CN117214113A - 一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测天麻硫熏标志物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测天麻硫熏标志物的方法。该方法以Zr为金属源，中‑四(4‑羧基苯基)卟吩(TCPP)为配体，铜掺杂碳点(Cu‑CDs)作为异相成核位点可以与Zr4+离子结合，合成了具有片状形貌的卟啉基金属‑有机框架化合物(PCN‑222/Cu‑CDs)，Pt纳米粒子(PtNPs)被嵌入到PCN‑222/Cu‑CDs的介孔中形成Pt@PCN‑222/Cu‑CDs，其表现出高的拟漆酶纳米酶活性，碳点的引入提供特定的吸附位点，提高了底物的吸附能力。中药材硫熏标志物对羟基苄基亚硫酸氢盐(p‑HS)作为漆酶底物，能被Pt@PCN‑222/Cu‑CDs氧化，在4‑安替比林(4‑AP)存在下，产生红色氧化产物从而建立了p‑HS比色快速检测新方法。建立的方法具有共存物质不干扰测定、特异性强等特点，且检出限达0.05mg/kg。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测天麻硫熏标志物的方法。
背景技术
硫磺熏蒸具有增白、快速干燥、防虫防霉的作用，且工艺简便、成本低，已被广泛应用在中药材的产地加工中。大量研究发现硫磺熏蒸会导致药材化学成分、药理活性发生改变，存在安全隐患。但大量研究已证实硫熏不仅会影响药材质量，残留过量的二氧化硫还会危害人体健康，尤其是药材进入人体后，对肝和肾脏等重要代谢器官的影响较大。研究表明，对羟基苄基亚硫酸氢盐(p-HS)作为硫熏天麻中丰度较高且专属性较好的硫熏标志物，是判断天麻硫熏成功与否的重要质控指标。目前检测p-HS的方法主要为UPLC-MS/MS，需要大型仪器设备及专门技术人员，难以进行硫熏天麻的现场快速质量控制。
纳米酶是指具有天然酶催化活性的纳米材料。其成本低、易储存、酶活性可调节控制。其中，漆酶是一种以铜离子为催化中心的多酚氧化酶，它可以通过电子的转移来催化酚类和酚胺类底物氧化并产生无害的水，独特的环保特性使其在纳米酶的研究中备受瞩目。近年来纳米酶包括漆酶模拟酶已在食品分析、生物传感、医学诊断和工业生产中得到广泛的应用。但由于漆酶纳米酶与天然漆酶相比，仍然存在催化活性较低、对底物特异性差，并非所有酚类和酚胺类底物都能被氧化，研究高催化活性漆酶纳米酶，拓展其应用是十分必要的。
本发明以Zr为金属源，中-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)为配体，苯甲酸及乙酸作为调节剂，铜掺杂碳点(Cu-CDs)作为异相成核位点可以与Zr4+离子结合，合成了具有均匀的二维片状形貌的卟啉基金属-有机框架化合物(PCN-222/Cu-CDs)，Pt纳米粒子(PtNPs)被嵌入到PCN-222/Cu-CDs的介孔中形成Pt@PCN-222/Cu-CDs，Pt@PCN-222/Cu-CDs表现出高的拟漆酶纳米酶活性，碳点的引入提供特定的吸附位点，降低传质势垒，提高了底物的吸附能力。天麻硫熏标志物对羟基苄基亚硫酸氢盐(p-HS)作为漆酶底物，能被Pt@PCN-222/Cu-CDs氧化，在4-安替比林(4-AP)存在下，产生红色偶联氧化产物从而建立了p-HS比色快速检测新方法。建立的方法具有共存物质不干扰测定、特异性强，灵敏度高、检出限达0.05mg/kg，操作简单、快速的特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测天麻硫熏标志物的方法，利用Pt@PCN-222/Cu-CDs拟漆酶活性，建立p-HS检测新方法。
一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测天麻硫熏标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在检测体系中加入Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶、4-安替比林(4-AP)溶液，加入pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液，反应5-10分钟，加入天麻硫熏标志物对羟基苄基亚硫酸氢盐(p-HS)标准溶液，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容，摇匀，静置5-10分钟，离心，取上清液，于505nm波长处测定吸光度，建立吸光度与p-HS浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；
(2)提取检测样品中p-HS，获得样品测定液，在Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶、4-安替比林(4-AP)溶液，加入pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液，反应5-10分钟，加入样品测定液，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容，摇匀，静置5-10分钟，离心，取上清液，于505nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤(1)回归方程中，获得样品中p-HS含量；
所述Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶制备包括：
①Cu-CDs的合成：取0.40-0.50g柠檬酸、0.1-0.2g多巴胺、0.1-0.2mL乙二胺及30-40mL去离子水混合后，加入0.2-0.3g的氯化铜，超声处理15-20分钟，转入马弗炉200℃烧制10-12小时，冷却至室温后，8000-10000rpm离心15-20分钟，取上清液过0.22μm滤膜除去大颗粒杂质，将溶液进一步真空干燥，得到铜掺杂碳点Cu-CDs；
②PCN-222/Cu-CDs的合成：称取350-400mg ZrCl4，8-10g苯甲酸、8-10mL纯净水和3-5mL铜掺杂碳点(Cu-CDs)加入80-100mLDMF中，搅拌5-10分钟后，加入350-400mg中-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)，在室温下继续搅拌5-10分钟，加入5-6mL乙酸，混合均匀，将该均相溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，加热至120℃反应4-5小时，冷却至室温后，产物在8000-10000rpm下离心5-10分钟分离，分别用乙醇及丙酮各洗涤2-3次，真空干燥得到PCN-222/Cu-CDs；
③Pt@PCN-222/Cu-CDs的合成：将0.05-0.06mmol氯铂酸、10-15mg PCN-222/Cu-CDs及20-25mg聚乙烯吡咯烷酮在剧烈搅拌下加入到45-55mL纯净水中，搅拌5-10分钟后，快速注入预冷的100mmol/L硼氢化钠水溶液5-10mL，室温下搅拌24小时后，产物在8000-10000rpm下离心5-10分钟分离，分别用乙醇及丙酮各洗涤2-3次，真空干燥得到Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶；
所述的p-HS溶液浓度范围在0.138-135.0μg/mL，Pt@PCN-222/Cu-CDs溶液的浓度为0.2mg/mL，添加量为50-100μL；4-AP溶液浓度为1mg/mL添加量为100-150μL。
本发明的优点在于：
1、本发明以Zr为金属源，中-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)为配体，苯甲酸及乙酸作为调节剂，铜掺杂碳点(Cu-CDs)作为异相成核位点可以与Zr4+离子结合，合成了具有均匀的二维片状形貌的卟啉基金属-有机框架化合物(PCN-222/Cu-CDs)，Pt纳米粒子(PtNPs)被嵌入到PCN-222/Cu-CDs的介孔中形成Pt@PCN-222/Cu-CDs，加快了电子转移的速率，Pt@PCN-222/Cu-CDs表现出高的拟漆酶纳米酶活性，碳点的引入提供特定的吸附位点，降低传质势垒，提高了底物的吸附能力。
2、Pt@PCN-222/Cu-CDs显示出强的模拟漆酶氧化酶活性，氧化p-HS及4-AP，产生红色的氧化反应，由此建立了灵敏、选择性强p-HS比色检测新方法。
3、该检测方法，检出限达0.05mg/kg，与现行UPLC-MS/MS方法相比，检测灵敏度相当，但无论从检测成本、操作性、时间上都具有极大优势，天麻主要成分没有此反应，方法具有好的特异性。
附图说明
图1为实施例1合成Pt@PCN-222/Cu-CDs的TEM图；
图2为实施例1中Pt@PCN-222/Cu-CDs+p-HS+4-AP及天然漆酶+p-HS+4-AP紫外吸收光谱图；
图3为实施例1中比色检测p-HS线性光谱图(A)及线性曲线图(B)；
图4为天麻主要成分(腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷E)对比色检测p-HS的影响。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：天麻中p-HS的测定
1、Cu-CDs的合成：取0.45g柠檬酸、0.2g多巴胺、0.2mL乙二胺及40mL去离子水混合后，加入0.3g的氯化铜，超声处理15分钟，转入马弗炉200℃烧制12小时，冷却至室温后，10000rpm离心15分钟，取上清液过0.22μm滤膜除去大颗粒杂质，将溶液60℃真空干燥24小时，得到铜掺杂碳点Cu-CDs。
2、PCN-222/Cu-CDs的合成：称取400mg ZrCl4，10g苯甲酸、10mL纯净水和5mL铜掺杂碳点(Cu-CDs)加入100mLDMF中，搅拌10分钟后，加入400mg中-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)，在室温下继续搅拌10分钟，加入6mL乙酸，混合均匀，将该均相溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，加热至120℃反应5小时，冷却至室温后，产物在10000rpm下离心5分钟分离，分别用乙醇及丙酮各洗涤2-3次，60℃真空干燥24小时，得到PCN-222/Cu-CDs。
3、Pt@PCN-222/Cu-CDs的合成：将0.06mmol氯铂酸、15mg PCN-222/Cu-CDs及25mg聚乙烯吡咯烷酮在剧烈搅拌下加入到50mL纯净水中，搅拌10分钟后，快速注入预冷的100mmol/L硼氢化钠水溶液10mL，室温下搅拌24小时后，产物在10000rpm下离心5分钟分离，分别用乙醇及丙酮各洗涤2-3次，60℃真空干燥24小时，得到Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶。TEM测试结果(图1)表明，Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶显示了均匀的椭圆结构。
4、p-HS的工作曲线
在样品瓶中分别加入0.2mg/mL的Pt@PCN-222/Cu-CDs溶液100μL、1mg/mL的4-AP溶液150μL、pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液1mL，反应10分钟，加入浓度范围为0.138-135.0μg/mLp-HS标准溶液，加入pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至4mL，摇匀，静置10分钟，10000r/min离心10分钟，取上清液，于505nm波长处测定吸光度，以p-HS浓度c为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线，见图3A及图3B，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1。
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
5、方法特异性考察：考察了天麻主要成分(腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷E)对测定p-HS影响；研究结果表明，在相同浓度下，天麻主要成分几乎不会对测定体系产生影响，因而测定结果也不存在干扰。上述结果表明，该方法具有良好的选择性和抗干扰效果，可选择性用于p-HS的测定。
6、天麻中p-HS的测定：
(1)样品前处理：取过60目筛天麻药材粉末0.05g(准确至0.001g)，加入1mL 50％甲醇，室温下超声提取(功率120W，频率40kHz)30分钟，重复提取2次，提取液10000r/min离心10分钟，取上清液，制得；
(2)样品测定：在样品瓶中分别加入0.2mg/mL的Pt@PCN-222/Cu-CDs溶液100μL、1mg/mL的4-AP溶液150μL、pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液1mL，反应10分钟，加入1mL样品测定液，加入pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至4mL，摇匀，静置10分钟，10000r/min离心10分钟，取上清液，于505nm波长处测定吸光度，结果见表2，同时进行加标回收率及相对标准偏差的测定。
表2样品p-HS加标回收率及RSD(n＝3)
Claims (2)
1.一种基于模拟漆酶纳米酶快速检测天麻硫熏标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在检测体系中加入Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶、4-氨基安替比林(4-AP)溶液，加入pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液，反应5-10分钟，加入天麻硫熏标志物——对羟基苄基亚硫酸氢盐(p-HS)标准溶液，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容，摇匀，静置5-10分钟，离心，取上清液，于505nm波长处测定吸光度，建立吸光度与p-HS浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；
(2)提取检测样品中p-HS，获得样品测定液，在Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶、4-AP溶液，加入pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液，反应5-10分钟，加入样品测定液，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容，摇匀，静置5-10分钟，离心，取上清液，于505nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤(1)回归方程中，获得样品中p-HS含量；
所述Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶制备包括：
①Cu-CDs的合成：取0.40-0.50g柠檬酸、0.1-0.2g多巴胺、0.1-0.2mL乙二胺及30-40mL去离子水混合后，加入0.2-0.3g的氯化铜，超声处理15-20分钟，转入马弗炉200℃烧制10-12小时，冷却至室温后，8000-10000rpm离心15-20分钟，取上清液，过0.22μm滤膜除去大颗粒杂质，将溶液进一步真空干燥，得到铜掺杂碳点Cu-CDs；
②PCN-222/Cu-CDs的合成：称取350-400mg ZrCl4，8-10g苯甲酸、8-10mL纯净水和3-5mL铜掺杂碳点(Cu-CDs)加入80-100mLDMF中，搅拌5-10分钟后，加入350-400mg中-四(4-羧基苯基)卟吩(TCPP)，在室温下继续搅拌5-10分钟，加入5-6mL乙酸，混合均匀，将该均相溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，加热至120℃反应4-5小时，冷却至室温后，产物在8000-10000rpm下离心5-10分钟分离，分别用乙醇及丙酮各洗涤2-3次，真空干燥得到PCN-222/Cu-CDs；
③Pt@PCN-222/Cu-CDs的合成：将0.05-0.06mmol氯铂酸、10-15mg PCN-222/Cu-CDs及20-25mg聚乙烯吡咯烷酮在剧烈搅拌下加入到45-55mL纯净水中，搅拌5-10分钟后，快速注入预冷的100mmol/L硼氢化钠水溶液5-10mL，室温下搅拌24小时后，产物在8000-10000rpm下离心5-10分钟分离，分别用乙醇及丙酮各洗涤2-3次，真空干燥得到Pt@PCN-222/Cu-CDs纳米酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，p-HS溶液浓度范围在0.138-135.0μg/mL，Pt@PCN-222/Cu-CDs溶液的浓度为0.2mg/mL，添加量为50-100μL；4-AP溶液浓度为1mg/mL添加量为100-150μL。
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