CN103760145A

CN103760145A - 检测羟基自由基的比率型荧光探针及合成方法和用途

Info

Publication number: CN103760145A
Application number: CN201410038820.XA
Authority: CN
Inventors: 庄梅; 田阳
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2014-01-27
Publication date: 2014-04-30

Abstract

本发明涉及一种检测羟基自由基的比率型荧光探针及合成方法和用途，该比率型荧光探针是将蛋白质包裹具有荧光的BSA-AuNCs（金纳米簇）和对羟基自由基有特定响应的有机分子HPF（2-[6-(4’-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoicacid）共价键和在一起，从而形成比率型荧光探针。此探针无羟基自由基的条件下仅BSA-AuNCs会发射出参比荧光，当环境中存在羟基自由基时，探针上的HPF会与羟基自由基发生反应，生成荧光产物，发射出羟基自由基的响应荧光。由于参比荧光的存在，可以有效的降低由于激光光源稳定性，激光强度，探针浓度，光学对焦，细胞内环境变化等原因引起的测定误差，能够更准确的测定羟基自由基的浓度。

Description

检测羟基自由基的比率型荧光探针及合成方法和用途

技术领域

本发明属于生物检测技术及临床医学检测领域，具体涉及一种检测羟基自由基的比率型荧光探针及合成方法和用途。

背景技术

活性氧是生物体生命代谢不可避免的副产物，它在机体的先天性免疫、信号转导、细胞的增生、分化、凋亡等方面有重要的作用，但是同时，活性氧自由基对生物机体也存在着氧化损伤，使组织细胞的结构发生破坏性修饰，损伤正常组织细胞的形态和功能（文献1：Chen X., .Probing oxidative stress: Small molecule fluorescent sensors of metal ions, reactive oxygen species, and thiols，Coord. Chem. Rev.，2011，40：4783-4804）。

羟基自由基是目前已知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，它能够造成细胞中DNA、脂质、糖类、蛋白质等分子过度氧化，而造成细胞伤害。相关研究证据显示，这些损伤可进一步造成多种退化性疾病、老化、突变以及癌症的形成（Tang, B.，Probing Hydroxyl Radicals and Their Imaging in Living Cells by Use of FAM–DNA–Au Nanoparticles，Chem. Eur. J.，2008, 14, 522-528），因此，对羟基自由基的测定尤为重要。

羟基自由基的寿命短，含量低，对其的检测是化学分析和生命科学分析领域最困难的问题之一。目前，国内外文献报道的检测羟基自由基的方法主要有电子自旋共振法（Yim, M. B.，Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical production from hydrogen peroxide，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，1990，87，5006-5010）,电化学法（Li, L.，An Electrochemical Strategy for Fast Monitoring of ^·OH Released from Live Cells at Electroactive FcHT-Functional Surface Amplified by Au Nanoparticles，Chem. Commun.，2013，49，1279-1281），以及荧光法（Czili, H.，Applicability of coumarin for detecting and measuring hydroxyl radicals generated by photoexcitation of TiO₂ nanoparticles，Appl. Catal. B.，2008，81，295-302）等。荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、重现性高、线性范围宽、方法简便快速等优点，且与激光共聚焦显微技术结合后，可以实现活体细胞和组织内目标物的“实时、定量、可见”的检测。目前已报道用于检测细胞内羟基自由基的探针多为单发射型，不能有效避免测定环境所引起的误差。

比率型荧光探针测定时包含两个荧光信号峰，其中一个作为参比荧光型号，另一个作为对待测物有响应的响应荧光信号，根据两个荧光信号的光强度比值度待测物进行定量，由于参比荧光的存在，在测定的过程中可以有效的避免复杂环境变化所引起的误差（A. Zhu. Carbon-Dot-Based Dual-Emission Nanohybrid Produces a Ratiometric Fluorescent Sensor for In Vivo Imaging of Cellular Copper Ions，Angew. Chem. Int. Ed.，2012，51: 7185-7189）。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种对细胞渗透性好，毒副作用小，适用于生物体内羟基自由基检测的比率型荧光探针。

本发明的目的之二是提供一种工艺简单的该荧光探针的合成方法。

本发明的目的之三是提供该荧光探针的用途。

本发明提出的一种检测羟基自由基的比率型荧光探针，以牛血清蛋白为还原剂和保护剂，制备具有荧光的BSA-AuNCs（金纳米簇）中，使牛血清蛋白上的胺基和对羟基自由基有特定响应的有机分子HPF（2-[6-(4’-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid）的羧基反应，产生共价键，从而形成比率型荧光探针。

本发明提出的一种检测羟基自由基的比率型荧光探针的合成方法，具体步骤如下：

（1）在37 ℃和充分磁力搅拌的条件下，将5 体积，浓度为10 mM 的氯金酸水溶液加入到5 体积、质量浓度为50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5 体积浓度为1 M 的NaOH溶液，持续反应12 h；用透析膜（MWCO : 3500）将反应得到的产物在超纯水中透析24 h，得到BSA-AuNCs溶液；

（2）室温条件下，将体积为10μL浓度为5 mM 的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入催化剂 0.0400 g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和0.0400 g N-羟基琥珀酰亚胺活化，再加入步骤(1)得到的AuNCs溶液反应10 h；所得产物在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中透析，得到比率型荧光探针溶液。

本发明提出的比率型荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基的检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的荧光成像检测，以及临床医学上组织和器官中羟基自由基的检测。

本发明提出的比率型荧光探针对羟基自由基的识别是基于有机分子HPF对羟基自由基的特殊响应。在没有羟基自由基的情况下，比率型荧光探针中只BSA-AuNCs会发射出荧光；当有羟基自由基存在时，羟基自由基会切断HPF中的对苯酚基，生成荧光素类荧光物质，成为双发射比率型荧光探针。

本发明提出的比率型荧光探针通常加入含有细胞及组织的适当缓冲溶液中进行测试，其线性范围为 0μM-150μM。

本发明提出的比率型荧光探针结合激光共聚焦显微技术被实际应用于Hela细胞在氧化应激条件下的羟基自由基的细胞成像。

本发明的荧光探针有如下优点：

(1)作为比率型荧光探针，由于参比荧光的存在，可以有效的降低由于激光光源稳定性，激光强度，探针浓度，光学对焦，细胞内环境变化等原因引起的测定误差，能够更准确的测定羟基自由基的浓度。

(2)合成方法简单，在室温下即可，不需要严格的合成条件；

(3)对羟基自由基有良好的选择性，其它活性氧物质几乎不会产生干扰荧光信号。

(4)参比荧光的存在可以有效避免由测定环境的变化而引起的误差。

(5)探针的细胞毒性低，生物兼容性好。

(6)探针的荧光激发波长为488 nm,对于活性组织和细胞的损伤小。

附图说明

图1是本发明的比率型荧光探针与不同浓度的羟基自由基作用后体系的荧光发射图谱，其横坐标为波长(Wavelength/nm),纵坐标为荧光强度(FL)。

图2是本发明的比率型荧光探针与不同浓度的羟基自由基作用的线性关系，横坐标为^·OH的浓度（[^·OH]/μM），纵坐标为荧光比率探针的荧光强度比率值（I_500-560/I_580-690）。

图3是本发明的比率型荧光探针对羟基自由基（^·OH）与过氧化氢（H₂O₂），超氧阴离子自由基（O₂ ^·-），次氯酸根(ClO^–)，脂过氧自由基（ROO^·），过氧亚硝基阴离子（ONOO^–），单线态氧（¹O₂），一氧化氮(NO)，次硝酸(HNO)的荧光响应，横坐标为各种活性自由基物质，纵坐标为比率荧光探针中响应荧光与参比荧光的荧光光强度比率值（I_500-560/I_580-690）。

图4是本发明的比率型荧光探针对细胞的MTT细胞实验。加入不同倍数于的原细胞探针溶液浓度的探针与细胞共培养后，细胞的存活率。

图5是本发明的比率型荧光探针研究宫颈癌细胞（Hela）的激光共聚焦显微成像的灰度图，（a）是未产生^·OH前，探针在细胞里的成像，（b）和（c）是引起氧化应激20 min和40 min后，探针在细胞里的成像。

图6是本发明的比率型荧光探针测定羟基自由基的机理示意图。

具体实施方式

下面具体实施例是结合技术方案和附图对本发明作进一步说明，但本发明不受下列实施例的严格限定。

实施例1：羟基自由基的比率型荧光探针的合成

1.在37 ℃和充分磁力搅拌的条件下，将5 mL 浓度为10 mM 的氯金酸水溶液加入到5 5 mL 质量浓度为50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5 mL浓度为1 M 的NaOH溶液，持续反应12 h；用透析膜（MWCO : 3500）将反应得到的产物在超纯水中透析，得到BSA-AuNCs溶液；

2.室温条件下，将体积为10μL浓度为 5 mM 的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入0.0040g 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和0.0040g N-羟基琥珀酰亚胺活化HPF中的羧基，再加入400μL上述BSA-AuNCs溶液反应10 h；所得产物在3000 mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中透析4 h，得到比率型荧光探针溶液。

实施例2：比率探针与^·OH反应后荧光性质的测定

1.羟基自由基的产生方法：

本发明中的羟基自由基是利用芬顿反应来产生，其根据如下反应：

其中^·OH以Fe²⁺来定量，为确保Fe²⁺充分反应，Fe²⁺与H₂O₂的浓度比为1:10，其反应介质为pH为7.4的PBS缓冲溶液，FeCl₂溶液和H₂O₂要求现配现用。

2.荧光测试：

（1）荧光光谱的测定参数：

用F-2700FL荧光仪进行荧光检测，光电倍增管的电压为700 V，狭缝宽度为2.5 nm,扫描范围为500-750 nm,扫描速度为1200 nm/min,采用的激发波长为488 nm,^·OH存在下，比率型探针的两个荧光峰位置分别为515 nm和630 nm。

（2）探针对^·OH的荧光响应：

向1cm×1cm的荧光比色皿中加入1 mL所得的探针溶液，测定其荧光光谱，然后向探针溶液中加入不同浓度^·OH并测定其荧光变化，不同浓度^·OH即不同浓度的芬顿试剂量[FeCl₂]：[H₂O₂]=3μM:30μM，5μM:50μM，7μM:70μM，10μM:100μM；30μM:300μM, 50μM：500μM, 70 μM:700μM, 100μM:1000μM, 150μM：1500μM，所得的荧光图谱如图1所示。两个荧光峰的积分面积之比，即荧光的光强度与羟基自由基的浓度之间的线性关系如图2所示。

（3）探针对^·OH的选择性：

向1cm×1cm的荧光比色皿中加入1 mL所得的探针溶液，测定其荧光光谱，加入H₂O₂（1500μM），O2^·-（150μM KO₂），ClO^–（150μM NaClO），ROO^·（150μM AAPH）, ONOO^–（[H₂O₂]:[NaNO₂]=150μM:150μM）,¹O₂([H₂O₂]:[NaClO]=150μM:150μM),NO(150μM S-Nitroso-N-acetyl-DL-Penicillamine),HNO(150μM Angeli’s salt),^·OH（[FeCl₂]：[H₂O₂]= 150μM:1500μM），在37℃下反应30 min后进行荧光测试，所得结果如图3所示。可见该比率型探针对^·OH有良好的选择性。

3.细胞实验：

（1）细胞培养：

将人宫颈癌细胞在含有10%小牛血清，1%链霉素和1%青霉素的高糖DMEM培养液中,密度为3×10⁵个/mL人宫颈癌细胞被接种在200μL的96孔板上。在37℃,5% CO₂的条件下培养24h。

（2）MTT探针生物兼容性实验：

在37℃下将细胞用含有不同浓度探针的细胞培养液培养24 h和48 h, 用酶标仪测定活细胞百分比，所得实验结果如图4所示，可见与空白细胞相比，加入不同浓度的探针培养24 h和48 h后，活细胞数量均大于80%，可知该探针具有良好的生物兼容性和低的生物毒性。该实验中细胞培养用到的探针浓度为细胞成像时探针浓度的0.01,0.1,1，10，100倍。

（3）细胞成像实验

在37℃下向2 mL的细胞培养液中加入20 uL的探针溶液并与细胞共培养1 h,然后用pH为7.4的HEPES冲洗3次，以除去未进入细胞的探针，在细胞成像过程中，细胞被培养在HEPES缓冲溶液中。用奥林巴斯FV × 1000激光共聚焦显微镜进行细胞成像，成像时物镜采用60倍油镜。未引起氧化应激时，比率型探针在细胞内仅仅是有BSA-AuNCs的荧光，光强度较弱（图5A），当加入H₂O₂诱导细胞发生氧化应激产生^·OH后，比率型探针的HPF部分会发出荧光，使细胞中探针的荧光强度逐渐变强，图5B和图5C分别是诱导细胞发生氧化应激20 min和40 min后探针在细胞内成像的灰度图，可以看出，因为羟基自由基的产生探针的荧光强度明显增强。图5D为细胞的明场图像。通过比率计算，测得细胞内羟基自由基的浓度为37μM（以芬顿试剂Fe²⁺定量）。

Claims

1.一种检测羟基自由基的比率型荧光探针，其特征在于：以牛血清蛋白为还原剂和保护剂，制备具有荧光的BSA-AuNCs（金纳米簇），使牛血清蛋白上的胺基和对羟基自由基有特定响应的有机分子HPF（2-[6-(4’-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoic acid）的羧基反应，产生共价键，从而形成比率型荧光探针。

2.一种如权利要求1所述的检测羟基自由基的比率型荧光探针的合成方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）在37 ℃和充分磁力搅拌的条件下，将5 体积浓度为10 mM 的氯金酸水溶液加入到5 体积质量浓度为50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5 体积浓度为1 M 的NaOH溶液，持续反应12 h；用透析膜（MWCO : 3500）将反应得到的产物在超纯水中透析，得到BSA-AuNCs溶液；

（2）室温条件下，将一定量5 mM 的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入适量催化剂 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化，再加入步骤(1)所述BSA-AuNCs溶液反应10 h；所得产物在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中透析，得到比率型荧光探针溶液。

3.一种如权利要求1所述的检测羟基自由基的比率型荧光探针的用途，其特征在于将比率型荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基的检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的荧光成像检测，以及临床医学上组织和器官中羟基自由基的检测。