CN115137845A - 一种含动态亚胺键的金属有机框架共价同时固载阿霉素和卟啉复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种含动态亚胺键的金属有机框架共价同时固载阿霉素和卟啉复合物及其制备方法和应用。将ZIF‑90和5,10,15,20‑四（4‑氨基苯基）卟啉混合反应，通过卟啉上的氨基与ZIF‑90上醛基反应，制备得到亚胺键共价固载的ZIF‑TAPP。再以ZIF‑TAPP和DOX反应得到ZIF‑TAPP‑DOX。本发明制备的复合物利用纳米金属有机框架的EPR效应，通过共价修饰的方法赋予无靶向性的化疗药物以及光敏剂靶向性，有效富集到肿瘤区域。具有优异的化学‑光热‑光动力的协同放大治疗，实现对肿瘤的CT/PDT/PTT联合放大治疗，其治疗效果远远优于单独的或者双疗法治疗。

Description

一种含动态亚胺键的金属有机框架共价同时固载阿霉素和卟 啉复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种含动态亚胺键的金属有机框架共价同时固载阿霉素和卟啉复合物及其制备方法和应用。

背景技术

近些年来，中国癌症的发病率和死亡率都呈上升趋势，癌症状况不容乐观，癌症的有效治疗是迫切需要解决的难题。目前，癌症的治疗方法还是以传统的手术切除为主，手术疗法虽然具有一定的治疗效果，但是也存在局限性。通过手术切除，能够解决肿瘤的占位性压迫，但由于肿瘤的复杂性、多样性和异质性，单一的治疗手段无法完全消除肿瘤细胞，也无法解决肿瘤细胞的转移和扩散问题，因而多配合使用放射性疗法和化疗，其中化疗由于适用性更高而受到广泛的关注。但由于肿瘤结构较为致密，因此，化疗药物难以有效传递到肿瘤区域。提高药物使用量可以达到预期治疗效果，但同时也会产生较大的毒副作用，很容易诱发机体的耐药性。因此，提高癌症治疗药物的靶向性和有效性，减少药物的耐药性仍是充满挑战的研究方向。

目前，科学家们已经开发出一些纳米级的载药系统，并对其应用于肿瘤治疗的效果进行了研究。结果显示，纳米载药系统由于其自身特点，能够被动或主动地聚集到肿瘤部位，选择性地释放负载药物，延长作用时间，提高药物的生物利用率，在癌症治疗中展示出独特优势，具备良好的应用前景。因此，纳米载药系统得到了广泛关注，具有良好的临床应用前景。

与其他类型的药物释放系统相比，基于多孔材料的药物释放系统可以通过功能化设计，将光疗、酶疗、免疫疗法等多种方法，集中到单个的平台上，利用它们之间的协同增效作用，弥补单一治疗方法的缺陷，从而产生1+1＞2的协同放大的治疗效果，而且有利于降低交叉耐药性。目前，基于多孔材料的载药系统的相关研究尚处于发展的起步阶段，在载药系统的功能化设计、生物可吸收性、实际抗癌效果等方面，仍有许多问题需要克服。例如申请号为：202111475996.8的专利公开了一种卟啉-硒醚-阿霉素复合纳米颗粒及其制备方法和应用，将光敏剂卟啉和硒醚制备成具有光活性的多孔有机聚合物，再负载阿霉素，达到光-化学-化学动力学疗法协同高效治疗肿瘤的目的。该专利虽然能实现光化热-化学-化学动力学治疗，但该专利是通过物理吸附的方法进行药物负载，使得复合物靶向性差，药物会在正常的生理环境中释放，而且大片状的结构，使得载体的胞吞能力变弱，在肿瘤内部的特异性释放能力不高。另外受GSH响应的双硒键的数量限制，对肿瘤微环境的响应性有限，起到的化学动力治疗的作用较弱。所以需要一种靶向性高、递药释药能力强、阿霉素的生物利用度更高、治疗效果更强的多孔药物释放系统，以实现肿瘤的特异性治疗。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种含动态亚胺键的金属有机框架同时共价固载阿霉素和卟啉复合物及其制备方法和应用。本发明通过化学固载的方法，利用载体和药物以及光敏剂的化学结构特点，将化疗药物和光敏剂通过动态亚胺键同时共价引入到具有肿瘤靶向性的金属有机框架中，制备新型复合物，在充分保留载体靶向性的同时，赋予了药物和光敏剂的靶向性，避免了物理吸附方法造成的药物和光敏剂的无差别释放，利用高敏感的配位键和动态亚胺键对酸性肿瘤微环境特异响应的特点实现药物和光敏剂在肿瘤部位的高选择性释放。从而实现光热-光动力的单波长治疗，以及化疗药物的特异性治疗，进而实现光热-光动力-化学治疗的协同放大治疗，显著增强治疗效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种含亚胺键的金属有机框架光热剂，由以下方法制备：

将5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉溶于甲醇，加入活化后的ZIF-90并搅拌，所述5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉、甲醇和ZIF-90的加入量之比为0.1mmol：25ml：0.24g；离心得固体产物，用甲醇洗涤后干燥得到ZIF-TAPP，即含亚胺键的金属有机框架光热剂。

将5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉、甲醇和ZIF-90按照0.1mmol：25ml：0.24g的加入量加入到100ml反应瓶，室温搅拌48h后，离心（10000 rpm, 15 min）。产物用乙醇充分洗涤，中空干燥。

优选的，所述活化的温度为100℃，活化的时间为3h。

优选的，所述搅拌的温度为室温，搅拌的时间为48h。

其中，ZIF-90的制备方法为：

将聚乙烯吡咯烷酮及2-咪唑甲醛混合搅拌溶于去离子水中，在强搅拌和超声的条件下，将溶于叔丁醇的硝酸锌加入后得到白色固体，收集固体并用甲醇洗涤浸泡，干燥后得到白色固体ZIF-90。

优选的，所述硝酸锌、2-咪唑甲醛、聚乙烯吡咯烷酮、叔丁醇和去离子水的加入量之比为0.18mmol：5.3mmol：500mg：25ml：25ml。

优选的，所述强搅拌和超声时间为5min。

优选的，所述浸泡时间为24h。

5，10，15，20-四（4-氨基苯基）卟啉的制备方法为：

在氩气氛围下，将4-硝基苯甲醛溶于丙酸，加入乙酸酐，混合搅拌均匀，逐滴缓慢滴加吡咯，滴加完毕后升温回流，冷却至环境温度，将混合物进行抽滤，依次使用足量蒸馏水及甲醇洗涤，干燥后得到黑色固体。再将所得黑色固体分散至吡啶中，升温搅拌，冷却过滤。将沉淀物用丙酮充分洗涤，干燥后，利用氯仿重结晶，得到紫色固体。将紫色固体溶于浓盐酸，加入二水合氯化二锡并加热回流，随后将溶液在冰水浴中冷却，滴加氨水调节pH至中性，过滤收集固体后用蒸馏水清洗、随后通过索氏提取用丙酮除去杂质，旋蒸以除去丙酮得紫色晶体5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉。

优选的，所述4-硝基苯甲醛、丙酸，乙酸酐、吡咯和吡啶的加入量之比为47.9mmol：100ml：7.91ml：3.3ml：55ml。

优选的，所述升温回流的温度为120℃，时间为30min。

优选的，所述分散升温搅拌的温度为120℃，时间为1h。

优选的，紫色固体、浓盐酸和二水合氯化二锡所加量之比为1.1g：100ml：20mmol。

优选的，加入二水合氯化二锡加热回流的温度为70℃，时间为1h。

本发明的第二方面，提供含亚胺键的金属有机框架光热剂在制备ZIF-TAPP-DOX复合物或制备靶向递药系统中的应用。

本发明的第三方面，提供一种含亚胺键的金属有机框架负载阿霉素复合物，由以下方法制备：将阿霉素和ZIF-TAPP加入水中室温避光搅拌，将搅拌后的液体离心，收集固体，真空避光室温干燥得到ZIF-TAPP-DOX复合物；

所述ZIF-TAPP和阿霉素的质量比为（1~3）:（1~3）。

本发明的第四方面，提供含亚胺键的金属有机框架负载阿霉素复合物在制备肿瘤化疗（CT）/光动力治疗（PDT）/光热治疗（PTT）联合治疗产品中的应用。

优选的，所述肿瘤的光热治疗和光动力治疗的激光波长为638nm。

优选的，所述肿瘤的细胞为人肺癌细胞A549。

本发明的有益效果：

（1）本发明成功构建了含有酸敏感的亚胺键的多孔材料ZIF-TAPP，ZIF-TAPP纳米微粒本身具有优异的光热、光动力效果以及靶向递药释药能力。400 μg/mL的ZIF-TAPP分散液在638 nm（1.5 W/cm²）的光照下在5 min内能起到理想的光致升温效果；同时ZIF-TAPP还具有良好的重复使用能力，在经历五个循环之后，仍能够保持较好的升温能力，具有良好的光热稳定性。不仅如此，在638 nm（0.5 W.cm^-2）的激光照射下，该微粒的分散液能产生大量的ROS。

（2）本发明构建的咪唑骨架纳米载体，具有较好的载药效果、适宜的粒径可被肿瘤细胞摄取。利用纳米金属有机框架特有的EPR效应，通过共价修饰的方法同时赋予无靶向性的化疗药物以及光敏剂靶向性，有效富集到肿瘤区域。解决化疗药物非特异性释放，光敏剂聚集严重，生物利用率低的问题。合成的纳米多孔材料可以实现高效的可控药物释放。共价键有利于对低pH的肿瘤微环境的响应，从而实现阿霉素在肿瘤部位的靶向释放。

（3）本发明制备的ZIF-TAPP 、ZIF-TAPP-DOX溶血率均未超过4%且具有良好的生物相容性，在实现药物的靶向释放的同时还具有出色的光疗能力，由于其靶向释放的特性可以极大降低化疗药物阿霉素对正常组织的损伤。在638 nm的激发下，ZIF-TAPP能产生足够的热量及ROS，可用于杀死肿瘤细胞。同时，在体内抑瘤实验中，ZIF-TAPP微粒介导的CT/PDT/PTT联合治疗具有优异的治疗效果。更重要的是，由于药物在肿瘤内部的特异性释放，能够提高阿霉素的生物利用度，并降低阿霉素对正常组织的损伤。

附图说明

图1：5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉的核磁共振氢谱图（溶剂为氘代DMSO）；

图2：（a）2-ICA、Zn(NO₃)₂、ZIF-90的红外图谱；（b）ZIF-90、TAPP、ZIF-TAPP的红外图谱；（c）ZIF-TAPP、DOX、ZIF-TAPP-DOX的红外图谱；

图3：ZIF-90、TAPP及ZIF-TAPP的紫外吸收图；

图4：（a）ZIF-TAPP、ZIF-90、模拟ZIF-90的X射线衍射图谱；（b）ZIF-TAPP、DOX、ZIF-TAPP-DOX的X射线衍射图谱；（c）ZIF-TAPP的固态核磁谱图；

图5：（a）ZIF-90的SEM；（b）ZIF-TAPP的SEM；（c）ZIF-TAPP-DOX的SEM；（d）ZIF-90的TEM；（e）ZIF-TAPP的SEM；（f）ZIF-TAPP-DOX的TEM；（g）ZIF-TAPP的mapping；

图6：ZIF-TAPP的热重分析图；

图7：（a）ZIF-90、ZIF-TAPP与ZIF-TAPP-DOX的低温氮气吸脱附等温线；（b）BJH模型计算的孔径分布图；

图8：阿霉素的标准曲线图；

图9：（a）ZIF-TAPP-DOX在不同pH值的释放缓冲液中的药物累积释放曲线图；（b）不同pH值下ZIF-TAPP-DOX的Zeta电位图；

图10：（a）不同浓度的ZIF-TAPP 溶液在激光（1.5 W/cm²）照射下的温度变化曲线图；（b）ZIF-TAPP（400 μg/mL）在不同功率密度的激光照射下的温度变化曲线图；（c）400 μg/mL的ZIF-TAPP在638 nm（1.5 W/cm²）激光照射下的热成像；

图11：（a）ZIF-TAPP在激光照射下5次升温降温循环的温度变化曲线；（b）400 μg/mL的ZIF-TAPP在激光照射下的升温降温图；（c）400 μg/mL的ZIF-TAPP 的光热转化线性拟合图；

图12：（a）ZIF-TAPP与DPBF混合后过638 nm（0.5 W/cm²）激光照射5 min后紫外光谱图，曲线由下至上为5至0min的紫外光谱图；（b）DPBF在417 nm处在不同处理条件下的紫外吸收值变化曲线图（激光: 638 nm, 0.5 W/cm²）；

图13：ZIF-TAPP-DOX分别与A549细胞孵育不同时间DOX的荧光图（比例尺为50 μm）；

图14：ZIF-TAPP-DOX在不同介质中与A549细胞孵育后的荧光图像（比例尺为50 μm）；

图15：（a）ZIF-TAPP在不同浓度下对A549及L929细胞的毒性（三角形代表A549细胞，正方形代表L929 细胞）柱状图；（b）经不同浓度的DOX的A549细胞的细胞活力图；（c）不同浓度的ZIF-TAPP经638 nm 激光（1.5 W/cm²）照射5 min后细胞活力柱状图；（d）A549细胞经不同处理后细胞活力柱状图（正方形为不同浓度的ZIF-TAPP-DOX处理，圆形为不同浓度的ZIF-TAPP-DOX+Vc+638 nm激光处理，三角形为不同浓度的ZIF-TAPP-DOX+冷却+638 nm激光处理，菱形为ZIF-TAPP-DOX+638 nm激光处理）；

图16：不同处理条件下A549细胞的活死染色图；

图17：不同处理条件下，A549细胞中活性氧的产生荧光图；

图18：不同浓度的ZIF-TAPP的溶血效果图；

图19：注射不同制剂12 h后，小鼠热成像图；

图20：注射ZIF-TAPP-DOX和DOX后，不同时间点主要脏器及肿瘤部位的荧光图像；

图21：治疗21天后，各组小鼠肿瘤照片；

图22：（a）治疗过程中小鼠体重变化图；（b）不同处理组21天后小鼠肿瘤部位的H&E染色图；

图23：不同处理组21天后小鼠主要器官H&E染色图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，纳米载药系统得到了广泛关注，具有良好的临床应用前景，但基于多孔材料的载药系统的相关研究尚处于发展的起步阶段。

基于此，本发明的目的是提供一种含有亚胺键的金属有机框架复合物及其制备方法和应用。本发明利用具有肿瘤靶向性的且对酸敏感的ZIF骨架与具有光敏特性的卟啉共价偶联，制备了ZIF-TAPP纳米系统。再以化疗药物阿霉素为负载药物，利用ZIF-TAPP骨架的多孔性，通过氨基与ZIF-TAPP上氨基的席夫碱反应，制备出ZIF-TAPP-DOX。利用配位键以及动态亚胺键在酸性条件下水解的特点，构建了具有智能响应性的靶向递药系统，在靶向释放的同时还具有出色的光疗能力，成为对肿瘤的CT/PDT/PTT联合治疗的治疗剂。ZIF-TAPP在酸性条件下裂解后，阿霉素逐渐从ZIF-TAPP中释放出来，同时利用卟啉的光敏特点，以阿霉素为负载药物，在靶向释放的同时还具有出色的光疗能力，成为对肿瘤的CT/PDT/PTT联合治疗的治疗剂。通过共价键的固载，本发明制备的ZIF-TAPP-DOX，一方面可以有效解决光敏剂聚集、靶向性差的限制，增强光敏剂的生物利用度，另一方面，利用载体的靶向性，可以解决药物在人体非特异性释放的问题，增强药物的利用度，提高治疗效果，减轻对人体的副作用。

本发明基于肿瘤细胞微环境呈酸性且含有H₂O₂的特点，通过化学固载的方法，利用纳米载体和药物以及光敏剂的化学结构特点，将化疗药物和光敏剂通过动态亚胺键同时共价引入到具有肿瘤靶向性的金属有机框架中，制备新型复合物，在充分保留载体靶向性的同时，赋予了药物和光敏剂的靶向性，避免了物理吸附方法造成的药物和光敏剂的无差别释放，利用高敏感的配位键和动态亚胺键对酸性肿瘤微环境特异响应的特点实现药物和光敏剂在肿瘤部位的高选择性释放。同时利用肿瘤部位双氧水过量的特点，实现光热-光动力的单波长治疗，以及化疗药物的特异性治疗，进而实现光热-光动力-化学治疗的协同放大治疗，显著增强治疗效果。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：ZIF-TAPP-DOX复合物的制备

（1）ZIF-90的合成：向单口瓶中加入硝酸锌（56.4 mg，0.18 mmol）、25 mL叔丁醇搅拌至溶解。将500 mg聚乙烯吡咯烷酮及2-咪唑甲醛（480 mg，5.3 mmol）加入到25 mL去离子水中，充分搅拌至完全溶解。在强搅拌和超声的条件下，将含硝酸锌的叔丁醇加入到上述溶液中。5 min后形成白色沉淀，随后将粗产品进行离心（10000 rpm，8 min）并用过量甲醇洗涤三次。将样品继续在甲醇中浸泡24 h，随后在室温下真空干燥12 h。

（2）5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉的合成：氩气氛围下，将4-硝基苯甲醛（7.25 g，47.9 mmol）溶于100 mL丙酸，用注射器加入7.91 mL乙酸酐，混合搅拌均匀，逐滴缓慢滴加3.3 mL新蒸吡咯，滴加完毕后升温至120 ℃回流30 min。反应完毕后，冷却至室温，将混合物进行抽滤，依次使用足量蒸馏水及甲醇洗涤，直至滤液无色，滤饼置于真空干燥箱中，干燥过夜，得到黑色固体。将上述所得粗产物分散到55 mL吡啶中，升温至120℃搅拌1 h，冷却过滤。将沉淀物用丙酮充分洗涤，干燥后，利用氯仿重结晶，得到紫色固体（1.05g，yield = 13%）。

（3）ZIF-TAPP的合成：ZIF-TAPP由ZIF-90和5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉反应制得。将5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉（67.5 mg，0.1 mmol）加入到50 mL圆底烧瓶中，加入25 mL甲醇至完全溶解，然后加入在100 ℃真空干燥箱中活化3 h的 ZIF-900.24g。将两种单体加入到单口瓶中，在室温下搅拌48 h，离心（10000 rpm，10 min）得到粗产物。将粗产物用过量甲醇洗涤至无色，室温真空干燥12 h。

（4）ZIF-TAPP-DOX载药纳米粒的制备 分别将质量比为3:1的ZIF-TAPP和DOX加入带磁子的棕色试剂瓶中，分别加入2 mL超纯水，搅拌过夜，离心（10000 rpm，10 min），弃上清，获得ZIF-TAPP-DOX载药纳米粒。

实施例2：

与实施例1的区别在于：步骤（4）中，ZIF-TAPP和DOX的质量比为2:1。

实施例3：

与实施例1的区别在于：步骤（4）中，ZIF-TAPP和DOX的质量比为1:1。

实施例4：

与实施例1的区别在于：步骤（4）中，ZIF-TAPP和DOX的质量比为1:2。

实施例5：

与实施例1的区别在于：步骤（4）中，ZIF-TAPP和DOX的质量比为1:3。

实施例6：表征

（1）本发明通过席夫碱缩合将咪唑醛（ZIF-90）和5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉制备含有亚胺键的金属有机框架。图1为5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉的核磁共振氢谱图，同先前所报道的结果一致。又通过图2 a所示，ZIF-90的红外光谱谱图与2-咪唑甲醛（ICA）不同，ICA配体在1200-1400 cm^-1附近的峰在与金属离子配位后变得清晰。其中1455 cm^-1、1360 cm^-1、1170 cm^-1、951 cm^-1、795 cm^-1处的吸收峰归因于ZIF-90中咪唑基。除此之外，在2850 cm^-1以及1678 cm^-1处的吸收峰则是醛基中C-H和C=O的伸缩振动。不仅如此，在ZIF-90的X射线衍射图与ZIF-90单晶的射线数据的模拟图高度匹配（图4 a），验证了ZIF-90的构建成功。

（2）傅里叶红外变换光谱由图2 b所示，ZIF-TAPP的结合了两种原料的特征，其中ZIF-90中位于2850 cm^-1醛基的C-H键消失，位于1678 cm^-1的C=O键的峰强度明显下降，残余的峰可能是对应材料边缘未缩合的官能团。此外，在ZIF-TAPP的红外光谱中出现了新的特征峰，这是-C=N（1672 cm^-1）的伸缩振动峰。ZIF-TAPP的固态核磁碳谱显示了-C=N中碳在151ppm处的特征峰以及卟啉单体的特征峰。

（3）如紫外光谱扫描（图3）所示，ZIF-90没有特征吸收带，但将卟啉结合到ZIF-90上之后，在400-500 nm光谱范围内显示出强而宽的吸收带，这明显不同于游离卟啉的吸收带，意味着卟啉和ZIF-90复合物的形成，而非简单的物理混合物。

（4）为了确定ZIF-TAPP的晶体结构是否发生变化，进一步测试了ZIF-TAPP粉末的X射线衍射。通过图4 a可以看到，ZIF-TAPP的峰与ZIF-90测试所得谱图也是高度重合的，说明5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉的修饰并未改变ZIF骨架的结构。图4 b为ZIF-TAPP、DOX以及ZIF-TAPP-DOX的X射线衍射图，结果显示，在不同的散射角处有许多尖锐而强烈的峰，显示了ZIF-TAPP和DOX的高度结晶性质。然而，在ZIF-TAPP-DOX的衍射图谱中，并未观察到阿霉素的特征峰。说明DOX载入了ZIF-TAPP框架中。

（5）通过电镜观察多孔材料的形貌和多孔形态。图5 a、d显示ZIF-90纳米晶分布均匀，具有规则的立方体形貌。图5 b、e可看出，经过TAPP修饰后，ZIF-TAPP的形貌与ZIF-90相比有了明显的变化，最初的晶体形状变得模糊不清，边缘趋于模糊，除此之外，ZIF-TAPP可以观察到明暗交错的孔隙存在，在负载DOX后（图5 c和5 f），大体形貌并没有发生明显变化，但孔的部分能观察到得到明显填充。ZIF-TAPP的元素映射谱（图5 g）显示各元素分布均匀，这进一步揭示了ZIF-90上TAPP的均相生长。

（6）由图6 ZIF-TAPP的热重分析图可看出在温度升到800℃过程中，质量百分比始终变化较为平缓，未出现骤降，表明ZIF-TAPP在受到激光照射产热期间，不会因为温度的变化导致其本身发生分解。更重要的是，升温至800℃时，ZIF-TAPP其质量仍占初始质量的63%以上，表明其具有较好的热稳定性。

（7）ZIF-90、ZIF-TAPP的经低温氮气吸附-脱附测试可证明其多孔结构，结果如图

7 a所示，ZIF-TAPP的等温线符合IUPAC分类中的Ⅳ型，在低压范围内（P/P0 <0.01）气体吸附量增加，而且在中压范围（0.3 < P/P0 < 0.8）内有回滞环的存在，这是典型的介孔材料。不仅如此，ZIF-TAPP及ZIF-TAPP-DOX的氮吸附曲线在高压区（0.9 < P/P0）又出现吸附量的快速增加，这表明，还有大孔的存在，这可能是由于各纳米晶体堆叠。ZIF-TAPP的BET表面积测量值为15.975 m²/g，但是在DOX负载之后，比表面积急剧下降至5.7653m²/g，并且在负载DOX之后可以看到其氮吸附曲线低压区吸附量降低，这可能是因为材料的微孔被阿霉素填充。经Barret-Joyner-Halenda（BJH）（图7 b）模型计算绘制的孔径分布（PSD）曲线也可以直观地观察到分级孔隙，其中ZID-TAPP-DOX中微孔的峰几乎消失，与氮吸附曲线的结果吻合。

（8）为了研究阿霉素在ZIF-TAPP-DOX中的加载和释放行为，用紫外分光光度计在483 nm波长下得到了DOX的标准曲线，如图8所示，可以确定药物的浓度与紫外吸收值呈良好的线性关系，y = 0.002x + 0.0229，R² = 0.9991。

（9）测量药物的负载量及包封率，在不同比例的药物和载体比值下，载药量与包封率结果如表1所示，随着投料比ZIF-TAPP: DOX的降低，阿霉素的包封率逐渐达到69.26%。之后，随着纳米材料质量的增加，包封率的增长趋势减缓。因此，选择3:1作为后续实验的最佳质量比。

表1 不同比例下的载药量包封率（Mean ± SD, n = 3）

（10）考查ZIF-TAPP的pH刺激响应性药物释放行为，如图9 a所示，与pH = 7.40时阿霉素的缓慢释放速率相比，pH=6.50和5.50时的释放速度快得多，而且在酸性条件下，阿霉素的累计释放量远高于中性条件下的释放，这归因于酸性环境诱导ZIF-TAPP纳米颗粒的分解。带正电荷的纳米颗粒会促进细胞摄取，因为它们对带负电荷的细胞膜具有高亲和力。如图9 b所示，随着pH的下降，ZIF-TAP-DOX的Zeta电位由负变正，这可能是ZIF-90上的咪唑环质子化所导致的。

（11）通过图3可知，ZIF-TAPP纳米粒子溶液在300-800 nm区域具有光谱吸收，这一结果表明ZIF-TAPP纳米粒子在近红外区具有增强的吸收，可能具有光热特性。用638 nm的激光垂直照射ZIF-TAPP纳米粒子分散液5 min，收集温度变化来测定其光热效应。图10显示，当激光强度和照射时间增加时，温度明显升高，此外，在室温下用638 nm激光，1.5 W/cm² 照射不同浓度ZIF-TAPP，温度上升的程度同ZIF-TAPP浓度之间具有很强的相关性。当浓度为400 μg/mL时，温度可在5 min内升至54℃，当浓度加倍至800 μg/mL时温度可升至65℃。图10 c是浓度为400 μg/mL的ZIF-TAPP纳米粒子在1.5 W/cm² 的光照下在5 min内逐渐产生明亮的热图像，结果直观地表明纳米材料在光照下可以产生热。

（12） 通过ZIF-TAPP在激光照射下5次升温降温循环的温度变化曲线（图11a）所示，ZIF-TAPP即使在五次照射的开、关循环后仍然能进行稳定的光热转化，表明ZIF-TAPP纳米粒子具有良好的光热稳定性，证明其具有重复治疗的效果。对于肿瘤光热治疗中的光热材料，需要更高的光热转化效率，这意味着用更少的光能达到治疗温度，而不会对周围组织造成损伤。为了计算光热转换效率，测量了ZIF-TAPP纳米粒子在有/无激光照射的温度变化，通过比较冷却时间与温度变化的关系，得到了ZIF-TAPP水分散液的传热时间常数（图11c）。计算得到ZIF-TAPP纳米颗粒的光热转换效率为16.41%。

用Roper' s法测定ZIF-TAPP的转化率(η)，根据公式1计算：

η=[h×S×（T_max-T_surr）-Q_dis]/[I×（1-10^-A638）]（1）

在上述公式中，"h" 是导热系数；S是激光照射区域；T_max是最大平衡温度（55℃）；T_surr是周围环境温度（28℃）；Q_dis是溶剂和容器热量耗散值（25.03 mW）；I表示激光照射电流；A⁶³⁸是ZIF-TAPP（400 μg/mL）在波长为638 nm处的吸光值（0.4586）。

根据以下公式2测定hS值：

=

（2）

公式2中m_i是ZIF-TAPP的质量（400μg）；

是去离子水的热容（4.2 J/g）S是激光照射区域。

t = −

sln（θ） （3）

θ =

（4）

公式3中

是

和

的比值，t是最高温度降温到室温所用的时间。

是指冷却时间的斜率与温度的负自然对数。

（13）借助DPBF作为活性氧探针，研究ZIF-TAPP 纳米材料在光照后ROS的生成情况。如图12所示，DPBF在425 nm处的吸光度随着照射时间的增加持续下降，当ZIF-TAPP在激光照射5min之后，吸光强度下降了89%，荧光强度下降程度呈明显的时间依赖性。维生素C是一种常用的还原剂，可以清除活性氧，在加入维生素C后吸光度的降低得到了明显的抑制。在对照组中，在没有ZIF-TAPP纳米颗粒的情况下，DPBF在激光照射下变化可以忽略，以上实验证明ZIF-TAPP在照射下可以产生ROS，具有PDT的潜力。更为重要的是，PDT和PTT是在单波长的激发下实现的，这对肿瘤光疗具有重要意义，可以避免二次激光，节省治疗时间，减轻患者的负担。

试验例1 ：体外纳米载体细胞摄取实验

作为一种pH特异性响应药物载体，首先评估细胞对ZIF-TAPP的吞噬能力。用激光共聚焦显微镜观察ZIF-TAPP-DOX的细胞摄取，将A549细胞以2×105个/孔的密度接种于底部放置盖玻片的6孔细胞培养板，孵育12 h。ZIF-TAPP-DOX在37 ℃下分别孵育0 h、3 h、6h。弃去培养基，PBS洗涤3次，4% 多聚甲醛固定10 min，弃去多聚甲醛，用PBS冲洗3次后用1μg/mL的DAPI对A549细胞进行10 min染色。最后用PBS冲洗3次以除掉多余染料。放置在载玻片上，封片，使用共聚焦显微镜进行荧光成像。如图13所示，阿霉素的荧光在细胞中随着时间的延长呈逐渐上升趋势，在6 h达到最大值，表明纳米粒子被成功地吸收，ZIF-TAPP在酸性条件下裂解后，阿霉素逐渐从ZIF-TAPP中释放出来。同样，为了更好地模拟实体肿瘤的微环境，将培养基替换为不同pH的的介质，共同孵育6 h后，通过激光共聚焦显微镜观察细胞中阿霉素的荧光强度以判断摄取情况。图14显示，在更接近实体肿瘤微环境的条件下，即pH= 5.50时，肿瘤内部阿霉素的荧光强度更高，但是在pH = 7.40的条件下，也可以观察到部分荧光，这可能是来源于A549细胞本身代谢所产生的的乳酸，使得少量亚胺键断裂，导致部分阿霉素的释放。

试验例2：细胞毒性实验

细胞毒性也是评价材料生物相容的一个重要指标，由于ZIF-TAPP具有良好的活性氧生成能力和光热转化能力，可用于评价ZIF-TAPP-DOX对A549细胞的协同治疗效果。用MTT法定量分析了纳米复合材料的细胞毒性。

细胞毒性测试步骤如下：将人肺腺癌细胞（A549，来自潍坊医学院药学院）及小鼠上皮样成纤维细胞（L929，来自潍坊医学院药学院）分别以8000个/孔的密度接种到标准96孔板中，在5% CO₂的培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁。用完全培养基将不同浓度的材料按梯度配置好，向每孔中加入200 μL配置好的材料分散液（每个浓度3个复孔），空白组加入200 μL完全培养基，37 ℃条件下孵育12 h。孵育完成后，弃去培养基，向每孔中加入20 μLMTT溶液（5 mg/mL，溶剂为1640培养基），于37 ℃下孵育4 h，弃去培养基，向每孔中加入150μL DMSO，轻轻震荡10 min，用酶标仪测定490 nm处的吸光度值。细胞的相对存活率（VR）计算公式如下：

VR = A/A₀×100% （5）

其中，A是实验组的吸光度值，A₀是空白对照组吸光度值。所有数据平行测量3次。

将不同浓度的ZIF-TAPP与L929和A549共同孵育24 h，相应的细胞存活率记录如图15 a。图15 a中，柱状图上方标注正方形的，代表L929细胞的存活率，即正常细胞的存活率；柱状图上方标注三角形的，代表A549细胞的存活率。当ZIF-TAPP浓度增加至200 μg/mL时，其对L929细胞造成的死亡可忽略不计，即对正常细胞的毒性可忽略不计，细胞活力仍可保持在95±2.5%。对于A549细胞，在无光照条件下，细胞活力则是在80±5%，但是在光照条件下，细胞活力仅有18.63%。

通过对纳米载体的光学性质研究，可以得知，当功率为1.5 W/cm²时，材料即可产生理想的光热效果。而对光动力而言，在功率为0.5 W/cm²时，就可产生一定量的活性氧，根据前面经验所得，在较小功率下即可产生活性氧，功率加大后，不改变其产ROS的特性，因此选择1.5 W/cm²进行后续体内外实验。然后将不同浓度的ZIF-TAPP加到A549细胞中，然后分别在638 nm激光下照射A549细胞。在638 nm激光照射下，经ZIF-TAPP-DOX处理的细胞的存活率低于ZIF-TAPP处理的A549细胞的细胞活力，这得益于光疗与化疗的协同作用。为了更好观察联合治疗疗效，通过AM-PI联合染色实验进行评价。如图16所示，PBS和ZIF-TAPP激光处理的细胞显示出较强的绿色荧光，表明细胞死亡数量较少。DOX与ZIF-TAPP-DOX处理组的红色细胞明显多于DOX组，这是增强靶向释放的结果。激光照射后，ZIF-TAPP组和ZIF-TAPP-DOX组均出现明显的红色荧光信号，显示光疗法的加入，可显著提高疗效。

细胞内ROS的产生则是利用单线态氧探针DCFH-DA进行检测，在波长为488 nm的光激发下，可发出绿色荧光。如图17可以观察到，对照组没有绿色荧光产生，然而加入ZIF-TAPP材料孵育并施加激光照射的组，可以观察到明亮的绿色，对于加入ZIF-TAPP和维生素C的组，即便在施加激光后，也只有微弱的绿色荧光，而仅与材料共孵育却不施加激光的组，也没有荧光出现，根据以上结果，ZIF-TAPP的产热和ROS生成得到了确认。

试验例3：溶血试验

为了避免静脉注射后可能出现的溶血或血细胞聚集，进行了ZIF-TAPP的溶血实验。取小鼠血液留存于有肝素的EP管中，以3000 rpm的转速离心15 min。分离的红细胞用PBS洗涤3次，然后用PBS稀释至红细胞体积占4%。然后，将不同浓度的ZIF-TAPP（分散在PBS中）与红细胞悬浮液混合作为样品组。将等量的水与红细胞悬液混合作为阳性对照组；将等量的PBS溶液与红细胞悬液混合作为阴性对照组，所有处理组在37℃下孵育3 h，然后2000rpm离心15分钟，拍照记录。然后取各组等量上清液，加入96孔板，在545 nm波长处测定OD值。溶血率计算公式如下：

如图18所示，与阳性对照组（H₂O）相比，与不同浓度的ZIF-TAPP共同孵育一定时间的血细胞仍然保持完整，并无明显破碎的红细胞。可以确定的是ZIF-TAPP在25-200 μg/mL浓度范围内无明显的溶血作用，在各浓度的ZIF-TAPP处理下，各组溶血率均小于4%，这一结果表明ZIF-TAPP具有良好的血液相容性。

试验例4：体内热成像与荧光成像实验

为了进一步验证ZIF-TAPP-DOX的靶向性和光热作用，如图19所示，采用638 nm（1.5 W/cm²，5 min）激光对静脉注射纳米颗粒的小鼠进行照射。照射5 min后，注射ZIF-TAPP-DOX的肿瘤部位温度升高至52℃。相反，在注射了生理盐水的肿瘤部位，只升温至37℃。由638 nm触发的ZIF-TAPP-DOX引发的高热进一步保证了PTT，也使ZIF-TAPP-DOX成为一个潜在的光热成像（PT）诊断试剂。

通过小动物活体成像系统测定肿瘤和器官中DOX的荧光信号，研究DOX在体内的生物分布和肿瘤靶向性。如图20所示，DOX和ZIF-TAPP-DOX组均可以在肿瘤部位蓄积，在注射12 h后达到最大值。然而，与游离DOX相比，ZIF-TAPP-DOX在肿瘤区域的药物荧光更强，蓄积量更多，同时一直到24 h时，荧光强度仍较强。DOX更高程度的累积归因于ZIF-TAPP-DOX靶向肿瘤部位导致药物在肿瘤中的特异性释放。在肿瘤的特殊环境下，动态的亚胺键容易断裂，从而高效地释放药物。在注射药物24 h后，相较于单纯的DOX组，ZIF-TAPP-DOX也展现了更强的荧光，说明其体内循环时间被有效的延长。

试验例5：体内抑瘤实验

为了评估ZIF-TAPP-DOX 复合物的体内治疗效果，构建了小鼠肿瘤模型。以A549注射到小鼠体内所长出的肿瘤块作为异种移植瘤，接种14天后肿瘤的平均体积达到100 mm³。此时将32只A549荷瘤裸鼠随机分为8组，记为实验I组~实验VIII组：

实验I组：PBS，用量与实施例1中DOX的用量相同；

实验II组：DOX：用量与实施例1中DOX的用量相同；

实验III组：TAPP+DOX：用量与实施例1中TAPP和DOX的用量相同；

实验IV组：ZIF+ DOX：用量与实施例1中ZIF-90和DOX的用量相同；

实验V组：实施例1制备的ZIF-TAPP- DOX；

实验VI组：实施例1制备的ZIF-TAPP-DOX+冷却：施加638 nm激光照射；

实验VII组：实施例1制备的ZIF-TAPP-DOX+Vc：施加638 nm激光照射；

实验VIII组：实施例1制备的ZIF-TAPP-DOX+Laser；施加638 nm激光照射；

随后，采取腹腔给药的方式每3天分别按照实验I组~实验VIII组给药一次，每隔两天记录一次小鼠肿瘤的长径和短径，评估抗肿瘤疗效，同时记录小鼠体重以判断纳米复合物的安全性。21天治疗完成后，将小鼠施以安乐死之后解剖拍照，并计算抑瘤率，所得结果见表2和图21~22。

抑瘤率=(实验I组平均体积—实验X组平均体积)/实验I组平均体积×100％；上述平均体积均为给药后的体积，X表示II……VIII。

表2

结果如表2和图21所示，与实验II组相比，实验V组的抑瘤率高于实验III组和实验IV组之和，说明ZIF与TAPP可以协同作用抑制肿瘤。实验VI组的设置相当于屏蔽了光热，实验VII组的设置相当于屏蔽了光动力；与实验V组相比，实验VIII组的抑瘤率高于实验VI组和实验VII组之和，说明实验VIII组ZIF-TAPP-DOX+激光组在化疗、光动力疗法和光热疗法的协同下，呈现出最优的抑瘤效果，表明其在体内具有最佳的抗肿瘤效果。

此外，为了进一步验证ZIF-TAPP-DOX利用CT/PDT/PTT协同治疗的效果，通过苏木精和伊红（H&E）评价各组的治疗效果。如图22 b所示，实验I组细胞核较大，肿瘤组织未出现坏死。ZIF-TAPP-DOX+激光处理的肿瘤切片明显观察到细胞核固缩或破裂，出现了大面积的细胞坏死，细胞形态变化明显，这充分说明CT/PDT/PTT的联合应用起到最佳治疗效果。上述结果表明，构建的纳米体系具有协同化疗/光治疗作用。

从图22中可以看出，经过三周的治疗后，只有游离DOX组的体重出现下降，而各组小鼠的体重变化微乎其微，说明了它们对小鼠健康没有明显影响，而且载体可以大大降低化疗药物的副作用。

同样的，为了进一步确认材料对小鼠是否产生毒副作用，我们利用H&E染色分析小鼠各主要脏器的切片。如图23所示，各主要器官的细胞形态正常，并未观察到明显的炎症和受损细胞，证明了，纳米粒子具有良好的生物安全性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种含亚胺键的金属有机框架光热剂，其特征在于，由以下方法制备：

将5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉溶于甲醇，加入活化后的ZIF-90并搅拌，所述5, 10, 15, 20-四（4-氨基苯基）卟啉、甲醇和ZIF-90的加入量之比为0.1mmol：25ml：0.24g；离心得固体产物，用甲醇洗涤后干燥得到ZIF-TAPP，即含亚胺键的金属有机框架光热剂。

2.根据权利要求1所述的含亚胺键的金属有机框架光热剂，其特征在于，所述活化的温度为100℃，活化的时间为3h。

3.根据权利要求1所述的含亚胺键的金属有机框架光热剂，其特征在于，所述搅拌的温度为室温，搅拌的时间为48h。

4.权利要求1~3任一项所述的含亚胺键的金属有机框架光热剂在制备ZIF-TAPP-DOX复合物或制备靶向递药系统中的应用。

5.一种含亚胺键的金属有机框架负载阿霉素复合物，其特征在于，由以下方法制备：将阿霉素和权利要求1~3任一项所述的含亚胺键的金属有机框架光热剂加入水中室温避光搅拌，将搅拌后的液体离心，收集固体，真空避光室温干燥得到ZIF-TAPP-DOX复合物；

所述含亚胺键的金属有机框架光热剂和阿霉素的质量比为（1~3）:（1~3）。

6.权利要求5所述的含亚胺键的金属有机框架负载阿霉素复合物在制备肿瘤化疗/光动力治疗/光热治疗联合治疗产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤的光热治疗和光动力治疗的激光波长为638nm。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤的细胞为人肺癌细胞A549。

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