CN110038126B - 钴的氧化物在制备肿瘤光治疗剂中的应用 - Google Patents

钴的氧化物在制备肿瘤光治疗剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了钴的氧化物在制备肿瘤光治疗剂中的应用。经试验证明，钴的氧化物具备良好的光热转换性能、光动力性能及优异的光热稳定性，应用于光治疗肿瘤具有显著的效果，且对生物体不具有毒副作用、安全、可靠；同时，本发明开发了钴的氧化物的新用途，提高了钴的氧化物的经济价值，也为钴的氧化物在制备光治疗肿瘤中的应用提供了理论和实践基础，其次，相比于现有技术的贵金属，本发明的钴的氧化物价格低廉，成本大大降低，因而更有利于实际应用。

Description

钴的氧化物在制备肿瘤光治疗剂中的应用
技术领域
本发明涉及钴的氧化物的应用，尤其涉及钴的氧化物在制备肿瘤光治疗剂中的应用。
背景技术
肿瘤是21世纪威胁全人类生命健康的最大杀手之一，传统疗法特异性差，副作用较强，因此对其有效的治疗是当前生物医学研究领域所面临的重大挑战。随着科学技术的发展，新的肿瘤治疗方法不断涌现。近年来，光响应疗法由于其卓越的疗效以及较低的毒副作用吸引了研究者们的广泛关注。目前主要的光疗法有：光热疗法(Photothermaltherapy,PTT)和光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)。PTT疗法是利用热疗试剂富集在肿瘤部位，在激光作用下局部加热肿瘤部位，从而杀死肿瘤细胞的治疗方法；PDT疗法主要利用光敏剂、氧分子和光在肿瘤部位产生单线态氧等毒性物质杀死肿瘤细胞。这类热疗试剂及光敏剂在无激光照射时毒性极低，因此对于非特异性分布或未照射激光的其它正常组织不产生系统毒性，保证了精确有效的胖瘤特异性杀伤作用。众所周知，近红外光(Near-infrared,NIR)组织吸收率低，可以穿透皮肤到达深层的肿瘤组织，因此非常适合用作PTT和PDT的引发光源。
随着科学技术的发展，越来越多光治疗的纳米载体已被开发。目前，研究较多的光治疗纳米材料包括有机聚合物、碳纳米材料、硫化铜、氧化钨以及贵金属纳米材料等。但是目前开发的光治疗试剂还存在着各种各样的缺陷。对于传统单一治疗模式，在安全剂量的前提下有效预防复发和清除残余肿瘤是一项非常具有挑战性的工作。比如单一的PTT由于可能的热量分布不均，且在大血管周围产生的热量容易被快速消散，从而难以完全清除肿瘤，导致部分区域发生肿瘤复发；此外，由于PDT的杀死肿瘤的主要机理为将组织中的氧气转化为活性氧，但是肿瘤组织通常呈现严重的缺氧现象，且活性氧的生成可刺激肿瘤细胞抗氧化应激系统激活，从而导致PDT耐药，故单一的PDT治疗效果仍具有局限性。为了解决这个问题，很多科研工作者尝试着将具有光热治疗效果的材料与具有光动力效果的材料结合在一起加强治疗肿瘤的效果，但是这种方案还存在很多的缺陷，一般情况下光动力和光热治疗的吸收峰不一致，且制备条件复杂，不利于大批量的生产，因此迫切需要开发同时具有光热和光动力效果的纳米光治疗剂。
在现有纳米光治疗剂中，氧铁钴、磷化钴、硒化钴、及硫钴铜等已被发现具有很好的光热效果。钴的氧化物目前的研究主要集中在光催化、气体传感器及锂电池等领域，但是其在生物医学领域的研究尚浅，未见钴的氧化物应用于光治疗肿瘤的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种钴的氧化物在制备肿瘤光治疗剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的目的之一在于提供钴的氧化物在制备肿瘤光治疗剂中的应用。
优选地，上述钴的氧化物选自CoO、Co2O3、Co3O4中的至少一种。
更优选地，上述钴的氧化物为Co3O4。
优选地，上述钴的氧化物的粒径为50nm～500nm。
更优选地，上述钴的氧化物的粒径为50nm～200nm。
优选地，上述肿瘤为浅表实体肿瘤。
更优选地，上述浅表实体肿瘤选自乳腺肿瘤或黑色素肿瘤。
优选地，上述肿瘤光治疗剂还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂。
优选地，本发明的钴的氧化物可与药学上各种常用添加剂(如稀释剂和赋形剂等)制成药物组合物。根据治疗目的及使用方式，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如液体或注射制剂(溶液及悬浮液)等。
优选地，上述肿瘤光治疗剂为注射制剂。
更优选地，上述注射制剂选自注射粉针剂或注射液。
优选地，上述注射制剂由钴的氧化物分散在临床应用的生理盐水或缓冲液中制备得到。
所述临床应用的生理盐水例如可以是质量分数为0.9％的氯化钠溶液，所述临床应用的缓冲液例如可以是pH＝7～9的PBS缓冲溶液。
优选地，上述注射制剂还可以包含有葡萄糖、甘油、乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、溶解剂、缓冲剂、止痛剂、稳定剂等药学上可接受的物质。
优选地，每毫升注射制剂中含有1～20mg钴的氧化物。
更优选地，每毫升注射制剂中含有5～10mg钴的氧化物。
本发明的另一目的在于提供一种肿瘤光治疗剂，其中包含有钴的氧化物，所述钴的氧化物选自CoO、Co2O3、Co3O4中的至少一种。
优选地，上述钴的氧化物为Co3O4。
优选地，上述钴的氧化物的粒径为50nm～500nm。
更优选地，上述钴的氧化物的粒径为50nm～200nm。
发明人需要说明的是对于上述光治疗剂的施用量没有特别的规定，可以依据所要治疗的肿瘤的大小以及患肿瘤生物体的患病阶段进行确定。
发明人还需要进一步说明的是，在不丧失光热及光动力性能的提前下，可对钴的氧化物进行化学修饰，使之具有亲水性、生物相容性等性能。
本发明的有益效果是：
1、经试验证明，钴的氧化物具备良好的光热转换性能、光动力性能及优异的光热稳定性，应用于光治疗肿瘤具有显著的效果，且对生物体不具有毒副作用、安全、可靠。
2、本发明开发了钴的氧化物的新用途，提高了钴的氧化物的经济价值，也为钴的氧化物在制备光治疗肿瘤中的应用提供了理论和实践基础。
3、相比于现有技术的贵金属，本发明的钴的氧化物价格低廉，成本大大降低，因而更有利于实际应用。
附图说明
图1：(A)为制备的材料的扫描电镜图；(B)为制备的材料的XRD图；
图2为不同浓度的纳米Co3O4的光热曲线图；
图3为纳米Co3O4的光热稳定性分析图；
图4：(A)为只加入PBS后的ROS效应图；(B)为加入纳米Co3O4的PBS分散液后的ROS效应图；(C)为加入PBS后并进行近红外光照射后的ROS效应图；(D)为加入纳米Co3O4的PBS分散液后进行近红外光照射后的ROS效应图；
图5：(A，B)为荷瘤小鼠注射纳米Co3O4的PBS分散液和PBS溶液进行光治疗后瘤内温度随时间变化图；(C)为不同治疗组治疗一天后的肿瘤组织病理切片图；(D)为不同治疗组的小鼠体内相对肿瘤体积随时间变化图；(E)为不同治疗组治疗后的小鼠存活率；(F)为不同治疗组治疗后小鼠体重的变化图；
图6：纳米Co3O4体内毒性实验。
具体实施方式
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
1、纳米Co3O4材料的制备：
依据(孔状Co3O4纳米片和纳米棒的选择性合成和表征，无机化学学报，2010，26，8：1394-1398)文献制备纳米Co3O4材料，具体步骤如下：
1)将1mmol氯化钴和2mmol氟化铵溶于24mL去离子水中，搅拌30min，后缓慢加入2.0mmol的氢氧化钠，继续搅拌30min，得混合溶液；
2)将步骤1)中的混合溶液转移至100mL的反应釜中，于120℃反应6h，后冷却至室温，过滤，并用乙醇和水反复洗涤至中性，于50℃真空干燥4h；
3)将步骤2)干燥后的材料于400℃马弗炉中煅烧2h，得纳米Co3O4材料。
由图1(A)可知：制备的材料的粒径约为50～500nm；
由图1(B)可知：本发明成功制备出纳米Co3O4材料。
2、不同浓度的纳米Co3O4的光热试验：
称取20mg上述制备得到的纳米Co3O4，加入2mL的超纯水，配制成10mg/mL的分散母液，后稀释成0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/mL的分散液，将不同浓度的分散液置于波长为808nm的激光器(上海西龙光电科技有限公司)下以1.0W/cm2功率照射10min，用热成像仪记录温度随时间的变化，水作为对照组，结果见图2；
由图2可知：在同样的光照密度条件下，对比未加入纳米Co3O4的对照组，加入纳米Co3O4的分散液的温度均出现升温的现象，且随着纳米Co3O4含量的升高，其分散液的温度也逐步升高，呈现浓度依赖性，这说明纳米Co3O4具有良好的光热转换性能。
3、纳米Co3O4的热稳定性分析试验：
将1mg/mL的纳米Co3O4分散液(超纯水配制)，在波长为808nm的激光器下以1.0W/cm2功率照射10min，测试连续4次开关照射条件下的升温/降温循环的温度变化情况，结果见图3；
由图3可知：纳米Co3O4经过4次升温/降温循环测试后，其升温能力依旧保持在正常范围内，这说明纳米Co3O4的光热稳定性不受光热转换过程的影响，具有良好的光热稳定性。
4、纳米Co3O4在肿瘤细胞内产生ROS效应：
用DEME+10％FBS培养液培养4T1乳腺癌细胞(购于ATCC)，待细胞培养2天后，将4T1乳腺癌细胞转入96孔板中，每孔104个细胞，分为4组，分别为：
A：PBS组，即只加入PBS缓冲溶液且不进行近红外光照射；
B：纳米Co3O4分散液组，不进行近红外光照射；
C：PBS+近红外光照射组；
D：纳米Co3O4分散液+近红外光照射组；
每组3个重复样，B、D中的纳米Co3O4分散液均用1×PBS缓冲液配制成的0.2mg/mL纳米Co3O4分散液，C、D的近红外光照射为在波长为808nm的激光器下以2W/cm2照射15min，后在上述4组试验组中均加入10μmol/L DCFH-DA，孵育2h，后在荧光显微镜下观察，结果见图4；
由图4可知：只有D组能产生ROS效应，这说明纳米Co3O4还具有较强的光动力效果。
5、纳米Co3O4用于肿瘤小鼠的光治疗试验：
用DEME+10％FBS培养液培养4T1乳腺癌细胞(购于ATCC)，培养传代，每只小鼠注射106个4T1乳腺癌细胞，将其皮下注入BALB/c小鼠体内，建立BALB/c小鼠荷4T1乳腺癌细胞模型，待肿瘤体积为100mm3时，将荷瘤小鼠随机分成四组治疗组，分别为：
(1)PBS组，即只加入PBS缓冲溶液且不进行近红外光照射；
(2)纳米Co3O4分散液组，不进行近红外光照射；
(3)PBS+近红外光照射组；
(4)纳米Co3O4分散液+近红外光照射组；
每组5只小鼠，纳米Co3O4分散液和PBS均采用瘤内注射的方式给药，(3)和(4)中的纳米Co3O4分散液均用1×PBS缓冲液配制成2mg/mL的纳米Co3O4分散液，且注入小鼠体内的纳米Co3O4的量为5mg/kg(按钴元素的量计)，给药后，将(3)和(4)小鼠的肿瘤部位分别置于波长为808nm，光照强度为1W/cm2的近红外光下照射10min(只照射一次)，并用热成像仪记录小鼠体内肿瘤部位温度随时间的变化，后按正常喂养方式喂养上述小鼠，每2天记录肿瘤体积和小鼠体重，连续记录26天，结果见图5；
由图5(A)、(B)可知：近红外光照射纳米Co3O4组的小鼠瘤内温度开始急剧上升，后平缓上升至58℃，而近红外光照射的PBS组的小鼠瘤内温度刚开始有微弱的上升，后基本保持不变，其瘤内温度远低于近红外光照射的纳米Co3O4组，可见，纳米Co3O4在小鼠瘤内具有良好的光热转换性能；
由图5(C)可知：PBS组、纳米Co3O4分散液组、PBS+近红外光照射组在治疗1天后，其肿瘤细胞均未出现明显的坏死，而纳米Co3O4分散液+近红外光照射组在治疗1天后，其肿瘤细胞出现明显坏死的现象；
由图5(D)可知：纳米氧化钴分散液+近红外光照射组的相对肿瘤体积随着时间的增长并没有出现增大的趋势，而其余3组的相对肿瘤体积随着时间的增长均出现急剧增大的趋势，无肿瘤抑制效果，在第26天时，纳米氧化钴分散液+近红外光照射组与其余3组的相对肿瘤体积达到显著的差异；
由图5(E)可知：纳米氧化钴分散液+近红外光照射组的小鼠在第60天时其存活率为100％，而其余3组小鼠在第30天左右均出现不同程度的死亡，其存活率均出现不同程度的下降，到第60天时，其存活率均为0；
由图5(F)可知：纳米氧化钴分散液+近红外光照射组的小鼠在治疗前后的体重与其余治疗组一样没有出现明显上升或下降的现象，这说明纳米氧化钴对小鼠无毒副作用，安全，可靠；
以上数据表明，纳米Co3O4在光治疗肿瘤中具有显著的效果。
6、纳米Co3O4体内毒性实验：
每组5只小鼠，纳米Co3O4分散液和PBS均采用尾静脉注射的方式给药，纳米Co3O4分散液均用1×PBS缓冲液配制成2mg/mL的纳米Co3O4分散液，且注入小鼠体内的纳米Co3O4的量为5mg/kg(按钴元素的量计)，给药后在第1天、第7天和第30天，收取老鼠的心肝脾肺肾，用HE染色观察病理损伤，结果见图6；
由图6可知：第1天、第7天及第30天的心肝脾肺肾均无明显的病理损伤，表明我们的纳米Co3O4对生物体不具有毒副作用、安全、可靠。

Claims (7)

1.钴的氧化物在制备肿瘤光治疗剂中的应用；所述钴的氧化物为Co3O4；所述肿瘤为浅表实体肿瘤；所述Co3O4的制备方法为：1)将1mmol氯化钴和2mmol氟化铵溶于24mL去离子水中，搅拌30min，后缓慢加入2 .0mmol的氢氧化钠，继续搅拌30min，得混合溶液；2)将步骤1)中的混合溶液转移至100mL的反应釜中，于120℃反应6h，后冷却至室温，过滤，并用乙醇和水反复洗涤至中性，于50℃真空干燥4h；3)将步骤2)干燥后的材料于400℃马弗炉中煅烧2h，得纳米Co3O4材料。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述钴的氧化物的粒径为50 nm～500 nm。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤光治疗剂还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤光治疗剂为注射制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述注射制剂选自注射粉针剂或注射液。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述注射制剂由钴的氧化物分散在临床应用的生理盐水或缓冲液中制备得到。
7.根据权利要求4或6所述的应用，其特征在于：每毫升注射制剂中含有1～20 mg钴的氧化物。
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