拌混合，离心后洗涤、干燥，得到的白色粉末为沸石咪唑酯骨架材料；所述2-甲基咪唑溶解在甲醇中的浓度为0.2857g/mL；所述醋酸锌溶解在甲醇中的浓度为0.0933g/mL；

（2）将对羟基苯甲醛溶解在丙酸和二甲基亚砜的混合溶剂中，搅拌加热，同时缓慢加入丙酸溶解的新鲜蒸馏吡咯，将混合物加热至回流进行反应，反应结束冷却至室温，加入无水乙醇过滤，干燥后得到蓝色粉末为四羟基苯基卟啉；所述对羟基苯甲醛、混合溶剂和新鲜蒸馏吡咯的加入量之比为3.0g：53mL：1.8 mL；所述混合溶剂中丙酸和二甲基亚砜的体积比为50：3；所述丙酸溶解的新鲜蒸馏吡咯中，丙酸和新鲜蒸馏吡咯的体积比为24：1.8；

（3）将步骤（1）制备的沸石咪唑酯骨架材料分散于甲醇中得到沸石咪唑酯骨架材料溶液；将六氯环三磷腈、步骤（2）制备的四羟基苯基卟啉溶于甲醇中得到卟啉-磷腈溶液，将两溶液混合，连续搅拌下加入三乙胺，然后洗涤、干燥，得到的深绿色粉末为卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒；所述沸石咪唑酯骨架材料溶液的浓度为5mg/mL；所述卟啉-磷腈溶液中六氯环三磷腈的浓度为7.0mg/mL、四羟基苯基卟啉的浓度为15.75mg/mL；所述沸石咪唑酯骨架材料、四羟基苯基卟啉、六氯环三磷腈和三乙胺的加入量之比为 400mg：630mg：280mg：740 μL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述搅拌为磁力搅拌，所述搅拌的时间为4h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离心的速度为11000rpm，时间为15min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述洗涤为：用无水乙醇洗涤三次；所述干燥为真空干燥12h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述丙酸溶解的新鲜蒸馏吡咯的滴加速度为2.0mL/min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述反应的时间为6h；所述无水乙醇的加入量与反应体系的体积相同；所述干燥为真空干燥，时间为12h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述连续搅拌的时间为6h；所述洗涤为无水乙醇洗涤三次；所述干燥为真空干燥12h。

8.权利要求1~7任一项所述的制备方法得到的卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒，其特征在于，所述卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒在体外638nm激光照射5min可达53.1℃，体内638nm激光照射5min可达50.2℃。

9.权利要求8所述的卟啉-磷腈-沸石咪唑酯骨架材料复合纳米颗粒在制备靶向肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述靶向肿瘤药物为具有光热治疗和光动力治疗的药物；所述靶向肿瘤药物为靶向治疗非小细胞肺癌的药物。

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