CN116735514A - 纳米酶结合液液微萃取快速检测天麻硫熏标志物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米酶结合液液微萃取快速检测天麻硫熏标志物的方法，该方法以乙二胺四乙酸铁钠、氯化铜及磷酸二氢钾为前驱，热解法制备Cu,Fe/P,K‑CDs纳米酶，Cu,Fe/P,K‑CDs纳米酶具有空位氧化和优异的电子转移能力而表现出高的拟过氧化物酶及漆酶纳米酶活性，以天麻硫熏标志物对羟基苄基亚硫酸氢盐作为漆酶底物，结合纳米酶过氧化物酶产生的羟基自由基，对羟基苄基亚硫酸氢盐能被Cu,Fe/P,K‑CDs氧化，在4‑安替比林及H2O2存在下，产生红色氧化产物；在天麻样品测定时，结合液液微萃取，消除干扰，提高检测灵敏度，检出限达0.01mg/kg，本方法具有操作简单、快速的特点。
Description
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种纳米酶结合液液微萃取快速检测天麻硫熏标志物的方法。
背景技术
在中医药领域，硫熏加工方法作为传统的中药材养护方法，具有快速干燥、漂白、防霉、防虫和延长贮藏期等作用，已广泛应用到中药材的初加工和仓储等环节。当前中药材硫熏滥用现象极为普遍，尤其是产地加工和贮藏保管等环节。一方面，二氧化硫是国内外允许使用的一种食品添加剂，多以亚硫酸盐的形式添加到食品中，发挥防腐、漂白和抗氧化的作用。另一方面，过度硫熏产生的大量二氧化硫不仅会影响药材质量，改变药材化学成分，甚至危害人体健康。研究表明，对羟基苄基亚硫酸氢盐(p-HS) 作为硫熏天麻中丰度较高且专属性较好的硫熏标志物，是判断天麻硫熏成功与否的重要质控指标。目前检测p-HS的方法主要为UPLC-MS/MS，需要大型仪器设备及专门技术人员，难以进行硫熏天麻的现场快速质量控制。
碳点（CDs）作为巨大的电子储库，由于其低毒性、生物相容性以及独特的物理化学性质引起了人们极大的研究兴趣，作为一类纳米酶被广泛研究与应用，但其纳米酶活性低，其应用受到很大限制。为了提高（无论是电子供体还是电子受体）的电子转移能力，将多种单金属和双金属（如Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn）共价掺杂到CDs中。
发明内容
本发明提供了一种纳米酶结合液液微萃取快速检测天麻硫熏标志物的方法，本发明是利用Cu,Fe/P,K-CDs拟过氧化酶及漆酶活性，结合微萃取建立的对羟基苄基亚硫酸氢盐（p-HS）的检测方法。
本发明以乙二胺四乙酸铁钠、氯化铜及KH2PO4为前驱，热解法制备铜、铁、磷及钾共掺杂碳点纳米酶（Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶），Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶具有空位氧化、大量电子和优异的电子转移能力而表现出高的拟过氧化物酶及漆酶纳米酶活性，以天麻硫熏标志物对羟基苄基亚硫酸氢盐(p-HS)作为漆酶底物，结合纳米酶过氧化物酶产生的羟基自由基，p-HS能被Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶氧化，在4-氨基安替比林（4-AP）及H2O2存在下，产生红色氧化产物从而建立了p-HS比色快速检测方法，在天麻样品测定时，结合分散液液微萃取，消除干扰，提高检测灵敏度，检出限达0.01mg/kg，本发明方法具有操作简单、快速的特点。
本发明纳米酶结合液液微萃取快速检测天麻硫熏标志物的方法如下：
（1）取3.00-4.00g 乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）、1.30-1.50g CuCl2·2H2O、50-60mg KH2PO4、3-4mL甲醇研磨混匀，在60-70℃下烘干后，粉末在氮气气氛、250-350℃下煅烧2-2.5h，冷却至室温后，将产物分散在50-60mL甲醇中，超声30-40min后，离心取上清液，过0.22μm滤膜除去大颗粒杂质，溶液真空干燥，制得Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶；
离心是在8000-10000rpm下处理15-20min；
（2）在对羟基苄基亚硫酸氢盐标准溶液中加入Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶溶液、4-氨基安替比林（4-AP）溶液、H2O2溶液，pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液，混匀后在冰浴中反应5-10min后，用去离子水定容，在505nm波长处测定吸光度，建立吸光度与对羟基苄基亚硫酸氢盐浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；
所述Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶溶液的浓度为0.1mg/mL，添加量为100-200μL；4-氨基安替比林溶液浓度为10mmol/L，添加量为100-150µL，H2O2溶液浓度为50mmol/L，添加量为100-150µL，对羟基苄基亚硫酸氢盐在定容后溶液中浓度为0.100-120.0μg/mL；
（3）提取检测样品中对羟基苄基亚硫酸氢盐，获得样品测定液，在样品测定液中加入Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶溶液、4-氨基安替比林溶液、H2O2溶液、pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在冰浴中反应5-10min后，用去离子水定容，进行液液微萃取，有机相于505nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（2）回归方程中，获得样品中对羟基苄基亚硫酸氢盐含量；
其中液液微萃取是在冰浴反应后溶液中加入正己醇为萃取剂，聚乙二醇三甲基壬基醚（TMN-6）为分散剂，涡旋处理0.5-1min，静置5-10min，取出下层水相，添加萃取剂及分散剂重复萃取1-2次，收集合并有机相；正己醇用量为0.1-0.2mL/3mL，聚乙二醇三甲基壬基醚用量为0.1-0.2 mL/3mL；
步骤（3）中Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶溶液的浓度为0.1mg/mL，添加量为100-200μL；4-氨基安替比林溶液浓度为10mmol/L，添加量为100-150µL，H2O2溶液浓度为50mmol/L，添加量为100-150µL。
本发明的优点和技术效果如下：
1、本发明通过Cu、Fe掺杂到CDs中，提高CDs的电子转移能力，同时，KH2PO4作为CDs合成原料，可以提供弱酸性环境促进原子空位的形成，K原子可以插入CDs中改变形貌并形成电子桥来加速光生电子转移，合成获得的Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶表现出高的拟过氧化物酶及漆酶纳米酶活性；
2、Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶显示出强的模拟过氧化物酶及漆酶氧化酶活性，氧化p-HS、4-AP及H2O2，产生红色的氧化反应，由于纳米酶活性高，反应速度快，致使检测体系的稳定性降低，将反应置于冰浴中进行，降低了反应速度，提高了体系稳定性，由此建立了灵敏、选择性强p-HS比色检测新方法；
3、本发明建立的方法用于天麻中p-HS检测时，结合液液微萃取，不仅消除了样品基质干扰，同时还提高检测灵敏度，p-HS检出限达0.01mg/kg，与现行UPLC-MS/MS方法相比，检测灵敏度相当，但无论从检测成本、操作性、时间上都具有极大优势，且天麻主要成分没有此反应，方法具有好的特异性。
附图说明
图1为实施例1合成的Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶的TEM图；
图2为实施例1中Cu,Fe/P,K-CDs+TMB+H2O2、Cu,Fe/CDs+TMB+H2O2紫外吸收光谱图；
图3为实施例1中Cu,Fe/P,K-CDs+2,4-DP +4-AP+H2O2、Cu,Fe/CDs+2,4-DP +4-AP+H2O2、天然漆酶+2,4-DP+4-AP紫外吸收光谱图；
图4为实施例1中Cu,Fe/P,K-CDs+p-HS+4-AP+H2O2在不同温度下的紫外吸收光谱图；
图5为实施例1中TA作为荧光探针检测羟基自由基（·OH）荧光光谱图；
图6为实施例1中DCFH-DA为总ROS检测探针的荧光光谱图；
图7为实施例1中比色检测p-HS线性光谱图（A）及线性曲线图（B）；
图8为天麻主要成分（腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷Ａ、巴利森苷Ｂ、巴利森苷Ｃ和巴利森苷Ｅ）对检测p-HS的影响；
图9为实施例1中食用油进行萃取前和萃取后的Cu,Fe/P,K-CDs氧化p-HS图；
图10为实施例1中天麻测定p-HS的液液微萃取流程示意图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此；
实施例1：天麻中p-HS的测定
1、Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶制备
取3.00g NaFeEDTA、1.40g CuCl2·2H2O、55mg KH2PO4、4mL甲醇研磨混匀，65℃下烘干后，粉末置于管式炉中，在300℃、N2气氛下煅烧2.5h，冷却至室温后，将产物分散在50mL甲醇中，超声30min后，8000rpm离心20 min，取上清液，过0.22μm滤膜除去大颗粒杂质，溶液真空干燥，得到铜、铁、磷、钾掺杂碳点Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶；Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶TEM测试结果见图1，从图中可以看出Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶显示了均一的零维球形结构，直径小于3nm，纳米酶粒径大部分分布在1.5~2nm范围内。
同时制备Cu,Fe/CDs纳米酶，方法同上，不同在于不添加KH2PO4。
2、Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶拟过氧化物酶活性（POD-like）评价
取50μL浓度为50mmol/L的TMB，加入0.1mg/mL Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶或Cu,Fe/CDs纳米酶100μL、50mmol/L的H2O2 50μL，加入0.1mmol/L pH 4.0醋酸盐缓冲溶液定容至3mL，摇匀，静置10min，于654nm波长处测定吸光度，以不添加纳米酶的作为对照，结果见图2，从图中可以看出，Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶具有强的拟过氧化物酶活性，其POD-like活性大于Cu,Fe/CDs纳米酶。
3、Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶漆酶活性评价
以2,4-二氯酚（2,4-DP）和4-氨基安替比林（4-AP）为底物，测定了漆酶的模拟酶活性；取100μL 50μg/mL的2,4-DP、100μL 10mmol/L 的4-AP，加入0.1mg/mL的Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶或Cu,Fe/CDs纳米酶100μL、50mmol/L的H2O2 100μL，加入0.1mmol/L pH 5.0乙酸-乙酸钠定容至3mL，摇匀，反应5min，然后在505nm处测定吸光度，同时以相同浓度的天然漆酶0.1mg/mL作为对照，不添加酶的作为空白对照；
结果见图3，从图中可以看出Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶的吸光度明显大于Cu,Fe/CDs纳米酶和天然漆酶。
4、不同温度对Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶氧化p-HS的影响
在样品瓶中分别加入0.1mg/mL Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶溶液100µL、10mmol/L的4-AP溶液100μL、pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液1mL，加入浓度20.0μg/mL p-HS标准溶液、50mmol/L的H2O2 100μL，摇匀，分别在室温、冰浴中反应30min，再加入去离子水容至3mL，于505 nm波长处测定吸光度；
结果见图4，在室温下反应至5min时，反应体系的吸光度最大，随后急剧下降，但在冰浴中反应，体系在5min达到最大，且趋于稳定，随后下降缓慢。
5、羟基自由基（·OH）测定
苯甲酸（TA）被氧化成对羟基苯甲酸可以用来检测·OH，且对羟基苯甲酸的荧光强度与·OH产生强度成正比。将500µL TA溶液（5mmol/L）、200µL 0.1mg/mL纳米酶、50mmol/L的H2O2 100μL混合均匀后，加入pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至3mL，摇匀，在室温下反应20min，之后使用分子荧光光谱仪记录荧光强度变化；
结果如图5所示，发现单独的TA与H2O2在375nm处显示出十分微弱，可忽略的荧光发射，而TA/H2O2在Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶存在下，其荧光强度最大，Cu,Fe/CDs纳米酶催化体系也有一定荧光强度，表明Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶在催化过程中将H2O2转化为·OH的量最多。
6、总活性氧（ROS）检测
2',7' -二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染料荧光探针被用于测定ROS水平。将DCFH-DA溶液（2.5mg/mL , 10μL）、纳米酶（200µL，0.1mg/mL）、50mmol/L的H2O2 100μL混合均匀后，加入pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至3mL，摇匀，室温下反应30min；
结果如图6所示，Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶体系产生了最强的荧光，与酶活测试结果一致。
7、p-HS工作曲线的制作
在样品瓶中分别加入p-HS标准溶液、0.1mg/mL Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶溶液100µL、10mmol/L的4-AP溶液100μL、50 mmol/L的H2O2 100μL、pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液1mL，摇匀，在冰浴中反应5min后，再加入去离子水定容至3mL，对羟基苄基亚硫酸氢盐在定容溶液中的浓度为0.100-120.0μg/mL，于505nm波长处测定吸光度，以p-HS浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图7，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围，见表1；
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
8、方法特异性考察
将对羟基苄基亚硫酸氢盐替换为天麻主要成分（腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷Ａ、巴利森苷Ｂ、巴利森苷Ｃ和巴利森苷Ｅ），检测天麻主要成分在步骤4检测体系中对Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶的影响；
结果见图8，结果表明在相同浓度下，天麻主要成分几乎不会对测定体系产生影响，因而测定结果也不存在干扰；该方法具有良好的选择性和抗干扰效果，可选择性用于p-HS的测定。
9、天麻中p-HS的测定
（1）样品测定液的制备
取过60目筛的天麻粉末 0.05g（准确至0.001g），加入1mL 50%甲醇，室温下超声提取（功率120W，频率40kHz）30min，10000r/min离心10min取上清，固体重复提取2次，合并提取液，制得样品测定液；
（2）样品测定：在10mL具塞比色管中加入步骤（1）的待测样品液1mL、0.1mg/mL的Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶100µL、10mmol/L的4-AP溶液100μL、50mmol/L的H2O2 100μL、 pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液1mL，混匀后冰浴反应5min后，用去离子水至3mL，将100μL的正己醇和100μL的TMN-6溶液加入到混合溶液中，涡旋震荡1min，溶液变成混浊，室温下静置10min，完成相分离，将下层水相移出，再重复萃取2次，收集有机相，液液微萃取流程见图10，于505nm波长处测定吸光度，代入步骤7回归方程，同时以不进行液液微萃取的样品作为对照，同时还进行加标回收率及相对标准偏差的测定，结果见表2、图9；
表2 样品p-HS加标回收率及RSD（n = 3）
本发明建立的p-HS测定法具有处理步骤少，快速、简便，不需要大型仪器设备，与UPLC-MS/MS测定结果一致，所用时间短，处理成本低，操作简便，在冰浴中反应及液液微萃取处理，提高了方法稳定性及准确性。
Claims (4)
1.一种纳米酶结合液液微萃取快速检测天麻硫熏标志物的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）取3.00-4.00g 乙二胺四乙酸铁钠、1.30-1.50g CuCl2·2H2O、50-60mg KH2PO4、3-4mL甲醇研磨混匀，在60-70℃下烘干后，粉末在氮气气氛、250-350℃下煅烧2-2.5h，冷却至室温后，将产物分散在50-60mL甲醇中，超声30-40min后，离心取上清液，过0.22μm滤膜除去大颗粒杂质，溶液真空干燥，制得Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶；
（2）在对羟基苄基亚硫酸氢盐标准溶液中加入Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶溶液、4-氨基安替比林溶液、H2O2溶液、pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液，混匀后在冰浴中反应5-10min后，用去离子水定容，在505nm波长处测定吸光度，建立吸光度与对羟基苄基亚硫酸氢盐浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；
（3）提取检测样品中对羟基苄基亚硫酸氢盐，获得样品测定液，在样品测定液中加入Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶溶液、4-氨基安替比林溶液、H2O2溶液、pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液，在冰浴中反应5-10min后，用去离子水定容，进行液液微萃取，有机相于505nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（2）回归方程中，获得样品中对羟基苄基亚硫酸氢盐含量。
2.根据权利要求1所述的纳米酶结合液液微萃取快速检测天麻硫熏标志物的方法，其特征在于：液液微萃取是在冰浴反应后溶液中加入正己醇为萃取剂，聚乙二醇三甲基壬基醚为分散剂，涡旋处理0.5-1min，静置5-10min，取出下层水相，添加萃取剂及分散剂重复萃取1-2次，收集合并有机相。
3.根据权利要求2所述的纳米酶结合液液微萃取快速检测天麻硫熏标志物的方法，其特征在于：正己醇用量为0.1-0.2mL/3mL，聚乙二醇三甲基壬基醚用量为0.1-0.2 mL/3mL。
4.根据权利要求1所述的纳米酶结合液液微萃取快速检测天麻硫熏标志物的方法，其特征在于：Cu,Fe/P,K-CDs纳米酶溶液的浓度为0.1mg/mL，添加量为100-200μL；4-氨基安替比林溶液浓度为10mmol/L，添加量为100-150µL，H2O2溶液浓度为50mmol/L，添加量为100-150µL，对羟基苄基亚硫酸氢盐在定容后溶液中浓度为0.100-120.0μg/mL。
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