CN109557064A - 一种通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸及其浓度的方法、检测丙酮酸氧化酶及其浓度的方法 - Google Patents

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刘美欣
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"

Abstract

本发明提供了一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用。本发明将荧光金纳米簇探针用于检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶，具有灵敏度高，良好的选择性，线性范围较宽等特点。本发明建立的通过荧光纳米簇发射荧光方法来检测丙酮酸，不仅避免了生物体其他因素的干扰，可以选择性的检测血液、尿液中丙酮酸的浓度，可以无创地检测丙酮酸浓度；而且使用荧光发射的方法检测丙酮酸的浓度，而不是使用事先制备好的荧光金属纳米簇，最大限度地避免了实验中的假信号可能带来的干扰；同时检测过程中同时生成的荧光金纳米簇具有优良的荧光性质，在光学材料、生物医学等领域上的应用具有重要的意义。

Description

一种通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸及其浓度的方法、检 测丙酮酸氧化酶及其浓度的方法
技术领域
本发明涉及丙酮酸检测技术领域，具体涉及一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用、采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法、采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸氧化酶浓度的方法以及采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸或丙酮酸氧化酶的方法，尤其涉及一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用、通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸及其浓度的方法、通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸氧化酶及其浓度的方法以及通过荧光金纳米簇探针检测样品中是否含有丙酮酸或丙酮酸氧化酶的方法。
背景技术
近年来随着科技的发展，荧光纳米材料由于在量子尺寸效应、等离子共振效应及最子隧道效应等方丽的特性，展现出与众不同的光学、化学、也学以及催化性能，使其在科学界备受关注。目前已研究发现的荧光纳米材料主要有有机染料、碳量子点、聚合物点、半导体量子点、荧光金属纳米簇(FM NCs)等。这其中，金属纳米簇是一种特殊材料，在20世纪六十年代，已有研究者发现铜、银、金等金属有较弱的荧光，但其荧光产率特别低，随着技术的发展和社会的需要，荧光金属纳米簇的研究越来越受科研工作者的关注。FMNCs是由保护剂同一些(几个、数十个或者上百个)金属原子，如(Cu、Ag、Au、Pt)结合而成的粒径小于2nm的荧光纳米材料。金属纳米簇的尺寸介于金属原子和纳米粒子之间，当金属本体材料的尺寸降到纳米级别甚至接近于电子费米水平，原来连续的能带就会分裂成若干个分立能级，电子的运动将不再受空间的限制，而跃迁于各个能级之间；连续能级将被分裂成各种离散能级，从而使FM NCs具有独特的较强荧光性能。这些分立能级导致了纳米簇具有可调的激发，良好的水溶性，光稳定性和低毒性等特点。金属粒子的物理化学性能与其尺寸大小密切相关，并对其有依赖性。目前，研究发现的荧光金属纳米簇已有多种，例如铂纳米簇、金纳米簇、银纳米簇、铜纳米簇以及各种合金纳米簇等。
正是由于荧光金属纳米簇荧光强度较强，同生物分子具有良好的相容性且稳定性较好，而且合成方法较为简单，使其在环境监测、生物成像、疾病监测、催化、光电学等多个领域具有广阔的前景，特别是在生物小分子检测领域具有很高的应用价值。
丙酮酸(Pyruvate)是体内葡萄糖分解代谢与合成代谢的重要中间产物,在体内糖、脂质、蛋白质三大物质代谢中起重要作用。丙酮酸测定在阴离子隙升高性酸中毒，维生素B1缺乏，糖尿病酮症酸中毒的诊诊断和治疗以及运动生理学研究等方面都有较高的临床意义。因此，建立简便、灵敏、准确的检测分析丙酮酸的方法是十分必要的。
目前，现有文献中记载检测丙酮酸的方法有二硝基苯腙比色法，紫外酶偶联分光光度法、气相色谱法等，但存在特异性差，操作复杂等缺点，尤其有时还需要大型仪器时，更存在操作复杂、设备昂贵、耗时长、灵敏度低等缺点，难以满足日常检测要求，大大限制了这些检测方法的推广和应用，也增加了使用方的成本。
因此，如何找到一种更加合适的检测丙酮酸的方法，克服现有检测丙酮酸的方法存在的上述缺陷，已成为诸多具有前瞻性的研究人员广为关注的焦点之一。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用，特别是采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法、采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸氧化酶浓度的方法以及采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸或丙酮酸氧化酶的方法。本发明将荧光金纳米簇用于检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中，不仅具有灵敏度高，良好的选择性，线性范围较宽等特点。而且不容易受到外界环境的影响，检测结果准确。
本发明提供了一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用。
优选的，所述荧光法检测丙酮酸还包括荧光法检测丙酮酸的浓度；
所述荧光法检测丙酮酸的过程中，同时原位制备荧光金纳米簇，所述原位制备的原料包括丙酮酸和丙酮酸氧化酶；
所述荧光金纳米簇的荧光发射强度与丙酮酸的浓度成正比；
所述丙酮酸的浓度为50～4000μM；
所述荧光金纳米簇包括金纳米簇和配体；
所述荧光金纳米簇的粒径为1～5nm；
所述荧光法为非荧光淬灭法。
优选的，所述荧光法检测丙酮酸氧化酶还包括荧光法检测丙酮酸氧化酶的浓度；
所述荧光法检测丙酮酸氧化酶的过程中，同时原位制备荧光金纳米簇，所述原位制备的原料包括丙酮酸氧化酶和丙酮酸；
所述荧光金纳米簇的荧光发射强度与丙酮酸氧化酶的浓度成正比；
所述丙酮酸氧化酶的浓度为50～4000μM；
所述配体为聚乙烯基吡咯烷酮；
所述金纳米簇和配体的摩尔比为1：(0.2～4.8)。
本发明提供了一种采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法，包括以下步骤：
1)将丙酮酸溶液和丙酮酸氧化酶溶液混合温育后，得到混合溶液；
2)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
3)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到具有荧光强度的金纳米簇溶液；
4)采用不同浓度的丙酮酸溶液重复上述步骤1)～3)，得到具有不同荧光强度的金纳米簇溶液；
5)建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系，用于检测待测样品中的丙酮酸浓度。
优选的，所述丙酮酸氧化酶溶液的浓度为0.5～2mg/mL；
所述丙酮酸溶液与所述丙酮酸氧化酶溶液的体积比为(35～40)：(1～5)；
所述温育的温度为40～45℃；
所述温育的时间为2～3h；
所述酸性缓冲液包括磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液一种或多种；
所述酸性缓冲液的pH值为3.2～5.5；
所述酸性缓冲液的浓度为0.5～2mM；
所述丙酮酸溶液与所述酸性缓冲液的体积比为(35～40)：(1～5)。
优选的，所述丙酮酸溶液与所述N-2-吡咯烷酮的体积比为(35～40)：(1～4)；
所述N-2-吡咯烷酮的浓度为20～60mM；
所述还原剂包括亚铜溶液、NaHSO3溶液、Na2SO3溶液、Na2S2O3溶液、草酸、葡萄糖溶液、醇溶液和胺溶液中的一种或多种；
所述还原剂的浓度为30～70mM；
所述丙酮酸溶液与所述还原剂的体积比为(35～40)：(0.1～1)；
所述反应的时间为10～120min；
所述反应后还包括透析步骤；
所述透析的透析膜的分子量为500～1500Da；
所述透析的时间为12～24h。
优选的，所述第二酸性缓冲液包括磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液一种或多种；
所述第二酸性缓冲液的pH值为4.2～5.2；
所述第二酸性缓冲液的浓度为0.5～2mM；
所述反应液与所述第二酸性缓冲液的体积比为(2～10)：(0.5～1)；
所述可溶性金源包括HAuCl4溶液；
所述可溶性金源的浓度为50～200mM；
所述反应液与所述可溶性金源的体积比为(2～10)：(1～5)；
所述微波反应的微波功率为400～800w；
所述微波反应的时间为3～15min。
优选的，所述不同浓度的丙酮酸溶液的浓度值为100～2000μM；
所述定量关系包括定量关系曲线、定量关系式、定量关系表和定量关系程序中的一种或多种；
所述检测待测样品中的丙酮酸浓度具体过程为：
将丙酮酸溶液替换为待测样品后，按照步骤1)～3)进行，得到具有一定荧光强度的金纳米簇的待测样品溶液，根据待测样品溶液中金纳米簇的荧光强度，关联定量关系，计算得到待测样品中的丙酮酸浓度。
本发明提供了一种采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸氧化酶浓度的方法，包括以下步骤：
1)将丙酮酸氧化酶溶液和丙酮酸溶液混合温育后，得到混合溶液；
2)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
3)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到具有荧光强度的金纳米簇溶液；
4)采用不同浓度的丙酮酸氧化酶溶液重复上述步骤1)～3)，得到具有不同荧光强度的金纳米簇溶液；
5)建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸氧化酶浓度的定量关系，用于检测样品中的丙酮酸氧化酶浓度。
本发明还提供了一种采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸或丙酮酸氧化酶的方法，所述采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸的方法，包括以下步骤：
a)将待测样品和丙酮酸氧化酶溶液混合温育后，得到混合溶液；
b)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
c)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到最终溶液；
当最终溶液含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中含有丙酮酸；
当最终溶液不含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中不含有丙酮酸；
所述采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸氧化酶的方法，包括以下步骤：
A)将待测样品和丙酮酸溶液混合温育后，得到混合溶液；
B)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
C)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到最终溶液；
当最终溶液含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中含有丙酮酸氧化酶；
当最终溶液不含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中不含有丙酮酸氧化酶。
本发明提供了一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用。与现有技术相比，本发明针对现有的检测丙酮酸的方法，特异性差，操作复杂等缺点，尤其有时还需要大型仪器时，更存在操作复杂、设备昂贵、耗时长、灵敏度低等缺点，难以满足日常检测要求，使用成本高的问题。还针对现有技术中也有少量基于纳米簇检测丙酮酸的报道，但原理上都是通过荧光淬灭的方式实现，而这种荧光淬灭的方式比较容易受到外界环境的影响，因为其他假信号可能带来阳性结果的缺陷。
本发明创造性的将荧光金纳米簇探针用于检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶，具有灵敏度高，良好的选择性，线性范围较宽等特点。本发明建立的通过荧光纳米簇发射荧光方法来检测丙酮酸，不仅避免了其他因素的干扰，可以选择性的检测血液、尿液中丙酮酸的浓度，可以无创地检测丙酮酸浓度；而且使用荧光发射的方法检测丙酮酸的浓度，而不是使用事先制备好的荧光金属纳米簇，最大限度地避免了实验中的假信号可能带来的干扰；同时检测过程中同时生成的荧光金纳米簇具有优良的荧光性质，在光学材料、生物医学等领域上的应用具有重要的意义。
实验结果表明，通过本发明的方法，可以唯一性的并且定量检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶血液、尿液中丙酮酸的浓度，检测浓度范围为50～3500μM。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的荧光金纳米簇的透射电子显微镜照片；
图2为本发明实施例1得到的金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系曲线；
图3为本发明实施例1得到的不同浓度梯度的丙酮酸溶液生成的荧光金纳米簇溶液在紫外线下的荧光照片；
图4为本发明对比例1得到的产物溶液的荧光强度的数值曲线；
图5为本发明对比例2得到的产物溶液的荧光强度的数值曲线。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用分析纯或满足医用纯度标准。
本发明所有原料，其牌号和简称均属于本领域常规牌号和简称，每个牌号和简称在其相关用途的领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据牌号、简称以及相应的用途，能够从市售中购买得到或常规方法制备得到。
本发明提供了一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用。
本发明原则上对所述荧光法的定义没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸或丙酮酸氧化酶的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述荧光法优选为荧光发射法。本发明所述荧光法特别是指为非荧光淬灭法。
本发明原则上对所述荧光金纳米簇的组成没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸或丙酮酸氧化酶的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述荧光金纳米簇优选包括金纳米簇和配体。其中，本发明所述配体优选为聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。本发明所述金纳米簇和配体的摩尔比优选为1：(0.2～4.8)，更优选为1：(0.7～4.3)，更优选为1：(1.2～3.8)，更优选为1：(1.7～4.3)，更优选为1：(2.2～2.8)。
本发明原则上对所述荧光金纳米簇的结构和参数没有特别限制，以本领域技术人员熟知的金属纳米簇的结构即可，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸或丙酮酸氧化酶的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述荧光金纳米簇优选具有包覆结构。其中，所述荧光金纳米簇优选包括金纳米簇和复合在金纳米簇表面的配体层。所述荧光金纳米簇的粒径优选为1～5nm，更优选为1.5～4.5nm，更优选为2～4nm，更优选为2.5～3.5nm。
本发明所述荧光法检测丙酮酸优选是指采用荧光金纳米簇探针发射荧光法检测丙酮酸是否存在，同时还包括检测丙酮酸的浓度含量。特别的，本发明所述荧光法检测丙酮酸的过程中，同时原位制备荧光金纳米簇，而且这种原位制备的原料中包括丙酮酸和丙酮酸氧化酶。更特别的，本发明所述荧光金纳米簇的荧光发射强度与丙酮酸的浓度成正比，即待测样品中丙酮酸的含量越高，荧光金纳米簇的荧光发射强度越强。如果待测样品中不含有丙酮酸，则本发明中的荧光金纳米簇不会形成，这也是本发明与现有的荧光淬灭法的区别所在。
本发明原则上对所述丙酮酸的浓度没有特别限制，以本领域技术人员熟知的丙酮酸的常规浓度即可，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸或丙酮酸氧化酶的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述丙酮酸的浓度优选在荧光发射强度检测仪的量程之内，具体优选为50～3500μM，更优选为70～3000μM，更优选为90～2500μM，更优选为100～2000μM，更优选为500～1500μM，更优选为800～1200μM。
本发明所述荧光法检测丙酮酸氧化酶优选包括采用荧光金纳米簇探针发射荧光法检测丙酮酸氧化酶是否存在，同时还包括检测丙酮酸氧化酶的浓度含量。特别的，本发明所述荧光法检测丙酮酸氧化酶的过程中，同时原位制备荧光金纳米簇，而且这种原位制备的原料中包括丙酮酸氧化酶和丙酮酸。更特别的，本发明所述荧光金纳米簇的荧光发射强度与丙酮酸氧化酶的浓度成正比，即待测样品中丙酮酸氧化酶的含量越高，荧光金纳米簇的荧光发射强度越强。如果待测样品中不含有丙酮酸氧化酶，则荧光金纳米簇不会形成这也是本发明与现有的荧光淬灭法的区别所在。
本发明原则上对所述丙酮酸氧化酶的浓度没有特别限制，以本领域技术人员熟知的丙酮酸氧化酶的常规浓度即可，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸或丙酮酸氧化酶的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述丙酮酸氧化酶的浓度优选在荧光发射强度检测仪的量程之内，具体优选为50～3500μM，更优选为70～3000μM，更优选为90～2500μM，更优选为100～2000μM，更优选为500～1500μM，更优选为800～1200μM，。
本发明为更好的实现丙酮酸或丙酮酸氧化酶的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，细化和完整具体的应用过程，本发明还提供了一种采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法，包括以下步骤：
1)将丙酮酸溶液和丙酮酸氧化酶溶液混合温育后，得到混合溶液；
2)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮(NVP)和还原剂进行反应后，得到反应液；
3)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到具有荧光强度的金纳米簇溶液；
4)采用不同浓度的丙酮酸溶液重复上述步骤1)～3)，得到具有不同荧光强度的金纳米簇溶液；
5)建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系，用于检测待测样品中的丙酮酸浓度。
本发明对所述采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法中原料的选择、组成和定义，及其相应的优选方案，与前述应用中原料的选择、组成和定义，及其相应的优选方案基本一致，在此不再一一赘述。
本发明首先将丙酮酸溶液和丙酮酸氧化酶溶液混合温育后，得到混合溶液。
本发明原则上对所述丙酮酸氧化酶溶液的浓度和用量没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述丙酮酸氧化酶溶液的浓度优选为0.5～2mg/mL，更优选为0.7～1.8mg/mL，更优选为1.0～1.5mg/mL。本发明所述丙酮酸溶液与所述丙酮酸氧化酶溶液的体积比优选为(35～40)：(1～5)，更优选为(35～40)：(1.5～4.5)，更优选为(35～40)：(2～4)，更优选为(35～40)：(2.5～3.5)。
在本发明中，所述丙酮酸溶液的体积比基数优选为(35～40)，更优选为(36～39)，更优选为(37～38)。后续涉及丙酮酸溶液的体积比基数的技术方案皆优选采用上述优选原则，不再一一赘述。
本发明原则上对所述温育的条件没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述温育的温度优选为40～45℃，更优选为41～44℃，更优选为42～43℃。所述温育的时间优选为2～3h，更优选为2.2～2.8h，更优选为2.4～2.6h。
本发明随后将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮(NVP)和还原剂进行反应后，得到反应液。
本发明原则上对所述酸性缓冲液的选择没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述酸性缓冲液优选包括磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液一种或多种，更优选为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
本发明原则上对所述酸性缓冲液的具体参数和用量没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述酸性缓冲液的pH值优选为3.2～5.5，更优选为3.7～5.0，更优选为4.2～4.5。所述酸性缓冲液的浓度优选为0.5～2mM，更优选为0.7～1.8mM，更优选为1.0～1.5mM。本发明所述丙酮酸溶液与所述酸性缓冲液的体积比优选为(35～40)：(1～5)，更优选为(35～40)：(1.5～4.5)，更优选为(35～40)：(2～4)，更优选为(35～40)：(2.5～3.5)。
本发明原则上对所述N-2-吡咯烷酮的具体参数和用量没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述N-2-吡咯烷酮的浓度优选为20～60mM，更优选为25～55mM，更优选为30～50mM，更优选为35～45mM。本发明所述丙酮酸溶液与所述N-2-吡咯烷酮的体积比优选为(35～40)：(1～4)，更优选为(35～40)：(1.5～3.5)，更优选为(35～40)：(2～3)。
发明原则上对所述还原剂的选择没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述还原剂优选包括亚铜化合物(含有Cu+的化合物，可以为硫酸亚铜、氯化亚铜、醋酸亚铜等等)、NaHSO3溶液、Na2SO3溶液、Na2S2O3溶液、草酸、葡萄糖溶液、醇溶液和胺溶液一种或多种，更优选为亚铜化合物、NaHSO3溶液、Na2SO3溶液、Na2S2O3溶液、草酸、葡萄糖溶液、醇溶液或胺溶液。
本发明原则上对所述还原剂的具体参数和用量没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述还原剂的浓度优选为30～70mM，更优选为35～65mM，更优选为40～60mM，更优选为45～55mM。本发明所述丙酮酸溶液与所述还原剂的体积比优选为(35～40)：(0.1～1)，更优选为(35～40)：(0.3～0.8)，更优选为(35～40)：(0.5～0.6)。
本发明原则上对所述反应的条件没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述反应的温度优选为室温，具体可以为10～40℃，更优选为15～35℃，更优选为20～25℃。所述反应的时间优选为10～120min，更优选为30～100min，更优选为50～80min。
本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，完整和细化整个检测过程，所述反应后优选还包括透析步骤。所述透析的透析膜的分子量优选为500～1500Da，更优选为700～1300Da，更优选为900～1100Da。所述透析的时间优选为12～24h，更优选为14～22h，更优选为16～20h。
本发明再将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到具有荧光强度的金纳米簇溶液。
本发明原则上对所述第二酸性缓冲液的选择没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述第二酸性缓冲液优选包括磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液一种或多种，更优选为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
本发明原则上对所述第二酸性缓冲液的具体参数和用量没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述第二酸性缓冲液的pH值优选为4.2～5.2，更优选为4.4～5.0，更优选为4.6～4.8。所述第二酸性缓冲液的浓度优选为0.5～2mM，更优选为0.7～1.8mM，更优选为1.0～1.5mM。本发明所述反应液与所述第二酸性缓冲液的体积比优选为(2～10)：(0.5～1)，更优选为(2～10)：(0.6～0.9)，更优选为(2～10)：(0.7～0.8)。
在本发明中，所述反应液的体积比基数优选为(2～10)，更优选为(4～8)，更优选为(5～7)。后续涉及反应液的体积比基数的技术方案皆优选采用上述优选原则，不再一一赘述。
本发明原则上对所述可溶性金源的选择没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述可溶性金源优选包括HAuCl4溶液。
本发明原则上对所述可溶性金源的具体参数和用量没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述可溶性金源的浓度优选为50～200mM，更优选为80～180mM，更优选为100～150mM。本发明所述反应液与所述可溶性金源的体积比优选为(2～10)：(1～5)，更优选为(2～10)：(1.5～4.5)，更优选为(2～10)：(2～4)，更优选为(2～10)：(2.5～3.5)。
本发明原则上对所述微波反应的条件没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述微波反应是指在微波的作用下进行反应，所述微波反应的微波功率优选为400～800w，更优选为450～750w，更优选为500～700w，更优选为550～650w。所述微波反应的时间优选为3～15min，更优选为5～13min，更优选为7～11min。
本发明对所述荧光强度的数值范围没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规的荧光强度的数值范围即可，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明所述荧光强度的范围以荧光强度检测仪器的量程范围为准即可。
本发明最后采用不同浓度的丙酮酸溶液重复上述步骤1)～3)，得到具有不同荧光强度的金纳米簇溶液。
本发明原则上对所述不同浓度的丙酮酸溶液的浓度值没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述不同浓度的丙酮酸溶液的浓度值优选自100～2000μM，更优选自300～1500μM，更优选自500～1200μM，更优选自800～1000μM。
本发明对所述不同浓度的丙酮酸溶液的数量(即重复的次数)和选择方式没有特别限制，以本领域技术人员熟知的此类重复实验的常规次数和梯度选择原则即可，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整。
本发明最后建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系，用于检测待测样品中的丙酮酸浓度。
本发明原则上对所述定量关系的具体形式没有特别限制，本领域技术人员可以根据实际情况、效果数据以及具体要求进行选择和调整，本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，所述定量关系优选包括定量关系曲线、定量关系式、定量关系表和定量关系程序中的一种或多种，更优选为定量关系曲线、定量关系式、定量关系表和定量关系程序，更优选为定量关系曲线。本发明所述定量关系曲线更优选为一次曲线。
本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，完整和细化整个丙酮酸检测过程，所述检测待测样品中的丙酮酸浓度具体过程优选为：
将丙酮酸溶液替换为待测样品后，按照步骤1)～3)进行，得到具有一定荧光强度的金纳米簇的待测样品溶液，根据待测样品溶液中金纳米簇的荧光强度，关联定量关系，计算得到待测样品中的丙酮酸浓度。
本发明为更好的实现丙酮酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，完整和细化整个丙酮酸检测过程，所述采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法的具体过程也可以为以下步骤：
(1)取3500～4000μL不同浓度梯度的一个丙酮酸溶液(100～2000μM)，分别将其与100～500μL浓度为0.5～2mg/mL的丙酮酸氧化酶共混。然后置于40～45℃水浴锅中温育2～3h；
(2)在上述步骤(1)的各种浓度的溶液中，依次加入酸性缓冲溶液(浓度为0.5～2mM，pH＝3.2～5.5)100～500μL，N-2-吡咯烷酮100～400μL(浓度为20～60mM)，还原剂10～100μL(浓度为30～70mM)。震荡摇匀，室温下反应10～120min。之后用分子量为500～1500Da的透析袋透析12～24h；
(3)取步骤(2)制得的溶液200～1000μL，依次加入第二酸性缓冲溶液50～100μL(pH＝4.2～5.2)，加入HAuCl4 100～500μL(50～200mM)并震荡混合均匀。将样品置于微波炉内，功率设为400～800w，时间3～15min，得到具有强烈荧光的金纳米簇；
(4)重复步骤(1)～(3)，测量其他不同浓度梯度的丙酮酸溶液，生成的金纳米簇荧光发射光谱。建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系曲线，进而可在荧光强度范围内求出丙酮酸的浓度。
本发明为更好的实现丙酮酸氧化酶的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，细化和完整具体的应用过程，还提供了一种采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸氧化酶浓度的方法，包括以下步骤：
1)将丙酮酸氧化酶溶液和丙酮酸溶液混合温育后，得到混合溶液；
2)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
3)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到具有荧光强度的金纳米簇溶液；
4)采用不同浓度的丙酮酸氧化酶溶液重复上述步骤1)～3)，得到具有不同荧光强度的金纳米簇溶液；
5)建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸氧化酶浓度的定量关系，用于检测样品中的丙酮酸氧化酶浓度。
本发明对所述采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸氧化酶浓度的方法中原料的选择、组成和定义，及其相应的优选方案，与前述采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法中原料的选择、组成和定义，及其相应的优选方案基本一致，在此不再一一赘述。两者的区别仅仅是将丙酮酸和丙酮酸氧化酶进行替换即可。
本发明基于丙酮酸氧化酶氧化丙酮酸生成过氧化氢，将丙酮酸氧化酶和丙酮酸发生氧化还原反应生成的H2O2。H2O2与还原剂(Cu+、NaHSO3、Na2SO3、Na2S2O3、草酸、葡萄糖、醇、胺)在酸性条件下构成氧化-还原引发体系产生OH自由基。该自由基可以引发N-2-吡咯烷酮(NVP)发生自由基聚合，生成的聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)作为金纳米簇的配体，在微波微波辐照下产生具有强烈荧光的金纳米簇。通过优化条件，获得的纳米簇荧光发射强度与丙酮酸(或者丙酮酸氧化酶)的浓度可以建立定量关系，进而实现对丙酮酸的检测。同样，也可以实现对丙酮酸氧化酶的检测。
本发明还提供了一种采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸的方法，包括以下步骤：
a)将待测样品和丙酮酸氧化酶溶液混合温育后，得到混合溶液；
b)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
c)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到最终溶液；
当最终溶液含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中含有丙酮酸；
当最终溶液不含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中不含有丙酮酸。
本发明对所述采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸的方法中原料的选择、组成和定义，及其相应的优选方案，与前述采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法中原料的选择、组成和定义，及其相应的优选方案基本一致，在此不再一一赘述。
本发明还提供了一种采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸氧化酶的方法，包括以下步骤：
A)将待测样品和丙酮酸溶液混合温育后，得到混合溶液；
B)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
C)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到最终溶液；
当最终溶液含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中含有丙酮酸氧化酶；
当最终溶液不含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中不含有丙酮酸氧化酶。
本发明对所述采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸氧化酶的方法中原料的选择、组成和定义，及其相应的优选方案，与前述采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸氧化酶浓度的方法中原料的选择、组成和定义，及其相应的优选方案基本一致，在此不再一一赘述。
本发明上述步骤提供了一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用、通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸及其浓度的方法、通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸氧化酶及其浓度的方法以及通过荧光金纳米簇探针检测样品中是否含有丙酮酸或丙酮酸氧化酶的方法。本发明将荧光金纳米簇探针用于检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶，具有灵敏度高，良好的选择性，线性范围较宽等特点。本发明建立的通过荧光纳米簇发射荧光方法来检测丙酮酸，不仅避免了生物体其他因素的干扰，可以选择性的检测血液、尿液中丙酮酸的浓度，可以无创地检测丙酮酸浓度；而且使用荧光发射的方法检测丙酮酸的浓度，而不是使用事先制备好的荧光金属纳米簇，最大限度地避免了实验中的假信号可能带来的干扰；同时检测过程中同时生成的荧光金纳米簇具有优良的荧光性质，在光学材料、生物医学等领域上的应用具有重要的意义。
实验结果表明，通过本发明的方法，可以唯一性的并且定量检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶血液、尿液中丙酮酸的浓度，检测浓度范围为50～3500μM。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用、采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法、采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸氧化酶浓度的方法以及采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸或丙酮酸氧化酶的方法进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
实施例1
(1)取3700μL丙酮酸溶液(600μM)，将其与250μL浓度为1mg/mL的丙酮酸氧化酶共混。然后置于43℃水浴锅中温育2.5h；
(2)在上述步骤(1)的各种浓度的溶液中，依次加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(浓度为1mM，pH＝4.3)350μL，N-2-吡咯烷酮250μL(浓度为40mM)，Cu2SO4 60μL(浓度为50mM)。震荡摇匀，室温下反应65min。之后用分子量为1000Da的透析袋透析18h；
(3)取步骤(2)制得的溶液600μL，依次加入HAuCl4 250μL(100mM)，乙酸-乙酸钠缓冲溶液75μL(pH＝4.5)，并震荡混合均匀。将样品置于微波炉内，功率设为600w，时间9min，得到具有强烈荧光的金纳米簇；
(4)重复步骤(1)～(3)，测量其他不同浓度梯度的丙酮酸溶液(800μM，1000μM)，生成的金纳米簇荧光发射光谱。建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系曲线，进而可在荧光强度范围内求出丙酮酸的浓度。
对本发明实施例1制备的具有强烈荧光的金纳米簇进行表征和检测。
参见图1，图1为本发明实施例1制备的荧光金纳米簇的透射电子显微镜照片。
由图1可以看出，本发明制备的荧光金纳米簇粒径均一稳定，且尺寸在1.9nm左右。
参见图2，图2为本发明实施例1得到的金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系曲线。
参见图3，图3为本发明实施例1得到的不同浓度梯度的丙酮酸溶液生成的荧光金纳米簇溶液在紫外线下的荧光照片。
由图3可以看出，这表明提供的荧光金纳米簇可以根据不同的浓度的丙酮酸溶液呈现不同的颜色的红色系荧光。其中，从左至右丙酮酸溶液的浓度分别为600μM，800μM和1000μM，可以明显的看出，随着丙酮酸溶液的浓度增加，荧光金纳米簇的荧光强度也明显增加。
实施例2
(1)取3500μL丙酮酸溶液(100μM)，将其与100μL浓度为0.5mg/mL的丙酮酸氧化酶共混。然后置于40℃水浴锅中温育2h；
(2)在上述步骤(1)的各种浓度的溶液中，依次加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液(浓度为0.5mM，pH＝5.5)100μL，N-2-吡咯烷酮100μL(浓度为20mM)，草酸10μL(浓度为30mM)。震荡摇匀，室温下反应10min。之后用分子量为500Da的透析袋透析12h；
(3)取步骤(2)制得的溶液200μL，依次加入HAuCl4 100μL(50mM)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液50μL(pH＝5.2)，并震荡混合均匀。将样品置于微波炉内，功率设为400w，时间15min，得到具有强烈荧光的金纳米簇；
(4)重复步骤(1)～(3)，测量其他不同浓度梯度的丙酮酸溶液(200μM，400μM)，生成的金纳米簇荧光发射光谱。建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系曲线，进而可在荧光强度范围内求出丙酮酸的浓度。
实施例3
(1)取4000μL丙酮酸溶液(1600μM)，将其与500μL浓度为2mg/mL的丙酮酸氧化酶共混。然后置于45℃水浴锅中温育3h；
(2)在上述步骤(1)的各种浓度的溶液中，依次加入甘氨酸-盐酸缓冲溶液(浓度为2mM,pH＝3.2)500μL，N-2-吡咯烷酮400μL(浓度为60mM)，NaHSO3 100μL(浓度为70mM)。震荡摇匀，室温下反应120min。之后用分子量为1500Da的透析袋透析24h；
(3)取步骤(2)制得的溶液1000μL，依次加入HAuCl4 500μL(200mM)，柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液100μL(pH＝4.2)，并震荡混合均匀。将样品置于微波炉内，功率设为800w，时间3min，得到具有强烈荧光的金纳米簇；
(4)重复步骤(1)～(3)，测量其他不同浓度梯度的丙酮酸溶液(1800μM，2000μM)，生成的金纳米簇荧光发射光谱。建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系曲线，进而可在荧光强度范围内求出丙酮酸的浓度。
对比例1
具体步骤和参数与实施例1相同。
将金源换成银源--硝酸银，最终得到产物溶液。
对本发明对比例1得到的产物溶液进行检测。
参见图4，图4为本发明对比例1得到的产物溶液的荧光强度的数值曲线。
由图4可知，针对丙酮酸或丙酮酸氧化酶，过程溶液中并无具有荧光效果的银纳米簇生成。
对比例2
具体步骤和参数与实施例1相同。
将金源换成铜源--硝酸铜，最终得到产物溶液。
对本发明对比例2得到的产物溶液进行检测。
参见图5，图5为本发明对比例2得到的产物溶液的荧光强度的数值曲线。
由图5可知，针对丙酮酸或丙酮酸氧化酶，过程溶液中并无具有荧光效果的铜纳米簇生成。
以上对本发明提供的一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用、通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸及其浓度的方法、通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸氧化酶及其浓度的方法以及通过荧光金纳米簇探针检测样品中是否含有丙酮酸或丙酮酸氧化酶的方法进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种荧光金纳米簇在荧光法检测丙酮酸和/或丙酮酸氧化酶中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光法检测丙酮酸还包括荧光法检测丙酮酸的浓度；
所述荧光法检测丙酮酸的过程中，同时原位制备荧光金纳米簇，所述原位制备的原料包括丙酮酸和丙酮酸氧化酶；
所述荧光金纳米簇的荧光发射强度与丙酮酸的浓度成正比；
所述丙酮酸的浓度为50～4000μM；
所述荧光金纳米簇包括金纳米簇和配体；
所述荧光金纳米簇的粒径为1～5nm；
所述荧光法为非荧光淬灭法。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述荧光法检测丙酮酸氧化酶还包括荧光法检测丙酮酸氧化酶的浓度；
所述荧光法检测丙酮酸氧化酶的过程中，同时原位制备荧光金纳米簇，所述原位制备的原料包括丙酮酸氧化酶和丙酮酸；
所述荧光金纳米簇的荧光发射强度与丙酮酸氧化酶的浓度成正比；
所述丙酮酸氧化酶的浓度为50～4000μM；
所述配体为聚乙烯基吡咯烷酮；
所述金纳米簇和配体的摩尔比为1：(0.2～4.8)。
4.一种采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将丙酮酸溶液和丙酮酸氧化酶溶液混合温育后，得到混合溶液；
2)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
3)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到具有荧光强度的金纳米簇溶液；
4)采用不同浓度的丙酮酸溶液重复上述步骤1)～3)，得到具有不同荧光强度的金纳米簇溶液；
5)建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸浓度的定量关系，用于检测待测样品中的丙酮酸浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸氧化酶溶液的浓度为0.5～2mg/mL；
所述丙酮酸溶液与所述丙酮酸氧化酶溶液的体积比为(35～40)：(1～5)；
所述温育的温度为40～45℃；
所述温育的时间为2～3h；
所述酸性缓冲液包括磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液一种或多种；
所述酸性缓冲液的pH值为3.2～5.5；
所述酸性缓冲液的浓度为0.5～2mM；
所述丙酮酸溶液与所述酸性缓冲液的体积比为(35～40)：(1～5)。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸溶液与所述N-2-吡咯烷酮的体积比为(35～40)：(1～4)；
所述N-2-吡咯烷酮的浓度为20～60mM；
所述还原剂包括亚铜溶液、NaHSO3溶液、Na2SO3溶液、Na2S2O3溶液、草酸、葡萄糖溶液、醇溶液和胺溶液中的一种或多种；
所述还原剂的浓度为30～70mM；
所述丙酮酸溶液与所述还原剂的体积比为(35～40)：(0.1～1)；
所述反应的时间为10～120min；
所述反应后还包括透析步骤；
所述透析的透析膜的分子量为500～1500Da；
所述透析的时间为12～24h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二酸性缓冲液包括磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液一种或多种；
所述第二酸性缓冲液的pH值为4.2～5.2；
所述第二酸性缓冲液的浓度为0.5～2mM；
所述反应液与所述第二酸性缓冲液的体积比为(2～10)：(0.5～1)；
所述可溶性金源包括HAuCl4溶液；
所述可溶性金源的浓度为50～200mM；
所述反应液与所述可溶性金源的体积比为(2～10)：(1～5)；
所述微波反应的微波功率为400～800w；
所述微波反应的时间为3～15min。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述不同浓度的丙酮酸溶液的浓度值为100～2000μM；
所述定量关系包括定量关系曲线、定量关系式、定量关系表和定量关系程序中的一种或多种；
所述检测待测样品中的丙酮酸浓度具体过程为：
将丙酮酸溶液替换为待测样品后，按照步骤1)～3)进行，得到具有一定荧光强度的金纳米簇的待测样品溶液，根据待测样品溶液中金纳米簇的荧光强度，关联定量关系，计算得到待测样品中的丙酮酸浓度。
9.一种采用荧光金纳米簇荧光法检测丙酮酸氧化酶浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将丙酮酸氧化酶溶液和丙酮酸溶液混合温育后，得到混合溶液；
2)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
3)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到具有荧光强度的金纳米簇溶液；
4)采用不同浓度的丙酮酸氧化酶溶液重复上述步骤1)～3)，得到具有不同荧光强度的金纳米簇溶液；
5)建立金纳米簇的荧光强度的数值与丙酮酸氧化酶浓度的定量关系，用于检测样品中的丙酮酸氧化酶浓度。
10.一种采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸或丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于，所述采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸的方法，包括以下步骤：
a)将待测样品和丙酮酸氧化酶溶液混合温育后，得到混合溶液；
b)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
c)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到最终溶液；
当最终溶液含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中含有丙酮酸；
当最终溶液不含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中不含有丙酮酸；
所述采用荧光金纳米簇荧光法检测样品中是否含有丙酮酸氧化酶的方法，包括以下步骤：
A)将待测样品和丙酮酸溶液混合温育后，得到混合溶液；
B)将上述步骤得到的混合溶液、酸性缓冲液、N-2-吡咯烷酮和还原剂进行反应后，得到反应液；
C)将上述步骤得到的反应液、第二酸性缓冲液和可溶性金源进行微波反应后，得到最终溶液；
当最终溶液含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中含有丙酮酸氧化酶；
当最终溶液不含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中不含有丙酮酸氧化酶。
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