CN104198454A

CN104198454A - 以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法

Info

Publication number: CN104198454A
Application number: CN201410468937.1A
Authority: CN
Inventors: 陈伟; 邓豪华; 林逢林; 何少斌; 彭花萍
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2014-09-13
Filing date: 2014-09-13
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-09-13
Also published as: CN104198454B

Abstract

本发明公开一种以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以直接用于尿素的含量测定。在0.055~0.55mmol/L范围内F₆₅₀与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。本发明选择性高，重现性好，能够作为分析方法应用于环境及生命科学体系中尿素的高灵敏测定。

Description

以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法

技术领域

本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的尿素测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术

尿素是人体蛋白质代谢的终产物，由肝脏产生，经血液运输至肾脏以尿液形式排出。尿素的生成量取决于蛋白质的摄入量、组织蛋白质的分解代谢以及肝功能状况。尿素是临床及生物化学一个重要的目标分析物，它是评价尿毒症毒素水平、肾脏及肝脏细胞功能的重要标志。目前，尿素的测定方法包括：氨电极法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联法，脲酶-亮氨酸脱氢酶偶联法等。

近年来，荧光金属纳米团簇作为一种新型的荧光纳米材料备受关注。金属纳米团簇是指在一定的分子层保护作用下，由几个到几百个金属原子构成的分子级聚集体，其直径一般小于2 nm，接近于电子的费米波长（约0.7 nm）。由于其独特的物理、电学和光学性质，金属纳米团簇在单分子光电、催化、生物成像和传感器等领域显示出广泛的应用前景。在所有的金属纳米团簇材料中，金纳米团簇（gold nanoclusters，AuNCs）因其具有化学性质稳定和生物相容性好等优点，是目前研究最多的一种金属纳米团簇材料。与小分子荧光染料和荧光蛋白相比，AuNCs用作荧光探针具有水溶性好、比表面积大、表面易于修饰、抗光漂白能力强以及荧光性质可调等优点。因此，金纳米团簇有望弥补一些有毒小分子荧光染料的不足，甚至可以取代某些光稳定性差的传统荧光探针。

本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针，建立了一种尿素测定的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的尿素测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能直接用于尿素的含量测定。

所述金纳米团簇溶液，脲酶溶液和尿素测定液按体积比为4：4：1混合，25°C反应40分钟测定发射光强度值F₆₅₀以判断尿素的浓度。

所使用的脲酶浓度为10 U/mL。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液。

利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F₆₅₀）以判断尿素含量，所使用的激发波长为355 nm。

将金纳米团簇溶液和脲酶溶液混合均匀后，将不同浓度尿素溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应后，测定发射光强度值F₆₅₀，在尿素浓度为0.055~0.55mmol/L的范围内F₆₅₀与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。

本发明所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，包括如下步骤：取新鲜人尿液，用pH=6.0的缓冲液稀释，取0.05 mL稀释液加入到由0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液和0.2 mL、浓度为10 U/mL的脲酶溶液组成的混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F₆₅₀，通过标准曲线进行定量，获得尿液中的尿素含量。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。

所述的新鲜人尿液为用pH=6.0的醋酸盐缓冲液稀释200倍后选取的0.05 mL稀释液。

具体地说，本发明采用的技术方案为：

（一）金纳米团簇荧光材料的制备

以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米团簇荧光材料的制备方法如下：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5小时，反应液由浅黄色变为无色。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。

（二）尿素的测定：

0.2 毫升步骤（一）制备的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）的样品溶液加入到上述混合液中，在25 °C的恒温水浴槽中反应40分钟。反应结束后，以355 nm为激发波长，测定在650 nm处的发射光强度值（F₆₅₀），通过标准曲线进行尿素的测定。

本发明的优点：

（1）本发明基于脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以直接用于尿素的含量检测。

（2）本发明所使用的金纳米团簇直接由N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。

（3）本发明对样品的处理要求低，抗干扰性好，尿液仅需适当稀释即可进行测定。

（4）本发明的检测灵敏度高，荧光分光光度计测定的检测限为0.055 mmol/L。

附图说明

图1为金纳米团簇溶液在紫外灯下的外观图。图中：（A）空白对照组；（B）尿素组（尿素浓度为0.88 mmol/L）。

图2为金纳米团簇溶液的发射光谱图。图中：（A）空白对照组；（B）尿素组（尿素浓度为0.88 mmol/L）。

图3为在金纳米团簇溶液中加入脲酶和尿素后，荧光发射光强度随时间的变化图。

图4为金纳米团簇溶液与脲酶催化反应液（不同浓度尿素）孵育后的荧光发射光谱图。

图5为金纳米团簇溶液的发射光强度值（F₆₅₀）与尿素浓度之间的关系图。

图6为金纳米团簇溶液的发射光强度值（F₆₅₀）与尿素浓度之间的线性关系图。

图7为金纳米团簇溶液与不同有机物作用后的发射光强度（F₆₅₀）图。（黑柱：有机物+脲酶+金簇；白柱：有机物+脲酶+尿素（0.55 mM）+金簇）

图8为金纳米团簇溶液与不同阳离子作用后的发射光强度（F₆₅₀）图。（黑柱：阳离子+脲酶+金簇；白柱：阳离子+脲酶+尿素（0.55 mM）+金簇）

图9为金纳米团簇溶液与不同阴离子作用后的发射光强度（F₆₅₀）图。（黑柱：阴离子+脲酶+金簇；白柱：阴离子+脲酶+尿素（0.55 mM）+金簇）。

具体实施方式

实例1：

金纳米团簇荧光材料的制备过程如下：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理。所得到的金纳米团簇溶液可见光下为无色，紫外灯照射下产生强烈的红色荧光。4°C暗处保存，能保持至少一个月的相对稳定。

实例2：

0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）尿素溶液（0.88 mmol/L）加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40 分钟。设置一组无尿素的空白对照。反应结束后，在紫外灯下观察，空白对照组显现红色荧光（图1中的A），而尿素组的金纳米团簇的红色荧光发生猝灭（图1中的B）。图2为空白对照组和尿素组金纳米团簇溶液的荧光发射光谱图。

实例3：

0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）含有不同浓度尿素的溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应0~50分钟。结果表明，金纳米团簇的荧光在40分钟后趋于稳定（见图3）。

实例4：

0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）含有不同浓度尿素的溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟。由图可知，随着尿素浓度的逐渐增大，金纳米团簇的发射光谱逐渐受到抑制（见图4），发射光强度值F₆₅₀逐渐减小（见图5）。如图6所示，在尿素浓度为0.055~0.55 mmol/L的范围内发射光强度值F₆₅₀与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。

实例5：

0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）浓度为0.22 mmol/L尿素的溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F₆₅₀。重复上述实验12次，得相对标准偏差（RSD）为3.6%，表明本方法重现性良好。

实例7：

0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）浓度为0.1 mmol/L的不同有机物溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F₆₅₀。如图7所示， 0~20依次为空白、谷胱甘肽、抗坏血酸、牛血清蛋白、ATP、尿酸、葡萄糖、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-乳糖、麦芽糖，结果表明本方法抗有机物干扰能力强。

实例8：

0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）浓度为0.01 mmol/L的不同阳离子加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F₆₅₀。如图8所示，0~19依次为空白，Ni²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Mn²⁺、NH₄ ⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Fe²⁺、Al³⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Co²⁺、Hg⁺、Cr³⁺、Ca²⁺、 Na⁺、K⁺，结果表明本方法抗阳离子干扰能力强。

实例9：

0.2 毫升实例1所制得的金纳米团簇溶液与0.2 毫升浓度为10 U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）混合均匀后，将0.05 毫升（pH=6.0）浓度为0.01 mmol/L的不同阴离子加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F₆₅₀。如图8所示，0~18依次为空白、S₂O₃ ^2-、NO₂ ^-、SO₃ ^2-、F^-、SCN^-、S^2-、H₂PO₄ ^-、BrO₇ ^2-、IO₃ ^-、BrO₃ ^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-、S₂O₈ ^2-、ClO₄ ^-、I^-、Br^-、CO₃ ^2-、Ac^-，结果表明本方法抗阴离子干扰能力强。

实例10：

取新鲜人尿液，用pH=6.0的醋酸盐缓冲液稀释200倍，取0.05 mL稀释液加入到由实例1所制得的0.2 mL金纳米团簇溶液和0.2 mL脲酶溶液（浓度为10 U/mL）组成的混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F₆₅₀。通过标准曲线进行定量，获得尿样中的尿素含量。与标准方法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与标准方法无显著性差异（表1）。

表1

F_0.05, 2, 2=19.00, t_0.05, 4=2.776。

Claims

1.一种以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能直接用于尿素的含量测定。

2.根据权利要求1所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所述金纳米团簇溶液，脲酶溶液和尿素测定液按体积比为4：4：1混合，25°C反应40分钟测定发射光强度值F₆₅₀以判断尿素的浓度。

3.根据权利要求1或2所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的脲酶浓度为10 U/mL。

4.根据权利要求3所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

5.根据权利要求4所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理得到N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液。

6.根据权利要求4或5所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F₆₅₀）以判断尿素含量，所使用的激发波长为355 nm。

7.根据权利要求6所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是将金纳米团簇溶液和脲酶溶液混合均匀后，将不同浓度尿素溶液加入到上述混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应后，测定发射光强度值F₆₅₀，在尿素浓度为0.055~0.55mmol/L的范围内F₆₅₀与尿素浓度呈线性关系，检测限为0.055mmol/L。

8.一种以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，包括如下步骤：取新鲜人尿液，用pH=6.0的缓冲液稀释，取0.05 mL稀释液加入到由0.2 mL N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液和0.2 mL、浓度为10 U/mL的脲酶溶液组成的混合液中，在25°C的恒温水浴槽中反应40分钟，测定发射光强度值F₆₅₀，通过标准曲线进行定量，获得尿液中的尿素含量。

9.根据权利要求8所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。

10.根据权利要求8或9所述的以荧光金纳米团簇为探针的尿素测定方法，其特征是所述的新鲜人尿液为用pH=6.0的醋酸盐缓冲液稀释200倍后选取的0.05 mL稀释液。