CN104215617A - 基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以用于脲酶活性的测定。在2.2~44U/L范围内F650与脲酶浓度呈线性关系，检测限为0.55U/L。本发明灵敏度高，重现性好，可用于幽门螺旋杆菌的测定。
Description
技术领域
本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的脲酶活性测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
脲酶（urease）是一种含镍的寡聚酶，它能高效、特异性催化尿素水解生成二氧化碳和氨。医学上，细菌脲酶是一种不容忽视的致病因素，它可诱发许多疾病，如肾盂肾炎、肝昏迷、消化性溃疡和感染性尿路结石等。农业上，当土壤脲酶的活性过高时，化肥中的尿素被迅速分解生成氨，排放到大气中，造成经济损失及环境污染。另外，豆类制品如豆奶、代乳粉等，如含有脲酶对人体有害，会引起腹泻等症状，故在制造工艺中，要除去脲酶。由上可见，脲酶活性的测定在医学、农业和食品等领域具有重要的意义。
金纳米团簇（gold nanoclusters, Au NCs）是一种新型的荧光纳米材料，由几个到几百个原子组成，尺寸接近于电子的费米波长（约0.7 nm）。由于量子尺寸效应，金纳米团簇显示出独特的光学特性。荧光金纳米团簇具有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、Stokes位移大、比表面积大、制备条件温和、表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点，其已被广泛应用于催化、传感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域。
本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇作为荧光探针，提供了一种简便、灵敏的脲酶检测新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光pH探针的脲酶活性测定方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于脲酶活性的测定。
所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F650）以判断脲酶含量，所使用的激发波长为355 nm。
将不同浓度pH=6.0的脲酶溶液加入到0~2.5 mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应0~50 min，测定发射光强度值F650，在脲酶浓度为2.2~44 U/L的范围内其发射光强度值F650与脲酶浓度呈线性关系，检测限为0.55 U/L。
所述尿素的浓度优选为1 mol/L，反应时间优选为40 min。
金纳米团簇溶液，脲酶溶液和尿素溶液按体积比为4：1：4混合，反应总体积为0.45 mL。
本发明所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，包括如下步骤：取适量人胃组织，加入2 mL浓度为1 mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40 min，取0.25 mL上述反应液，加入0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液，在25°C的恒温水浴槽中反应3 min，测定发射光强度值F650以定性判断胃组织是否存在幽门螺旋杆菌。
所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
具体地说，本发明采用的技术方案为：
（一）金纳米团簇荧光材料的制备
以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米团簇荧光材料的制备方法如下：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5小时，反应液由浅黄色变为无色。反应结束后用分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
（二）脲酶活性的测定：
脲酶活性的测定分两步进行：（一）将0.05 mL脲酶样品溶液（pH=6.0缓冲液溶解）加入到0.2 mL浓度为1 M的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25 °C的恒温水浴槽中反应40 min；（二）将0.2 mL的金纳米团簇溶液加入到第一步反应后的溶液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3 min，在355nm激发波长下测定650 nm处的荧光强度值（F650），通过标准曲线进行脲酶活性的测定。
本发明的优点：
（1）本发明基于脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以用于脲酶活性的检测。
（2）本发明所使用的金纳米团簇直接由N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。
（3）本发明的检测灵敏度高，荧光分光光度计测定的检测限为0.55 U/L。
附图说明
图1为金纳米团簇溶液在紫外灯下的外观图。图中：（A）空白对照组；（B）脲酶组（脲酶浓度为22 U/L）。
图2为金纳米团簇溶液的发射光谱图。图中：（A）空白对照组，为上方的曲线；（B）脲酶组（脲酶浓度为22 U/L），为下方的曲线。
图3为不同浓度尿素条件下金纳米团簇溶液与脲酶催化反应液（脲酶浓度为22 U/L）作用后发射光强度（F650）变化值（ΔF650）关系图。
图4为在金纳米团簇溶液中加入脲酶和尿素后，荧光发射光强度随时间的变化图。
图5为金纳米团簇溶液与脲酶催化反应液（含不同浓度脲酶）作用后的荧光发射光谱图。
图6为金纳米团簇溶液的发射光强度值（F650）与脲酶浓度之间的关系图。
图7为金纳米团簇溶液的发射光强度值（F650）与脲酶浓度之间的线性关系图。图8为金纳米团簇溶液用于胃组织幽门螺旋杆菌测定结果图。
具体实施方式
实例1：
将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理。所得到的金纳米团簇溶液可见光下为无色，紫外灯照射下产生强烈的红色荧光。4°C暗处保存，能保持至少一个月的相对稳定。
实例2：
将0.05 mL浓度为22 U/L的脲酶溶液（pH=6.0）加入到0.2 mL浓度为1 mol/L的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40 min。将0.2 mL的实例1制备的金纳米团簇溶液加入到上述溶液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3 min。设置一组无脲酶的空白对照组。反应结束后，在紫外灯下观察，空白对照组显现红色荧光（图1中的A），而加入22 U/L的脲酶的金纳米团簇的红色荧光发生猝灭（图1中的B）。图2为空白对照组和脲酶组金纳米团簇溶液的荧光发射光谱图。
实例3：
将0.05 mL浓度为22 U/L的脲酶溶液（pH=6.0）加入到0.2 mL不同浓度的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40 min。将0.2 mL的实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到上述溶液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3 min，测定发射光强度值F650。由图3可知，当尿素浓度为1mol/L时，荧光猝灭值ΔF650达到最大。
实例4：
将0.05 mL浓度为22 U/L的脲酶溶液（pH=6.0）加入到0.2 mL浓度为1 mol/L的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应0~50 min。将0.2 mL的实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到上述溶液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3 min，测定发射光强度值F650。由图4可知，F650在40 min后达到稳定。
实例5：
将0.05 mL不同浓度的脲酶溶液（pH=6.0）加入到0.2 mL浓度为1 mol/L的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40 min。将0.2 mL的实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到上述溶液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3 min，测定发射光强度值F650。由图5可知，随着脲酶浓度的增大，金纳米团簇的荧光逐渐受到抑制，F650逐渐减小（见图6）。如图7所示，在2.2~44 U/L范围内F650与脲酶浓度呈线性关系，检测限为0.55 U/L。
实例6：
将0.05 mL浓度为11 U/L的脲酶溶液（pH=6.0）加入到0.2 mL浓度为1 mol/L的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40 min。将0.2 mL的实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到上述溶液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3 min，测定发射光强度值F650。重复上述实验12次，得相对标准偏差（RSD）为3.2%，表明本方法重现性良好。
实例7：
取10 mg人胃组织，加入2 mL浓度为1 mol/L的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40 min。取0.25 mL上述反应液，加入0.2 mL实例1制得的金纳米团簇溶液，在25 °C的恒温水浴槽中反应3 min，测定发射光强度值F650。实验结果如图8，由图可知，本方法可用于人胃组织幽门螺旋杆菌的测定。
Claims (9)
1.一种基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于脲酶活性的测定。
2.根据权利要求1所述的基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
3.根据权利要求2所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
4.根据权利要求2或3所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F650）以判断脲酶含量，所使用的激发波长为355 nm。
5.根据权利要求4所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是将不同浓度pH=6.0的脲酶溶液加入到0~2.5 mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应0~50 min，测定发射光强度值F650，在脲酶浓度为2.2~44 U/L的范围内其发射光强度值F650与脲酶浓度呈线性关系，检测限为0.55 U/L。
6.根据权利要求4所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是尿素的浓度优选为1 mol/L，反应时间优选为40 min。
7.根据权利要求4所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是金纳米团簇溶液，脲酶溶液和尿素溶液按体积比为4：1：4混合，反应总体积为0.45 mL。
8.一种基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，包括如下步骤：取适量人胃组织，加入2 mL浓度为1 mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40 min，取0.25 mL上述反应液，加入0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液，在25°C的恒温水浴槽中反应3 min，测定发射光强度值F650以定性判断胃组织是否存在幽门螺旋杆菌。
9.根据权利要求8所述的基于金纳米团簇的脲酶活性荧光测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
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