CN115845086A

CN115845086A - 一种光热-类芬顿反应人工纳米酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115845086A
Application number: CN202310175497.XA
Authority: CN
Inventors: 高飞; 殷禄昌; 曹步凡; 滕晓童; 周宝龙
Original assignee: Affiliated Hospital of Weifang Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Weifang Medical University
Priority date: 2023-02-28
Filing date: 2023-02-28
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2043-02-28
Also published as: CN115845086B

Abstract

本发明公开了一种光热‑类芬顿反应人工纳米酶及其制备方法和应用。将5,10,15,20‑四[4‑(乙炔基苯基)卟啉]钴、双(三苯基膦)二氯化钯和碘化铜分散在四氢呋喃中，加入ZIF‑8，混合后，于室温下静置，然后冷冻干燥得到PZCo‑CMP；将PZCo‑CMP在N₂气氛中加热碳化得到具有类细菌结构的人工纳米酶PZCo‑800。本发明制备的PZCo‑800根据仿生学的原理，利用碳纳米管模拟细菌鞭毛，具有细菌结构，提高载体快速进入细胞的能力，并产生类芬顿反应，实现肿瘤细胞的抑制；还能将光能转化为热能，实现光热治疗，促进类芬顿反应，得到放大增强的协同治疗效果，进一步提高杀灭肿瘤细胞的能力。

Description

一种光热-类芬顿反应人工纳米酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种光热-类芬顿反应人工纳米酶及其制备方法和应用。

背景技术

目前癌症依然是世界上最致命的疾病之一。传统的癌症治疗方法包括化疗、手术、放疗等，副作用大，全身毒副作用严重，并可能导致永久性器官功能障碍和毁容。因此，开发一种对正常细胞/组织同时具有高癌症治疗疗效和低副作用的非侵入性抗癌治疗方法是非常迫切且具有挑战性的。经过几十年的发展，癌症的非侵入性治疗取得了显著的进展，如光触发光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)，以及芬顿反应介导的化学动力疗法(CDT)。然而，由于肿瘤组织固有的复杂性和异质性，肿瘤细胞会自发突变以适应外界刺激，这大大降低了这些抗癌策略的治疗效果。

与正常组织不同，肿瘤具有异常的物理微环境，如低氧、弱酸性、异常的活性氧(ROS)浓度等。肿瘤细胞中最典型的ROS为过氧化氢(H₂O₂)，其产生于肿瘤细胞的异常代谢和增殖。此外，H₂O₂可作为化学动力学治疗(CDT)的燃料，可以在弱酸性肿瘤微环境(TME)中产生羟基自由基(·OH)。而·OH具有极强的细胞毒性，可对肿瘤细胞产生致命杀伤力。CDT作为一种肿瘤特异性和深度独立性的肿瘤治疗方法，其最关键之处在于催化类芬顿反应的试剂。这决定了CDT的治疗效率。为了促进表面/界面介导的化学反应过程，类芬顿催化剂应具有较高的比表面积，适中的形貌和尺寸，以及稳定的物理化学性质，这是小分子类芬顿催化剂难以实现的。治疗剂进入细胞主要通过被动靶向的方式，但是，当粒子尺寸较大时，其被肿瘤细胞摄取的能力也会降低，粒子进入肿瘤的能力大大减弱，相应的使治疗效果大打折扣。肿瘤细菌疗法，利用具有鞭毛的较大尺寸的细菌来治疗癌症，在肿瘤治疗中表现出巨大的潜力。

纳米材料现在广泛应用于生物医学领域，其具有结构可调、高比表面积等特点。迄今为止，已成功研制出了各种用于肿瘤治疗的纳米系统。但由于TME的限制，纳米系统的治疗效率较为低下。因此，为了获得足够的疗效，人们广泛开发了能同时结合两种或多种疗法的协同治疗策略。但普遍的效率都不是很高，尤其是当纳米级的尺寸稍大时。以往的研究大多集中在复杂的多组分纳米体系上，这些体系的合成过程复杂而繁琐，存在着合成不均匀、重现性差的问题。为了解决这一问题，需要一种具有类细菌结构的纳米剂，通过模拟细菌疗法，进而实现高效的光热-芬顿联合治疗，以提高治疗效果。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种光热-类芬顿反应人工纳米酶及其制备方法和应用。本发明根据仿生学的原理制备了一种具有类细菌结构的纳米剂，通过载体表面生长的纳米管来模仿细菌的鞭毛，模拟细菌疗法。进而实现高效的光热-芬顿联合治疗，大大提高治疗效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种光热-类芬顿反应人工纳米酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）将5,10,15,20-四[4-(乙基苯基)卟啉]钴、双(三苯基膦)二氯化钯和碘化铜分散在四氢呋喃中，加入ZIF-8，超声混合后，于室温下静置，然后冷冻干燥得到PZCo-CMP；

（2）将PZCo-CMP在惰性气体中加热碳化得到人工纳米酶PZCo-800。

优选的，步骤（1）中，所述5,10,15,20-四[4-(乙基苯基)卟啉]钴由以下方法制备：

1）4-[(三甲基硅基)乙基]-苯甲醛的制备：

氩气条件下，将4-溴苯甲醛，双(三苯基膦)二氯化钯，碘化铜，溶于干燥的四氢呋喃和三乙胺，搅拌混匀，室温条件下，加入三甲基硅基乙炔，升温搅拌过夜；冷却至室温，过滤得固体，将固体溶解于二氯甲烷中，分别用水、盐酸溶液、水萃取；有机相用硫酸钠干燥，过滤，保留滤液，减压干燥得粗混合物；粗混合物通过柱层析纯化，得到无色固体4-[(三甲基硅基)乙基]-苯甲醛；

2）5,10,15,20-四(4-(三甲基硅基)乙基苯基)卟啉的制备：

将4-[(三甲基硅基)乙基]-苯甲醛溶于丙酸加热至回流温度，然后加入吡咯，混合物在回流条件下搅拌，然后冷却到室温，静置，后过滤得黑色固体，甲醇洗涤至滤液无色得到紫色固体5,10,15,20-四(4-(三甲基硅基)乙基苯基)卟啉；

3）5,10,15,20-四(4-乙基苯基)卟啉的制备：

将步骤（2）中得到的紫色固体5,10,15,20-四(4-(三甲基硅基)乙基苯基)卟啉溶于四氢呋喃中，低温条件下缓慢加入四丁基氟化铵，加入完成后，缓慢恢复温度至室温，搅拌过夜，用水和氯仿萃取，收集有机相，干燥得紫色固体5,10,15,20-四(4-乙基苯基)卟啉；

4）[5,10,15,20-四(4-(乙炔基苯基)-卟啉]钴的制备：

将步骤（3）中得到的5,10,15,20-四(4-(乙基苯基)-卟啉溶于N,N’-二甲基甲酰胺中，搅拌均匀，加入四水合乙酸钴，加热回流，冷却至环境温度；加入甲醇使其沉淀，干燥后，利用氯仿甲醇重结晶得到紫色晶体5,10,15,20-四[4-(乙基苯基)卟啉]钴。

优选的，步骤1）中，所述4-溴苯甲醛、双(三苯基膦)二氯化钯、碘化铜、四氢呋喃、三乙胺和三甲基硅基乙炔加入量之比为100 mmol:0.727 mmol: 1.2mmol:100 ml:28ml：150mmol；

优选的，所述升温温度为65℃。

优选的，步骤2）中，所述4-[(三甲基硅基)乙基]-苯甲醛、丙酸、吡咯加入量之比为：86.5 mmol:360 ml:86.4 mmol；

优选的，所述回流温度为140℃，回流的时间为3h。

优选的，步骤3）中，所述5,10,15,20-四(4-(三甲基硅基)乙基苯基)卟啉、四氢呋喃、四丁基氟化铵加入量之比为3mmol:200 ml:15 ml；

优选的，所述低温为-78℃。

优选的，步骤4）中，所述5,10,15,20-四(4-(乙基苯基)-卟啉、N,N’-二甲基甲酰胺和四水合乙酸钴的加入量之比为1.69 mmol：70 mL:1.32 mmol；

优选的，所述加热回流的温度为150℃，回流时间为1h。

优选的，步骤（1）中，所述5,10,15,20-四[4-(乙基苯基)卟啉]钴、双(三苯基膦)二氯化钯、碘化铜和ZIF-8加入量之比为0.1 mmol：0.01 mmol：0.01 mmol：10mg；

所述超声混合的频率为75W、时间为10min；

所述静置的时间为12h。

所述冷冻干燥的温度为-50℃、真空度为-0.09MPa、时间为12h。

优选的，步骤（2）中，所述惰性气体为氮气；所述碳化的温度为800℃，碳化的时间为2h，升温速率为5℃/min。

本发明的第二方面，提供上述制备方法制备得到的光热-类芬顿反应人工纳米酶。

本发明的第三方面，提供光热-类芬顿反应人工纳米酶在制备抗肿瘤药物中的应用。

即本发明提供光热-类芬顿反应人工纳米酶在制备光热治疗/化学动力治疗的联合治疗肿瘤的药物中的应用。

所述光热-类芬顿反应人工纳米酶通过638 nm的光照诱导可实现光热治疗/化学动力治疗的联合治疗。

所述肿瘤为恶性肿瘤；所述恶性肿瘤为人肺腺癌。

本发明的有益效果：

（1）本发明首次采用原位氧化偶联法使钴卟啉基共轭有机聚合物包覆ZIF-8，合成了人工纳米酶，通过638 nm的光照诱导可实现光热及化学动力协同抗肿瘤。

（2）本发明制备的PZCo-800对人体无毒副作用，这将推动多功能抗肿瘤平台的发展，为开发新型、高效智能抗肿瘤方式提供一定基础。

（3）本发明制备的PZCo-800溶血率未超过5%，具有良好的生物相容性。

附图说明

图1 ：a）PZCo-CMP的红外光谱；b）PZCo-CMP的热重分析图；c）PZCo-CMP的低温氮气吸收等温线；d）PZCo-CMP的孔径分布曲线；e）PZCo-800的X射线衍射图谱；

图2：a）PZCo-800的XPS全谱图；b）C1s的XPS谱图；c）N1s的XPS谱图；d）O1s的XPS谱图；e）Co2p的XPS谱图；f）PZCo-800的紫外光谱；

图3：PZCo-800的元素映射和能量色散分析图。a) 200 nm比例尺下PZCo-800的SEM，b）500 nm比例尺下PZCo-800的TEM，c）200 nm比例尺下PZCo-800的TEM，d）200μm比例尺下PZCo-800的TEM，e-j) O、Co、C、Zn、N元素在PZCo-800中的分布情况。k）O、Co、C、Zn、N在PZCo-800中的含量；

图4：PZCo-800的光热性能：a) 638 nm激光照射下，PZCo-800功率依赖性光热效应；b) 在1.0 W cm^-2的638 nm激光照射下，PZCo-800浓度依赖性光热效应；c) PZCo-800（200 μg mL^-1）水分散体在638 nm激光照射（1.0W cm^-2）的光热效应，其中照射持续达到平衡能够温度，然后关闭激光；d) 冷却周期与温度的负自然对数；e）638 nm激光在1.0Wcm^-2下对PZCo-800（200 μg mL^-1）进行5次光照冷却的温度变化曲线；f）PZCo-800（200 μgmL^-1）5 min内，在1.0W cm^-2的热成像图片；

图5：PZCo-800的化学动力学性能：a）pH =5.5的条件下不同处理组TMB溶液的紫外光谱(A: PZCo-800 + TMB + PBS. B: PZCo-800 + TMB + H₂O₂+ PBS. C: PZCo-800 +H₂O₂+ PBS. D: TMB + H₂O₂+ PBS)；b）PZCo-800（200 μg mL^-1）水分散体在不同pH条件下与TMB溶液反应的紫外光谱；c）pH =5.5时PZCo-800水分散体在不同浓度条件下与TMB溶液反应的紫外光谱；d）pH =5.5时PZCo-800（200 μg mL^-1）水分散体在638nm激光照射下及未经激光照射时与TMB溶液反应的紫外光谱；e) 不同处理条件下，A549细胞中活性氧的产生；

图6：a）PZCo-800在不同浓度下的溶血效果；b）PZCo-800在不同浓度下对L929细胞的毒性；c）PZCo-800在不同浓度下及不同处理条件下对A549细胞的毒性；d）不同处理条件下A549细胞的活死染色图；

图7：a）注射PZCo-800@Cy5.5后，不同时间点体内分布的荧光图像；b）注射不同制剂12 h后，使用638nm激光（1.0W cm^-2、5min）照射后小鼠肿瘤的温度变化；c）注射不同制剂12 h后，使用638nm激光（1.0W cm^-2、5min）照射后小鼠的热成像图像；

图8：a）14天治疗周期中小鼠体重变化；b）14天治疗周期中小鼠肿瘤体积变化；c）治疗14天后，各组小鼠肿瘤照片；d）不同处理组14天后小鼠肿瘤部位的H&E染色；e）不同处理组14天后小鼠主要器官H&E染色；

图9：a）PZCo-800的形貌示意图；b）PZCo-800的制备过程及作用原理示意图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，由于TME的限制，纳米系统的治疗效率较为低下。治疗剂进入细胞主要通过被动靶向的方式，但是当粒子尺寸较大时，其被肿瘤细胞摄取的能力也会降低，粒子进入肿瘤的能力大大减弱，相应的使治疗效果大打折扣。肿瘤细菌疗法可以利用大尺寸的细菌来治疗癌症，在肿瘤治疗中表现出巨大的潜力。

基于此，本发明的目的是提供一种具有类细菌结构的兼具光热-类芬顿反应活性的人工纳米酶及其制备方法和应用。本发明首次采用炔基的氧化偶联方法，利用分子间氢键、π-π作用力，首先使得反应单体钴-卟啉基吸附到模板的表面，在催化剂的存在下，通过共价键氧化偶联，得到钴-卟啉基共轭多孔聚合物(CMP)覆盖的ZIF-8复合物 (PZCo-CMP)。以制备的ZIF-8纳米颗粒为模板，利用溶剂交换、冻干法得到杂化物，同时控制杂化物的尺寸和形貌。采用冷冻干燥法制备了可再分散的纳米级PZCo-CMP，通过碳化得到具有细菌仿生结构的人工纳米酶PZCo-800。由于Co的存在，对复合物进行碳化，会得到碳纳米管生在在材料表面的具有类细菌结构的人造酶 (PZCo-800)，可以快速穿过肿瘤细胞，产生类芬顿反应，将H₂O₂转化为具有细胞毒性的羟基自由基(·OH)，实现肿瘤细胞的抑制。同时人造酶还能将光能转化为热能，促进类芬顿反应，实现光-芬顿协同治疗，进一步杀灭肿瘤细胞。

细菌疗法是利用带有鞭毛的大尺寸细菌(0.5~5 μm)，可以轻易地穿透肿瘤组织，产生惊人的效果。因此本发明开发了利用碳纳米管来模拟细菌的鞭毛，通过模拟细菌形貌以提高载体快速进入细胞的能力。通过仿生学，通过直接热解Co -卟啉基共轭多孔聚合物(CMP)包覆的沸石-咪唑酸盐框架(ZIF-8)杂化物，开发了肿瘤微环境(TME)特异性激活光热/芬顿酶(PZCo-800)选择性地在肿瘤位点上反应。碳化导致多面体颗粒表面生长鞭毛样CNTs的形成，提高了颗粒进入癌细胞的能力。PZCo-800利用酸性和过氧化氢启动芬顿样反应(CDT)，产生活性氧(ROS)杀死肿瘤细胞。此外，在激光照射(638 nm)下，PZCo-800产生的热量提供了显著的光热治疗(PTT)，增强了芬顿样治疗效果。体外和体内试验均证实PTT和CDT协同作用，对肿瘤生长的抑制率高达81.17%，远远优于单结CDT和PTT。这种微环境激活的人工纳米酶使安全可靠的癌症联合治疗成为可能。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：光热-类芬顿反应人工纳米酶PZCo-800的制备

（1）4-[(三甲基硅基)乙基]-苯甲醛的制备：

氩气条件下，将4-溴苯甲醛(18.5g, 100 mmol)，双(三苯基膦)二氯化钯(510 mg,0.727 mmol)，碘化铜(0.228mg, 1.20 mmol)，溶于干燥的四氢呋喃（100 ml）和三乙胺（28ml），搅拌混匀，室温条件下，加入三甲基硅基乙炔（14.7 g，150 mmol），升温（65 ℃）搅拌过夜。冷却至室温，过滤得固体，将固体溶解于二氯甲烷（100ml）中，依次用水（100 ml）、10wt%盐酸溶液（100 ml）、水（100 ml）萃取。有机相用硫酸钠干燥，过滤，保留滤液，减压干燥得粗混合物。粗混合物通过柱层析纯化（己烷/二氯甲烷2∶1），得到无色固体4-[(三甲基硅基)乙基]-苯甲醛(19.0 g, 95%)。

（2）5,10,15,20-四(4-(三甲基硅基)乙基苯基)卟啉的制备：

将4-[(三甲基硅基)乙基]-苯甲醛（17.5g，86.5mmol）溶于丙酸（约360mL）加热至140℃，然后加入吡咯(6 mL, 86.4mmol)。混合物在回流条件下搅拌3h，之后让其冷却到室温。静置一夜，过滤得黑色固体，甲醇洗涤至滤液无色，得到紫色固体5,10,15,20-四(4-(三甲基硅基)乙基苯基)卟啉(5.9 g, 收率27.3%)。

（3）5,10,15,20-四(4-乙基苯基)卟啉的制备：

将步骤（2）中得到的紫色固体5,10,15,20-四(4-(三甲基硅基)乙基苯基)卟啉(3g, 3 mmol)溶于四氢呋喃（200 ml）中，在-78℃下缓慢加入四丁基氟化铵（15 ml），加入完成后，缓慢恢复温度至室温，搅拌过夜，用200 mL水和3 × 200mL氯仿萃取，收集有机相，用Na2SO4干燥得紫色固体5,10,15,20-四(4-乙基苯基)卟啉(2.1 g, 产率:98.5%)。

（4）[5,10,15,20-四(4-(乙炔基苯基)-卟啉]钴的制备：

将步骤（3）中所得到的将5,10,15,20-四(4-(乙基苯基)-卟啉(1.2 g, 1.69mmol)溶于N,N’-二甲基甲酰胺（70 ml）中，混合搅拌均匀。加入四水合乙酸钴(0.328 g,1.32 mmol)，加热至150℃，回流1h。后冷却至环境温度，加入100 mL甲醇使其沉淀，收集沉淀物干燥后，利用氯仿和甲醇重结晶得到紫色晶体5,10,15,20-四[4-(乙基苯基)卟啉]钴（收率:28%）。

（5）ZIF-8的制备：

将2-甲基咪唑（20.0 g，243.59 mmol）和醋酸锌（2.8 g，9.39 mmol）分别溶解在70mL和30 mL的甲醇中。将两种溶液混合室温下搅拌4小时，后离心（11000rpm，15 min）得到白色沉淀。用无水乙醇洗涤三次，60℃干燥12 h后得到白色固体ZIF-8。

（6）PZCo-CMP的制备：

将步骤（4）中得到的5,10,15,20-四[4-(乙基苯基)卟啉]钴（0.1 mmol）、双(三苯基膦)二氯化钯(7 mg, 0.01 mmol)和碘化铜(1.9mg, 0.01 mmol)分散在四氢呋喃中。将得到的溶液与步骤（5）中得到的ZIF-8（10mg）混合，超声混合10分钟后，溶液在室温下静置。过滤后进行冷冻干燥得到了可再分散的纳米级PZCo-CMP。

（7）PZCo-800的制备：

将PZCo-CMP在N₂气氛中，800℃，5℃min^-1的加热速率下碳化2 h，得到光热-类芬顿反应人工纳米酶PZCo-800。

实施例2：表征

（1）本发明通过原位氧化偶联法使钴卟啉基共轭有机聚合物包覆ZIF-8制备了新型金属有机纳米杂化物（PZCo-CMP），对PZCo-CMP进一步碳化，制得了具有类细菌结构的催化剂PZCo-800。结果通过图1a所示，PZCo-800的FTIR光谱结合了ZIF-8（咪唑的3135、2960和1586 cm^-1）和卟啉（1575和3120 cm^-1）的特征。此外，与卟啉单体不同，还可以检测到alkynyl-alkynyl键的新振动峰。同时，峰值红移到3231cm^-1的更高波长——这归因于炔基偶联的共轭增加了π电子离域。所有这些结果表明了PZCo-800的构建成功。

（2）通过热重分析（TGA）检测了PZCo-800的热稳定性。结果通过图1b所示，PZCo-800在320℃以前时质量百分比始终变化较为平缓，未出现骤降，表明PZCo-800在受到激光照射产热期间，不会因为温度的变化导致其本身发生分解。320℃后由于多孔网络的分解，重量逐渐降低，但升温至800℃时，PZCo-800其质量仍占初始质量的77.6%，表明其具有较好的热稳定性。

（3）用低温氮气吸附测定了PZCo-800的比表面积，以及孔隙分情况。结果通过图1c所示，PZCo-800的等温线符合IUPAC分类中的Ⅳ型，在低压范围内（P/P0<0.01）气体吸附量增加，而且在中压范围（0.3<P/P0<0.8）内有回滞环的存在，这是典型的介孔材料。不仅如此，PZCo-800的氮吸附曲线在高压区（0.8<P/P0）又出现吸附量的快速增加，这表明还有大孔的存在。孔径分布进一步证实了PZCo-800的分层孔隙结构，主峰中心位于1.24 nm，同时还存在几个范围从4.1nm到80 nm的次峰。通过Brunauer-EmmettTeller（BET）方法获得的PZCo-800的比表面积为301.42 m³g^-1，累积孔体积为0.3019 cm³g^-1，这种多孔的形态有利于催化活性位点的暴露，大大提高了酶活性。

（4）通过X射线衍射（XRD）证实了PZCo-800的晶相。结果通过图1所示，观察到位于26.4°和43.6°的清晰的峰，对应于石墨碳的250（002）和（101）平面。此外，还可以检测到对应于（111）平面的44.5°处Co的特征峰（JCPDS Card No.15-806）、43.6°处Co₄N的特征峰，以及分配给253（101）和（020）平面的位于36.2°和41.3°处的f Co₂N的252特征峰（JCPDS CardNo.65-1458）。

（5）通过X射线光电子能谱（XPS）证实了PZCo-800的元素组成和表面化学状态。结果如图2a所示，C、O、N、Zn和Co作为主要元素存在于PZCo-800中。在C1s谱图中（图2b），在284.4、285.4和287.1 eV处存在三处拟合峰，分别对应于C-C/C=C、C-O/C-N和C=O/C=N；在N1s谱图中（图2c），398.4 eV处的拟合峰对应样品中的N-Co配位键，399.8 eV和400.9eV处的峰分别对应卟啉结构结构中的C-N和C=N；在O1s谱图中（图2d），经过分解之后，O1s在531.3 eV和532.7 eV处有两个拟合峰，分别归属于C-O-Co和C-OH,其中C-O-Co和C-OH来源于Co₂(COO)₄桨轮结构的金属节点和羧基。Co2p谱图（图2e）在778.8、793.9eV和781.1、796.5eV处出现了两对2p轨道峰，分别对应Co³⁺2p_3/2、Co³⁺2p_1/2和Co²⁺2p_3/2、Co²⁺2p_1/2，785.2和800 eV是Co³⁺的卫星峰，788.6和804.2 eV是Co²⁺的卫星峰。XPS测试结果表明，所设计的PZCo-800已成功制备，并且含有大量Co²⁺。

（6）透射电子显微镜（TEM）图像揭示了PZCo-800的表面形态。结果如图3a-c所示，可以清楚地观察到PZCo-800的多面体核表面生产的类似细菌鞭毛的碳纳米管结构，其纳米管直径分布在10~40nm之间，长度从几百纳米到1μm之间。此外，图9为PZCo-800的示意图及制备过程和作用过程，由图9可以看出，实施例1制备的PZCo-800利用碳纳米管来模拟细菌的鞭毛，通过模拟细菌形貌以提高载体快速进入细胞的能力。通过仿生学，通过直接热解Co-卟啉基共轭多孔聚合物(CMP)包覆的沸石-咪唑酸盐框架(ZIF-8)杂化物，开发了肿瘤微环境(TME)特异性激活光热/芬顿酶(PZCo-800)选择性地在肿瘤位点上反应。碳化导致多面体颗粒表面生长鞭毛样CNTs的形成，提高了颗粒进入癌细胞的能力。PZCo-800利用酸性和过氧化氢启动芬顿样反应(CDT)，产生活性氧(ROS)杀死肿瘤细胞。此外，在激光照射(638 nm)下，PZCo-800产生的热量提供了显著的光热治疗(PTT)，增强了芬顿样治疗效果。

（7）通过元素映射和能量色散分析揭示了PZCo-800的元素构成。从图3e-j中可以看出在PZCo-800中均匀分布着大量的C、N、O、Zn、Co元素，同时图3k显示各元素分布均匀，这进一步揭示了ZIF-8上钴卟啉基共轭有机聚合物的均相生长。

（8）用638 nm激光照射PZCo-800来测定光热效应。如图4a和4b所示，随着激光功率的增加以及浓度的增加被照射的PZCo-800分散液温度也明显上升，在功率为1.0W/ cm²时，浓度为200μg mL^-1时，温度可升至54.7℃。表明PZCo-800的光热性能具有浓度及功率依赖性。此外，还考察了PZCo-800的光热转换效率。当PZCo-800（200 µg/mL）在638 nm （1.0W/cm²）下照射时，温度升至平衡温度，停止激光照射后，温度降低至室温（图4c）。因此，通过计算的光热转换效率为45.54%。通过 ON/OFF 循环照射实验记录PZCo-800（200 µg/mL）的温度变化（图 4e）。结果表明，PZCo-800在循环5个周期后（638 nm，1.0 W/cm²）显示出良好的光热稳定性，温度的上升和冷却趋势没有明显的变化。图4f记录了PZCo-800（200 µg/mL）被638 nm （1.0W/cm²）照射5分钟时温度的变化。以上结果表明，PZCo-800具有良好的光热效应和光热稳定性，使其成为一种潜在光热治疗剂。

用Roper' s法测定PZCo-800的光热转化率(η)，根据公式1计算：

（1）

在上述公式中，"h" 是导热系数；S是激光照射区域；T _max是最大平衡温度（52.5℃）；T _surr是周围环境温度（28.5℃）；Q _dis是溶剂和容器热量耗散值（25.03 mW）；I表示激光照射电流；A638是PZCo-800（200 μg/mL）在波长为638 nm处的吸光值（0.49）。

根据以下公式2测定hS值：

（2）

公式2中m_d是PZCo-800的质量（200 μg）； QUOTE

/>

是去离子水的热容（4.2 J/g）S是激光照射区域。

（3）

（4）

公式3中

是/>

和/>

的比值，/>

是最高温度降温到室温所用的时间。/>

是指冷却时间的斜率与温度的负自然对数。/>

（9）考察了PZCo-800的芬顿反应能力。如图5a所示，只有当PZCo-800、H₂O₂共同存在于TMB溶液中时，溶液的吸光度才发生了变化，证明了PZCo-800具有芬顿反应的能力。从图5b、c中可知，PZCo-800的芬顿反应能力具有浓度及pH依赖性，当Ph = 5.5，浓度为200 μg/mL时，反应最为强烈。从图5d中可知，当混合溶液被638 nm激光（1.0 W/cm²）照射5分钟后，溶液吸光度上升，证明了光热对芬顿反应的促进作用。细胞内ROS的产生则是利用单线态氧探针DCFH-DA进行检测，在波长为488 nm的光激发下，可发出绿色荧光。在图5e中可以观察到，PBS对照组没有绿色荧光产生，对于仅与PZCo-800孵育却不施加激光的组只有微弱的绿色荧光，然而加入PZCo-800孵育并施加激光照射的组，可以观察到明亮的绿色，根据以上结果，PZCo-800 芬顿反应能力得到了确认。

试验例1：溶血试验

为了避免PZCo-800注射进入体内后可能出现的溶血或血细胞聚集，进行了溶血实验。取小鼠血液留存于有肝素的EP管中，以3000 rpm的转速离心15 min。分离的红细胞用PBS洗涤3次，然后用PBS稀释至红细胞体积占4%。然后，将不同浓度的PZCo-800（分散在PBS中）与红细胞悬浮液混合，阳性对照为水，阴性对照为PBS。所有处理组在37℃下孵育3 h，然后2000 rpm离心15分钟，拍照记录。然后取各组等量上清液，加入96孔板，在545 nm波长处测定OD值并计算溶血率。

如图6a所示，与阳性对照组相比，与不同浓度的PZCo-800共同孵育一定时间的血细胞仍然保持完整，并无明显破碎的红细胞。在浓度为200 μg/mL时，并未出现明显的溶血，即使在浓度翻倍达到400 μg/mL时，溶血率仍小于5%，这一结果表明PZCo-800具有良好的血液相容性。

试验例2：细胞毒性试验

细胞毒性也是评价材料生物相容的一个重要指标，由于PZCo-800具有良好的芬顿反应能力和光热转化能力，可用于评价PZCo-800对A549细胞的协同治疗效果。用MTT法定量分析了纳米复合材料的细胞毒性。

细胞毒性测试步骤如下：将人肺腺癌细胞（A549，来自潍坊医学院药学院）及小鼠上皮样成纤维细胞（L929，来自潍坊医学院药学院）分别以8000个/孔的密度接种到标准96孔板中，在5% CO₂的培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁。用完全培养基将不同浓度的材料按梯度配置好，向每孔中加入200 μL配置好的材料分散液（每个浓度3个复孔），空白组加入200 μL完全培养基，37 ℃条件下孵育12 h。孵育完成后，弃去培养基，向每孔中加入20 μLMTT溶液（5 mg/mL，溶剂为1640培养基），于37 ℃下孵育4 h，弃去培养基，向每孔中加入150μL DMSO，轻轻震荡10 min，用酶标仪测定490 nm处的吸光度值。细胞的相对存活率（VR）计算公式如下：

VR = A/A₀×100% （5）

其中，A是实验组的吸光度值，A₀是空白对照组吸光度值。所有数据平行测量3次。

如图6b所示，对于正常细胞，即L929细胞，当PZCo-800的浓度为200 μg/mL时，细胞的存活率达到了93.07%，即使当浓度增加至800 μg/mL时，细胞的存活率依然能够达到86.16%，这说明了PZCo-800具有良好的生物相容性。

如图6c所示，对于人肺腺癌A549细胞，当PZCo-800的浓度不断增加时，细胞的存活率不断下降，这一趋势在增加了光热治疗之后更加明显，在光热和化学动力联合治疗下，PZCo-800的浓度为200 μg/mL时，癌细胞存活率仅有18.83%，这说明了PZCo-800的联合治疗对肿瘤具有良好的杀伤作用。

为了更好观察联合治疗疗效，通过AM-PI联合染色实验进行评价。如图6d所示，PBS和PBS+激光处理的细胞显示出较强的绿色荧光，表明细胞死亡数量较少。PZCo-800处理组的红色细胞明显多于对照组，这是化学动力治疗的结果。激光照射后，PZCo-800激光组出现明显的红色荧光信号，也证明了光热治疗的加入，可显著提高疗效。

试验例3：体内荧光成像与热成像实验

为了进一步验证PZCo-800的靶向性，通过使用荧光剂Cy5.5将PZCo-800标记，合成Cy5.5@ PZCo-800，利用小动物活体成像系统测定体内Cy5.5@ PZCo-800的荧光信号，研究PZCo-800在体内的生物分布和肿瘤靶向性。如图7a所示，腹腔注射Cy5.5@ PZCo-800 6小时后，肿瘤部位出现了荧光强度蓄积，并在注射12 h后达到最大值，证明了PZCo-800具有肿瘤靶向性，这是由于EPR效应所致。在24h后，肿瘤部位的荧光强度出现了大幅衰减，说明药物已经被代谢出体内，不会在裸鼠体内过度蓄积。

为了进一步验证PZCo-800的体内光热作用，如图7b所示，采用638 nm（1.0 W/cm²）激光对腹腔注射纳米颗粒6小时后的裸鼠进行照射。照射5 min后，注射PZCo-800的肿瘤部位温度较照光前升高了16.7℃。相反，注射了PBS的裸鼠的肿瘤部位，只升温了7.5℃。通过图7c，可以更加直观的看到这一升温过程。这也证明了PZCo-800在裸鼠体内也具有良好的光热性能。

试验例4：体内抑瘤实验

为了评估PZCo-800的体内治疗效果，构建了裸鼠肿瘤模型。选用4~6周龄雌性Balb/C裸鼠，体重为18~20 g。在裸鼠右后肢皮下注射A549细胞建立肿瘤模型。接种14天后肿瘤的平均体积达到100 mm³。此时将20只A549荷瘤裸鼠随机分为4组，记为实验I组~实验IV组：

实验I组：PBS；

实验II组：PBS：施加638 nm激光照射；

实验III组：PZCo-800 (10 mg Kg^-1)；

实验IV组：PZCo-800 (10 mg Kg^-1)：施加638 nm激光照射；

随后，采取腹腔注射的方式每7天分别按照实验I组~实验IV组给药一次，II组及IV组给药12小时后使用638nm激光（1.0 W/cm²）照光5min。每隔两天记录一次小鼠肿瘤的长径和短径，评估抗肿瘤疗效，同时记录裸鼠体重以判断PZCo-800的安全性。14天治疗完成后，将裸鼠施以安乐死之后解剖拍照，肿瘤及主要器官进行切片、HE染色。

结果如图8b、c所示，与实验I组、II组相比，实验III组的肿瘤体积较小，说明化学动力治疗可以对肿瘤的生长起到抑制。但实验IV组的治疗效果远高于其他三组，说明化学动力和光热疗法的协同起到了最优的抑瘤效果，其在体内具有极佳的抗肿瘤效果。此外，为了进一步验证PZCo-800协同治疗的效果，通过苏木精和伊红（H&E）染色来进行评价。如图8d所示，实验I组、II组肿瘤组织未出现坏死。实验IV组的肿瘤切片明显观察到细胞核浅染，出现了大面积的细胞坏死，这充分说明化学动力/光热的联合应用起到最佳治疗效果。上述结果表明，构建的纳米体系具有良好的化学动力/光热协同治疗能力。

从图8a中可以看出，经过14天的治疗后，各组裸鼠的体重并未发生显著下降，说明PZCo-800对裸鼠并未产生显著的副作用。而从图8e中可以看到，各组裸鼠的主要器官的细胞形态正常，并未观察到明显的炎症和细胞损伤，进一步证明了该人工纳米酶的良好生物相容性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种光热-类芬顿反应人工纳米酶的制备方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述5,10,15,20-四[4-(乙基苯基)卟啉]钴由以下方法制备：

1）4-[(三甲基硅基)乙基]-苯甲醛的制备：

2）5,10,15,20-四(4-(三甲基硅基)乙基苯基)卟啉的制备：

3）5,10,15,20-四(4-乙基苯基)卟啉的制备：

4）[5,10,15,20-四(4-(乙炔基苯基)-卟啉]钴的制备：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述4-溴苯甲醛、双(三苯基膦)二氯化钯、碘化铜、四氢呋喃、三乙胺和三甲基硅基乙炔加入量之比为100 mmol：0.727 mmol：1.2mmol：100 ml：28ml：150mmol；

所述升温温度为65℃。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述4-[(三甲基硅基)乙基]-苯甲醛、丙酸、吡咯加入量之比为86.5 mmol：360 ml：86.4 mmol；

所述回流温度为140℃，回流的时间为3h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述5,10,15,20-四(4-(三甲基硅基)乙基苯基)卟啉、四氢呋喃、四丁基氟化铵加入量之比为3mmol：200 ml：15 ml；

所述低温为-78℃。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4）中，所述5,10,15,20-四(4-(乙基苯基)-卟啉、N,N’-二甲基甲酰胺和四水合乙酸钴的加入量之比为1.69 mmol：70 mL：1.32 mmol；

所述加热回流的温度为150℃，回流时间为1h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述5,10,15,20-四[4-(乙基苯基)卟啉]钴、双(三苯基膦)二氯化钯、碘化铜和ZIF-8加入量之比为0.1 mmol:0.01 mmol: 0.01 mmol：10mg；

所述超声混合的频率为75W、时间为10min；

所述静置的时间为12h；

所述冷冻干燥的温度为-50℃、真空度为-0.09MPa、时间为12h。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述惰性气体为氮气；所述碳化的温度为800℃，碳化的时间为2h，升温速率为5℃/min。

9.权利要求1~8任一项所述的制备方法制备得到的光热-类芬顿反应人工纳米酶。

10.权利要求9所述的光热-类芬顿反应人工纳米酶在制备抗肿瘤药物中的应用。