CN104330391A - 基于n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种 基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法。 涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的过氧化氢测定方法，其特征是利用Fe²⁺催化H₂O₂产生羟自由基使金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以用于H₂O₂的检测。在0.044~6.66μmol/L范围内ΔF₆₅₀与H₂O₂浓度呈线性关系，检测限为27nmol/L。本发明灵敏度高，重现性好，可用于食品、工业、环境及生命体系中H₂O₂的测定。

Description

基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法

技术领域

本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的过氧化氢的测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术

过氧化氢（H₂O₂）是一种非常重要的化学试剂，可作为消毒剂、杀菌剂、脱氧剂、漂白剂和聚合反应的引发剂，而且它也是一种重要的化工产品，在纺织、化工、环保、电子、食品卫生行业及其他领域有广泛的应用。此外，H₂O₂在生物体内扮演着重要的角色，它是细胞活动过程中一种必不可少的物质，并且已被证实是细胞信号传递的第二信使。另外，H₂O₂还是众多生物氧化酶（例如葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乳酸氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、单胺氧化酶）的主要产物以及一些酶类（如辣根过氧化物酶和过氧化氢酶）的底物。因此，构建一种灵敏、准确、经济的H₂O₂的检测手段十分重要。目前H₂O₂的测定方法主要有分光光度法、荧光法、电化学法、化学发光法、共振光散射法和色谱法等。在上述方法中，荧光法因其具有灵敏度高、特异性好、检测速度快和操作简便等优点，所以应用得最为广泛。目前，荧光法测定H₂O₂主要采用一些小分子的有机染料作为探针，其光稳定性差、生物毒性高、易发生自氧化、成本较高，很大程度上限制了其实际应用。寻找具有更为优越性能的荧光探针十分有必要。

金纳米团簇（gold nanoclusters, Au NCs）是一种新型的荧光纳米材料，其具有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、Stokes位移大、比表面积大、制备条件温和、表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点，其已被广泛应用于催化、传感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域。

本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇作为荧光探针，提供了一种简便、灵敏的H₂O₂检测的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的过氧化氢的测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明所述的基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法，其特征是利用Fe²⁺催化H₂O₂产生羟自由基使金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于H₂O₂的检测。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.08 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于37°C水浴恒温反应2.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

本发明利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F₆₅₀）以判断H₂O₂含量，所使用的激发波长为355 nm。

本发明将金纳米团簇溶液加入到不同浓度和pH 1~6的H₂O₂溶液中，混合均匀后，再加入浓度为0~1.5 mmol/L的Fe²⁺，摇匀后置于25°C水浴锅反应1~15分钟，测定发射光强度值F₆₅₀，在0.044~6.66 μmol/L范围内ΔF₆₅₀与H₂O₂浓度呈线性关系，检测限为27 nmol/L。

本发明所述的Fe²⁺催化H₂O₂反应产生的羟自由基使金原子发生氧化，从而导致金纳米团簇荧光的猝灭。

本发明所述的H₂O₂溶液的pH优选为3，Fe²⁺终浓度优选为0.9 mmol/L，反应时间优选为10分钟。

本发明所述的金纳米团簇溶液，H₂O₂溶液和Fe²⁺溶液按体积比为4：4：1混合，反应总体积为0.45 mL。

具体地说, 本发明采用的技术方案为：

（一）金纳米团簇荧光材料的制备

以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米团簇荧光材料的制备方法如下：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5小时，反应液由浅黄色变为无色。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。

（二）过氧化氢的测定

0.2毫升样品溶液（pH=3）加入0.2毫升步骤（一）制备的金纳米团簇溶液，混合均匀后，再加入0.05毫升浓度为0.9 mmol/L的亚铁离子（Fe²⁺），摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟。反应结束后，以355 nm为激发波长，测定在650 nm处的发射光强度值（F₆₅₀），通过F₆₅₀标准曲线进行H₂O₂的测定。

本发明的优点：

（1）本发明基于Fe²⁺催化H₂O₂产生羟自由基（Fenton反应）使金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以用于H₂O₂的检测。

（2）本发明使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇材料其制备过程快速、简便，不需要任何前修饰步骤。

（3）本发明所构建的方法测定灵敏度高，检测限低至27 nmol/L。

（4）本发明所构建的方法分析时间短，仅需10分钟即可完成H₂O₂的测定。

附图说明

图1为金纳米团簇溶液在紫外灯下的外观对照图。图中：（A）金纳米团簇溶液；（B）金纳米团簇溶液 + 25 μmol/L H₂O₂ + 100 μmol/L Fe²⁺。

图2为金纳米团簇溶液的发射光谱图。图中：(A）金纳米团簇溶液；（B）金纳米团簇溶液 + 25 μmol/L H₂O₂ + 100 μmol/L Fe²⁺。

图3为金纳米团簇Au 4f X射线光电子能谱图。图中：(A）金纳米团簇；（B）金纳米团簇 + 100 μmol/L H₂O₂ + 100 μmol/L Fe²⁺。

图4为pH值对金纳米团簇溶液荧光强度的影响图。F₀为过氧化氢浓度为0时的荧光强度，F为H₂O₂浓度为4.44 μmol/L时的荧光强度，ΔF=F₀-F。

图5为Fe²⁺浓度对金纳米团簇溶液荧光强度的影响图。F₀为过氧化氢浓度为0时的荧光强度，F为H₂O₂浓度为4.44 μmol/L时的荧光强度，ΔF=F₀-F。

图6为反应时间对金纳米团簇溶液荧光强度的影响图。

图7为不同H₂O₂浓度时金纳米团簇溶液的荧光发射光谱图。

图8为金纳米团簇溶液的荧光强度变化值（ΔF₆₅₀）与H₂O₂浓度之间的线性关系图。

具体实施方式

本发明实例所用的Fe²⁺溶液为任一现有技术公开的Fe²⁺溶液，其优选为氯化亚铁溶于40 mM硫酸配制而成的Fe²⁺溶液。

实例1：

将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理。所得到的金纳米团簇溶液可见光下为无色，紫外灯照射下产生强烈的红色荧光。4°C暗处保存，能保持至少一个月的相对稳定。

实例2：

取0.2毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到0.2毫升浓度为25 μmol/L的H₂O₂溶液（pH=3）中，混合均匀后，再加入0.05毫升浓度为0.9 mmol/L的Fe²⁺，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟。在紫外灯下观察，金纳米团簇溶液本身显现红色荧光（图1中的A），而发生Fenton反应之后金纳米团簇溶液红色荧光发生猝灭（图1中的B）。图2为金纳米团簇溶液（图2中的A）和发生Fenton反应之后金纳米团簇溶液（图2中的B）的荧光发射光谱图。

实例3：

取0.2毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到0.2毫升浓度为100 μmol/L的H₂O₂溶液（pH=3）中，混合均匀后，再加入0.05毫升浓度为0.9 mmol/L的Fe²⁺，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟。反应结束后的溶液进行冷冻干燥，取干燥后的粉末进行X射线光电子能谱分析。如图3所示，Fenton反应之后金的4f_7/2结合能由原先的84.57 eV偏移到84.75 eV，表明Fenton反应产生的羟自由基使金原子发生氧化，从而导致金纳米团簇荧光的猝灭。

实例4：

取0.2毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到0.2毫升浓度为4.44 μmol/L的H₂O₂溶液（pH 1~6）中，混合均匀后，再加入0.05毫升浓度为0.9 mmol/L的Fe²⁺，摇后匀置于25°C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F₆₅₀。由图4可知，当pH为3时，荧光猝灭值ΔF₆₅₀达到最大。

实例5：

取0.2毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到0.2毫升浓度为4.44 μmol/L的H₂O₂溶液（pH=3）中，混合均匀后，再加入0.05毫升浓度为0~1.5 mmol/L的Fe²⁺，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F₆₅₀。由图5可知，当Fe²⁺浓度为100 μmol/L时，荧光猝灭值ΔF₆₅₀达到最大。

实例6：

取0.2毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到0.2毫升浓度为4.44 μmol/L的H₂O₂溶液（pH=3）中，混合均匀后，再加入0.05毫升浓度为0.9 mmol/L的Fe²⁺，摇匀后置于25°C水浴锅反应1~15分钟，测定荧光强度值F₆₅₀。由图6可知，反应10分钟后，荧光猝灭值ΔF₆₅₀变化平稳。

实例7：

取0.2毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到0.2毫升不同浓度的H₂O₂溶液（pH=3）中，混合均匀后，再加入0.05毫升浓度为0.9 mmol/L的Fe²⁺，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F₆₅₀。由图7可知，随着H₂O₂浓度的增大，金纳米团簇的荧光逐渐受到抑制，F₆₅₀逐渐减小。如图8所示，在0.044~6.66 μmol/L范围内ΔF₆₅₀与H₂O₂浓度呈线性关系，检测限为27 nmol/L。

实例8：

取0.2毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液加入到0.2毫升浓度为4.44 μmol/L H₂O₂溶液（pH=3）中，混合均匀后，再加入0.05毫升浓度为0.9 mmol/L的Fe²⁺，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F₆₅₀。重复以上步骤12次，得相对标准偏差（RSD）为2.2%，表明本方法重现性良好。

Claims (8)

1.一种基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法，其特征是利用Fe²⁺催化H₂O₂产生羟自由基使金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于H₂O₂的检测。

2.根据权利要求1所述的基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.08 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于37°C水浴恒温反应2.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

4.根据权利要求1或2所述的基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法，其特征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F₆₅₀）以判断H₂O₂含量，所使用的激发波长为355 nm。

5.根据权利要求1或2所述的基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法，其特征是将金纳米团簇溶液加入到不同浓度和pH 1~6的H₂O₂溶液中，混合均匀后，再加入浓度为0~1.5 mmol/L的Fe²⁺，摇匀后置于25°C水浴锅反应1~15分钟，测定发射光强度值F₆₅₀，在0.044~6.66 μmol/L范围内ΔF₆₅₀与H₂O₂浓度呈线性关系，检测限为27 nmol/L。

6.根据权利要求1或2所述的基于荧光金纳米团簇的过氧化氢测定方法，其特征是Fe²⁺催化H₂O₂反应产生的羟自由基使金原子发生氧化，从而导致金纳米团簇荧光的猝灭。

7.根据权利要求5所述的基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法，其特征是H₂O₂溶液的pH优选为3，Fe²⁺终浓度优选为0.9 mmol/L，反应时间优选为10分钟。

8.根据权利要求5所述的基于N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇的过氧化氢测定方法，其特征是金纳米团簇溶液，H₂O₂溶液和Fe²⁺溶液按体积比为4：4：1混合，反应总体积为0.45 mL。