CN115728262A - 基于红外光增强缺陷纳米酶快速检测草甘膦的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于红外光增强缺陷纳米酶快速检测草甘膦的方法，本方法合成了钼、磷掺杂四氧化三铁纳米酶Fe3O4/Mo/P，纳米酶具有丰富的缺陷位点，包括Mo、P取代和氧空位（OV）缺陷，缺陷位点的产生显著提高Fe3O4/Mo/P纳米酶的结合能力和催化活性，红外光作用下，纳米酶活性得到进一步提高；基于草甘膦能特异性地吸附于Fe3O4/Mo/P纳米酶粗糙表面，而抑制纳米酶模拟过氧化物酶催化活性，建立了草甘膦的快速检测方法，检出限为0.039mg/kg，其他农药不干扰此反应，检测方法具有特异性；将本方法应用于包括咖啡的样品中草甘膦残留的检测分析，结果与相关国家标准测定方法相符；方法具有操作简单、灵敏度高、快速等特点。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种基于红外光增强缺陷纳米酶快速检测草甘膦的方法。
背景技术
草甘膦是一种低毒的广谱除草剂，是目前世界上产量最大、应用最广的有机磷除草剂，因高效、便宜等综合特性，被广泛用于我国种植业中。草甘膦在环境中会通过微生物降解，氨甲基膦酸(aminomethyl phosphonic acid, AMPA)是草甘膦的主要代谢物，草甘膦C-N 键通过酶促反应断裂生成低毒的氨甲基膦酸。我国颁布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB2763-2019）中规定食品中草甘膦和草铵膦的最大残留限量分别为0.05~7.00mg/kg和 0.05~5.00mg/kg，但是对咖啡豆没有限量要求，茶叶中草甘膦最大残留限量为1mg/kg，草甘隣属氨基酸类除草剂，具有强极性，易溶于水难溶于有机溶剂的特点，缺少发色和荧光基团，与植物中的有机物有很强结合能力，使其直接分析难度较大。相关的检测标准和传统的检测方法前处理成本高、耗时长、步骤繁琐、回收率不高。
纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶，纳米酶作为一类新型的模拟酶，它具有许多其他传统模拟酶所无法企及的优点，人们可以根据纳米材料模拟酶的特性进行研究并加以利用，让纳米酶具有更大的应用前景；含有氧化还原活性金属的纳米酶，因其能够原位触发催化反应，并凭借其固有的氧化还原特性而备受追捧。然而，开发高效氧化还原纳米酶，特别是可与天然酶相媲美的纳米酶仍然是一个巨大的挑战。催化活性中心的缺乏是氧化还原纳米酶面临的最大障碍之一，缺陷工程已被证明是调控纳米材料结构和性能的一种实用而有效的方法。
发明内容
针对草甘膦检测现有技术的不足，本发明提供了一种基于红外光增强缺陷纳米酶快速检测草甘膦的方法，本发明方法合成了钼、磷掺杂四氧化三铁（Fe3O4/Mo/P）纳米酶，产生丰富的缺陷位点，包括Mo、P取代和氧空位（OV）缺陷，从而显著提高Fe3O4/Mo/P纳米酶的结合能力和催化活性，红外光作用下，纳米酶活性得到进一步提高；基于草甘膦特异性地吸附于Fe3O4/Mo/P粗糙表面，而抑制纳米酶模拟过氧化物酶催化活性，建立了草甘膦的快速检测方法；具体涉及Fe3O4/Mo/P纳米酶在近红外光辐射下，催化氧化无色3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）及H2O2产生蓝色溶液，草甘膦存在抑制了酶的催化氧化反应，颜色随草甘膦浓度增加而变浅，且呈线性关系，由此建立了草甘膦检测方法，检出限为0.039mg/kg，反应仅在10分钟以内完成，体系稳定性超过30分钟，其他农药不干扰此反应，本发明检测方法具有特异性；将本方法应用于样品中草甘膦残留的检测分析，结果与相关国家标准测定方法相符；方法具有操作简单、灵敏度高、快速等特点。
本发明基于红外光增强缺陷纳米酶快速检测草甘膦的方法如下：
（1）草甘膦工作曲线制作
在具塞比色管中加入100µg/mLFe3O4/Mo/P纳米酶50~100µL、草甘膦标准溶液、10mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）50~100µL、40mmol/L H2O2 20~50µL，用pH 2.0醋酸-醋酸钠缓冲液稀释定容至4mL，制得浓度范围在0.124~12.4mg/L的草甘膦溶液，808nm波长红外光照射10min，用磁铁分离Fe3O4/Mo/P纳米酶，溶液倒入比色皿中，于654nm波长处测定吸光度，建立吸光度与草甘膦浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；
（2）样品测定
准确的称取检测样品1.00g（精确至0.01g）置于具塞聚乙烯离心管中，加入1mol/L的 NaOH 1mL和去离子水30mL，超声处理15~30min，8000rpm离心5min，上清液移于另一离心管中，即得提取液，取提取液2mL，加入1mol/L NaOH 400~500μL、0.4~0.5g ZnSO4，涡旋30~60s混匀净化，4000rpm离心5-10min后，取上清液即得样品净化液；
所述净化离心后，还可以再添加1mol/L NaOH净化1-2次；
在样品净化液中加入100µg/mLFe3O4/Mo/P纳米酶50~100µL、10mmol/L TMB 50~100µL、40mmol/LH2O2 20~50µL，用pH 2.0醋酸-醋酸钠缓冲液定容至4mL，808nm波长红外光照射10min，用磁铁分离Fe3O4/Mo/P纳米酶，溶液倒入比色皿中，于654nm波长处测定吸光度，代入步骤（1）回归方程中，计算获得样品中草甘膦含量。
所述的Fe3O4/Mo/P纳米酶制备如下：
（1）将1.5~1.8g硫酸亚铁铵、1.4~1.5g三氯化铁、0.5~0.7g钼酸钠溶于50mL去离子水中，混合液转移至三口烧瓶中，在氮气气氛下搅拌并水浴加热，当反应液加热至75~85℃时，加入5mL质量体积浓度28%的氨水，继续75~85℃下搅拌30min后，冷却至室温；用钕铁硼（Nd-Fe-B）强磁性磁铁收集反应产物，经去离子水和乙醇交替洗后，磁铁收集，冷冻干燥，即得Fe3O4/Mo；
（2）将4~6g NaH2PO4置于管式炉上游，45~55mg Fe3O4/Mo置于管式炉下游，在氮气气氛、200~300℃下煅烧1h后，制得Fe3O4/Mo/P纳米酶。
上述检测样品包括咖啡。
本发明的优点在于：
1、本发明合成的钼、磷掺杂四氧化三铁（Fe3O4/Mo/P）纳米酶，由于产生丰富的缺陷位点，显著提高纳米酶的结合能力和催化活性，红外光作用下，纳米酶活性得到进一步提高；基于草甘膦特异性地吸附于Fe3O4/Mo/P粗糙表面，而抑制纳米酶模拟过氧化物酶催化活性，建立了草甘膦的快速检测方法；
2、本发明合成的Fe3O4/Mo/P纳米酶，在红外光作用下，草甘膦检测的检出限下降了2倍，达到0.039mg/kg，检测时间缩短到10分钟，其他农药存在不干扰此反应，检测方法具有特异性；
3、在用于咖啡样品测定时，采用了共沉淀法进行两次净化处理，样品加标回收率达96.0-104.5%，RSD小于3.3%，测定结果与国标法大致相同，且与国标法相比，该方法成本低廉、操作简单。
附图说明
图1为实施例1中Fe3O4/Mo/P纳米酶的扫描电镜图（SEM）；
图2为Fe3O4/Mo/P+H2O2+TMB分别在红外光808nm照射及没有红外光照射（空白）的吸收光谱图；
图3为EDTA对Fe3O4/Mo/P氧空位捕获效果图，图中Blank是不添加Fe3O4/Mo/P纳米酶的EDTA，+Fe3O4/Mo/P为只添加纳米酶不含EDTA；
图4为草甘膦抑制Fe3O4/Mo/P+H2O2+TMB体系的紫外-可见吸收光谱图；
图5为检测标准溶液的线性方程；
图6为草甘膦、氨基酸、甲基纤维素、葡萄糖、咖啡因对本发明检测体系影响结果；
图7为草甘膦、共存离子对本发明检测体系影响结果。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：挂耳咖啡样品中草甘膦的测定
（1）取1.6g硫酸亚铁铵、1.4g三氯化铁、0.6g 钼酸钠溶于50mL去离子水中，将混合液转移至250mL三口烧瓶中，在氮气气氛下机械搅拌并水浴加热，当反应液加热至80℃时，加入5mL氨水（w/v，28%），80℃继续搅拌30min后，冷却至室温，用钕铁硼强磁性磁铁收集反应产物，并用去离子水和乙醇交替洗后，磁铁收集，冷冻干燥，即得Fe3O4/Mo；
（2）将5g NaH2PO4置于管式炉上游，50mg Fe3O4/Mo置于管式炉下游，在氮气保护下，250℃下煅烧1h后得到Fe3O4/Mo/P纳米酶，其形貌见图1；
（3）Fe3O4/Mo/P纳米酶过氧化物酶活性
将100µg/mL Fe3O4/Mo/P纳米酶100μL、10mmol/L TMB 50µL、40mmol/L H2O2 50µL混合后经808nm红外光照射10min后，测定吸光度，且设置没有经过808nm红外光照射的作为空白对照，吸收光谱图见图2，由图可知红外光作用下，Fe3O4/Mo/P纳米酶活性得到进一步提高；
（4）EDTA为氧空位捕获剂，在0.5、1.0、5.0μg/mL的EDTA加入100µg/mL Fe3O4/Mo/P纳米酶100μL、10mmol/L TMB 50µL、40mmol/L H2O2 50µL，测定吸光度；结果表明，随着EDTA浓度的增加，吸光度随之下降，表明Fe3O4/Mo/P纳米酶存在氧空位，氧空位的存在可提高表面氧气的吸附与活化，进而对底物的氧化有促进作用，浓度5.0 μg/mL EDTA的结果见图3；
（5）草甘膦工作曲线制作：在5mL具塞比色管中加入100µg/mL Fe3O4/Mo/P纳米酶100µL、草甘膦标准溶液、10mmol/L TMB 50µL、40mmol/L H2O2 50µL，用pH2.0醋酸-醋酸钠缓冲液稀释定容至4mL，制得浓度范围在0.124~12.4mg/L的草甘膦溶液，808nm波长红外光照射10min，用磁铁分离Fe3O4/Mo/P纳米酶，溶液倒入1cm比色皿中，于654nm波长处测定吸光度，建立吸光度与草甘膦浓度的定量关系，绘制标准曲线，见图4、5得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1；
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
（6）方法特异性考察：在草甘膦、共存离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cl-、SO4 2-、CO3 2-）、氨基酸（甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸、赖氨酸及天冬氨酸）、甲基纤维素、葡萄糖、咖啡因中分别加入Fe3O4/Mo/P纳米酶、H2O2、TMB（方法同上），检测草甘膦对本发明检测体系的特异性，其中草甘膦浓度为5mg/L；其他干扰物质浓度为125mg/L，为草甘膦浓度的25倍，结果见图6、7，从图中可以康处仅有草甘膦对纳米酶催化活性有明显的抑制作用，其它物质几乎没有抑制作用，方法具有好的选择特异性。
（7）挂耳咖啡样品中草甘膦的测定
准确称取挂耳咖啡试样1.00g（精确至0.01g）置于50mL具塞聚乙烯离心管中，加入1mol/L的 NaOH 1mL和去离子水30mL，超声处理15min，8000rpm离心5min，上清液移于另一离心管中，即得棕色提取液；
该净化过程经两次沉淀处理，具体步骤为取棕色提取液2mL，加入ZnSO4 0.4g，混合均匀，加入1mol/L的 NaOH 400μL，溶液变浑浊并有沉淀生成，涡旋40s，4000rpm离心5min后，下层为棕色沉淀物质，上层溶液澄清透明，将上清液移于另一离心管中，再加入1mol/L的 NaOH 200μL，涡旋40s，4000rpm离心5min后，取上清液即得样品净化液；
在5mL具塞比色管中加入100µg/mL Fe3O4/Mo/P纳米酶100µL、样品净化液2mL、10mmol/L TMB 50µL、40mmol/L H2O2 50µL，用pH2.0醋酸-醋酸钠缓冲液稀释定容至4mL，808nm波长红外光照射10min，用磁铁分离Fe3O4/Mo/P纳米酶，溶液倒入1cm比色皿中，于654nm波长处测定吸光度，代入步骤（4）回归方程，样品草甘膦未检出；
（8）回收率与精密度实验：在挂耳咖啡样品中分别添加3个不同浓度的草甘膦标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差RSD，结果见表2；测得草甘膦的加标回收率在98.2％～103.5％，RSD在1.81％～3.20％，本方法有好的的准确性和精密度；
表2 样品草甘膦加标回收率及RSD（n = 3）
实施例2：速溶咖啡样品中草甘膦含量的测定
（1）取1.8g硫酸亚铁铵、1.5g三氯化铁、0.5g 钼酸钠溶于50mL去离子水中，将混合液转移至250mL三口烧瓶中，在氮气气氛下机械搅拌并水浴加热，当反应液加热至80℃时，加入5mL氨水（w/v，28%），80℃继续搅拌30min后，冷却至室温，用钕铁硼强磁性磁铁收集反应产物，并用去离子水和乙醇交替洗后，磁铁收集，冷冻干燥，即得Fe3O4/Mo；
（2）将4g NaH2PO4置于管式炉上游，55mg Fe3O4/Mo置于管式炉下游，在氮气保护下，250℃下煅烧1h后得到Fe3O4/Mo/P纳米酶，
（3）草甘膦工作曲线制作：同实施例1步骤（5）；
（4）速溶咖啡样品中草甘膦含量的测定
（5）回收率与精密度实验：在速溶咖啡样品中分别添加3个不同浓度的草甘膦标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差RSD，结果见表3；测得草甘膦的加标回收率在96.0％～104.5％，RSD在2.42％～2.71％，本方法有好的的准确性和精密度；
表3 样品草甘膦加标回收率及RSD（n = 3）
实施例3：发酵咖啡样品中草甘膦含量的测定
本实施例中步骤（1）-（4）同实施例1的步骤（1）、（2）、（5）、（7），样品中草甘膦未检出；
回收率与精密度实验：在速溶咖啡样品中分别添加3个不同浓度的草甘膦标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差RSD，结果见表4；测得草甘膦的加标回收率在100.1％～104.3％，RSD在1.90％～3.12％，本方法有好的的准确性和精密度。
表4 样品草甘膦加标回收率及RSD（n = 3）
将本发明建立的方法与GC-MS方法进行比对，检测误差在±3%以内，检测结果一致性较好，本发明所用时间短，成本低，操作简便，不需要大型仪器设备，在实际检测中具有较强优势。
Claims (3)
1.一种基于红外光增强缺陷纳米酶快速检测草甘膦的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在草甘膦标准溶液中加入Fe3O4/Mo/P纳米酶、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、H2O2，并用
pH 2.0醋酸-醋酸钠缓冲液定容，制得浓度范围在0.124~12.4mg/L的草甘膦溶液，草甘膦溶液经808nm波长红外光照射后，用磁铁分离出Fe3O4/Mo/P纳米酶，溶液置于654nm波长处测定吸光度，建立吸光度与草甘膦浓度的定量关系，绘制标准曲线，得到回归方程；
（2）提取净化检测样品中草甘膦获得样品净化液，在样品净化液中加入Fe3O4/Mo/P纳米酶、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、H2O2，并用pH 2.0醋酸-醋酸钠缓冲液定容，经808nm波长红外光照射后，用磁铁分离出Fe3O4/Mo/P纳米酶，溶液置于654nm波长处测定吸光度，吸光度代入步骤（1）回归方程中，获得样品中草甘膦含量；
所述Fe3O4/Mo/P纳米酶制备如下：
a、将1.5~1.8g硫酸亚铁铵、1.4~1.5g三氯化铁、0.5~0.7g钼酸钠溶于50mL去离子水中，在氮气气氛下搅拌并水浴加热，当反应液加热至75~85℃时，加入5mL质量体积浓度28%的氨水，继续75~85℃下搅拌30min后，冷却至室温；用磁铁收集反应产物，经去离子水和乙醇交替洗后，磁铁收集，冷冻干燥，即得Fe3O4/Mo；
b、将4~6g NaH2PO4置于管式炉上游，45~55mg Fe3O4/Mo置于管式炉下游，在氮气气氛、200~300℃下煅烧1h后，制得Fe3O4/Mo/P纳米酶。
2.根据权利要求1所述的基于红外光增强缺陷纳米酶快速检测草甘膦的方法，其特征在于：样品净化液是将样品1.00g置于离心管中，加入1mol/L NaOH 1mL、去离子水30mL，超声处理15~30min，离心，取2mL上清液加入1mol/L NaOH 400~500μL、0.4~0.5g ZnSO4，涡旋30~60s混匀净化离心，取上清液即得。
3.根据权利要求1所述的基于红外光增强缺陷纳米酶快速检测草甘膦的方法，其特征在于：100µg/mL Fe3O4/Mo/P纳米酶添加量为50~100µL，10 mmol/L 3,3',5,5'-四甲基联苯胺添加量为50~100µL，40 mmol/L H2O2添加量为20~50µL。
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