CN101578517A - 分析反应中光损伤的缓解 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于减少和/或消除照射分析反应中对一种或多种反应物的光损伤的组合物、装置、系统和方法，所述方法通过将一种或多种光损伤缓解剂结合到反应混合物中和/或在比光损伤阈值时间段短的时间段询问反应混合物的不同观察区。

Description

分析反应中光损伤的缓解
[0001]本申请是2005年11月2日提交的申请号为11/293040的美国专利申请的部分后续申请，其全部公开内容通过全文引用包含在本申请中用于所有目的。
有关联邦赞助研究的声明
[0002]本发明的一部分是在NHGRI Grant No.1 R01 HG003710-01下使用政府基金完成的，政府在本发明中拥有一些权利。
背景技术
[0003]光学可检测的标记基团的使用，尤其是具有高量子产额的那些基团例如荧光或者化学发光基团的使用在整个分析化学、生物化学和生物学领域都是广泛存在的。特别是，通过提供与给定反应相关的高度可见信号，人们可更好地监测该反应以及该反应的任何潜在效应器(effector)。这样的分析是在遗传学、诊断学、药物研究以及相关领域等生命科学研究的基本工具。
[0004]到目前为止，这种分析一般在其中反应物的量远远过量以致光事件的任何相反效果都将被忽视的条件下进行。例如，基于荧光标记基团的这样的分析一般要求指向反应混合物的激发放射源的使用，以激发荧光标记基团，该集团然后可独立地被检测。但是，化学和生物化学反应物对这种光源单独或者当在其他成分例如荧光基团存在的情况下延长的曝光可潜在地导致对所述反应物的损伤，例如对蛋白质、酶、底物或者类似物的损伤。但是，如前所述，用于所述反应的现有形式一般性防止了使任何所述效果成为问题甚至被注意到。
[0005]但是，偏离了前述形式的多种分析技术正在被开发，使这种光损伤的有害效果对给定分析的操作方面具有更引人注目的影响。特别是，包括荧光剂的反应的实时分析可将多种不同成分暴露给光能。另外，反应以日益减少的更少试剂量为基础，例如在微流体或者纳米流体反应容器或者通道中，或者在“单个分子”分析中。如此以来，本发明涉及防止所述光损伤的不利效果或者将其减轻到一些程度的方法和组合物，还涉及在其他有用过程和组合物中从所述方法和/或组合物中获益的过程。
发明内容
[0006]本发明一般涉及用于减少和/或消除照射反应中光损伤及其效果的组合物、装置、系统和方法，尤其是利用荧光和/或荧光反应物的那些。
[0007]在第一方面，本发明提供了包括第一反应物、第二反应物和光损伤缓解剂的组合物，其中第一反应物在激发辐射条件下与第二反应物的相互作用在光损伤缓解剂不存在时，引起对第一反应物的光损伤。
[0008]在另一方面，本发明提供了包括限定的酶、用于所述酶的底物和光损伤缓解剂，其中酶与底物在激发辐射条件下的相互作用在光损伤缓解剂不存在时引起对酶的光损伤。
[0009]在又一方面，本发明提供了包括限定的酶、用于所述酶的底物和光损伤缓解剂，其中酶与底物在激发辐射条件下的相互作用引起对第一反应物的光损伤。
[0010]本发明还提供了装置，其包括具有观察区的基板、固定在观察区中的第一反应物和设置在观察区中的第二反应物，其中第一和第二反应物在激发辐射条件下的反应引起对第一反应物的光损伤。所述装置还包括设置在观察区中的光损伤缓解剂。
[0011]本发明进一步提供了进行照射反应的方法。所述方法典型地包括提供具有设置在其上的反应混合物的基板，其中反应混合物包括第一反应物、第二反应物和光损伤缓解剂，其中光损伤缓解剂减少了由第一反应物与第二反应物在激发辐射条件下在不存在光损伤缓解剂时发生相互作用产生的对第一反应物的光损伤的量。反应混合物然后以激发辐射进行照射。
[0012]相关地，本发明还提供了进行酶反应的方法，包括在第一观察区提供酶，将酶与荧光剂或者将酶与用于该酶的荧光底物接触，对第一观察区进行激发辐射比光损伤阈值时间段短的时间段并检测来自该区的信号。
[0013]在又一方面，本发明提供了监测碱基延伸反应的方法，包括在第一观察区中提供聚合酶，将聚合酶与至少第一荧光剂或者荧光核苷酸类似物接触，并监测由第一观察区响应于比光损伤阈值时间段短的时间段激发辐射的照射所发出的荧光信号。
[0014]在还一方面，本发明提供了用于分析当照射比光损伤阈值时间段长的时间段时易受到光损伤的照射反应的系统，包括具有设置在其上用于反应的试剂的基板，支撑基板并被构造成容纳基板的固定台，被定位成与至少一部分基板光学连通的复合成像链(opticaltrain)，以照射一部分基板并检测从其上发出的信号，和可操作地与安装台或者复合成像链连接的平移系统，用于将复合成像链和基板中之一相对于彼此运动。
[0015]在又一方面，本发明提供了进行酶反应的方法，包括在观察区中提供酶，在存在至少第一光损伤缓解剂时，在激发辐射下将酶与荧光剂或者用于该酶的荧光底物接触。
[0016]本发明的方法可在监测碱基延伸反应中使用。在这种情况下，该方法包括在观察区中提供聚合酶，在存在至少第一光损伤缓解剂的情况下将聚合酶与至少第一荧光剂或者荧光核苷酸类似物接触，并监测由观察区响应于激发辐射的照射所发出的荧光信号。
[0017]在还一方面，本发明提供了监测反应混合物的方法，所述混合物包括至少第一种酶和用于第一种酶的荧光剂或者荧光底物，所述方法包括将激发辐射指向第一观察区照射比光损伤阈值时间段短的第一时间段。
[0018]在另一方面，本发明提供了通过exploiuting光损伤事件将活性分子固定在基板的第一选择区域中的方法。特别是，所述方法包括提供基板，其具有非选择性地设置在基板表面上的分子，并在基板表面上提供感光剂。与基板上的第一选择区域不同的一个或多个区域然后被暴露在足以活化感光剂的光下，使不同于第一选择区域的区域中的活性分子充分失活。
[0019]相关地，本发明提供了装置，包括具有至少第一表面的基板，非选择性设置在第一表面上的活性分子和设置在第一表面上的感光剂。
[0020]另外，本发明提供了系统，包括与照射系统组合的上面阐明的基板，该照射系统光学地与基板的第一表面连接，并被构造成选择性地照射基板第一表面的选择区域足以活化感光剂，而不照射基板的其他选择区域。
[0021]本发明还提供了分析活性分子反应的方法，包括提供具有至少第一表面的基板，活性分子非选择性地设置在第一表面上，并且感光剂也设置在第一表面上，照射第一表面的选择区域以活化感光剂并使选择区域而不是非选择区域中的活性分子失活，观察非选择区域中的活性分子的反应。
附图说明
[0022]图1是在激发辐射条件下使用荧光核苷酸类似物进行模板依赖合成中对DNA聚合酶的光损伤的建议机制的示意性图解。
[0023]图2A-2B是荧光核苷酸类似物存在时在使用激光激发光选择性照射下进行的DNA合成产品的琼脂糖凝胶的图像。显示了在不同光损伤缓解剂存在和不存在的情况下合成反应混合物产品。
[0024]图3A-3C是使用荧光核苷酸类似物同时以荧光类似物的激发波长选择性照射下在平板上合成的DNA图像，显示了在不同光损伤缓解剂存在和不存在的情况下受反应混合物影响的底物。
[0025]图4A-4B是具有设置在波导上并应用到使用荧光核苷酸类似物进行DNA合成的模板中的固定化DNA聚合酶的零模波导(zeromode waveguide)的图像阵列，该阵列同时以荧光类似物激发波长选择性照射。
[0026]图5是避免对测定底物的过量光损伤影响的步骤和重复分析方法的示意性图示。
[0027]图6A和6B提供了非重叠步骤和重复询问以及扫描模式询问的示意性比较。
[0028]图7是用于执行本发明的一些方面的系统的示意性图示。
具体实施方式
[0029]本发明一般性涉及进行改进的照射反应特别是采用荧光剂或者荧光反应物的反应的方法，减轻对所述反应中存在的各种反应物的光损伤的效果和/或降低光损伤。本发明包括用于防止或者减少所述光损伤的方法以及用于减轻所述光损伤可能对整个分析产生的影响的方法，以及它们的组合。
[0030]虽然本发明一般可应用到需要化学基团例如荧光剂的实质性照射和/或光活化转换或者激发的各种光测定中任何一种，发现在利用可能受到光损伤的非常有限的反应物浓度的分析中也具有最大的实用性。应当理解，在所述试剂限制的分析中，关键试剂的任何降解将通过进一步限制试剂而引人注目地影响分析。出于本发明的目的，术语光损伤一般指的是在所需反应中照射对一种或多种试剂的任何直接或间接影响，使其对反应产生负面影响。同样地，光损伤可包括给定试剂中直接光诱导改变以便降低所需反应中该试剂的活性，例如荧光剂分子的光致退色，或者降低其在所述反应中的有用性，例如通过使试剂在给定反应中不那么专一。同样地，光损伤可包括由试剂与另一种光诱导反应的产物的相互作用引起的试剂的负面变化，例如在荧光激发事件过程中单态氧的产生，这种单态氧可损伤有机或者其他试剂，例如蛋白质等。
[0031]从本发明受益的一个特别恰当的分析实例是单分子生物分析物，尤其是包括单分子核酸序列分析、单分子酶分析、杂交测定，例如抗体测定、核酸杂交测定以及类似测定，其中一次性进口(primaryimport)的试剂在其中发生光转化/激发的环境以及其相关产物的产生下受到相对集中的光源的延长的照射，例如激光或者其它集中光源，即水银、氙气、卤素或者其他灯。
[0032]以核酸分析为例，已经观察到在使用荧光核苷酸类似物作为底物的核酸合成的模板中，在所述条件下延长的照射造成聚合酶合成所述DNA的能力的实质性下降(见图3A及例1)。聚合酶、模板序列和/或引物序列的损伤甚至失活可严重地降低聚合物处理长链核算的能力。酶的进程性(processivity)方面的这种降低进而导致基于它们结合到新生链中来识别序列构成的排序过程的阅读长度的降低。如在基因分析领域所希望的那样，序列的相邻阅读长度直接影响由染色体DNA片段装配染色体信息的能力。对于这种光损伤的建议机制在图1中显示。如图所示，通过对激发波长的电磁辐射曝光所激发的荧光团可跃迁到三重态。随后三重态荧光团的弛豫可导致活性氧类的产生，其进而损伤荧光团或者处理该荧光团的酶例如聚合酶中的一者或两者。因此，氧清除剂和/或还原剂可被包括以防止活性氧的形成。
[0033]在一般条件下，本发明一般性涉及照射的反应分析物的行为，其中所述分析物被照射一定的时间量，仍允许分析的有效进行。在特别优选的方面，照射分析指的是被照射同时发生的分析反应，例如使用激发辐射以便评估产量、消耗和/或发光物质的转化，例如荧光反应剂和/或产物。
[0034]在本文中，对反应物产生实质影响使分析无用的光损伤之前可进行的照射分析的时间量被称为光损伤阈值时间段。根据本发明，光损伤阈值时间段优选为所述光损伤发生以致与不存在所述照射的相同反应相比将所述反应的速率降低20％的过程中进行照射分析的时间段，优选速率降低50％以上，在一些情况下，优选90％以上，例如，引起系统的反应速率降低90％，或者将给定时间桢期间产生的产品量降低90％。本发明的一个目的在于在光损伤阈值时间段内进行照射分析。这一般通过替代方式来实现。首先，在前述参数内并根据本发明或其方面进行给定反应，可包括将反应进行一个短于光损伤阈值时间段的时间段。第二，反应可被设计成增加光损伤阈值时间段的长度，或者第三，其可包括这些方法的组合。
[0035]与前面不同，在一些程度上应当理解，“光损伤的”反应可产生虚假活性，因而比预期的更为活跃。在这种情况下，应当能够理解感兴趣的光损伤阈值时间段可为具有如下特征的照射分析时间段：在所述虚假活性(例如通过反应率增加，或者非专一性反应率增加来测定)不超过非照射反应的10％、不超过非照射反应的20％、不超过非照射反应的50％，并且在一些情况下不超过非照射反应的90％的过程中的时间段。仅仅作为实例，由于光损伤事件，在模板定向的合成过程中核酸聚合酶开始错误地结合核苷酸，这种活性将影响上面阐明的光损伤阈值时间段。
[0036]应当理解，试图通过本发明的方法和组合物防止的光损伤不仅仅是对荧光试剂例如光致退色的光损伤，还涉及防止或者降低所述荧光试剂对在反应混合物中数量有限的其他试剂的光活化的下游效果，否则，由于光损伤，即便略微损失，它们的有限存在也受到更大的影响，特别是反应性蛋白质或者酶，在没有与操作理论结合时，它们可包括对酶或者反应性蛋白质的损伤或者所述酶或蛋白质与光损伤的试剂之间不可逆的相互作用。如同前面建议的那样，光损伤一般指的是给定试剂、反应物以及类似物的改变，引起所述试剂在需要的反应中发生功能性改变，例如降低的活性、降低的特异性，或者由光诱导反应直接或间接地使另一种分子作用、转化或者修饰的降低的能力，例如，光诱导反应形成与一种或多种其他反应物相互作用并引起它们损伤的反应物。典型地，所述光反应直接影响目标反应物(例如直接光损伤)或者影响所述目标反应物的一个、两个或三个反应步骤中的反应物。
[0037]如本文中一般所指的那样，所述有限量的试剂或反应物可存在于溶液中，但浓度非常有限，例如低于200nM，在一些情况低于10nM，在还一些情况下低于10pM。但在优选方面，所述有限量的试剂或者反应物指的是固定或者限定在给定区域中的试剂，以便在该给定区域提供有限量的试剂，在一些情况下，在该给定区域中提供所述试剂的少量分子，例如从1到1000个单个分子，优选在1到10个分子之间。应当理解，给定区域中固定的反应物的光损伤可具有对该区域的实质影响，而其他的非损伤反应物不能扩散到该区域并屏蔽损伤效果。
[0038]虽然研究者已经提供了用于限制对荧光体的光损伤的方法和组合物，但对荧光试剂或其产生的光破坏的存在下的酶系统的下游光损伤的负面影响也不能很容易地被识别或者解决。为讨论简便起见，无论是否产生对给定试剂的实际损伤光或者与损伤试剂的相互作用，损伤实践的有害影响在本文中一般都被称为光损伤。
I.光损伤的防止
[0039]在第一方面，本发明涉及减少在照射例如使用激发辐射源的照射过程中一种或多种非荧光反应物发生的光损伤量的方法和组合物。特别是，提供组合物与在所述组合物不存在时进行的反应相比产生光损伤水平的降低(或者光损伤阈值时间段的增加)。在本文中，提供这种效果的所述组合物的成分一般被称为光损伤缓解剂。特别是，在分析反应的进程中提供光损伤缓解剂以降低光损伤的水平(和/或增加光损伤阈值时间段)，要不是光损伤缓解剂的存在则会发生的光损伤。
[0040]再次，将试剂定义为光损伤缓解剂一般反映了所述试剂对光损伤事件具有影响或者对损伤的下游具有影响。同样地，光损伤缓解剂可防止一种或多种试剂的光损伤，或者其可缓解已经受到光损伤的试剂对目标反应中的特定的有限试剂的影响。作为实例，阻隔受到光损伤的荧光化合物和关键酶成分之间的有害相互作用的试剂仍然可被称为光损伤缓解剂，而不考虑其不能防止对荧光试剂的最初光损伤的事实。
[0041]作为使用光损伤能够缓解剂的结论或者处理的光损伤减少的测定可表征为对比未处理的反应提供光损伤水平的减少。此外，光损伤降低的表征一般利用经处理的反应混合物和未处理的反应混合物之间的反应速率例如酶活性的比较，和/或光损伤阈值时间段的比较。
[0042]在本发明的情况下，本发明的光损伤缓解剂的内涵一般导致系统中给定反应中一种或多种光损伤的减少(如同根据所防止的反应损失例如酶活性测定的那样)至少10％，优选大于20％，更优选大于大约50％的降低，在许多情况下大于90％甚至达到大于99％的所述光损伤的降低。作为说明并仅仅用于举例的目的，当将光损伤的降低作为光损伤缓解剂存在和不存在情况下的酶活性测定时，如果包括在具有100单位的酶活性的反应混合物中的反应(在光损伤缓解剂存在和不存在的情况下)产生仅仅具有50单位活性的反应混合物时(在光损伤缓解剂存在和不存在的情况下，随后进行照射分析)，则10％的光损伤降低可产生55单位的最终反应混合物(例如50单位的10％的损失可不再被损失)。
[0043]在没有被结合的特定理论或者运行机制的情况下，认为对酶活性的至少一种光诱导损伤的原因，特别是在荧光剂存在的情况下，来自于酶与受到光损伤的荧光剂的直接相互作用。此外，认为荧光剂的这种光损伤(以及对酶的可能额外损伤)至少部分通过在分子氧存在的情况下在荧光体的三重态的弛豫过程中产生的活性氧类介导。一种或两种受到光损伤的荧光剂和/或活性氧类可被包括在光损伤的整个有害影响中。
[0044]因此，在至少一个方面，本发明涉及在一种或多种试剂的照射反应混合物中的内涵是起到封闭最小化导致所述光损伤的途径的作用。所述试剂包括防止三重态荧光体的形成的还原剂或者抗衰减试剂(也被称为三重态淬灭剂)，以及将氧或者活性氧类从反应混合物中除去的氧清除剂，由此防止对系统中酶的下游损伤。
[0045]各种还原剂或者抗衰减试剂都可被用作三重态淬灭剂，包括例如抗坏血酸、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙胺(MEA)、β-巯基乙醇(BME)、没食子酸正丙酯、对苯二胺(PPD)、对苯二酚、叠氮化钠(NaN3)、重氮二环辛烷(DABCO)、环辛四烯(COT)，以及可从市场上购买的抗衰减试剂，例如Fluoroguard(购自BioRad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)，Citifluor antifadants(Citifluor，Ltd.，London，UK)，ProLong，SlowFade，和SlowFade Light(Invitrogen/MolecularProbes，Eugene，OR)。
[0046]同样地，一些单态氧淬灭剂可被用于消除或减少活性氧类，例如包括酶系统，例如超氧化物歧化酶，葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶(GO/Cat)，氧化酶/过氧化物酶系统，例如葡萄糖氧化酶，醇氧化酶，胆固醇氧化酶，乳酸氧化酶，丙酮酸氧化酶，黄嘌呤氧化酶，以及它们的类似物与耗竭过氧化氢的酶的组合，所述耗竭过氧化氢的酶例如辣根过氧化物酶(HRP)，谷胱甘肽过氧化物酶，或者这些酶与其他酶的组合，原儿茶酸3，4双加氧酶(PCD)(单个酶氧消耗剂)，或者硫醇基的淬灭剂例如麦角硫因、甲硫氨酸、半胱氨酸、β-二甲基半胱氨酸(青霉胺)、巯基丙酰甘氨酸，MESNA，谷胱甘肽、二硫苏糖醇(如上所述用作还原剂)、N-乙酰半胱氨酸和卡托普利(例如参见Biochem Soc.Trans.1990年12月；18(6)：1054-6)，咪唑。而且，生物单态氧淬灭剂也可被采用，诸如番茄红素，α、β和γ-胡萝卜素以及它们的类似物，花药黄质，虾青素，角黄素(例如参见Carcinogenesis vol.18no.1pp.89-92，1997)，链孢红素，玫红品，胭脂树素，红木素，玉米黄质，叶黄素，胆红素，胆绿素，以及生育酚(例如参见Biochem Soc Trans.1990年12月；18(6)：1054-6ref.)以及聚烯二醛(Carcinogenesisvol.18no.1 pp.89-92，1997)褪黑激素，维生素E(α-生育酚琥珀酸酯及其类似物)和B6(吡哆醇及其衍生物)。其他化学除氧剂也可使用，例如肼(N2H4)，亚硫酸钠(Na2SO3)，羟胺，谷胱甘肽，和N-乙酰半胱氨酸，组氨酸，色氨酸及其类似物。除了前述物质以外，在许多情况下，单态氧淬灭剂或者清除剂也可通过将氧从目标反应中物理性排除而被减少或者消除，例如脱气剂、灌注惰性气体或者类似物。除了前述以外，作为前述化合物的替代或者附加，抗氧化剂也可在反应混合物中提供，例如包括Trolox及其类似物U-78715F和WIN62079，具有羧基取代的维生素E的可溶解形式，或者在类似物的情况下，代替维生素E的叶绿基侧链的其他取代，抗坏血酸(或者抗坏血酸盐)，丁基化的苯甲醇(BTH)及其类似物。
[0047]根据本发明，光损伤缓解剂一般可作为反应混合物的成分提供，既可通过作为添加剂加入，也可以液体或固体或者通过在发生反应的区域中光损伤缓解剂的预先沉积和/或固定来提供。作为实例，在其中目标反应被限定为特定区域或者位置中的情况下，可理想地将光损伤缓解剂固定或者定位在该区域内或靠近该区域。类似地，当光损伤缓解剂包括协同起作用的成分时，例如双酶系统，同样可理想地将所述成分相对于彼此以及目标反应固定。
[0048]在一些情况下，光损伤缓解剂可被提供以增强他们的有效性。例如，在一些情况下，缓解剂的溶解性可比在含水系统中的理想状态低，例如在许多类胡萝卜素的情况下。同样地，这些化合物可固定在基板或反应孔的表面上来提供，或者通过将所述试剂包括在例如吸持基团中，以允许它们自由地与含水系统成分例如除氧剂相互作用的构造来提供，所述吸持基团使悬浮于含水系统中的试剂和另外可得到的试剂与反应混合物的相关部分例如溶解的氧类相互作用。
[0049]在相关方面，并作为在本文中描述的用于光损伤或其影响的缓解的任何一个步骤的替代或者附加，本发明还提供了通过其他方式消除潜在的损伤氧类。特别是，如使用其他系统一样，溶解的氧类可通过提供不同气体环境下的反应系统而从含水系统中被冲洗出来。特别是，例如，人们可将水反应状态暴露到中性气体环境，诸如氩、氮、氦、氙以及类似物，防止过量的氧溶解在反应混合物中。通过减少系统最初的氧荷载，已经观察到光损伤效果例如对聚合酶介导的DNA合成方面的光损伤效果被显著降低。在特别优选的方面中，系统被喷射或者暴露给氙气环境。特别是，当氙气可被诱导形成偶极子时，除排挤掉含水系统中的氧气以外，其可作为三重态淬灭剂起作用。(例如参见Vierstra和Poff，Plant Physiol.1981年5月；67(5)：996-998)。同样地，氙气也可被归为淬灭剂，如上面阐明的那样。
II.光损伤影响的缓解
[0050]与使用光损伤缓解剂不同和/或作为其附加，本发明还提供了在发生过量光损伤之前的所述照射时间段的这一部分的过程中，仅仅通过询问反应混合物例如检测荧光发射缓解光损伤对给定分析操作的结果的影响。这种方法在其中可能受到光损伤的反应成分通过结构限定的存在和/或通过成分的固定而在空间上被限定在测定板或者基板上的光询问中特别有用。所述限定试剂的实例包括表面固定或者定位的试剂，例如表面固定或者连接的酶、抗体等，它们可在表面上被询问，例如通过荧光扫描显微镜或者扫描共焦显微镜，全内反射显微镜或者荧光剂、表面成像或者类似仪器。
[0051]在本文中，基板可包括各种形式的任何一种：平面基板，例如玻璃片，或者更大结构中的平面表面，例如多孔板诸如96孔、384孔和1536孔板，或者规则间隔的微米或者纳米多孔基板，或者所述基板可包括更多不规则的多孔材料，诸如膜、气凝胶、纤维垫或者类似物，或者它们可包括特定基板，例如小珠、小球、金属或者半导体纳米粒子，或者类似物。另外，为了在这里进行讨论的目的，无论特定试剂借助结构屏障来限制其自由运动，还是化学连接或固定到基板的表面，都将被描述为被“限定的”。
[0052]例如，在询问其中所述光损伤可发生并且其中酶被固定到基板表面上的酶反应中，特定区域的延长的曝光时间将导致对固定在该区域中的酶的光损伤或者“灼伤(burning in)”。在许多情况下，包括目标反应的基板的选定区域将被询问。出于讨论的目的，所述区域被称为“观察区”。
[0053]根据本发明，通过照射并收集来自不同观察区的发射信号，“灼伤(burn in)”或者所述灼伤的至少一种效果被减少或者消除。为讨论简便起见，来自目标反应或者发生目标反应的特定观察区的照射和收集发射信号两者的作用都被称为对该反应和/或该区域的询问。如同所理解的那样，询问基板的新观察区域将组成对区域的新的照射并从所述新照射区域收集发射信号。换一种说法，只要人们询问新的照射区域，灼伤区域(the burned region)是否仍然被照射不是最重要的，除非人们渴望在后一时刻返回到对该区域的询问。
[0054]除了减少光损伤的优点之外，经时询问基板的不同区域的过程还提供了能够以给定光源询问比在没有改变照射性质的情况下可能询问的基板面积更大的基板面积，例如通过改变照射角来扩大激光斑尺寸，例如提供拉长的激光斑尺寸(例如参见申请号为6881312的美国专利申请，其为了所有目的通过全文引用而包含在本申请中)，或者将照射通过改变基板上入射光斑的形状的复合成像链，例如提供圆柱形透镜以提供谱线形照射，或者对照射重新聚焦以提供扩大的斑大小或尺寸。尽管前面的描述了这么多，但应当理解本发明任选地与提供扩大的照射区域的所述光学组合，在其中所述扩大的照射轮廓然后在基板上方运动过程中之外任选地被使用，以经时询问基板的不同区域。图5示出了当在目标反应进行时基板上方经时询问光斑区域的运动，以询问基板的不同区域。应当能够理解，基板上方线性照射斑的使用可更迅速地照射比图5中显示的圆形光斑更大的基板面积。如图5中所示，典型基板包括多个更小结构限制的阵列(其也起到零模波导形式的光学限制作用)，其中每个阵列或者阵列亚组被包括在独立的结构限制中，例如多孔基板或者多孔板的孔中。应当理解，询问功能典型地在给定区域上进行延长的时间段，但不长于光损伤阈值时间段。典型地，这可大于10秒，优选大于1分钟，更优选大于5分钟，大于10分钟，大于20分钟，在一些情况下大于2小时或者大于3或者更多小时，但仍然比光损伤阈值时间段短。
[0055]除了通过使询问区域在基板区域上运动来获得另外的询问区域以外，使该区域运动的能力，还提供了在特定系统或者设备中调整与基板的机械接口(mechanical interfaces)的能力，以便使在特定系统或设备中不可询问的区域可用于询问。特别是，在典型的基板分析装置中，待分析的基板固定在分析台上，在分析台上基板的一部分可通过分析台的安装结构例如夹片、支架结构以及类似结构变得模糊而不能询问。但是，根据本发明的一些方面，询问区域的运动提供了经时改变因安装结构而模糊的基板部分的能力。在第一个实例中，不是移动为基板的给定区域提供照射的复合成像链，而是所述基板可相对于询问光移动。这可通过使用各种操纵硬件或者机械设备的任何一种来完成。例如使用使基板以精确的方式步进通过复合成像链的询问区域的分节器(stepper)/输送器(feeder)。所述精确的输送器设备在高性能打印技术中以及在半导体工业中使用的平移机器人技术例如分析和制造应用中都是公知的。所述分节器输送器可包括与整个基板的上表面接触的辊子或者轮组件，其被旋转以精确的方式为基板提供运动的力，输送基板通过复合成像链的询问区域。在替代方面，机器人系统可被用于拾取并重新定向给定基板以便询问基板表面的不同区域，或者使基板的先前不能触及的区域可触及。所述机器人系统一般可购买到，例如Beckman，Inc.，Tecan，Inc.，Caliper LifeSciences以及类似物。
[0056]根据本发明，询问第一观察区中目标反应时间，比光损伤阈值时间段短，如在本文其它地方所阐明的那样，然后询问不同的第二观察区中目标反应。根据本发明，观察典型地包括可能受到光损伤的限定试剂。如此一来，观察区可包括平面或者其他基板表面的区域，在这些区域上固定有试剂，例如酶。作为替代，观察区可包括限制可能受到光损伤的试剂的物理限制，例如微孔、纳米孔，包括疏水屏障以限制试剂的平面表面。如上所述，本发明特别适用于其中易受损伤的试剂以光损伤极大地影响反应进程的浓度或水平存在的观察区中。特别是在其中额外的过量试剂不能在大量溶液中提供以掩盖任何被损伤试剂的影响的固定反应系统中的场合下。
[0057]不同观察区的循序询问一般可以很多次重复，例如10次以上，100次以上，1000次以上，甚至10000次以上，只要观察区保持即可。多个区域的可得到性一般仅仅由离散的观察区的尺寸来限制，这些离散的观察区可由使用的任何结构限定的一个或多个性质和维度、和照射斑尺寸以及分析基板的整个面积来定义。一般说来，这种使询问区域步进(stepping)到另一个(优选相邻区域)并重复询问过程的方法一般被称为“步进并重复(step and repeat)”过程。
[0058]虽然以“步进并重复”方法来描述，但在其中询问区域运动穿过基板的一些实施方式中，该运动不是步进式并重复的，相反构成了连续运动、基本上连续的运动，或者这样的步进运动或者重复运动(其中每个重复步骤询问的新区域，其与前面已经询问过的区域或者穿过基板的询问区域的一些部分重叠)。特别是，基板可连续运动通过光系统的询问区域，从而询问区域连续运动穿过正被询问的基板(以“扫描模式”)。根据优选方面，询问区域的运动速度服从给定反应区域例如结构或者光学限定、ZMW或类似物需要停留在询问区域的时间量，例如比光损伤阈值时间段短的时间。图6A显示了使用圆形照射斑的非重叠的步进和重复询问方法的示意性图示。如图所示，由阴影表示的基板表面的一些部分没有受到询问。但在图6B中，扫描或者重叠步进过程被用于询问更大部分的基板面积。
[0059]图7是用于根据本发明的一些方面执行基板上步进和运动操作的整个系统700的示意性图示。如图所示，反应基板702设置在平移台704上。台704典型地与合适的自动机械(由衔铁(armature)706示意性表示)连接，为基板702提供在固定复合成像链708上的二维(X和Y)侧向平移运动。虽然已经显示与基板连接并使其平移，但应当理解替代构造也可被耦合到复合成像链的平移系统，使系统的该方面相对于基板运动。复合成像链708可包括用于询问基板的各种不同构造，包括合适的激发光源例如激光器718、聚焦和滤波光学器件例如分色镜720、物镜710、成像镜头712、棱镜714，以及检测器或者检测器阵列例如检测器阵列716。特别优选的复合成像链的一个实例在共有的美国专利申请No.11/201,768中描述，其提交于2005年8月11日，该申请为所有目的通过全文引用而包含在本申请中。
III.示范性应用
[0060]如上所述，本发明的方法和组合物在光学检测分析反应的广泛领域是有用的，特别是使用光致发光或荧光反应物的那些，特别是其中容易受到光损伤的试剂以相当低的水平存在的所述反应。在本文中描述的方法和组合物的一种典型应用是单分子分析反应，其中在分析中观察单个或者非常有限数量的分子的反应，诸如观察单个酶分子的活动。特别是，当分析依赖于数目很少的试剂分子时，对该数目的任何明显部分的损伤都将对正在进行的分析具有实质影响。
[0061]单分子分析的一个实例包括在以模板定向的聚合物为基础的合成过程中通过观察核苷酸结合到新生核酸序列中的核酸测序。所述方法(一般称为“通过结合测序”)涉及观察核苷酸或核苷酸类似物以模板依赖方式的添加以便确定模板链的顺序。用于进行这种测定的一些过程包括在限定观察区域例如在纳米尺度的孔中或者直接或间接连接到表面的荧光标记的核苷酸类似物。通过照射并检测结合或者将被结合到新生链中的荧光碱基，人们可确定碱基的本质，因而就确定了模板链中的互补碱基。
[0062]本发明的一个特别优选方面是与通过将核酸结合在光限定中诸如零模波导中进行测序相结合，其中人们可观察极其小的反应体积，在该反应体积中可存在一个或者仅仅很少几个聚合酶以及他们的荧光底物。零模波导以及它们在测序应用中的使用一般在美国专利6,917,726中有描述，通过结合进行测序的优选方法一般在公开出版的美国专利申请2003-0044781中描述，这两份文件的内容出于所有目的通过全文引用而包含在本申请中。
[0063]应当理解，有限数目试剂例如荧光类似物和限定的聚合酶的延长询问可导致各种试剂被光损伤到实质性影响聚合酶活性或者功能性的点。特别是，已经显示在使用荧光核苷酸类似物的合成中涉及的DNA聚合酶的延长照射导致酶合成DNA能力的急剧降低。在不受任何操作理论束缚的情况下，认为光损伤事件影响酶的催化区域，从而影响酶保持与模板复合的能力，或者影响其处理额外合成的能力。
[0064]根据本发明，上述测序反应可在一种或多种光损伤缓解剂的存在下进行，如上所述。在优选方面，测序反应可在还原剂诸如DTT、MEA或者BME和除氧剂诸如GO-Cat两者都存在的情况下进行。
[0065]一般说来，光损伤缓解剂在反应混合物中以足以提供有益影响的水平存在，例如降低光损伤和/或光损伤阈值时间段的范围，但不以干扰目标反应的水平存在，例如干扰测序反应。光损伤缓解剂的成分的浓度一般可随使用而改变。作为实例，还原剂诸如DTT、MEA或者BME一般可以大约100μM到500mM之间的量存在，优选在大约1mM到大约200mM之间，例如在一些情况下对DTT来说为大约5mM，对MEA来说为100mM，但可从这些浓度而变化。在DTT的情形下，优选的浓度范围为约1mM至约10mM，而优选的对于MEA的范围为大约10mM到大约200mM。类似地，除氧剂的浓度一般可基于应用、存在的氧水平系统对活性氧类的易感性等而变化。例如，在测序反应中，氧清除酶系统例如GO-Cat一般以提供有效氧清除但不过多削弱所需反应例如聚合酶活性的水平存在。典型地，这包括来自任何地方的反应混合物中的GO-Cat的浓度，例如，多达大约5μM的葡萄糖氧化酶和多达大约575nM的过氧化氢酶，或者3到4倍的典型GO-Cat浓度下降到13nM葡萄糖氧化酶和1.5nM的过氧化氢酶，或者0.01X GO-Cat浓度。典型地，浓度可在大约0.01X到大约0.5X的前面阐明的典型GO-Cat浓度，更优选包括或者在大约0.1X到0.25X的GO-Cat之间。对于固定的氧缓解系统来说，固定化试剂的量一般可提供与前述非固定形式的浓度的活性水平对应的活性水平。试剂的精确量一般可取决于固定过程的相对效率，以及固定化成分所产生的活性。
[0066]如前所述，其他酶系统同样也可用于消除氧类。在至少一个方面，所述系统可包括氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、胆固醇氧化酶、乳酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、以及它们的类似物与过氧化物酶的组合，例如辣根过氧化物酶(HRP)。HRP是广泛应用的过氧化物酶，在氧化底物即Amplex Red、O-苯二胺(ODP)、鲁米诺存在的情况下其容易将溶液中存在的过氧化氢转化成水。因此，例如在含氧系统中与葡萄糖氧化酶系统例如葡萄糖氧化酶、葡萄糖结合，酶可利用溶液中的氧将葡萄糖转化成D-葡糖酐-1，4-内酯和过氧化氢。HRP然后将过氧化氢转化成水，同时氧化电子供体底物，诸如鲁米诺、ODP或类似物。
IV.光损伤的开发
[0067]与前述本发明的许多方面不同，在另一相关方面，本发明提供了开发潜在的光损伤过程以便改善整个系统的功能的方法。特别是，并参照本发明的一些优选方面，在一些情况下，理想地是开发对系统成分诸如酶、干扰蛋白或类似物选择性光损伤的能力，以便除去它们感兴趣的测定过程中的潜在干扰影响。例如，在光限定结构中聚合酶介导的测序过程中，一般理想地是在指定观察区提供反应复合物。另外，一般理想地是将系统中任何地方的反应复合物的供应最小化，这样一来其他复合物就可有助于反应和/或检测过程，例如通过试剂消除、发出非专一性信号事件的产生，例如通过产生过量标记的产品或者延长的合成产品以及类似物。
[0068]作为实例，在通过采用固定在零模波导的观察区中的聚合酶复合物的结合系统进行的典型测序中，人们可开发光损伤效应以便消除或者大体上降低整个反应基板上任何其他地方聚合酶的存在。特别是，零模波导结构典型地包括核心，其尺寸设置使得具有低于截止频率的频率的光不会传播通过该核心，但相反会指数衰退，在光从其发出的核心末端处或其附近形成非常小的照射区域。这种来自通过ZMW的透明基板末端的照射的指数衰退仅仅被用于照射设置在波导底部或其附近的一种或多种反应复合物。
[0069]由于通过首先在引起光损伤的条件下从对侧或者顶侧例如容纳反应混合物的流体成分的一侧照射，使得波导核心防止了光经过其传播，因而人们可有效地减少波导基板顶面或其附近的任何聚合酶活性，而不是使核心底部的复合物实质上失活。
[0070]除了开发典型反应条件的照射的光损伤效果以外，在至少一些方面，所述光损伤过程可被增强以便优先降解一些位置中的材料。例如，在一些情况下，额外的光敏感成分可被提供，进一步增加对照射成分的光损伤效果。为讨论简便起见，所选的光损伤能够优选在活性分子上进行，以便使那些分子选择性失活。在本文中，活性分子指的是提供另外功能的分子，其功能可通过本文中描述的光损伤效应被改变和/或基本受限制或者被消除。所述分子可包括蛋白质、核酸、碳水化合物，或者容易被光损伤到限制它们的功能的程度的其他各种分子中的任何一种。功能的限制在本文中一般指的是使分子失活。在特别优选的方面，活性分子可包括聚合酶或者在核酸分析中通常采用的其他蛋白质或者酶，和/或核酸分子诸如引物序列、模板序列、探针或者类似物。在聚合酶或者其他酶的情况下，失活典型地意味着在目标光损伤之后酶活性的实质下降，例如超过50％，优选超过75％，更优选超过90％。以核酸为参照，所述失活一般指的是核酸与给定反应中另一种所需的分子杂交或者复合的能力的实质降低，例如与引物序列杂交的能力降低或者与聚合酶复合的能力降低。典型地，所述降低在上述指定范围。
[0071]如前所述，聚合酶的光损伤与本文中描述的测序应用结合被认为阻止了在被结合到新生链中的核苷酸类似物上的荧光标记基团的激发过程中单态氧的产生，所述单态氧可引起其接触的蛋白质诸如聚合酶的有害影响。当暴露到适当波长的光时可高效产生单态氧的感光剂化合物一般可用于本文中描述的选择性光损伤过程中。许多所述感光剂在大于大约600nm的波长范围内起作用。为在本文中便于讨论起见，当暴露于适当的照射/或激发时会被活化的称为感光剂。典型地，如本文中所说明的那样，当被活化时感光剂可产生单态氧或者其他有害氧类。以本发明的优选方面为参照，活化感光剂的波长范围通过零模波导补充光的衰减，并一般可由此适用于波导阵列中选择性顶面光损伤。再声明一遍，当零模波导或者波导阵列包括具有设置在其上的包层，并且设置波导芯通过包层达到下面的透明基板时，在感光剂存在时包层的顶侧照射导致损伤氧类在包层的顶面或者上面或其附近产生，但完全不在芯本身内部产生，例如不在包层下面的基板表面或其附近产生。出于讨论的目的，并以本发明的一些方面为参照，当涉及零模波导阵列结构时，基板表面典型地指的是阵列的整个曝光表面，包括包层的上表面、包层中芯的壁表面以及芯的底面，其通常位于透明基板之下。因此，根据本发明，在表面的一些区域上但不在表面的其他区域上的分子的选择性光损伤包括其中分子在包层的上表面之上失活但不在芯的底面失活的情况。
[0072]一些感光剂在本领域是已知的，并在本发明的该方面的上下文中是有用的，例如包括二氢卟酚e6、卟吩姆钠、氯化铝二磺酸化的酞菁、金丝桃蒽素、四碘四氯荧光素、竹红菌甲素、竹红菌乙素、孔雀石绿、部花青540、quantum dots、Alexa 633、Alexa 647、AlphaScreen供体珠(来自Perkin-Elmer)、四苯基卟吩、A酞菁染料(A酞菁)、尾孢菌素以及它们的类似物。
[0073]根据本发明的一些方面，在聚合酶被固定到那些表面上之后系统的整个基板(例如零模波导阵列)被暴露给感光剂。基板然后可选择性地被照射，使仅仅选择区域中的感光剂能够产生单态氧。例如，在零模波导阵列中，顶侧曝光导致单态氧仅仅在波导阵列的包层的上表面或其附近产生，因为光不能深度穿进芯区域。由于芯的尺寸，可以预期单态氧不能有意义地扩散到波导中并损伤定位在波导底部的聚合酶。结果，固定或者吸收在包层上表面上(或者上表面附近但在芯区域中)的蛋白质、核酸或者其他目标分子将受到更高水平的单态氧作用，结果，典型地被光损伤到它们不能再有意义地有助于干扰所需分析的点。如同所理解的那样，将被光损伤的分子类型例如蛋白质、核酸或者类似物以及所需光损伤的程度一般可基于所使用的感光剂、其在处理阶段的浓度以及曝光的持续时间和强度来调节。
[074]虽然根据零模波导进行了描述，但应当理解各种选择性照射策略都可被用于提供基板表面上的模式化光损伤，例如仅仅为了损伤基板上一些选定区域中的分子，但不损伤基板的其他选择区域中的分子。例如，人们可采用光掩模来仅仅照射基板表面的一些区域，由此仅仅在所述区域中产生单态氧。作为替代，人们可采用选择性照射仅仅照射所选区域，例如使用定向光源，诸如激光。
[0075]下面提供非限制性的实例来进一步解释本发明。
V.实施例
[0076]由于核酸测序应用中单分子分析的值，DNA聚合酶系统被用于识别根据本发明的光损伤的影响以及其解决方案。最初的测定在三种不同构造中进行，以识别对聚合酶反应的光损伤的范围和/或本质。这些包括大量DNA合成试验、基于平面的核酸合成反应和在零模波导阵列中的合成。
实施例1：大量反应体积中的光损伤和缓解
[0077]在第一种测定中，合成反应混合物包含溶于合成缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，75mM KCL，20mM(NH4)2SO4，10mM BME，0.7mM MnCl2)中的修饰的Φ29DNA聚合酶、300nM DNA模板、三种天然核苷三磷酸(每种10μM)和荧光染料标记的核苷多磷酸(10μM)。每个反应在室温(22℃)下进行所需的照射时间段，范围从1分钟到1小时。
[0078]实验包括两组，每组包括三种不同的反应混合物：(1)仅仅使用天然的例如未标记的核苷三磷酸的合成反应；(2)包括两种天然核苷三磷酸、Alexa488标记的dCTP类似物和Alexa568标记的dTTP的合成反应；以及(3)包括两种天然核苷三磷酸、Alexa488标记的dC4P类似物(四磷酸盐)和Alexa568标记的dT4P的合成反应，每个不同合成反应条件包括不照射或者在488、568和647nm波长下激光照射合成5分钟，接着在不照射下合成60分钟。
[0079]合成之后，反应产物在标准条件下在0.7％的琼脂糖凝胶上分离。图2A提供了
Figure A20068004962400291
Gold染色的凝胶的照片。如图所示，左侧道1包括分子量标准。接着的两道(3和4，道2是空的)包括在不存在激光照射下(-)和存在激光照射下(+)仅仅含有未标记的核苷三磷酸的合成反应(上面的反应条件1)。移动到下两道至右侧(5和6)包括类似反应，但包括标记的核苷三磷酸(上述的反应条件2)，同时最右侧的道(7和8)在合成反应中包括标记的核苷四磷酸类似物(上面的反应条件3)(为了讨论磷酸标记的核苷多磷酸，参见美国专利US6399335。以及公开出版的美国专利申请No.2003/0124576，这两份专利的全部内容为所有目的通过引用而包含在本申请中)。
[0080]如同从凝胶看到的那样，在有激光照射和没有激光照射两种情况下大量相对高分子量的DNA已经在天然反应中都被合成。在每种利用标记类似物的情况下，合成的DNA的量和相对大小比天然条件下要小。但特别注意的是，在这后两种反应的每种中，激光照射导致产生的更高分子量的DNA的量实质性下降。进一步需要注意的是，尽管对于反应条件2和3来说，除使用四磷酸类似物以外反应条件是相同的，但在标记的四磷酸反应中被照射样品中损失的DNA合成的量成比例地增大。这由对于每个反应条件来说被照射样品与未照射样品中DNA的比例来表示(通过图像扫描来确定)。特别是，照射的凝胶道中DNA量与天然反应条件下未照射的DNA量的比例大约为1(1.10)。当反应包括标记的三磷酸类似物时，该比例下降到0.27，而四磷酸类似物的使用则将该比例降低到0.56。这些数据表明光损伤效果可由照射过程中荧光体在酶活性位点的保留时间的接近或长度引起。该询问通过以未标记的核苷三磷酸进行的类似实验而被加强，所述实验搀杂游离染料例如不与类似物结合的染料，显示对合成很小的照明影响或者没有影响。
[0081]类似地，使用荧光类似物以非激发波长照射的合成反应显示对聚合酶活性的很小影响或者没有影响。再次表明激发和/或发出荧光的类似物在一些测定中介导了对聚合酶活性的损伤。上述各种实验表明，光损伤在包括Alexa568染料标记的核苷酸类似物的反应中最大，进一步支持了建议的光物理效果，因为报道Alexa568染料比Alexa488染料的光稳定更差。使用非结合染料标记的类似物例如不与模板中任何碱基互补的类似物的其他实验提供了很少或者没有可测光损伤。所有前面的实验提供了进一步明显的指示，即对聚合酶活性的影响来自聚合酶活性位点中被激发的染料标记的核苷酸(或者核苷酸类似物)的存在，表明在活性位点对酶的一些损伤或者不可逆相互作用。
[0082]使用染料标记的四磷酸的实验(上面的反应条件3)使用三种不同缓解处理进行重复：(1)10mM βME(标准状态或者阴性对照)；(2)5mM DTT；和(3)100mM MEA，如上所述，使用或不使用激光照射。再次地，合成产物在琼脂糖凝胶上分离，其照片在图2B中显示。对凝胶进行图像扫描(Molecular Dynamics Typhoon 9400，withTyphoon scanner Control Version 2；gel image quantified withMolecular Dynamiics ImageQuant ver.5.2)。该分析的结果显示，在不存在来自标准条件的任何变化，例如仅仅包括10mM βME时，当曝光于激光照射时的产物与在没有所述照射存在时的产物之比为0.24。当将DTT加入到反应混合物中时，该比例上升到0.59，而加入MEA时则似乎提供了对5分钟的照射产生的光诱导损伤的完全或者大致完全的保护(该比例为1.04)。这些数据证明还原剂作为光损伤缓解剂的使用看起来防止了在激光激发辐射下发生的合成过程中发生的聚合酶活性的损失。
例2：在表面固定酶系统中的光损伤和缓解
[0083]下面，通过将聚合酶沉积在载玻片上并将表面在冰上培养15分钟将GST-标记的Φ29聚合酶包被在熔融石英纤维载玻片上。使用天然核苷酸和10μM Alexa488-标记的-dC4P和Alexa568-标记的-dT4P在表面上进行模板依赖的DNA合成，同时将小的半圆形激光斑照射到载玻片上。混合物中仅存在的还原剂为10mM βME。载玻片以不同位置暴露在488nm(1.1mW)和568nm(1.8mW)下照射1分钟和5分钟。在照射后，允许仅使用天然核苷酸继续合成60分钟。载玻片在合成的DNA存在下使用Sybr-金染色。照射1分钟和5分钟后的载玻片的图像在图3A中显示。从该图可以看出，半圆形照射区域在仅仅照射1分钟后就没有任何合成的DNA，显示影响在5分钟照射后更大。
[0084]由于合成缺乏甚至当没有照射的合成被允许继续进行60分钟时，不仅表明对聚合酶活性的光损伤，而且所述损失能够明显持续甚至是永久的。
[0085]在光损伤缓解剂的不同混合物或其不同浓度的混合物存在下进行了类似实验。特别是，与上面的例1相同，使用包括不同缓解处理的三种不同反应混合物：(1)10mM βME(标准状态或者阴性对照，与图3A中显示的相同)；(2)100mM MEA；和(3)100mM MEA，5mM DTT和1X GO Cat(1.3μM葡萄糖氧化酶和150nM过氧化氢酶)。结果在图3B中显示。可以看出，包括MEA的反应在1分钟和5分钟照射实验中损伤的聚合酶活性的图像指示中显示了灼伤的戏剧性下降。DTT和GO-Cat的加入进一步将对聚合酶活性损伤的水平降低到其在1分钟曝光中不可辨别的点，并且仅仅在5分钟曝光后才能辨别。
[0086]虽然GO-Cat的存在提供了光损伤的实质消除，相对高浓度的这些蛋白质的存在可具有对一些应用的相反效果，例如在一些反应以相对低水平的反应物为基础的情况下，因为所述蛋白质可掩蔽、封闭或者抑制目标反应。同样地，在预处理表面上进行另外的实验来确定对各种光损伤缓解剂的有效降低的水平。简言之，制备提供选择性聚合酶固定的被处理表面并用于在GO-Cat的浓度上进行滴定实验。下面解释建立的实验。
A.表面制备
[0087]将Neutravidin在1X BFA溶液中(0.05％Tween 20，150mM KCl，25mM Tris-HCl pH 7.5，5mM DTT)从1mg/ml稀释到0.2mg/ml。Biotin-GST标记的Φ29聚合酶在1X BFA中被稀释为大约128nM的浓度，将等体积的neutravidin溶液和聚合酶溶液组合并在23℃下培育30分钟。
[0088]neutravidin聚合酶混合物然后放置到具有PEG24-Biotin修饰的表面的带垫圈的熔融石英载玻片上，并用盖玻片覆盖。载玻片然后在23℃下培育1小时。在培育之后，将载玻片用1XBFA洗涤3次。
B.合成/照射实验
[0089]使用GO-Cat试剂，将其用2X MM试剂(2X prb-BME(100mM Tris-HCl pH 7.5，40mM硫酸铵，150mM KCl)，200mM MEA，10mM DTT，0.4％葡萄糖，1.4mM MnCl2，300nM CL31圆形模板，20μM A488 dC4P，20μM A568 dT4P，20μM dATP和dGTP)按1∶1稀释，产生最终的反应混合物，其具有100mM MEA，5mM DTT和0，0.02X，0.05X以及0.1X GO-CAT试剂。这些被稀释的合成试剂(用含有和不含有GO-CAT的2X MM稀释)然后被沉积到带垫圈的载玻片上，然后在合适位置用488nm和568nm的激光斑对其照射5分钟。激光照射后，用1X postMM试剂(1X prb-BME(50mM Tris-HCl pH 7.5，20mM硫酸铵，75mM KCl)，100nM CL31圆形模板，0.7mM MnCl2，2μMA488-dUTP，8μM dTTP，10μM dATP，dCTP和dGTP)代替反应混合物，并在没有照射的情况下在23℃下培育60分钟。得到的载玻片用1X BFA洗涤2次并用
Figure A20068004962400331
Gold嵌入染料(intercalating dye)，并成像。所得图像示于图3C中。可以看出，非常低水平的GO-Cat的使用提供了对聚合酶活性的有益影响。但是，GO-Cat以标准浓度的大约0.1X的存在几乎完全消除了聚合酶活性损伤。然后作为背景标准化环形强度体积(background normalized crate rintensity volume)对GO-Cat浓度的函数对图像数据作图(图3D)。再次地，以加入的较低蛋白水平的0.1X GO-Cat似乎实现合适的保护。
例3：纳米结构反应表面上的光损伤和缓解
[0090]使用固定在波导阵列中的零模波导内的DNA聚合酶进行了与上面描述的类似的实验组。如上所述，第一实验被设计成识别激光照射是否引起对固定在纳米结构的表面上的聚合酶的损伤。表面包括ZMW阵列，其中聚合酶没吸附在表面上。使用染料标记的核苷四磷酸(Alexa488dC4P和Alexa568dT4P)的DNA合成在有和没有激光照射(488nm和568nm)下进行，得到的产物再次用
Figure A20068004962400332
Gold染色。阵列的图像在图4A中显示。照射曲线在第一方格(最左侧)显示，而照射合成中的染色的DNA产物在相邻方格(中间靠左)中显示。可以看出，阴性图像显然在与照射模式对应的照射区域中。中间靠右和最右侧的方格显示了非照射的波导阵列，表明比照射样品中实质上存在更多的DNA，再次显示在波导阵列中对聚合酶活性的光诱导损伤。
[0091]图4B示出了第一组波导阵列，其中在存在非额外的缓解剂(例如仅10mM βME)的情况下或者在5mM DTT和100mM MEA存在的情况下进行类似合成反应。可以看出，添加DTT和MEA提供了对由激光照射引起的聚合酶活性损伤的实质保护，看来发生了产生与非照射阵列实质上相等量的DNA产物的反应。另外的实验也显示在存在160mM DTT而没有MEA时损失的聚合酶活性的量的改善，但不如在存在5mM DTT和100mM MEA时那么明显。
例3：光损伤缓解剂的证明
[0092]一些其他添加剂被检测来证明在降低激光照射下光损伤效果中的相对效率。在该实验中，DNA聚合酶被固定在平面玻璃基板(熔融石英显微载玻片)上并给以可发生DNA合成的反应条件。每种反应混合物还包括基线水平的光损伤缓解剂(10mM MEA-Ac，0.1xGO-Cat，25mM Tris-抗坏血酸盐)。在变化强度的激光照射下进行反应。
[0093]在光损伤步骤之后，将所有的溶液从芯片上洗去并用常用缓冲液和dNTPs替换。另外，加入碱基标记的荧光核苷酸染色单体，以在上述光损伤步骤之后提供结合活性的荧光信号。活化酶可被预期将染色单体结合到DNA中，而不活化的酶则不能。基于载玻片上DNA的相对荧光来测定酶活性。
[0094]下面的表1提供了对于每种不同添加剂在所列激光强度下相对于非照射的对照区的染色单体百分数。
  添加剂   激光强度(μW/μm2)   ％染色单体活性
  碱   2.5   15
  PPD   2.5   58
  DABCO   2.5   20
  NaN3   2.5   22
  BHT   2.5   22
  Trolox   2.5   41
[0095]可以看出，所有的添加剂都提高了染色单体的结合，表明与在不存在添加剂的情况下相比降低了光损伤。特别是，与基线混合物相比Trolox(1mM)和PPD(100mM)很好地提供了超过100％的改进，而与基线混合物相比其他添加剂一般提供从大约30％到大约40％范围内的改进。此外，与PPD和DABCo相比Trolox还显示提供了对荧光类似物较小的负面影响，因此是优选的添加剂。
[0096]虽然已经出于解释的目的进行了一些详细描述，但很容易理解，本领域技术人员所知道或者理解的一些变化也在本发明范围的实践之内。除非在上下文中清楚或者明确声明，在本文中提供的任何浓度值一般根据混合物值或者百分比给出，而不考虑当添加混合物的特定成分时或之后发生的任何转化。到没有明确结合在本文中的程度，声称在本公开说明书中的所有公开出版的参考和专利文献都出于所有目的通过全文引用而包含在本申请中。

Claims (59)

1、一种组合物，包括：
第一反应物；
第二反应物；和
光损伤缓解剂；
其中第一反应物在激发辐射条件下与第二反应物的相互作用在光损伤缓解剂不存在时，引起对第一反应物的光损伤。
2、权利要求1所述的组合物，其中第一反应物以第一限定量存在。
3、权利要求1所述的组合物，其中第一反应物以少于200nM而存在。
4、权利要求1所述的组合物，其中第一反应物以少于10nM而存在。
5、权利要求1所述的组合物，其中第一反应物以少于10pM而存在。
6、权利要求1所述的组合物，其中第一反应物被固定在表面上。
7、权利要求6所述的组合物，其中表面包括光学限定的表面。
8、权利要求7所述的组合物，其中光学限定包括零模波导。
9、权利要求1所述的组合物，其中第一反应物被限定在第一区域。
10、权利要求9所述的组合物，其中在第一区域中存在1到3个固定的第一反应物分子。
11、权利要求9所述的组合物，其中第一区域包括光学限定。
12、权利要求11所述的组合物，其中光学限定包括零模波导。
13、权利要求1所述的组合物，其中第一反应物包括酶，并且第二反应物包括用于该酶的荧光剂或者荧光底物。
14、权利要求1所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括三重态淬灭剂。
15、权利要求1所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括抗氧化剂。
16、权利要求1所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括除氧剂或淬灭剂。
17、权利要求1所述的组合物，其中光损伤缓解剂选自下组，包括：抗坏血酸、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙胺(MEA)、β-巯基乙醇(BME)、没食子酸正丙酯、对苯二胺(PPD)、对苯二酚、叠氮化钠(NaN3)、重氮二环辛烷(DABCO)、Trolox、丁基化的苯甲醇(BHT)、环辛四烯(COT)。
18、权利要求1所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括氧耗竭酶。
19、权利要求18所述的组合物，其中氧耗竭酶包括选自下列的酶：超氧化物歧化酶、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乳酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶和原儿茶酸3，4双加氧酶。
20、权利要求1所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括葡萄糖-氧化酶/过氧化氢酶系统。
21、权利要求18所述的组合物，进一步包括选自下组的过氧化氢耗竭酶，包括过氧化氢酶、辣根过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶。
22、权利要求1所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括至少选自下组的第一试剂：麦角硫因、甲硫氨酸、半胱氨酸、β-二甲基半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、巯基丙酰甘氨酸、MESNA、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、N-乙酰半胱氨酸、卡托普利、番茄红素、γ-胡萝卜素、虾青素、角黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、胭脂树素、花药黄质、玉米黄质、叶黄素、胆红素、胆绿素、生育酚、聚烯二醛、α-生育酚琥珀酸酯及其类似物、吡哆醇及其衍生物、肼(N2H4)、亚硫酸钠(Na2SO3)和羟胺。
23、权利要求1所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括至少选自下组的第一试剂：二硫苏糖醇和巯基乙胺。
24、一种组合物，包括：
限定的酶；
用于所述酶的底物；和
光损伤缓解剂；
其中在激发辐射条件下酶与底物的相互作用在光损伤缓解剂不存在时引起对酶的光损伤。
25、权利要求24所述的组合物，其中底物包括荧光剂或者荧光底物。
26、权利要求25所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括三重态淬灭剂。
27、权利要求24所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括除氧剂或淬灭剂。
28、权利要求24所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括至少选自下组的第一试剂：二硫苏糖醇和巯基乙胺。
29、权利要求24所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括葡萄糖-氧化酶/过氧化氢酶系统。
30、权利要求24所述的组合物，其中限定的酶被固定在基板的表面上。
31、权利要求24所述的组合物，其中光损伤缓解剂包括选自下组的至少一种试剂，包括：抗坏血酸、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙胺(MEA)、β-巯基乙醇(BME)、没食子酸正丙酯、对苯二胺(PPD)、对苯二酚、叠氮化钠(NaN3)、重氮二环辛烷(DABCO)、环辛四烯(COT)、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙胺(MEA)、Trolox及其衍生物、丁基化的苯甲醇(BHT)、超氧化物歧化酶、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乳酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶和原儿茶酸3，4双加氧酶、麦角硫因、甲硫氨酸、半胱氨酸、β-二甲基半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、巯基丙酰甘氨酸、MESNA、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、N-乙酰半胱氨酸、卡托普利、番茄红素，γ-胡萝卜素、虾青素、角黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、胭脂树素、玉米黄质、叶黄素、胆红素、胆绿素、生育酚、聚烯二醛、褪黑激素、α-生育酚琥珀酸酯及其类似物、吡哆醇及其衍生物、肼(N2H4)、亚硫酸钠(Na2SO3)和羟胺。
32、一种组合物，包括：
限定的酶；
用于所述酶的底物；其中在激发辐射条件下酶与底物的相互作用引起对第一反应物的光损伤；和
光损伤缓解剂。
33、一种装置，包括：
具有观察区的基板；
固定在观察区中的第一反应物；
设置在观察区中的第二反应物，其中第一和第二反应物在激发辐射条件下的反应引起对第一反应物的光损伤；和
设置在观察区中的光损伤缓解剂。
34、一种进行照射反应的方法，包括：
提供具有设置在其上的反应混合物的基板，其中反应混合物包括第一反应物、第二反应物和光损伤缓解剂，其中光损伤缓解剂减少了由第一反应物与第二反应物在激发辐射条件下在不存在光损伤缓解剂时发生反应产生的对第一反应物的光损伤的量；和
用激发辐射对基板上的反应混合物进行照射。
35、权利要求34的方法，进一步包括在对反应混合物进行照射的同时监测第一和第二反应物之间的反应。
36、权利要求34的方法，其中光损伤缓解剂包括选自下组包括的一种试剂：抗坏血酸、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙胺(MEA)、β-巯基乙醇(BME)、没食子酸正丙酯、对苯二胺(PPD)、对苯二酚、叠氮化钠(NaN3)、重氮二环辛烷(DABCO)、环辛四烯(COT)、二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙胺(MEA)、Trolox及其衍生物、丁基化的苯甲醇(BHT)、超氧化物歧化酶、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、乳酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶和原儿茶酸3，4双加氧酶、麦角硫因、甲硫氨酸、半胱氨酸、β-二甲基半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、巯基丙酰甘氨酸、MESNA、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、N-乙酰半胱氨酸、卡托普利、番茄红素、γ-胡萝卜素、虾青素、角黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、胭脂树素、玉米黄质、叶黄素、胆红素、胆绿素、生育酚、聚烯二醛、褪黑激素、α-生育酚琥珀酸酯及其类似物、吡哆醇及其衍生物、肼(N2H4)、亚硫酸钠(Na2SO3)和羟胺。
37、一种进行酶反应的方法，包括：
在第一观察区内提供酶；
将酶与用于该酶的荧光剂或者荧光底物接触；和
将激发辐射定向到第一观察区比光损伤阈值时间段短的时间段，并检测来自第一观察区的信号。
38、权利要求37的方法，包括在至少第二观察区重复提供、接触和定向步骤的方法。
39、一种监测碱基延伸反应的方法，包括：
在第一观察区中提供聚合酶；
将聚合酶与至少第一荧光剂或者荧光核苷酸类似物接触；和
监测由第一观察区响应于以激发辐射的照射比光损伤阈值时间段短的时间段所发出的荧光信号。
40、一种用于分析当照射比光损伤阈值时间段长的时间段时易受到光损伤的照射反应的系统，包括：
具有设置在其上用于反应的试剂的基板；
支撑基板并被构造成容纳基板的固定台；
被定位成与至少一部分基板光学连通的复合成像链，以照射一部分基板并检测从其上发出的信号；
可操作地与安装台或者复合成像链连接的平移系统，用于将复合成像链和基板中之一相对于彼此运动。
41、一种进行酶反应的方法，包括：
在观察区中提供酶；
在存在至少第一光损伤缓解剂时在激发辐射下将酶与荧光剂或者用于该酶的荧光底物接触。
42、一种监测碱基延伸反应的方法，包括：
在观察区中提供聚合酶；
在存在至少第一光损伤缓解剂的情况下将聚合酶与至少第一荧光剂或者荧光核苷酸类似物接触；和
监测由观察区响应于以激发辐射的照射所发出的荧光信号。
43、一种监测混合物反应的方法，所述混合物包括至少第一种酶和用于第一种酶的荧光剂或者荧光底物，其中酶与荧光剂或者荧光底物在激发辐射的情况下的相互作用导致酶活性的降低，所述方法包括将激发辐射定向到第一观察区照射比光损伤阈值时间段短的第一时间段。
44、权利要求43的方法，进一步包括在第一时间段之后将激发辐射定向到第二观察区，照射比光损伤阈值时间段短的第二时间段。
45、一种将活性分子定位在基板的第一选择区域中的方法，包括：
提供基板，其具有非选择性地设置在基板表面上的分子；
在基板表面上提供感光剂；
将与基板上的第一选择区域不同的一个或多个区域暴露在足以活化感光剂的光下，使不同于第一选择区域的区域中的活性分子充分失活。
46、权利要求45的方法，其中活性分子包括蛋白质。
47、权利要求45的方法，其中活性分子包括核酸。
48、权利要求46的方法，其中活性分子包括酶。
49、权利要求48的方法，其中酶包括核酸聚合酶。
50、权利要求45的方法，其中当被活化时感光剂产生单态氧。
51、权利要求50的方法，其中感光剂包括选自下组的试剂：
二氢卟酚e6、卟吩姆钠、氯化铝二磺酸化的酞菁、金丝桃蒽素、四碘四氯荧光素、竹红菌甲素、竹红菌乙素、孔雀石绿、部花青540、quantumdots、Alexa 633、Alexa 647、四苯基卟吩、A酞菁染料、以及尾孢菌素。
52、权利要求45的方法，其中将一个或多个区域曝光的步骤包括防止光冲击第一选择区域。
53、权利要求52的方法，其中将一个或多个区域曝光的步骤包括通过掩模照射一个或多个区域。
54、权利要求52的方法，其中基板包括零模波导阵列，所述零模波导阵列包括设置在透明基板上的包层以及通过包层到透明基板设置的多个芯，其中将一个或多个区域曝光的步骤包括以不通过芯传播到透明层的照射射包层的顶面，第一选择区域被设置在透明基板上的芯中。
55、一种装置，包括：
具有至少第一表面的基板；
非选择性设置在第一表面上的活性分子；
设置在第一表面上的感光剂。
56、一种系统，包括：
具有至少第一表面的基板；
非选择性设置在第一表面上的活性分子；
设置在第一表面上的感光剂；
照射系统，其任选地与基板的第一表面连接，并被构造成选择性地照射基板第一表面的选择区域以便充分活化感光剂，而不照射基板的其他选择区域。
57、一种分析活性分子反应的方法，包括：
提供具有至少第一表面的基板，活性分子非选择性地设置在第一表面上，并且感光剂也设置在第一表面上；
照射第一表面的选择区域以活化感光剂并使选择区域中的活性分子失活，但不使非选择区域中的活性分子失活；和
观察非选择区域中的活性分子的反应。
58、权利要求57的方法，其中活性分子为聚合酶，反应包括模板导向的核酸合成。
59、权利要求57的方法，其中基板基板包括零模波导阵列，对第一表面的选择区域进行照射的步骤包括以不通过零模波导的芯传播的频率的照射射零模波导阵列上的包层的顶面。
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WO (1) WO2007064905A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103403188A (zh) * 2011-01-31 2013-11-20 伊鲁米那股份有限公司 用于降低核酸损伤的方法
CN105982890A (zh) * 2014-09-05 2016-10-05 中国医药大学 麦角硫因应用于活化细胞的Nrf2信号通路的用途
CN109557064A (zh) * 2018-12-30 2019-04-02 长春中医药大学 一种通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸及其浓度的方法、检测丙酮酸氧化酶及其浓度的方法
CN113795595A (zh) * 2020-04-20 2021-12-14 深圳华大智造科技股份有限公司 Dna成像缓冲液中的dna保护试剂
WO2023185795A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 深圳市真迈生物科技有限公司 荧光检测试剂及其制备方法及应用

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1354064A2 (en) 2000-12-01 2003-10-22 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US7763423B2 (en) * 2005-09-30 2010-07-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates having low density reactive groups for monitoring enzyme activity
US7998717B2 (en) * 2005-12-02 2011-08-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Mitigation of photodamage in analytical reactions
US8975216B2 (en) * 2006-03-30 2015-03-10 Pacific Biosciences Of California Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same
US20080050747A1 (en) * 2006-03-30 2008-02-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing and using same
US8802424B2 (en) 2008-01-10 2014-08-12 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and systems for analysis of fluorescent reactions with modulated excitation
US8501922B2 (en) * 2008-02-07 2013-08-06 Pacific Biosciences Of California, Inc. CIS reactive oxygen quenchers integrated into linkers
AU2009223702B2 (en) 2008-03-13 2013-08-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. Labeled reactants and their uses
US7973146B2 (en) * 2008-03-26 2011-07-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Engineered fluorescent dye labeled nucleotide analogs for DNA sequencing
US8628940B2 (en) 2008-09-24 2014-01-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Intermittent detection during analytical reactions
US8236499B2 (en) * 2008-03-28 2012-08-07 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sample preparation
CA2991818C (en) 2008-03-28 2022-10-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for nucleic acid sequencing
US9127259B2 (en) * 2008-03-31 2015-09-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Enzymes resistant to photodamage
US9637380B2 (en) 2008-03-31 2017-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanoscale apertures having islands of functionality
EP2286217B1 (en) * 2008-03-31 2015-02-18 Pacific Biosciences of California, Inc. Single molecule loading methods and compositions
US20100227327A1 (en) * 2008-08-08 2010-09-09 Xiaoliang Sunney Xie Methods and compositions for continuous single-molecule nucleic acid sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides
US20100036110A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 Xiaoliang Sunney Xie Methods and compositions for continuous single-molecule nucleic acid sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides
WO2010036287A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Intermittent detection during analytical reactions
US8383369B2 (en) * 2008-09-24 2013-02-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Intermittent detection during analytical reactions
WO2010059880A2 (en) * 2008-11-19 2010-05-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Photo-induced damage mitigating agents and preparation and methods of use thereof
WO2010111690A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Life Technologies Corporation Polymerase compositions and methods
WO2010117420A2 (en) * 2009-03-30 2010-10-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fret-labeled compounds and uses therefor
US8501406B1 (en) 2009-07-14 2013-08-06 Pacific Biosciences Of California, Inc. Selectively functionalized arrays
WO2011031313A2 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Pacific Biosciences Of California, Inc. Zero-mode waveguides with non-reflecting walls
US8367159B2 (en) 2009-09-11 2013-02-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods for producing ZMWs with islands of functionality
WO2012021733A2 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Photodamage mitigation compounds and systems
US8669374B2 (en) 2010-08-25 2014-03-11 Gene Shen Functionalized cyanine dyes (PEG)
US9109222B2 (en) 2010-12-27 2015-08-18 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sample preparation methods and compositions
US9115353B2 (en) 2011-01-31 2015-08-25 Illumina, Inc. Method for nucleotide detection
WO2013022778A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sequencing by electrochemical detection
MX361039B (es) * 2011-10-26 2018-11-26 Amgen Inc Métodos para reducir o eliminar modificación de proteína y degradación que surge de la exposición a luz ultravioleta.
EP2872523B1 (en) 2011-12-30 2018-01-17 Abbott Molecular Inc. Microorganism nucleic acid purification from host samples
EP3434789A1 (en) 2012-01-13 2019-01-30 Data2Bio Genotyping by next-generation sequencing
US9528107B2 (en) 2012-01-31 2016-12-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for selection of nucleic acids
US10031139B2 (en) * 2012-03-30 2018-07-24 Konica Minolta, Inc. Method for detecting biological material
WO2013148400A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and composition for sequencing modified nucleic acids
EP3789502A1 (en) 2012-05-02 2021-03-10 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequencing
US10584377B2 (en) 2012-05-02 2020-03-10 Ibis Biosciences, Inc. DNA sequencing
ES2683707T3 (es) 2012-05-02 2018-09-27 Ibis Biosciences, Inc. Secuenciación de ADN
US9315864B2 (en) 2012-05-18 2016-04-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Heteroarylcyanine dyes with sulfonic acid substituents
EP2850086B1 (en) 2012-05-18 2023-07-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Heteroarylcyanine dyes
US8956816B2 (en) 2012-06-05 2015-02-17 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for performing analytical operations
US9637782B2 (en) 2012-09-28 2017-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Charged triplet-state quenchers for mitigation of photo-induced damage
ES2701750T3 (es) 2012-10-16 2019-02-25 Abbott Molecular Inc Procedimientos para secuenciar un ácido nucleico
US9146248B2 (en) 2013-03-14 2015-09-29 Intelligent Bio-Systems, Inc. Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments
US9591268B2 (en) 2013-03-15 2017-03-07 Qiagen Waltham, Inc. Flow cell alignment methods and systems
ES2873850T3 (es) 2013-08-19 2021-11-04 Abbott Molecular Inc Bibliotecas de secuenciación de próxima generación
EP3083700B1 (en) 2013-12-17 2023-10-11 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Detection of an antibody against a pathogen
WO2015200541A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital pcr barcoding
CN107209188A (zh) 2014-06-27 2017-09-26 雅培制药有限公司 用于检测人Pegivirus 2 (HPgV‑2)的组合物和方法
US10435685B2 (en) 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
WO2016044391A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Ibis Biosciences, Inc. Sequencing by synthesis using pulse read optics
US10302972B2 (en) 2015-01-23 2019-05-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Waveguide transmission
CN108350487B (zh) 2015-11-19 2022-05-27 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于改善信号检测的化合物和系统
CN105301086A (zh) * 2015-12-05 2016-02-03 桂林理工大学 一种葡萄糖氧化酶生物传感器的制备方法及其应用
EP3400298B1 (en) 2016-01-08 2024-03-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiple beads per droplet resolution
EP3458465A1 (en) * 2016-05-20 2019-03-27 Quantum-si Incorporated Labeled nucleotide compositions and methods for nucleic acid sequencing
WO2018042251A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 Oslo Universitetssykehus Hf Chip-seq assays
WO2018118971A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna
WO2018236918A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. MDA USING A BALL OLIGONUCLEOTIDE
TWI829642B (zh) 2017-07-24 2024-01-21 美商寬騰矽公司 高強度經標記之反應物組合物及用於定序之方法
US10907205B2 (en) 2017-11-02 2021-02-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Transposase-based genomic analysis
EP4324962A2 (en) 2018-01-31 2024-02-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for deconvoluting partition barcodes
US11512002B2 (en) 2018-04-18 2022-11-29 University Of Virginia Patent Foundation Silica materials and methods of making thereof
US10400272B1 (en) 2018-04-26 2019-09-03 Omniome, Inc. Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes
US11332787B2 (en) 2018-06-29 2022-05-17 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for delivery of molecules and complexes to reaction sites
EP4249651A3 (en) 2018-08-20 2023-10-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions
JP2022518056A (ja) 2019-01-23 2022-03-11 クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド 高強度標識されたシーケンシング用の反応組成物および方法
CN110665005B (zh) * 2019-10-29 2022-02-22 重庆医科大学 一种掺铁聚合物纳米粒及其制备方法和应用
CA3157457A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 Xiaolin Wu Cyclooctatetraene containing dyes and compositions
WO2021152586A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state
WO2021214766A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4994373A (en) 1983-01-27 1991-02-19 Enzo Biochem, Inc. Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes
US5821058A (en) 1984-01-16 1998-10-13 California Institute Of Technology Automated DNA sequencing technique
US4689307A (en) 1986-09-02 1987-08-25 Caribbean Microparticles Corporation Fluorescence microscopy sample mounting method and structure
US4962020A (en) 1988-07-12 1990-10-09 President And Fellows Of Harvard College DNA sequencing
JPH02123303A (ja) * 1988-11-02 1990-05-10 Power Reactor & Nuclear Fuel Dev Corp 光ファイバの放射線劣化防止方法
US4979824A (en) 1989-05-26 1990-12-25 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High sensitivity fluorescent single particle and single molecule detection apparatus and method
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
CA2044616A1 (en) 1989-10-26 1991-04-27 Roger Y. Tsien Dna sequencing
EP0428000A1 (en) 1989-11-03 1991-05-22 Abbott Laboratories Fluorogenic substrates for the detection of proteolytic enzyme activity
IL108497A0 (en) * 1993-02-01 1994-05-30 Seq Ltd Methods and apparatus for dna sequencing
AU5171696A (en) 1995-02-27 1996-09-18 Ely Michael Rabani Device, compounds, algorithms, and methods of molecular characterization and manipulation with molecular parallelism
US5866331A (en) * 1995-10-20 1999-02-02 University Of Massachusetts Single molecule detection by in situ hybridization
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
ZA973642B (en) * 1996-04-26 1997-11-25 Merck & Co Inc DNA vaccine formulations.
DK0956859T3 (da) * 1996-09-27 2006-06-26 Takeshi Karita Antioxiderende sammensætning til opfangning af frie radikaler, farmaceutisk præparat som omfatter denne samt fremgangsmåde til fremstilling heraf
US6544797B1 (en) * 1997-04-09 2003-04-08 Biosite Diagnostics, Inc. Compositions and methods for inhibiting light-induced inactivation of biological reagents
ATE225858T1 (de) 1997-07-28 2002-10-15 Medical Biosystems Ltd Sequenzanalyse von nukleinsäuren
CA2339121A1 (en) 1998-07-30 2000-02-10 Shankar Balasubramanian Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US6210896B1 (en) 1998-08-13 2001-04-03 Us Genomics Molecular motors
DE69912444T3 (de) * 1998-08-25 2010-05-06 University Of Washington, Seattle Schnelle quantitative analyse von proteinen oder proteinfunktionen in komplexen gemischen
US6232075B1 (en) 1998-12-14 2001-05-15 Li-Cor, Inc. Heterogeneous assay for pyrophosphate detection
ATE272391T1 (de) * 1998-12-23 2004-08-15 Idea Ag Verbesserte formulierung zur topischen, nichtinvasiven anwendung in vivo
ATE556149T1 (de) 1999-02-23 2012-05-15 Caliper Life Sciences Inc Manipulation von mikropartikeln in mikrofluidischen systemen
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
WO2001016375A2 (en) 1999-08-30 2001-03-08 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
US6982146B1 (en) 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
US6917726B2 (en) * 2001-09-27 2005-07-12 Cornell Research Foundation, Inc. Zero-mode clad waveguides for performing spectroscopy with confined effective observation volumes
US6869764B2 (en) 2000-06-07 2005-03-22 L--Cor, Inc. Nucleic acid sequencing using charge-switch nucleotides
GB0016473D0 (en) 2000-07-05 2000-08-23 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Sequencing method
GB0016472D0 (en) 2000-07-05 2000-08-23 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Sequencing method and apparatus
US6953659B2 (en) * 2000-07-14 2005-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Direct, externally imposed control of nucleic acids
US6540923B2 (en) * 2000-12-05 2003-04-01 Kurita Water Industries Ltd. Oxygen scavenger
US20020102595A1 (en) * 2001-01-29 2002-08-01 Davis Lloyd Mervyn Methods for detection of incorporation of a nucleotide onto a nucleic acid primer
EP1370690B1 (en) * 2001-03-16 2012-03-14 Kalim Mir Arrays and methods of use
AU2002305193A1 (en) 2001-04-18 2002-11-05 Wyeth Methods and reagents for regulating bone and cartilage formation
EP1262563A3 (en) * 2001-05-31 2003-02-05 Takara Bio Inc. Method for immobilizing DNA on a surface
DE10129504A1 (de) * 2001-06-19 2003-01-09 Beiersdorf Ag Verwendung von Carnitin und/oder einem oder mehreren Acyl-Carnitinen zur Herstellung von kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Pigmentierungsstörungen
US7560254B2 (en) 2001-08-29 2009-07-14 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Allele specific primer extension
US7033762B2 (en) 2001-08-29 2006-04-25 Amersham Biosciences Corp Single nucleotide amplification and detection by polymerase
ATE458067T1 (de) 2001-08-29 2010-03-15 Ge Healthcare Bio Sciences Markierte nukleosidpolyphosphate
US7244566B2 (en) 2001-08-29 2007-07-17 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Analyte detection
US7309568B2 (en) * 2001-09-26 2007-12-18 Hitachi, Ltd. Method in inspecting DNA and apparatus therefor
CN1802409A (zh) * 2003-04-08 2006-07-12 西巴特殊化学品控股有限公司 颜料分散体中的光稳定聚合物分散剂
CA2533892A1 (en) * 2003-07-28 2005-02-10 The Regents Of The University Of California Methods for treating, preventing, or inhibiting injuries, cell membrane stabilization, and calcium mobilization using pseudopterosin compounds
US20050141843A1 (en) 2003-12-31 2005-06-30 Invitrogen Corporation Waveguide comprising scattered light detectable particles
US7981604B2 (en) * 2004-02-19 2011-07-19 California Institute Of Technology Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
AU2005240078A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 Allergan, Inc. Retinoid-containing sustained release intraocular drug delivery systems and related methods of manufacturing
US7998717B2 (en) * 2005-12-02 2011-08-16 Pacific Biosciences Of California, Inc. Mitigation of photodamage in analytical reactions
WO2007070572A2 (en) 2005-12-12 2007-06-21 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Probe for nucleic acid sequencing and methods of use
GB0621361D0 (en) 2006-10-26 2006-12-06 Fermentas Uab Use of DNA polymerases

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIM GILOH,JOHN W. SEDAT: "Fluorescence Microscopy: Reduced Photobleaching of Rhodamine and Fluorescein Protein Conjugates by n-Propyl Gailate", 《SCIENCE》 *
JAN A. SIKORSKY ET AL.: "Effect of DNA damage on PCR amplification efficiency with the relative threshold cycle method", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
LOLING SONG,ET AL.: "Influence of the Triplet Excited State on the Photobleaching Kinetics of Fluorescein in Microscopy", 《BIOPHYSICAL JOURNAL》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103403188A (zh) * 2011-01-31 2013-11-20 伊鲁米那股份有限公司 用于降低核酸损伤的方法
CN103403188B (zh) * 2011-01-31 2016-03-30 伊鲁米那股份有限公司 用于降低核酸损伤的方法
CN105982890A (zh) * 2014-09-05 2016-10-05 中国医药大学 麦角硫因应用于活化细胞的Nrf2信号通路的用途
CN109557064A (zh) * 2018-12-30 2019-04-02 长春中医药大学 一种通过荧光金纳米簇探针检测丙酮酸及其浓度的方法、检测丙酮酸氧化酶及其浓度的方法
CN113795595A (zh) * 2020-04-20 2021-12-14 深圳华大智造科技股份有限公司 Dna成像缓冲液中的dna保护试剂
CN113795595B (zh) * 2020-04-20 2023-02-28 深圳华大智造科技股份有限公司 Dna成像缓冲液中的dna保护试剂
WO2023185795A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 深圳市真迈生物科技有限公司 荧光检测试剂及其制备方法及应用

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US20080176316A1 (en) 2008-07-24

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