CN109395078B - 一种MoO2-ICG多功能纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种MoO2-ICG多功能纳米颗粒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种MoO2‐ICG多功能纳米颗粒及其制备方法与应用，其中制备方法包含光热剂MoO2纳米颗粒的合成制备，以及表面PEI分子的改性，以及光敏剂ICG的加载。本发明中的MoO2纳米颗粒合成方法简单，尺寸均一，水中分散性好，ICG水溶性好，加载量高，且在NIR区域响应，可以实现808nm激光辐照下的肿瘤光治疗，并且实现光热光动力协同治疗，以期达到更好的肿瘤治疗效果。

Description

一种MoO2-ICG多功能纳米颗粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物纳米材料领域，涉及一种MoO2-ICG多功能纳米颗粒及其制备方法与应用。具体地说，本发明涉及具有光热及光动力功能，可以实现对肿瘤的光热-光动力治疗纳米平台的制备和应用性能评价。
背景技术
肿瘤是目前全世界范围内失望率最高的疾病之一，且其发病率和死亡率呈现上升趋势。肿瘤的扩散和转移是造成如此高死亡率和低治愈率的原因。传统的肿瘤治疗手段有外科手术，放疗和化疗。这三种方法都有各自的弊端，无法有效的治愈肿瘤以及抑制癌症的复发，而且往往伴随着较大的毒副作用，从而造成患者机体功能的急剧下降。所以，现在全世界范围内的研究人员都在致力于开发高效，低毒副作用的新型纳米诊疗平台以及治疗方法，对于提高人类生活质量，保障人类生命健康事业以及发展国民经济等都具有重要的意义。
新型多功能的生物纳米材料的研发抑制是国际生物技术领域的研究前沿和热点问题。光治疗手段是区别于传统治疗手段的新型治疗手段，主要通过外场光的激发来实现肿瘤细胞的杀伤以及肿瘤的消融作用，进而达到高效安全的肿瘤治疗的目的。现在研究最多的光治疗的手段包括光热治疗和光动力治疗。光热治疗是一种基于光热剂的治疗方式，在合适外场光源的激发下，光热剂会在局部产生较高温度，进而实现肿瘤细胞的凋亡甚至坏死。理想的光热剂的选择原则是基于无毒，光热转换效率高，低成本，制备简单等优点。而光动力治疗则是应用光敏剂在光的作用下吸收光能，通过将能量传递给氧气进而产生活性很高的单线态氧来杀死肿瘤细胞，实现肿瘤治疗的目的。在生物医学领域，光源的选择优先趋向于组织穿透能力更强的近红外光，所以光热剂和光敏剂的选用应考虑在近红外波段具有更好性能的材料。MoO2制备简单，无毒，光热转换效率高，在肿瘤光热治疗方面具有比较突出的优势。通过表面PEI的修饰改变表面基团和电性，在ICG的装载提升上具有很好的效果。ICG作为水溶性的光敏剂，在近红外波段具有优良的光动力效果，并且可以成功用于肿瘤的治疗。这样的多功能治疗平台的成功搭建，其效果不管在体外还是老鼠体内都得到了很好的证明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种MoO2-ICG多功能纳米颗粒及其制备方法与应用。光热治疗和光动力治疗同时发生作用，并且取得更加有效的肿瘤杀伤效果，克服单一功能的治疗方式所带来的弊端。
本发明采用如下技术方案：一种MoO2-ICG多功能纳米颗粒，ICG通过PEI 加载于MoO2表面。
一种MoO2-ICG多功能纳米颗粒的制备方法，包括：将MoO2用PEI改性后，加入到200μg/mL浓度的ICG溶液中，加载ICG分子,离心洗涤即可制得所述基于MoO2-ICG多功能纳米颗粒。
进一步地，PEI的分子量为25000，PEI改性浓度为2mg/mL。
进一步地，所述离心速度是10000rpm，洗涤是水：丙酮体积比1:3的配比的溶液以及蒸馏水进行洗涤。
基于MoO2-ICG多功能纳米颗粒在制备肿瘤的光热光动力协同治疗制剂中的应用。
本发明的有益效果在于：MoO2-ICG多功能纳米颗粒中，MoO2纳米颗粒在近红外波段具有强烈的吸收，并且将光能转化为热能，这种高效的光热转换作用释放的热量可以使得肿瘤部位的温度升高，从而起到杀伤肿瘤细胞或者热消融的作用。PEI的改性目的是为了改变颗粒表面的基团分布以及电性，进而提高 ICG分子在MoO2纳米颗粒表面的加载。ICG分子跟随MoO2纳米颗粒进入细胞，在808nm激光作用下跟氧气反应产生单线态氧，杀伤肿瘤细胞。这样的设计可以实现在单一光源作用下，光热光动力治疗一体化，实现更加高效的肿瘤杀伤，在肿瘤治疗中具有重要意义。
在本发明中，通过在尺寸均匀，分散性良好的MoO2纳米颗粒表面加载ICG 分子实现单光源激发的光热光动力协同治疗平台。迄今为止，本领域尚未开发一种基于MoO2纳米颗粒的光热-光动力协同治疗平台。而本发明填补了这一空白。本发明的制备方法具有工艺简单，价格低廉，分散性稳定性良好等优点，适合大规模生产。
附图说明
图1MoO2纳米颗粒的(a)扫描电镜图片，(b)透射电镜图片，(c)Mo和 O元素的能谱图
图2MoO2纳米颗粒的(a)XRD图谱，(b)UV吸收曲线
图3MoO2，MoO2-PEI，ICG和MoO2-PEI-ICG的(a)FTIR图谱，(b)UV吸收曲线，(c)Zeta电位，(d)不同ICG加载浓度的UV吸收曲线
图4(a)MoO2-ICG纳米颗粒不同浓度和不同时间下的热成像照片。(b)和 (c)分别是MoO2纳米颗粒及MoO2-ICG纳米颗粒的温度随照射时间变化的曲线。
图5(a)DPBF，(b)MoO2+DPBF，(c)MoO2-ICG+DPBF在808nm激光照射后的UV吸收曲线，(d)DPBF，MoO2+DPBF，MoO2-ICG+DPBF在410nm处UV 吸收峰位强度随时间变化
图6(a)MoO2和MoO2-ICG在水，PBS及DMEM中的稳定性(48h)(b) PBS，MoO2以及MoO2-ICG注射2h后，808nm激光器照射3min下4T1细胞成瘤后小鼠的红外热成像照片
图7(a)50g/mL不同材料培养下24h和48h的细胞毒性(b)，(c)分别是不同照射时间和不同材料浓度下MoO2和MoO2-ICG的肿瘤细胞杀伤能力(d) 50μg/mL的MoO2和MoO2-ICG材料共同培养的4T1细胞在经过808nm激光照射 3min后经过Calcein AM和PI染色后的荧光照片(e)经过PBS，MoO2和MoO2-ICG 材料共同培养后，808nm激光照射后细胞内的ROS检测
图8动物实验，不同处理方式下(a)小鼠体重变化曲线(b)小鼠肿瘤体积变化曲线(c)第十四天小鼠肿瘤体积大小(d)第十四天小鼠肿瘤的光学照片
具体实施方式
以下结合附图和下述实施方式仅有必须说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
本发明提供的.一种MoO2-ICG多功能纳米颗粒，ICG通过PEI加载于MoO2表面，MoO2-ICG纳米颗粒中，ICG的加载量为10wt％，MoO2纳米颗粒尺寸为100 nm。在MoO2-ICG纳米颗粒中，MoO2纳米颗粒可以吸收近红外激光，并将光能转化为热能进而引起肿瘤局部温度的上升而杀死肿瘤细胞。ICG分子在808nm 的激光照射下，可以和氧气反应生成单线态氧，具有很强的细胞杀伤能力，进而能杀伤肿瘤。因此，MoO2-ICG纳米颗粒在单一的808nm激光光源作用下，可以同时产生光热治疗和光动力治疗作用，进而实现更强的肿瘤杀伤效果。
PEI的改性主要是为了提高ICG分子的加载量，因为MoO2纳米颗粒表面带负电，ICG分子表面也带负电，通过PEI的改性可以使得纳米颗粒表面带正电，进而可以ICG分子在表面的结合力和加载量。
本发明的MoO2纳米颗粒尺寸在100nm左右，具有纳米效应，其对近红外区域的光具有很强的吸收作用，而且将吸收的光能转化为热能。
ICG的加载赋予体系光动力治疗效果，具体先对MoO2纳米颗粒进行PEI修饰，然后在400μg/mL ICG水溶液中室温搅拌一定时间，离心洗涤之后就可以得到MoO2-ICG纳米颗粒。这种制备工艺简单，成本低廉。
在水热反应釜中加入的钼酸铵的量可以是0.07-0.2mmol，此处优选0.2 mmol，200℃下反应48-60h后离心洗涤。
反应完毕后的固液分离，使用的是10000rpm高速离心，之后进行多次洗涤，所述的洗涤方式是按体积浓度为75％的丙酮的水溶液和蒸馏水进行洗涤的，洗涤次数分别为1-3次和1-2次，清洗产物再次分散在水溶液中。
PEI表面修饰是通过一定浓度的PEI水溶液，室温搅拌一定时间，PEI浓度可以在1mg/mL到5mg/mL不等，搅拌时间4-6h不等，此处选用2mg/mL以及4h。
ICG的加载浓度在100-500μg/mL，此处优选加载浓度为400μg/mL。将加载完毕的产物通过离心分离之后洗涤就可以得到MoO2-ICG纳米颗粒
下面通过实施例以详细说明本发明。应理解为以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述十里具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
称取0.2mmol钼酸铵(0.2472g)溶于20mL水中，与10mL PVP水溶液 (0.1g/mL)混合，加入3mL乙二醇，室温搅拌10分钟后得到澄清透明溶液。随后将所得到的溶液转移至50mL容积的不锈钢反应釜中密封。将反应釜置入 200℃烘箱中反应60h，自然冷却至室温后取出，10000rpm离心分离出反应产物，并用75％丙酮水溶液洗涤3次，蒸馏水洗涤2次，离心后得到MoO2纳米颗粒。
图1(a，b)分别是MoO2纳米颗粒的SEM和TEM图，可以看出，MoO2纳米颗粒的尺寸比较均匀，大约在100nm，图1(b)中的高分辨图可以看到清晰的晶格条纹，晶格间距为0.343nm对应的是单斜MoO2相的(-111)晶面。从图1(c)可以看出Mo和O的元素含量和分布，Mo：O的原子比约为1:2。
图2(a)所示为MoO2纳米颗粒的XRD图谱，从中可以看出其晶相为单斜 MoO2相，这从HRTEM和Mapping的结果都可以得到佐证。图2(b)是MoO2纳米颗粒UV吸收曲线，可以看到MoO2纳米颗粒在近红外区域有较好的吸收。这为MoO2纳米颗粒用于近红外光下的优良的光热转换作用以及肿瘤光热治疗奠定了基础。
实施例2
通过对合成的MoO2纳米颗粒进行表面修饰，进而提高ICG分子在颗粒上的加载效率和加载量，取一定量MoO2纳米颗粒配成1mg/mL的浓度，加入 PEI-25000分子使得PEI的浓度为2mg/mL，室温搅拌4h后，离心，再次分散在水溶液中，在梯度浓度的ICG溶液(20-400μg/mL)中加入MoO2-PEI纳米颗粒，避光搅拌24h后，离心洗涤多次至上清液无色透明。所述离心速度是10000rpm，洗涤是水：丙酮体积比1:3的配比的溶液以及蒸馏水进行洗涤。
图3(d)是不同ICG浓度下的加载量的探索，可以看到，随着ICG浓度的提升，UV曲线在780nm的吸收峰强度逐渐变大，说明ICG的加载量逐渐增大，直到200μg/mL时，UV吸收峰不再升高，说明加载量达到最大，这也就是我们所采用的加载浓度的较优值。
取少量MoO2纳米颗粒以及PEI和ICG改性后(200μg/mL的ICG改性)的样品，加入KBr粉末于研钵中进行研磨，然后压成一定大小的片状固体。使用 PerkinElmer 580B(Tensor27,Bruker)的红外光谱仪测出不同样品的FTIR谱线 (图3a)，证明了PEI改性及ICG加载过程的完成。图3(b，c)分别是加载过程的UV吸收光谱和Zeta电位值，也进一步证明了加载成功。
以下实施例对实施例2中200μg/mL的ICG改性的MoO2-ICG纳米颗粒进行性能表征。
实施例3
将MoO2纳米颗粒及MoO2-ICG纳米颗粒配置成不同浓度的水溶液置于24 孔板中，浓度梯度为10，20，50，100，200μg/mL，去离子水作为对照。用808nm 的激光器(功率密度为0.8W/cm2)照射不同样品的水溶液，在不同照射时间下用红外热像仪记录温度的变化情况。图4(a)所示为MoO2-ICG纳米颗粒不同浓度和不同时间下的热成像照片。图4(b，c)分别是MoO2纳米颗粒及MoO2-ICG 纳米颗粒的温度随照射时间变化的曲线。
从图4(b)可以看到，808nm激光5min照射下，水的温度升高只有1℃，可以忽略不计，而10μg/mL,20μg/mL,50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL的MoO2纳米颗粒溶液分别可以上升10℃,14.2℃,23.7℃,31.2℃,35.3℃，而相对应的， 10μg/mL,20μg/mL,50μg/mL,100μg/mL,200μg/mL的MoO2-ICG纳米颗粒分别上升8.7℃,13.2℃,22.8℃,29.9℃,35℃，表明MoO2纳米颗粒确实具有较好的光热转换性能，在很低的浓度下也可以表现出较强的光热作用，而ICG的加载对这种光热作用的影响很小，对其升温速率的衰减几乎可以忽略不计。
采用DPBF的降解速率来表征光动力性能，配置一定浓度的DPBF溶液， MoO2+DPBF溶液及MoO2-ICG+DPBF溶液，加入比色皿中。在808nm激光照射下，不同时间间隔测量溶液的UV吸收谱线。
从图5(a)可以看到，纯DPBF溶液在808nm激光照射下，在410nm的 DPBF特征峰位处其强度曲线随时间基本重合，排除DPBF本身在光照情况下的分解。图5(b)和(c)分别是MoO2+DPBF，MoO2-ICG+DPBF溶液随着808nm 光照时间的变化UV曲线的变化，可以看到MoO2+DPBF溶液的UV吸收曲线基本重合，表明MoO2纳米颗粒本身并不分解DPBF，即其本身并没有光动力效果。而可以从图5(c)看到，MoO2-ICG溶液中DPBF迅速降解，表明其具有极好的光动力性能，DPBF在一两分钟内完全降解。图5(d)是DPBF，MoO2+DPBF， MoO2-ICG+DPBF在410nm处UV吸收峰位强度随时间变化，可以更加直观的看到不同材料的光动力性能的区别。
实施例4
材料的稳定性：将MoO2-ICG纳米颗粒配置成相同浓度的水溶液，PBS溶液及DMEM溶液，在室温条件下静置一定时间，观察溶液是否保持澄清稳定状态，进而来表征MoO2-ICG纳米颗粒在水，PBS和蛋白溶液中的稳定性。由图6(a) 可以看到，MoO2-ICG在水溶液，PBS溶液以及DMEM溶液中的稳定性均很好，在静置48h后仍能保持原来的状态。
材料自身的近红外热成像性能：先给Balbc小鼠的右腿打入一定量的4T1 细胞，一段时间后，肿瘤长大到100mm3，然后将一定浓度的(1mg/mL)MoO2-ICG 的PBS溶液通过瘤内注射到成瘤的小鼠肿瘤内。2h后，用808nm激光器光照一定时间，随后在红外热像仪下成像。得到的图像用热像仪自带拍照功能捕获，见图6(b)，可以看到随着材料的打入，温度具有明显的变化，说明材料在红外成像方面具有良好的应用前景。
实施例5
本实验通过在细胞层面的杀伤作用来说明材料在肿瘤细胞杀伤方面的应用。所有的细胞是4T1小鼠乳腺癌细胞。将小鼠乳腺癌细胞与一定浓度的不同材料进行共同培养，24h和48h后检测细胞存活率，如图7(a)，可以看到细胞存活率相比不加材料而言都大于90％，说明不管是MoO2还是MoO2-ICG其细胞毒性都很小。在引入外部808nm激光照射后，可以从图7(b)看到，随着照射时间的提高，MoO2和MoO2-ICG的肿瘤细胞杀伤能力逐渐增强，在照射时间为2min 内，MoO2-ICG的肿瘤杀伤作用很强而MoO2则比较弱，这主要是因为此时MoO2的温升效应还不是特别明显，并未达到肿瘤杀伤所需要的温度，而ICG则已经表现出较强的细胞杀伤作用，而随着时间的提高，这种杀伤作用逐渐增强，时间超过2min后，光热作用逐渐体现出来，而MoO2-ICG比MoO2的肿瘤细胞杀伤作用相对更强。图7(c)则是不同浓度的材料在光照时间为3min下的肿瘤细胞杀伤能力，可以看到浓度越高杀伤作用更强，而同样的MoO2-ICG比MoO2具有更强的肿瘤细胞杀伤作用。
Live&Dead结果(图7d)也证明了MoO2-ICG比MoO2具有更大的优势，其肿瘤细胞杀伤作用更强。可以看到PI可以给死细胞染色，而Calcein AM则给活细胞染色，可以直观的看到MoO2-ICG共同培养的细胞在光照后的死细胞数量比 MoO2更多，这表明其杀伤作用更强。
通过检测细胞内的ROS的产生，来证明MoO2-ICG光动力治疗对细胞杀伤作用。DCFH-DA是一种检测ROS的探针，具有ROS敏感作用，在ROS的作用下被氧化为高荧光强度的DCF，在蓝光激发下可以发出绿光。从图7(e)可以看到， PBS和MoO2处理后的细胞不产生绿光，表明没有ROS产生，而MoO2-ICG处理后的细胞经过808nm激光照射后，在蓝光照射下产生很强的绿光，表明由大量的ROS产生，证明了光动力治疗效果的存在。
实施例6
本实验通过在动物(小鼠)层面的肿瘤杀伤来说明材料在肿瘤细胞杀伤方面的应用。随机将注射4T1细胞后的老鼠分为五组，组1注射PBS溶液，组2,3 注射1mg/mL MoO2纳米颗粒溶液，组4,5注射1mg/mL MoO2-ICG纳米颗粒溶液。组1，3和5用808nm激光(1.5W/cm2)照射3min后，每隔一天测量老鼠的体重和肿瘤的尺寸。从图8(a)可以看到，各组的老鼠体重变化差别不大，图 8(b)可以看到，组1,2,3的肿瘤体积大小随着时间变化不断增大，且差别不大，表明材料本身的生物毒性比较低，而组4的肿瘤体积大小得到比较明显的遏制，表明MoO2纳米颗粒本身具有光热治疗效果，而组5的肿瘤大小变得很小甚至发生脱落，表明MoO2-ICG纳米颗粒的肿瘤杀伤作用很强，这主要来源于光热治疗和光动力治疗的协同作用。在第14天将肿瘤从小鼠身上切下，图8(c)和(d) 分别是第14天的肿瘤质量大小和光学照片，可以看出，MoO2-ICG确实具有更加优异的肿瘤杀伤效果，在肿瘤治疗方面具有重大的意义。

Claims (5)

1.一种MoO2-ICG多功能纳米颗粒，其特征在于，ICG通过PEI加载于MoO2表面；其中，所述MoO2通过钼酸铵水热反应制得，水热反应具体为：称取0.07-0.2mmol钼酸铵溶于20mL水中，与10mL 0.1g/mL PVP水溶液混合，加入3mL乙二醇，搅拌后加入反应釜中，于200℃下反应48-60h。
2.一种权利要求1所述的MoO2-ICG多功能纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：将MoO2用PEI改性后，加入到200μg/mL浓度的ICG溶液中，加载ICG分子,离心洗涤即可制得所述MoO2-ICG多功能纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，PEI的分子量为25000，改性使用的PEI浓度为2mg/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述离心速度是10000rpm。
5.一种权利要求1所述的MoO2-ICG多功能纳米颗粒在制备肿瘤的光热光动力协同治疗制剂中的应用。
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