KR20080091125A - 분석반응에서 광 손상의 완화 - Google Patents

Abstract

반응 혼합물 중에 1종 이상의 광손상 완화제(photodamage mitigating agents)를 혼합하며 및/또는 광손상 허용시간(photodamge threshold period) 미만의 시간 동안 반응 혼합물의 서로 다른 관측영역을 검색(interrogating)하여 조사분석반응(illuminated analytical reactions)을 할 때 1종 이상의 반응물질의 광손상을 감소 및/또는 예방하기 위한 조성물, 디바이스(devices), 시스템(systems) 및 방법.

광 손상 완화제, 관측영역, 조사분석반응, 표면 고정화 효소계, 형광 뉴클레오티드 유사체.

Description

분석반응에서 광 손상의 완화{MITIGATION OF PHOTODAMAGE IN ANALYTICAL REACTIONS}

(관련특허)

이 특허출원은 미국특허출원 11/293,040(2005.12.2 출원)의 일부 계속 출원(continuation-in-part)으로, 여기에 그 출원 명세서의 전문을 편집하여 기재한다.

(연구 보조금 지원)

이 발명 연구는 정부지원 연구 보조금(NHGRI Grant) No. 1 R01 HG003710-01에 의해 일부 지원되어, 미합중국 정부는 본 발명에 있어서 소정의 권리를 가진다.

광 검출 가능한 표지 그룹(labeling grouops)과, 특히 양자 수득율(quantum yields)이 높은 그룹, 즉 형광 또는 화학발광 그룹(chemiluminescent groups)은 분석화학, 생화학 및 생물학의 분야를 통하여 보편적으로 사용하였다.

특히, 소정의 반응과 관련하여 높은 가시신호(visible signal)를 높게 제공함으로써 그 반응과 그 반응의 어느 잠재성 있는 효과인자(effectors)를 더 좋게 모니터링(monitoring)할 수 있다.

이와 같은 분석은 게노믹스(genomics), 진단학, 제약연구 및 관련 기술분야 에서 생활 과학연구(life science research)의 기초적인(tools) 수단이다.

종래에는 이와 같은 분석을 일반적으로 반응물질의 양이 너무 과량인 상태에서 실시하여 그 결과 그 광 사건(optical event)의 어느 역효과(adverse effects)를 알지 못하였다.

예로서, 형광 표지 그룹(fluorescent labeling groups)에 의한 상기 분석은 일반적으로 반응 혼합물에서 여기 방사선원(excitation radiation source)을 사용하여, 그 형광 표지 그룹을 여기시킨 다음, 분리하여 검출할 수 있다.

그러나, 이와 같은 광원(light sources)에 화학적 반응물질과 생화학적 반응물질의 장기 노출(prolonged exposure)은 단독으로, 또는 다른 성분, 즉 형광 그룹과 함께 존재할 때 이와 같은 반응물질, 즉 단백질, 효소, 기질(substrates) 등에 손상을 잠재적으로 유도할 수 있다.

그러나, 종래에 공지된 바와 같이, 이와 같은 반응에 대한 현행 포맷(existing formats)에서는 일반적으로 기술적인 문제가 되는 불확실한 점을 효과적으로 예방하거나 또는 인식하지도 못하였다.

그러나, 광 손상의 유해효과가 주어진 분석 조작에서 더 현저한 악영향을 주도록 하는 상기 포맷에서 벗어난 여러 가지의 분석기술이 개발되었는바, 특히, 형광시약을 포함하는 반응의 실시간 분석에서는 다수의 다른 성분을 광 에너지에 노출시킬 수 있었다.

또, 반응은 양이 점점더 적어지는 시약을 기준으로 하였다.

즉, 마이크로유체 또는 나노유체반응용기 또는 채널에서 또는 "단분 자"(single molecule) 분석에서, 이와 같이, 본 발명은 위에서 설명한 광 손상의 역효과를 어느 정도 방지 또는 완화하는 방법과 조성물에 관한 것이며, 또 다른 유용한 방법과 조성물 중에서 상기 방법 및/또는 조성물로부터 효과를 얻도록 하는 방법에 관한 것이다.

(발명의 간단한 기술적 요약)

본 발명은 일반적으로 조사반응(illuminated reactions), 특히 형광반응물질 및/또는 형광발생 반응물질을 이용하는 조사반응에서 광 손상(photodamage) 및 그 효과를 감소 및/또는 제거하기 위한 조성물, 디바이스(devices), 시스템(systems) 및 방법에 관한 것이다.

제 1국면(first aspect)에서, 본 발명은 하나의 제 1 반응물질과, 하나의 제 2 반응물질 및 하나의 광 손상 완화제(photodamage mitigating agent)를 함유하여, 여기 조사(excitation illumination)에 의해 제 1 반응물질과 제 2 반응물질을 상호 작용시켜 광 손상 완화제 없이 제 1 반응물질에 광 손상을 발생하도록 하는 하나의 조성물을 제공한다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 하나의 차단효소(confined enzyme)와, 그 차단효소의 기질(substrate) 및 광 손상 완화제를 함유하여 여기 조사에 의해 그 차단효소와 기질을 상호작용시켜 광 손상 완화제 없이 그 차단효소에 광 손상을 발생하도록 하는 하나의 조성물을 제공한다.

또 다른 하나의 국면에서, 본 발명은 하나의 차단효소와, 그 효소의 기질과, 광 손상 완화제를 함유하여 그 차단효소와 기질을 여기 조사에 의해 상호작용시켜 그 차단효소에 광 손상을 발생하도록 하는 하나의 조성물을 제공한다.

본 발명은 또 하나의 관측영역을 가진 기질과, 그 관측영역 내에서 고정화된 제 1 반응물질과, 그 관측영역 내에 설정된 제 2 반응물질을 함유하여 여기 조사에 의해 제 1 반응물질과 제 2 반응물질 사이에서 상호작용시켜 제 1 반응물질에 광 손상을 발생하도록 하는 디바이스(devices)를 제공한다.

이와 같은 디바이스(devices)에는 또 그 관측영역 내에 설정된 광 손상 완화제를 포함한다.

본 발명은 또 하나의 조사반응(illuminated reaction)을 실시하는 방법(methods)을 제공한다.

이들의 방법은 일반적으로 반응 혼합물을 처리하는 하나의 기질을 제공하며, 그 반응 혼합물은 하나의 제 1 반응물질과, 하나의 제 2 반응물질 및 광 손상 완화제를 함유하며, 광 손상 완화제 없이 발생하는 여기 조사에 의한 제 1 반응물질과 제 2 반응물질의 상호작용 결과 제 1 반응물질의 광 손상 량을 상기 광 손상 완화제가 감소시키는 것을 특징으로 한다.

그 다음, 그 반응 혼합물은 여기 조사에 의해 조사(illumination)된다.

동일하게, 본 발명은 또 하나의 효소반응을 실시하는 방법(methods)을 제공하며, 그 방법은 제 1 관측영역 내에 하나의 효소를 제공하여, 그 효소와 그 효소용 형광물질 또는 형광발생물질을 접촉하여, 광 손상 허용시간(photodamage threshold period) 미만인 시간 동안 제 1 관측영역에서 여기 방사선(excitation radiation)을 지향(directing)하여 신호를 검출하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 하나의 염기 신장 반응(base extension reaction)을 모니터링(monitoring) 하는 방법을 제공하며, 그 방법은 제 1 관측영역 내에 하나의 폴리머라아제(polymerase) 효소를 제공하며, 그 폴리머라아제와 제 1 형광 또는 형광발생 뉴클레오티드 유사체(nucleotide analog)를 접촉하여, 광 손상 허용시간 미만인 시간 동안 여기 방사선에 의한 조사에 응답하여 제 1 관측영역에 발광된 형광신호를 모니터링 하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 국면에서 본 발명은 광 손상 허용시간(photodamage threshold period)보다 더 긴 시간 동안 조사(illumination)할 때 광 손상에 감수성 있는 조사반응을 분석하는 시스템에 있어서 그 조사반응을 처리하는 시약을 가진 하나의 기질(substrate)과, 그 기질을 지지하며 그 기질을 수용하도록 구성된 하나의 장착 스테이지(mounting stage)와, 일부분(portion) 이상의 기질과 광 교통(optical communication)이 되도록 위치시켜 그 기질 일부를 조사하여 그 기질 일부에서 방사(emanating)하는 신호(signals)를 검출하는 하나의 광 트레인(optical train)과, 그 장착 스테이지 또는 광 트레인에 작동하도록 커플링(coupling)시켜 그 광 트레인과 기질 중 하나를 다른 하나에 대하여 이동하도록 하는 하나의 변환 시스템(translation system)을 구성하는 것을 특징으로 한다.

추가 국면에서, 본 발명은 효소반응을 실시하는 방법(methods)을 제공하며, 이들의 방법은 효소를 하나의 관측영역 내에 제공하여, 1종 또는 그 이상의 제 1 광 손상 완화제의 존재하에서 여기조사(excitation illumination)에 의해 그 효소와 그 효소에 쓰이는 하나의 형광기질 또는 형광발생기질(fluorogenic substrate) 을 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법이다.

본 발명의 방법(methods)은 하나의 염기 신장반응(base extension reaction)을 모니터링 하는데 사용할 수 있다.

이와 같은 경우, 이들의 방법은 하나의 관측영역 내에 하나의 폴리머라아제 효소를 제공하며, 그 폴리머라아제를 1종 또는 그 이상의 제 1 광 손상 완화제의 존재하에 하나 또는 그 이상의 제 1 형광 또는 형광발생 뉴클레오티드 유사체와 접촉하여, 여기 방사선(excitation radiation)에 의한 조사에 따라 그 관측영역에서 발광한 형광신호를 모니터링 하는 것으로 이루어진다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 제 1 효소와 그 제 1 효소에 사용하는 하나의 형광 또는 형광발생기질을 함유하는 하나의 반응 혼합물을 모니터링 하는 하나의 방법을 제공하며, 그 방법은 광 손상 허용시간 미만인 제 1 시간 동안 제 1 관측영역에 여기 방사선을 배향(directing)하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 광 손상 이벤트(photodamage events)를 활용하여 하나의 기질의 제 1 선택영역 내에 활성분자들을 국재(localization)하는 하나의 방법을 제공한다.

특히, 이와 같은 방법(methods)은 기질의 표면상에서 비선택적으로 활성분자들을 처리하는 하나 기질을 제공하며, 그 기질의 표면상에 하나의 광감작(photosensitizer agent)를 제공하는 것으로 이루어진다.

그 다음, 그 기질의 제 1 선택영역 이외 하나 또는 그 이상의 영역은 제 1 선택영역 이외 영역 내에 활성분자를 실활(deactivation)하기에 충분한 광감작제의 활성화에 충분한 광(light)에 노출시킨다.

동일하게, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 제 1 표면(first surface)을 가진 하나의 기질(substrate)과, 제 1 표면 상에서 비선택적으로 처리하는 활성분자(active molecules)와 제 1 표면상에서 처리하는 하나의 광감작제를 함유하는 디바이스(devices)를 제공한다.

또 추가로, 본 발명은 위에서 설명한 기질(substrate)의 제 1표면에 작용할 수 있게 커플링되고, 그 기질의 선택한 다른 영역을 조사하지 않고 광감작제를 활성화하는데 충분한 기질의 제 1 표면의 선택영역을 선택적으로 조사하도록 구성된 하나의 조사 시스템(illumination system)과 조합하여 상기 기질을 구성하는 하나의 시스템(system)을 제공한다.

또, 본 발명은 하나의 활성분자와의 반응을 분석하는 방법(methods)을 제공하며, 이들의 방법은 하나 또는 그 이상의 제 1 표면과, 제 1 표면 상에서 비선택적으로 처리되는 활성분자(active molecule) 및 제 1 표면 상에 처리되는 하나의 광감작제를 가진 하나의 기질(substrate)을 제공하여, 제 1 표면의 선택영역을 조사하여 광감작제를 활성화하고 선택영역에서 활성분자를 실활시키나 비선택영역에서 활성분자를 실활시키지 않으며, 활성분자의 반응을 비선택영역 내에서 관측하는 것으로 이루어짐을 특징으로 한다.

도 1은 형광 뉴클레오티드 유사체(fluorescent nucleotide analogs)를 사용 함과 동시에 여기 조사(excitation illumination)에 의해 주형 의존성 합성(template dependent synthesis)에서 DNA 폴리머라아제(polymerase)의 광 손상에 의한 제안 메카니즘(proposed mechansism)의 개략 설명도이다.

도 2A와 도 2B는 형광 뉴클레오티드 유사체의 존재하에서 레이저 여기 광(laser excitation light)에 의한 선택적 조사로 생성된 DNA 합성 생성물의 아가로스 겔(agarose gels)에 대한 화상(images)을 각각 나타내며, 서로 다른 광 손상 완화제의 존재와 부재(不在)하에 합성반응 혼합물의 생성물을 나타낸다.

도 3A, 3B 및 도 3C는 형광 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 하나의 평면상 기질 상에서 합성하고, 동시에 형광 뉴클레오티드 유사체의 여기 파장(excitation wavelengths)에서 선택적으로 조사한 DNA의 화상(image)을 각각 나타낸다.

서로 다른 광 손상 완화제의 존재와 부재(不在)하에서 그 반응 혼합물에 처리된 기질을 나타낸다.

도 3D는 광 손상 완화제의 농도 대(vs.) 백그라운드 정상화 강도 용량의 함수관계로 하여 플로팅한 도 3C의 화상 데이터 그래프를 나타낸다.

도 4A와 도 4B는 형광 뉴클레오티드 유사체를 사용하며 동시에 그 형광 뉴클레오티드의 여기 파장에서 레이저(lasers)로 선택 조사하여 제로모드 도파관(zero mode waveguides) 내에서 처리되고, DNA의 주형 배향 합성(template directed synthesis)에서 처리되는 고정화 DNA 폴리머다아제 효소를 가진 제로모드 도파관의 배열(arrays) 화상을 나타낸다.

도 5는 아세이 기질(assay substrates) 상에서 과잉 광 손상(excessive photodamage)에 대한 악영향을 회피하는 하나의 스텝(step) 및 반복 분석방법(repeat analysis method)에 대한 개략 설명도를 나타낸다.

도 6A와 도 6B는 하나의 비중첩 스텝(non-overlapping step) 및 반복 검색(repeat interrogation)과 하나의 스캔모드 검색(scan mode interrogation)의 개략적인 비교도를 나타낸다.

도 7은 소정의 본 발명을 실시하는 하나의 시스템의 개략 설명도를 나타낸다.

본 발명은 일반적으로 개량 조사반응의 실시방법(methods)에 관한 것으로, 특히 형광 반응물질 또는 형광발생 반응물질을 사용하여 이와 같은 반응에 존재한 여러 가지의 반응물질에 광 손상의 효과를 완화하거나, 광 손상을 감소하는 반응의 실시방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 이와 같은 광 손상을 방지 또는 감소하는 방법(methods) 및 전체 분석을 통하여 광 손상으로 초래할 수 있는 악영향을 완화하는 방법과 이들 방법의 조합을 포함한다.

본 발명이 일반적으로 화학제 그룹(chemical groups), 즉 플루오로포르(fluorophores)의 실질상 조사(illumination) 및/또는 광 활성 전환 또는 여기를 필요로 하는 여러 가지의 광 아세이(optical assays) 중 어느 하나에 적용될 경우, 광 손상으로 처리할 수 있는 반응물질의 극히 한정된 농도를 이용하는 분석에서 최대의 유용성을 발견하였다.

이와 같은 시약의 한정 분석에서 알 수 있는 바와 같이 하나의 중요한 시약의 분해(degradation)는 그 시약을 더 한정함으로써 분석에 현저하게 악영향을 미친다.

본 발명에 있어서, 용어 광 손상(photodamage)는 일반적으로 바람직한 반응에서 1종 이상의 시약에 대한 조사의 직간접적인 악영향을 주어, 그 결과, 그 반응에 부(negative) 영향을 제공한다.

이와 같이, 광 손상은 소정의 반응에서 주어진 시약의 반응성, 즉 형광분자의 광표백을 감소하거나, 또는 이와 같은 반응에서 유용성(usefulness)을 감소시키기 위한 소정의 시약에서 직접적인 광유도 변화(photoinduced change)를 포함한다. 그 시약은 그 소정의 반응에서 특이성이 덜하게 된다.

동일하게, 광 손상에는 그 시약과 또 다른 광유도 반응의 생성물과 상호작용에 의해 발생하는 하나의 시약에서 음성변화(negative changes)를 포함한다. 즉 형광 여기 이벤트 중에 일중항산소(singlet oxygen)의 발생을 포함한다.

그 일중항산소는 유기시약 또는 다른 시약, 즉 단백질을 손상시킬 수 있다.

본 발명에서 효과적인 분석 중 특히 적합한 하나의 예에는 특히, 단 분자 핵산 서열결정 분석(single molecule nucleic acid sequencing analyses), 단 분자 효소 분석, 혼성화 아세이(hybridization assays), 즉 항체 아세이(antibody assays), 핵산 혼성화 아세이 등을 포함하는 단 분자 생물학적 분석이 있으며, 여기서 1차적으로 중요한 시약은 비교적 집중된 광원, 즉 레이저(lasers) 또는 다른 집중 광원, 즉 수은, 크세논, 할로겐 또 다른 램프(lamps)로 관련 생성물의 발생과 함께, 광 변환(photoconversion)/여기(excitation)가 발생하는 환경(분위기)하에서 지연조사(prolonged illumination)를 시킨다.

핵산분석에 대하여, 기질로서 형광 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 핵산의 주형 배향 합성(template directed synthesis)에서 이와 같은 조건하에서 지연조사는 DNA(도 3A와 실시예 1 참조)를 합성하는 중합효소의 능력으로 실질상 분해된다는 것을 관측하였다.

중합효소, 주형 서열(template sequences) 및/또는 프라이머 서열(primer sequences)의 손상 또는 실할(inactivation)도 핵산의 비교적 긴 스트랜드(strands)를 처리하는 그 중합효소의 능력을 크게 감손(detraction)시킬 수 있다.

즉, 중합효소의 처리특성(processivity)의 이와 같은 감소는 미완성 스트랜드(nascent strand)의 결합에 기재로 되는 서열 성분(sequence constituents)을 동정하는 서열결정 프로세스에서 판독길이(read lengths)의 감소를 초래한다.

유전자 분석(genetic analysis) 기술에서 알 수 있는 바와 같이, 서열의 연속판독(contiguous reads) 길이는 게놈 DNA 의 세그멘트(segments)에서 게놈 정보의 집합능력을 직접적으로 악영향을 준다.

이 광 손상에 대하여 제안되어 있는 메카니즘은 도 1에서 나타낸다.

그 도면에서 나타낸 바와 같이 여기 파장(excitation wavelength)에서 전자방사선 조사(electromagnetic radiation)에 노출됨으로써 여기된 플루오로포어(fluorophore)가 삼중항 상태(triplet state)로 전이(transition)할 수 있다.

그 다음으로, 그 삼중항 상태의 플루오로포르의 연속적인 이완 처리(relaxation)로 반응성 산소 종의 발생을 유도할 수 있으며, 이것은 그 플루오로포어 또는 프루오로포어를 처리하는 효소, 즉 중합효소 중 하나 또는 둘 모두를 손상시킬 수 있다.

따라서, 산소 포착제(scavengers) 및/또는 환원제를 함유시켜 반응성 산소의 형성을 방지한다.

본 발명은 일반적으로 조사반응 분석(illuminated reaction analyses)의 실시에 관한 것으로, 이와 같은 분석에서는 효과적인 분석실시를 허용하도록 하는 허용시간 동안 조사(illuminated)한다.

특히 바람직한 국면에서, 조사분석(illuminated analysis)은 그 생성(production), 소비(consumption) 및/또는 발광, 즉 형광 반응물질 및/또는 생성물의 변환(conversion)을 평가하도록, 조사, 즉 여기 방사선 조사(excitation radiation)와 함게 동시에 발생하는 하나 분석반응이다.

여기서 사용되고 있는 바와 같이, 광 손상 전에 조사 분석을 실시할 수 있는 시간은 이와 같이 실질상 반응물질에 악영향을 주어 그 조사 분석의 실시에 비효과적으로 되어 이것을 광 손상 허용시간(photodamage threshold period)이라 한다.

본 발명의 용어(terms)에서, 그 광 손상 허용시간은 이와 같은 광 손상이 상기 조사가 없을 때 동일반응에 걸쳐 20% 또는 그 이상, 더 바람직하게는 50% 이상, 동일한 경우 90% 이상, 즉 반응계의 반응속도에서 90% 감소율 또는 소정의 시간 동안 생성물의 생성량에서 90% 감소율로 그 반응속도를 감소하도록 그 광 손상이 발생하는 동안 그 조사 분석시간으로 하는 것이 바람직한 것이다.

본 발명의 하나의 목적은 그 광 손상 허용시간 내에 조사 분석을 실시하는데 있다. 이 목적은 일반적으로 변형방법으로 달성한다.

첫째로, 본 발명 또는 본 발명의 국면에 따라, 상기 파라미터 내에서 소정의 반응의 실시에서는 그 광 손상 허용시간 미만인 시간 동안 반응 실시를 포함한다.

둘째로, 그 반응은 광 손상 허용시간을 증가하도록 구성할 수 있다.

또는 세째로, 그 광 손상 허용시간에는 이들의 접근방법의 조합을 포함할 수 있다.

상기 설명과 대조적으로, 일부 경우, "광 손상"(photodamaged) 반응은 의사활성(spurious activity)으로 처리할 수 있어 소정의 활성 보다 더 활성인 것으로 할 수 있다는 것을 알 수 있다.

이와 같은 경우, 관련된 광 손상 허용시간은 반응속도 증가 또는 비특이성 반응속도의 증가에 의해 측정되는 이와 같은 의사활성(spurious activity)이 비 조사반응 상에서 10% 미만이며, 비 조사반응 상에서 20% 미만이고, 비 조사반응 상에서 50% 미만이며, 일부 어느 경우 비 조사반응 상에서 90% 미만일 때 조사분석 시간(poriod)으로 하는데 그 특징이 있다는 것을 알 수 있다.

다만 실시예에 의해, 여기서 광 손상 이벤트에 의해 핵산 중합효소가 주형 배향 합성(template directed synthesis)을 할 때 뉴클레오티드의 부정확한 혼입을 개시하여, 이와 같은 활성은 위에서 설명한 바와 같이 광 손상 허용시간에 악영향을 준다.

위 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법과 조성물에 의해 예방되도록 하는 광 손상은 형광 시약에 대한 광 손상, 즉 광표백(photobleaching)만이 아니라, 그 대신 반응 혼합물 중에서 혼합량을 한정시킨 형광 시약에서 다른 시약까지의 광 활성화에 대한 정체효과(downstream effects)의 예방 또는 감소에 관한 것으로, 이들의 한정된 존재는 광 손상 때문에 약간의 손상(loses)에 의해 더 크게 악영향을 주며, 특히 반응성 단백질 또는 효소는 작용(operation)에 대한 이론에 구속됨이 없이 그 효소 또는 반응성 단백질에 대한 손상 또는 이와 같은 효소 또는 단백질과 광 손상 시약 간의 불가역성 상호작용(irreversible interactions)을 포함한다.

상기 기재 설명에 의해 나타낸 바와 같이 광 손상은 일반적으로 주어진 시약, 반응물질 등에 의해 하나의 변형(alteration)을 말하며, 그 변형은 이와 같은 시약을 소정의 반응에서의 기능성, 즉 활성감소, 특이성(specificity) 감소 또는 또 다른 분자에 작용하여 변환 또는 변경하도록 하는 능력 감소를 변형(alteration)시켜 그 결과, 직접 또는 간접적으로 광 유발반응(photo-induced reaction)을 얻는다. 즉 광 유발반응은 1종 이상의 다른 반응물질과 상호작용하여 손상을 발생하는 하나의 반응물질을 생성한다.

일반적으로, 이와 같은 광 반응(photoreaction)은 관련되어 있는 그 반응물질에 직접 악영향을 준다. 즉, 직접 광 손상을 주거나, 또는 관련되어 있는 이와 같은 반응물질의 1, 2 또 3개의 반응 스텝에서 하나의 반응물질에 악영향을 준다.

여기서 일반적으로 설명한 바와 같이, 이와 같이 한정된 양의 시약 또는 반응물질은 용액 중에 존재할 수 있고 극히 한정된 농도, 즉 200nM 미만, 어느 일부 경우에 10nM 미만, 또 다른 경우 10pM 미만으로 존재할 수 있다.

그러나, 바람직한 국면에서, 이와 같은 한정된 양의 시약 또는 반응물질은 고정화(immobilized)되어 있거나 또는 주어진 영역 내에서 한정되어 있는 반응물질로, 그 주어진 영역 내에서 한정된 양의 시약을 제공하며, 어느 경우에는 그 주어진 영역 내에서 이와 같은 시약의 분자의 작은 수, 즉 각각 1 ~ 1000개의 분자, 바람직하게는 1 ~ 10개의 분자를 제공한다. 주어진 영역 내에서 고정화된 반응물질의 광 손상은 다른 비 손상 반응물질이 그 영역 내에서 유리하여 확산되지 않을 때 그 영역의 반응성에 실질적으로 악영향을 주어, 그 광 손상 효과를 차폐한다.

연구자들은 플루오로포어(fluorophore)에 광 손상을 한정시키는 방법과 조성물을 제공한바 있었다.

그러나, 형광 시약의 광 파괴(photodestruction)의 존재하에 또는 그 당 파괴 결과 얻어진 효소계(enzymatic systems)에서 하류(downstream) 광 손상의 악(negative)영향에 대하여 용이하게 인식하거나 역점을 두고 처리한바 없다.

설명을 용이하게 이해하기 위하여, 그 광 손상 이벤트(photodamage event)의 유해한 영향은 소정의 시약에 대한 실제 손상 또는 손상 시약과의 상호작용의 결과 여하에 따라 일반적으로 광 손상이라 한다.

Ⅰ. 광 손상( photodamage )의 예방

첫째 국면(aspect)에서, 본 발명은 조사(illumination) 중에, 즉 하나의 여기 방사선 조사원(excitation radiation source)으로 1종 이상의 비형광 반응물질에 조사를 하여 얻어진 광 손상 량을 감소하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

특히, 상기 조성물이 없을 때 상기 반응과 대비할 때 광 손상량 레벨(또는 광 손상 허용시간의 증가)에서 감소를 얻는 조성물을 제공한다.

여기서 사용한 바와 같이, 상기 효과를 제공하는 조성물의 성분은 일반적으로 광 손상 완화제(photodamage mitigating agents)라 한다.

특히, 광 손상 완화제는 분석반응에서 제공되어 광 손상 레벨을 감소하며(및/또는 광 손상 허용시간(photodamage threshold period)을 증가한다). 그외 다른 방법으로 이것은 그 광 손상 완화제의 존재하에서만 발생한다.

또, 광 손상 완화제로서 약제(agent)의 정의는 실제의 광 손상 이벤트(event)에서 상기 완화제가 가진 영향 또는 그 광 손상의 하류영향(downstream impacts)을 일반적으로 반영한 것이다.

이와 같이, 하나의 광 손상 완화제는 1종 이상의 시약의 광 손상을 방지할 수 있고, 또 광 손상 시약이 관련된 반응에서 하나의 특정의 한정된 시약에서 가질 수 있는 영향을 완화할 수 있다.

실시예에 따라, 하나의 광 손상 형광 화합물과 하나의 중요한 효소성분 사이의 유해한 상호작용을 차단(blocking)하는 하나의 약제(agent)를, 그 형광 시약의 초기 광 손상을 방지하지 않은 사실과 무관하게 하나의 광 손상 완화제로 한다.

하나의 광 손상 완화제를 함유(inclusion) 하거나 처리한 결과 광 손상의 감소 측정은 하나의 미처리 반응에서 광 손상 레벨의 감소를 제공하여 캐릭터리제이션(특성 해석)(characterization)을 할 수 있다.

또, 광 손상 감소의 캐릭터리제이션은 일반적으로 하나의 처리반응 혼합물과 하나의 미처리 반응 혼합물 사이에서 반응속도(reaction rate), 즉 효소 활성의 대비 및/또는 광 손상 허용시간(photodamage threshold period)의 대비를 이용한다.

본 발명의 경우, 본 발명의 광 손상 완화제를 함유(inclusion)하여 그 계(system)에서 반응성, 즉 효소 활성의 손실(loss)을 예방함으로써 그 광 손상이 10% 또는 그 이상 감소, 바람직하게는 20% 이상 감소, 더 바람직하게는 약 50% 이상 감소, 대부분의 경우 90% 이상, 99%까지와 그 이상 감소하는 것으로 측정되었을 때, 하나의 주어진 반응에서 1종 이상의 반응물질의 광 손상 감소를 일반적으로 얻는다.

조사(illustration)에 의해, 또 실시예에서, 광 손상 완화제의 존재와 부재(不在) 하에서 효소활성의 측정에서 같이 광 손상의 감소를 설명할 때, 하나의 반응이 효소활성 100 단위를 가진 반응 혼합물을 포함할 경우 광 손상 완화제 없이 조사 분석을 하여 효소활성 50 단위 미만을 가진 반응 혼합물을 얻으며, 그 다음 광 손상 10% 감소는 55단위의 최종 반응 혼합물에서 얻었다(즉, 다른 방법으로 하여 효소활성 50 단위 혼합물에서 광 손상 10% 감소가 상실되었고, 더 이상 상실되지 않았음).

하나의 특정이론 또는 조작 메카니즘에 구속됨이 없이, 특히, 형광시약의 존재하에서 효소활성에 대한 광 유발손상의 하나 이상의 원인은 광 손상 형광시약과 효소의 직접적인 상호작용 결과에서 비롯된 것으로 본다.

또, 형광시약의 이 광 손상(및 효소에 대한 추가 손상 가능성)은 분자 산소의 존재하에서 3중항 상태(triplet state)의 플루오로포르(fluorophores)가 이완(relaxation) 중에 있을 때 발생하는 반응성 산소 종에 의해 부분적으로 매개(mediation)되는 것으로 본다.

광 손상의 모든 유해효과 중에는 광 손상 형광시약 및/또는 반응성 산소 종 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.

따라서, 제 1 국면에서 본 발명은 상기 광 손상(photodamage)으로 유도하는 경로를 차단(blocking)하거나, 또는 이와 다른 방법으로 최소화하도록 작용하는 1종 이상의 약제(agents)의 조사 반응 혼합물 중에서의 봉입체(inclusion)에 관한 것이다.

이와 같은 약제(agents)에는 환원제 또는 소실 방지제(anti-fade agents)를 포함하여, 3중항 상태 플루오로포르(triplet state fluorophores)[또는 3중항 상태 소광제(triplet state quenchers)라고도 함]와 산소 포착제(oxygen scavenging agents)의 형성을 방지하며, 그 산소 포착제는 산소와 반응성 산소 종을 반응 혼합물에서 제거하여 그 계(system) 중에서 효소의 하류 손상을 방지한다.

다수의 여러 가지의 환원제 또는 소실 방지제는 3중항 상태 소광제로서 사용할 수 있으며, 예로서 아스코르브산, 디티오트레이톨(DTT), 메르캅토에틸아민(MEA),

-메르캅토에타놀(BME), n-프로필갈레이트, p-페닐렌디아민(PPD), 히드로퀴논. 소듐아지드(NaN₃), 디아조비시클로옥탄(DABCO), 시클로옥타테트라엔(COT)과, 시중 상품으로 입수할 수 있는 소실 방지제(anti-fade agents)로 Fluoroguard(미국 캘리포니아주 Hercules 소재 BioRad Laboratories, Inc., 제조회사 제품), Citifluor antifadants(영국 런던 소재 Citifluor, Ltd, 제조회사 제품), ProLong, slowFade 및 SlowFade Light(미국 오레곤주 Eugene 소재, Invitrogen/Molecular Probes 제조회사 제품)을 포함한다.

동일하게, 다수의 단중항 산소 소광제(singlet oxygen quenchers))를 사용하여 반응성 산소 종을 제거 또는 감소할 수 있으며, 예로서 효소계(enzymatic systems), 즉 과산화물 분자 변위보 효소(superoxide dismutase), 글루코오스옥시다아제(oxidase)/카탈라아제(catalase)(GO/Cat), 옥시다아제/퍼옥시다아제 효소계, 즉 글르코오스옥시다아제, 알코올옥시다아제, 콜레스테롤옥시다아제, 락테이트(lactate)옥시다아제, 피루베이트옥시다아제, 크산틴옥시다아제 등, 고추냉이의 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)(HRP), 글루타티온퍼옥시다아제 등 과산화물 결핍 효소(depleting enzyme)와의 조합, 또는 이들 효소와 다른 효소의 조합, 프로토카타카우트(protocatachaute) 3,4-디옥시게나아제(PCD)(하나의 단일 효소 산소 소비제:single enzyme oxygen consumer), 또는 티올 기재 소광제(thiol based quenchers), 즉 에르고티오네인(ergothioneine), 메티오닌, 시스테인, 베타-디메실시스테인(페니실라민), 메르캅토프로피오닐글리신, 메스나(MESNA), 글루타티온, 디티오트레이롤(하나의 환원제로서 위에서 기재한 것과 같이), N-아세틸 시스테인 및 캅토프릴(captopril)(즉, Biochem. Soc. Trans. 1990, Dec; 18(6): 1054-6 참조), 이미다졸을 포함한다.

또, 생물학적인 단중항 산소 소광제(singlet oxygen quenchers)는 리코펜(lycopene),

,

및 r-카로텐 및 이들의 유사체(analogs), 안테라크산틴, 아스타크산틴, 칸타크산틴(카르시노게네시스(Carcinogenesis) vol. 18 no. 1. pp. 89-92, 1997), 뉴로스포렌(neurosporene) 로도핀, 빅신(bixin), 노르빅신(norbixin), 제악산틴(Zeaxanthin), 루테인(lutein), 빌리루빈(bilirubin), 빌리베르딘 및 토코페롤(Biochem, Soc Trans. 1990 Dec; 18(6): 1054-6 ref 참조)과 폴리엔디알데히드(Carcinogenesis vol. 18 no. 1 pp. 89-92, 1997 참조), 멜라토닌, 비타민 E(

-토코페릴숙시네이트 및 그 유사체) 및 비타민 B₆(피리독시넬 및 그 유도체) 등을 사용할 수 있다.

또 다른 화학적 산소 포착제(scavengers), 즉 히드라진(N₂N₄), 소듐술파이트(Na₂SO₃), 히드록실아민, 글루타티온 및 N-아세틸시스테인, 히스티딘, 트립토판 등을 이용할 수 있다.

상기 화합물 이외에, 대부분의 경우 단중항 산소 소광제 또는 포착제의 양은 관련 반응에서 산소를 물리적으로 제거함으로써 감소시킬 수 있고, 또는 배출할 수 있다. 즉 시약의 탈기(degassing), 불활성 가스의 살포(perfusion)에 의해 감소 또는 제거할 수 있다.

상기 화합물 이외에, 상기 화합물에 추가 화합물 또는 대치 화합물로서, 항산화제는 또 예로서 트롤록스(Trolox) 및 그 유사체 U-78715F와 WIN62079, 하나의 카르복실 치환을 갖거나 또는 그 유사체의 경우 비타민 E 피틸 측쇄 대신에 다른 치환을 가진 비타민 E의 가용형태, 아스코르브산(또는 아스코르베이트), 부틸레이트 히드록시톨루엔(BTH) 등을 포함하며, 그 반응 혼합물 중에 함유할 수 있다.

본 발명에 의해, 광 손상 완화제는 액상 또는 고상의 하나의 첨가제로서 첨가에 의해, 또는 반응이 발생하는 영역 내에서 광 손상 완화제의 사전설정(predisposition) 및/또는 고정화(immobilization)에 의해 일반적으로 반응 혼합물 중 하나의 성분으로 함유할 수 있다.

예로서, 그 관련 반응이 하나의 특정영역 또는 위치로 한정될 경우 그 영역 내 또는 그 영역 인접면에 광 손상 완화제를 고정화하거나 또는 다른 방법으로 위치설정하는 것이 바람직하다.

동일하게, 광 손상 완화제가 협조할 수 있도록 기능적 작용을 하는 성분, 즉 이중 효소계(dual enzyme systems)을 함유할 경우, 또 이와 같은 성분들을 서로 간에 그리고 관련 반응에 따라 위치 설정하는 것이 바람직하다.

어느 일부의 경우에, 그 광 손상 완화제를 함유하여 이들의 유용성을 강화하도록 할 수 있다.

예에서, 어느 일부의 경우 그 광 손상 완화제의 용해도가 수용성계에서, 즉 다수의 카로테노이드(carotenoids)의 경우에서 이상적인 용해도 미만이다.

이와 같이, 이들의 성분들은 기질(subsrates) 표면 또는 반응에서 고정화시켜 함유할 수 있거나, 또는 수용성계 성분, 즉 포착산소(scavenging oxygen) 등과 자유롭게 상호작용을 하도록 하는 구성배치(configuration)에서 이와 같은 약제를 수용성계 중에 현탁하도록 하는 케이징 그룹(caging groups) 내에 상기 약제를 포함시켜 구성할 수 있으며, 반응 혼합물의 관련부분, 즉 용해 산소 종과 상호작용할 수 있도록 하여 추가로 이용할 수 있다.

하나의 관련 국면에서, 하나의 변형 예로서 광 손상의 완화 또는 그 악영향에 대하여 여기서 설명한 스텝 중 어느 하나 이외에 본 발명은 또 다른 수단을 통하여 잠재적으로 손상을 주는 산소 종의 제거에 대하여 제공한다.

특히, 다른 계(system)와 함께 용존 산소 종은 서로 다른 가스 환경(분위기) 하에서 그 반응계를 제공함으로써 수용성계에서 풀러싱(flushing)할 수 있다.

예로서, 특히 이것은 아르곤, 질소, 헬륨, 크세논 등 중성가스 환경(분위기)에 그 수용성 반응상태를 노출하여 그 반응 혼합물 중에서 과잉 산소의 용해를 방지할 수 있다.

예(system)의 초기 산소부하를 감소시킴으로써 광 손상 효과, 즉 중합효소(polymerase) 중개 DNA 합성에서 광 손상 효과가 현저하게 감소된다는 것을 특정하였다.

특히 바람직한 국면에서, 그 계(system)는 크세논 가스 환경(분위기)에 살포하거나, 또는 그외 다른 방법으로 그 크세논 가스 환경(분위기)에 노출시킨다.

특히, 크세논은 쌍극자(dipole)를 형성하도록 유도할 수 있어, 그 수용성계에서 산소의 탈취(supplanting) 이외에 3중항 상태 소광제로서 작용할 수 있다(즉, Vierstra and Poff, Plant Physiol. 1981 May; 67(5): 996-998 참조).

이와 같이, 또 크세논은 위에서 설명한 바와 같이 하나의 소광제(quencher)로서 분류할 수도 있다.

Ⅱ. 광 손상 악영향( photodamage impacts )의 완화( mitigation )

본 발명은 광 손상 완화제의 사용을 대비하거나 또는 그 사용 이외에, 또 과잉의 광 손상이 발생하기 전, 조사기간 동안에 반응 혼합물의 검색, 즉 형광발광(fluorescent emission)의 검색만으로 하여 소정의 분석 조작 결과 광 손상의 악영향을 완화하는 방법을 제공한다.

이와 같은 접근방법은 특히 구조상의 차단(structural confinements) 및/또는 구성성분의 고정화를 통하여 아세이플레이트(assay plate) 또는 기질 상에서 광 손상에 민감한 반응성분들을 공간적으로 제한시키는 반응의 광 검색(optical interrogation)에 특히 유용하다.

이와 같은 차단 시약(confined reagents)의 예에는 표면 고정화 또는 위치설정 시약, 즉 표면 고정화 또는 표면 연관 효소, 항체 등으로, 그 표면상에서 검색한다. 즉, 형광주사 현미경(fluorescence scanning microscopy), 또는 주사 동초점 현미경(scanning confocal microscopy), 총내부 반사 현미경(total internal reflectance microscopy) 또는 형광 측정(fluorometry), 표면 화상 진단(surface imaging) 등을 통하여 검색한다.

여기에 사용되는 바와 같이 하나의 기질(substrate)은 평면상 기질, 즉 글라스 슬라이드(glass slides) 또는 비교적 큰 구조 내의 평면상 표면, 즉 96웰(well), 384웰 및 1536웰 플레이트 등 하나의 멀티웰 플레이트(multiwell plates) 또는 일정하게 간격을 둔 마이크로 또는 나노 다공성 기질(porous substrates)에서 여러 가지의 포맷(formats) 중 어느 하나로 이루어지거나, 또는 이와 같은 기질은 막(membranes), 에어로겔(aerogels), 섬유상 맷(fibrous mats) 등 더 불규칙적인 다공성재(porous materials)로 구성할 있거나, 또는 이들의 기질은 입자상 기질, 즉 비드(beads), 구(spheres), 금속 또는 반도체 나노 입자 등으로 구성할 수 있다.

또, 하나의 특정 시약이 구조상에서의 배리어(barriers)에 의해 그 자유운동에 제한을 받거나, 또는 하나의 기질의 표면에 화학적으로 구속하거나 고정화시키는지의 여부에 따라, 여기서는 "차단"(제한)(confined)으로 설명한다.

예로써, 이와 같은 광 손상이 발생할 수 있고 그 효소가 하나의 기질 표면 상에서 고정화되는 효소반응을 검색할 때 하나의 특정영역의 지연노출(prolonged exposure)은 그 영역 내에서 고정화된 효소에 광 손상을 얻거나 또는 "발광"("burning in")을 얻는다.

다수의 경우, 관련된 반응을 포함하여 하나의 기질의 선택영역은 검색을 한다. 이와 같은 영역을 "관측영역"(observation region)이라 한다.

본 발명에 의해, "발광"(burn in) 또는 이와 같은 발광의 효과는 서로 다른 관측영역에서 조사하여 발광신호를 수집함으로써 감소 또는 제거한다.

설명을 용이하게 하기 위하여, 하나의 관련 반응 또는 관련 반응이 발생하는 하나의 특정 관측영역에서 조사하여 발광신호를 수집하는 작용을 그 반응 및/또는 그 영역의 검색을 하는 것으로 한다.

위 설명에서 이해할 수 있는 바와 같이 하나의 기질의 하나의 새로운 관측영역의 검색에는 새로운 조사영역에서 하나의 영역을 새로 조사하여 발광신호를 수집하는 것으로 이루어진다.

즉, 바꾸어 말하면, 검색이 하나의 새로운 조사영역의 검색이면 다음에 그 영역의 검색으로 되돌아가지 않을 경우 그 발광영역(burned region)이 아직도 조사되고 있는지의 여부는 중요하지 않다.

광 손상을 감소하는 이점 이외에, 하나의 기질의 서로 다른 영역을 비교적 짧은 시간에 걸쳐 검색하는 프로세스에서는 또 그밖에 다른 방법으로 그 조사의 특성을 변형함이 없이, 즉 그 조사각도를 변동시켜 레이저 스폿 사이드(laser spot size) 즉, 하나의 연장된 레이저 스폿 사이드(특허문헌 U.S. 특허출원 6,881,312 참조)를 제공하여 확대하거나, 또는 그 기질에 입사광 스폿(incident light spot)의 형상을 변형(alteration)하는 하나의 광 트레인(optical train)을 통하여, 즉 하나의 라인 포맷(line format)에서 조사를 제공하는 하나의 원통형상 렌즈를 제공하여 그 조사를 통과하거나, 또는 그밖에 다른 방법으로 그 조사를 재초점 조정(refocusing)하여 하나의 확대 스폿 사이즈 또는 디멘션(dimension)을 제공하는 것은 하나의 소정 광원으로 비교적 큰 기질영역을 검색할 수 있는 이점을 제공한다.

상기 기질 설명에서 본 발명은 하나의 확대 조사영역을 제공하는 상기 광학기계기구(optics)와 선택적으로 조합한다는 것을 알 수 있으며, 그 확대 조사영역은 이와 같은 확대 조사 프로파일이 그 기질 상에서 이동하여 그 기질의 서로 다른 영역을 짧은 시간에 걸쳐 검색하는 포르세스 이외에 선택적으로 사용한다.

도 5는 하나의 기질의 서로 다른 영역을 비교적 짧은 시간에 걸쳐 검색을 하기 위하여 관련 반응을 실시할 때 하나의 기질 상에 하나의 검색 스폿 영역의 이동을 나타낸 것이다.

위 기질에서 알 수 있는 바와 같이 그 기질 상에 하나의 선상 조사 스폿을 사용하여 도 5에서 나타낸 원형상 스폿보다 더 큰 기질의 영역을 더 신속하게 조사한다.

도 5에서 나타낸 바와 같이, 예로 나타낸 기질은 크기가 더 작은 구조의 구성요소[제로모드(zero mode) 도파관(waveguides)의 형태에서 광 차단 구성요소(optical confinements)로도 작용 함]의 다수 배열로 이루어지며, 여기서 각각의 배열 또는 배열의 서브셋(subset)에는 하나의 분리식 차단 구성요소, 즉 하나의 멀리웰 기질 또는 플레이트 내 하나의 웰(well) 내에 포함되어 있다.

위 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 그 검색 작동은 일반적으로 주어진 영역에서 광 손상 허용시간(photodamage threshold period)보다 더 길지 않는 연장시간 동안에 실시한다.

일반적으로, 이것(검색 작동)은 10초 이상, 바람직하게는 1분 이상, 더 바람직하게는 5분이상, 10분 이상, 20분 이상, 일부 어느 경우에 2시간 이상 또는 3시간 또는 그 이상의 시간이나, 아직도 광 손상 허용시간 미만이다.

그 기질(substrate)의 영역 상에서 그 검색영역을 이동하여 추가 검색영역을 얻는 것 이외에, 또 그 영역을 이동하는 그 이동능력은 하나의 특정 시스템 또는 장치에서 그 기질의 기계적인 계면을 조정하는 조정능력을 제공하여, 그 특정 시스템 또는 장치에서 다른 방법으로 하여 검색할 수 없는 검색에 대하여 이들의 영역이 이용할 수 있도록 한다.

특히, 하나의 일반적인 기질 분석 설치(set-up)에 있어서 분석되는 하나의 기질을 하나의 분석 스테이지(analysis stage) 상에 고정시켜, 그 기질의 부분들(portion)은 그 분석 스테이지, 즉 클립(clips), 지지 구조체 등의 설정 구조물에 의해 검색을 차폐시킬 수 있다.

그러나, 본 발명의 어느 국면에 따라, 그 검색영역의 이동은 그 설정 구조물에 의해 차폐된 기질의 부분들을 단시간에 걸쳐 변경할 수 있는 능력을 제공한다.

하나의 제 1 예에서, 그 기질의 주어진 영역에 조사를 제공하는 옵티컬 트레인(optical train)을 이동시키는 것보다 오히려, 그 기질을 그 검색 광학기계기구에 대하여 이동할 수 있다.

이것은 여러 가지의 조작 하드웨어(manipulation hardware) 또는 로봇장치(robotic set-ups) 중 어느 하나를 사용하여 달성할 수 있다.

예로서, 하나의 스텝퍼/피더장치(stepper/feeder apparatus)를 사용하여 그 장치에서는 그 옵티컬 트레인(optical train)의 검색영역을 통하여 정밀하게 그 기질을 스텝팅(stepping)한다.

이와 같은 정밀 피더장치(precise feeder apparatus)는 고성능 프린팅 기술과 반도체 산업에서 사용되는 변환 로봇(translational robotics), 즉 분석 및 제조 응용분야에서 공지되었다.

이와 같은 스텝퍼/피더장치(stepper/feeder apparatus)에는 하나의 롤러(roller) 또는 피일(wheel) 조립체를 구비하여 그 조립체는 전체의 기질의 상부면과 접촉하면서 회전하여 원동력(motive force)을 그 기질에 정밀하게 제공하며, 그 옵티컬 트레인의 검색영역(zone)을 통하여 그 기질을 공급(feeding)한다.

본 발명의 또 다른 변형 국면에서, 로봇 시스템을 사용하여 그 기질 표면의 서로 다른 영역을 검색하기 위하여 하나의 주어진 기질을 픽업(pick-up)하여 재배열(re-orientation)하거나, 또는 사전에 접근할 수 없는 그 기재의 영역을 접근할 수 있도록 한다.

이와 같은 로봇 시스템은 일반적으로 제작업자(Beckman, Inc., Tecan, In., Caliper Life Sciences 등)의 제품에서 입수하여 이용할 수 있다.

본 발명에 의해, 하나의 제 1 관측영역 내에서 관련 반응을 본 발명에서 설명한 바와 같이 광 손상 허용시간 미만인 시간 동안 검색하고, 그 다음 서로 다른 제 2 관측영역에서 관련 반응을 검색한다.

본 발명에 의해, 그 관측에는 일반적으로 광 손상에 민감한 차관시약(confined reagents)을 포함한다.

이와 같이, 하나의 관측영역에는 시약, 즉 효소를 고정화한 하나의 평면상 기질 표면 또는 다른 기질 표면의 영역을 포함할 수 있다.

또 변형 예로서, 그 관측영역에는 광 손상에 민감한 시약을 차단하는 하나의 물리적 차단 구성요소(physical confinement)를 포함할 수 있다. 즉, 시약을 차단하는 소수성 배리어를 포함하는 평면상 표면, 마이크로웰(microwells), 나노웰(nanowells)을 포함하다.

위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 반응진행에 따라 광 손상이 크게 악영향을 주는 농도 또는 레벨에서 광 손상 민감 시약이 존재하는 관측영역에 특히 적용할 수 있다.

이것은 특히, 어느 광 손상 시약이라도 악영향을 차단하는 벌크용액(bulk solution) 중에 과잉량의 시약을 추가로 함유할 수 없는 고정화된 반응계의 경우이다.

서로 다른 관측영역의 연속검색(sequential interrogation)은 일반적으로 상당히 많은 회수, 즉 10회 이상, 100회 이상, 1000회 이상 또는 10,000회 이상까지도 관측영역이 잔류하는 동안 반복할 수 있다.

복수영역(multiple regions)의 이용율(availability)은 하나의 개별 관측영역(discrete observation region)의 사이즈에 의해서만 일반적으로 한정되어 있고, 그 개별 관측영역은 하나 이상 사용되는 어느 차단 구조체의 특성과 디멘션(dimensions), 조사 스폿 사이즈(illumimation stot size) 및 분석 기질의 전체 면적에 의해 구성할 수 있다.

일반적으로, 그 검색영역을 또 다른 바람직한 인접영역으로 스텝핑(stepping)하여 그 검색 프로세스를 반복하는 이 방법을 "스텝(step) 및 리피트(repeat)" 방법이라 한다.

"스텝(step)" 및 리피트(repeat)" 방법으로 설명하였으나, 그 검색영역이 하나의 기질을 횡단하면서 이동하는 일부 예에서, 그 이동은 단계식(step-wise)이나 반복식(itertive)이 아니나, 그 대신 연속운동, 실질상 연속운동 또는 단계식 운동 또는 반복식 운동으로 이루어짐으로써, 각각의 반복 단계에서는 그 기질을 횡단하는 검색영역 또는 사전에 검색한 영역의 어느 일부와 함께 중첩(overlapping)하는 하나의 새로운 영역을 검색한다.

특히, 하나의 기질이 하나의 광학 시스템의 검색영역(zone)을 통하여 연속적으로 이동할 수 있어, 그 검색영역은 ("주사모드"(scan mode)에서) 검색되는 기질을 횡당하면서 연속적으로 이동한다.

본 발명의 바람직한 국면에 따라, 그 검색영역의 이동속도는 하나의 주어진 반응영역(reaction zone)에서 주어진 시간에 의해 나타낸다. 즉, 하나의 구조 또는 광 차단 구성요소(optical confinement), ZMW 등은 광 손상 허용시간 미만인 시간동안 그 검색영역 내에서 머무는 것(staying)이 바람직하다.

도 6A는 하나의 원형조사 스폿(circular illumination spot)을 사용하여 하나의 비중복(non-overlapping) 스텝 및 리피토 검색방법의 개략 설명도를 나타낸다.

도 6A에서 나타낸 바와 같이, 배칭(batching)에 의해 나타낸 그 기질 표면의 어느 일부분은 검색 처리되어 있지 않다.

그러나, 도 6B에서는 하나의 주사(scanning) 또는 중복(overlapping) 스텝핑 프로세스를 사용하여 그 표면적의 더 큰 부분을 검색한다.

도 7은 본 발명에 의해 기질 상에서 스텝 및 이동조작을 실시하는데 유용한 하나의 전체 시스템(overall system) 700의 개략 설명도이다.

도 7에서 나타낸 바와 같이, 하나의 반응 기질(reaction substrate) 702를 병진운동 스테이지(translation stage) 704 상에 설정한다.

그 병진운동 스테이지 704는 일반적으로 적합한 로봇장치(robotics)(개략적으로 아마춰(armature) 706에 의해 나타냄)에 커플링(coupling)되어 있으며, 그 로봇장치는 하나의 고정식 광 트레인(fixed optical train) 708 상에 2차원(x 및 y)에서 그 반응기질 702의 횡병진운동(lateral translation)을 제공한다.

그 반응기질의 병진운동에 커플링되어 병진운동을 하는 것으로 그 도면에 나타내었으나, 또 다른 변형구성이 병진운동 시스템에서 그 광 트레인에 커플링되어 그 반응기질에 대한 그 시스템의 국면(aspect)을 이동시킬 수 있다.

그 광 트레인 708은 그 반응기질을 검색하는데 유용한 여러 가지의 다른 구성요소를 구성하며, 적합한 여기 광원(excitation light sources), 즉 레이저 718, 초점조정(focusing) 및 필터링(filtering)을 하는 광학기계기구, 즉 이색성 미러(dichroic mirror) 720, 대물렌즈(objective lens) 710, 이미징렌즈(imaging lens) 712, 프리즘(prism) 714 및 디텍터(detectors) 또는 디텍터 아레이(detector arrays), 즉 디렉터 아레이(detector array) 716을 포함한다.

특히 바람직한 하나의 광 트레인(optical train)의 하나의 예는 특허문헌으로 미국 특허출원 11/201,768(2005.08.11 출원) 명세서에 기재되어 있으며, 여기서 참고로 인용하여 편집한다.

Ⅲ. 대표적인 응용( exemplary applications )

위에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법(methods)과 조성물(compositions)은 광 검출분석반응과, 특히 포토루미니센트(photoluminescent) 또는 형광 반응물질을 사용하는 반응과, 특히 광 손상에 민감한 시약이 비교적 낮은 농도에서 존재하는 상기 반응의 넓은 범위에서 유용하다.

여기서 설명한 방법과 조성물의 하나의 대표적인 응용은 단분자 분석반응(single molecule analytical reactions)에서 존재하며, 여기서 극히 한정된 단일수의 분자들의 반응은 하나의 단일효소분자의 작용 관측 등 그 분석에서 관측한다.

특히, 하나의 분석이 하나의 적은 그룹의 시약분자에 의존될 때, 그 그룹(군)의 어느 중요한 프랙션(fraction)은 실시하는 분석에 실질적으로 악영향을 준다.

하나의 단분자 분석의 하나의 예에는 주형 배향 폴리머라아제기질 합성(template directed polymerase based synthesis)을 할 때 하나의 인접 핵산 서열에 뉴클레오티드의 결합을 측정하여 핵산의 서열을 결정하는 것을 포함한다.

이와 같은 방법들은 일반적으로 "결합에 의한 서열결정"(sequencing by incorporation)"이라 하며, 주형 스트랜드(template-strand)의 서열을 결정하기 위하여 하나의 주형 의존성 방식에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체(analogs)의 부가의 관측을 포함한다.

이 검출을 실시하는 다수의 프로세스에는 하나의 차단 관측영역(confined observation region), 즉 하나의 나노스케일웰(nanoscale well) 내에 또는 하나의 표면에 직접 또는 간접적으로 차단(tether)된 형광 표지 뉴클레오티드 유사체의 사용을 포함한다.

그 초기 스트랜드(nascent strand)에 결합되거나, 또는 결합되도록 하는 형광염기(fluorescent bases)를 조사 또는 검출함으로써 그 염기, 결과적으로 그 주형 스트랜드에서 상보성 염기의 특성을 확인할 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 하나의 국면(aspect)은 하나의 제로 모드 도파관(zero mode waveguide) 등 하나의 광 차단 구성요소(optical confinement) 내에서 핵산의 결합에 의한 서열결정(sequencing)에 관한 것이다. 여기서 1종 또는 수종의 폴리머라아제 효소 및 이들의 형광기질만이 존재할 수 있는 극히 적은 양의 반응용량을 관측한다.

서열결정 응용에서 제로 모드 도파관과 이들의 사용은 일반적으로 특허문헌 USP 6,917,726 명세서에 기재되어 있으며, 결합에 의한 서열결정의 바람직한 방법은 일반적으로 특허문헌 미국 특허출원 2003-0044781(공개) 명세서에 기재되어 있고, 그 명세서의 개시 내용 전부를 참고로 여기서 인용하여 설명한다.

위 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 한정되어 있는 그룹의 시약, 즉 형광 유사체와 차단(confined) 폴리머라아제 효소의 지속검색(prolonged interrogation)으로 여러 가지의 시약이 광 손상으로 유도되어 그 폴리머라아제 효소의 활성 또는 기능성에 실제적으로 악영향을 주게 된다.

특히, 형광 뉴클레오티드 유사체를 사용하는 합성에서 관련된 DNA 폴리머라아제의 지속조사는 DNA를 합성하는 그 효소의 합성능력에서 현저하게 감소된다는 것을 나타낸다.

어느 조작 원리에 구속하지 않고, 그 광 손상 이벤트(event)는 그 효소의 접촉영역에 악영향을 주어, 최종적으로 그 주형(template)과 합성하는 그 효소의 능력 또는 추가합성을 처리하여 진행하는 그 효소의 능력에 악영향을 주는 것으로 본다.

본 발명에 의해, 위에서 설명한 서열결정 반응은 위에서 설명한 바와 같이, 1종 또는 그 이상의 광 손상 완화제의 존재하에서 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 국면에서, 그 서열결정 반응은 DTT, MBA 또는 BME 등 하나의 환원제와 GO-Cat 등 하나의 산소 포착제(oxygen scavenger)의 존재하에서 실시할 수 있다.

일반적으로, 그 광 손상 완화제는 효과적인 영향(beneficial impact), 즉 광 손상 감소(reduced photodamage) 및/또는 광 손상 허용시간(photodamage threshold period) 연장의 제공에 충분한 레벨(농도)에서 그 반응 혼합물 중에 존재한다.

광 손상 완화제의 성분의 농도는 일반적으로 적용(application)에 따라 변동한다.

예로서, DTT, MEA 또는 BME 등 환원제는 약 100μM ~ 500mM, 바람직하게는 약 1mM ~ 약 200mM, 즉, 어느 일부 경우 DTT에 대하여 약 5mM과 MEA에 대하여 100mM의 양으로 존재하는 것이 바람직하나, 이들의 농도로부터 변동시킬 수 있다.

DTT의 경우, 바람직한 농도의 범위는 약 1mM ~ 약 10mM이나, MEA의 바람직한 범위는 약 10mM ~ 약 200mM이다.

동일하게, 산소 포착제(oxygen scavengers)의 농도는 그 적용, 존재한 산소의 레벨(농도), 반응성 산소 종에 대한 그 시스템(system)의 감수성(susceptibility) 등에 따라 일반적으로 변화한다.

예로서, 서열결정 반응에서, 산소 포착 효소계, 즉 GO-Cat는 일반적으로 바람직한 반응, 즉 폴리머라아제 효소 활성을 과도하게 손상시킴이 없이 효과적인 산소 포착을 제공하는 레벨에서 존재한다.

일반적으로, 이것은 약 5μM까지의 글루코오스옥시다아제 및 약 575nM까지의 카탈라아제 또는 3 ~ 4배의 대표적이 GO-Cat 농도, 13nM 미만의 글루코오스옥시다아제 및 1.5nM의 카탈라아제 또는 0.01X GO-Cat 농도에서 어느 것으로 존재하는 반응 혼합물 중에서 GO-Cat 시약의 농도를 포함한다.

일반적으로, 그 농도는 위에서 설명한 바와 같이 대표적인 GO-Cat 농도 약 0.01X ~ 약 0.5X이며, 더 바람직하게는 약 0.1X ~ 0.25X GO-Cat를 포함한다.

고정화 산소 완화제에 있어서, 고정화 시약의 양은 비고정화 포맷(formats)에서 상기 농도의 활성 레벨에 상당하는 활성 레벨을 일반적으로 제공한다. 시약의 정밀한 양은 일반적으로 그 고정화 프로세스의 상대적인 효율에 따라 좌우되며, 그 결과 그 고정화 성분의 활성을 얻는다.

앞서 설명한 바와 같이, 다른 효소계는 동일하게 산소 종의 결핍(depletion) 중에서 사용할 수 있다.

본 발명의 하나 또는 그 이상의 국면에서, 이와 같은 계(systems)에서는 글루코오스옥시다아제(glucose oxudase), 알코올옥시다아제, 콜레스테롤옥시다아제, 락테이트(lactate)옥시다아제, 피루베이트옥시다아제, 크산틴옥시다아제 등 하나의 옥시다아제(oxidase) 효소를 고추냉이의 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase) (HRP) 등 하나의 퍼옥시다아제 효소와 조합하여 포함할 수 있다.

HRP는 광범위하게 이용할 수 있는 퍼옥시다아제 효소로, 하나의 산화할 수 있는 기질[즉, 상품명 제품 Amplex Red인 O-페닐렌디아민(ODP), 루미놀(luminol)]의 존재하에 수중에서 용액 중에 존재한 과산화수소를 용이하게 전화한다.

따라서, 예로서 하나의 글로코오스옥시다아제계, 즉 하나의 글르코오스옥시다아제 효소, 산소 함유계에서 글루코오스와 관련하여, 그 효소는 글루코오소를 D-글루코노-1,4-락톤 및 과산화수소로 전화하는데 용액 산소를 이용한다.

그 다음, 상기 HRP는 그 과산화물을 물로 전화함과 동시에 루미놀, ODP 등 하나의 전자도너 기질(electron donor substrate)을 산화한다.

Ⅳ. 광 손상의 활용( exploitation of photodamage )

본 발명의 다수의 상기 기재 국면과 대조하여, 또 다른 관련 국면에서 본 발명은 상기 전체 시스템(overall system)의 기능성을 향상시키기 위하여 잠재적인 광 손상 프로세스를 활용하는 방법을 제공한다.

특히, 본 발명의 어느 바람직한 국면과 관련하여 어느 일부의 경우에서, 관련 아세이의 잠재적인 방해에서 성분의 기여를 제거하기 위하여, 그 계(system)의 선택적인 광 손상 성분들의 능력을 활용하는 것이 바람직하다.

예로서, 광 차단 구성요소 구조물(optical confinement structures) 내에서 폴리머라아제 효소의 중개에 의한 서열결정 프로세스(polymerase mediated sequencing processes)에서 하나의 특정 관측영역 내에 하나의 반응 복합체(reaction complex)를 형성하는 것이 일반적으로 바람직하다.

또, 이와 같이 다른 복합체(complexes)가 시약의 부족(depletion)으로 비특정 신호 이벤트의 발생과 과잉표지 생성물 또는 형성된 합성 생성물의 발생 등을 통해 그 반응 및/또는 검출 프로세스에 기여할 수 있기 때문에 그 계(system)에서 반응 복합체 이외의 형성을 최소화하는 것이 일반적으로 바람직하다.

실시예에서, 하나의 제로 모드 도파관(zero mode waveguide)의 하나의 관측영역에서 고정화환 하나의 폴리머라아제 효소 복합물을 사용하여 계돌(systems)의 결합에 의한 하나의 대표적인 서열결정에서, 그 전체의 반응 기질 상에서 어디에서나 다른 폴리머라아제 효소의 존재를 실질적으로 감소시키거나 제거하기 위하여 광 손상 효과를 활용할 수 있다.

특히, 하나의 제로 모드 도파관 구조체는 일반적으로 하나의 코어(core)를 구성하여, 그 코어는 차단 주파수(cut-off frequency) 이하인 주파수를 가진 광(light)이 그 코어를 통하여 진행하지 않으나, 그 대신 지수 함수적으로 붕괴하도록 구성하여 그 광이 직진한 코어의 단부에서 또는 그 단부 부근에서 극히 작은 조사영역을 형성한다.

이 지수함수적인 붕괴는 그 ZMW의 투명성 기질 단부를 통하여 조사(illumination)로부터 이 지수 함수적인 붕괴를 사용하여 그 반응 복합체 또는 그 도파관의 저부면에 또는 그 저부면 부근에 설정되어 있는 복합체만을 조사한다.

그 도파관 코어가 광(light)의 진행(propagating)을 방지하기 때문에 그 도파관 기질을 그 대향 측면 또는 상부 측면, 즉 광 손상을 발생하는 상태하에서 그 반응 혼합물의 유체 성분을 수납하는 측면에서 1차 조사(first illuminating) 함으로써 그 도파관 코어의 저부면에서 그 복합체의 실질적인 불활성화 없이 그 도파관 기질의 상부면(top-surface)에서 또는 그 상부면 부근에서 어느 폴리머라아제 효소 활성도 효과적으로 감소할 수 있다.

일반적인 반응상태의 조사(illumination)에 대한 광 손상 효과의 활용 이외에, 어느 국면에서, 이와 같은 광 손상 프로세스는 어느 위치에서 재료(materials)를 바람직하게 분해하기 위하여 더 악화시킬 수 있다.

예로서, 어느 일부의 경우, 추가 감광 성분은 조명성분(illuminated componets) 상에서 광 손상 효과를 더 증가하도록 제공할 수 있다.

설명을 용이하게 하기 위하여, 선택한 광 손상은 활성분자를 선택적으로 실환(deactivation)하기 위하여 활성분자 상에서 바람직하게 실시한다.

여기서 사용되는 것과 같이, 활성분자는 추가 기능성을 제공하는 분자들이며, 그 추가 기능성은 여기서 설명한 광 손상 효과를 통하여 변경(alteration) 및/또는 실제적으로 한정을 시킬 수 있고, 또는 제거를 할 수 있다.

이와 같은 분자들은 단백질, 핵산, 카르보히드레이트 또는 이들의 기능성을 한정하는 지점(points)까지 광 손상에 민감한 여러 가지의 다른 분자들 중 어느 하나를 포함할 수 있다.

그 기능성의 한정을 일반적으로 여기서 그 분자의 실활(deactivation)이라 한다.

특히 바람직한 국면에서, 그 활서분자에는 폴리머라아제 효소 또는 다른 단백질 또는 핵산 분석에서 일반적으로 사용하는 효소, 또는 프라미어 서열(primer sequences), 주형서열(template sequenus), 프로보(probes) 등 핵산분자를 포함한다.

하나의 폴리머라아제 효소 또는 다른 효소의 경우, 실활(deactivation)은 일반적으로 효소 활성의 실질적인 감소율, 즉 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상을 의미하며, 그 다음으로 이어서 표적 광 손상(targeted photodamage)을 말한다.

핵산에 대하여, 이와 같은 실활은 일반적으로 주어진 반응에서 필요로 하는 다른 분자와 혼성화하거나, 또는 이와 달리 복합하는 핵산의 능력, 즉 하나의 프라이머 서열과의 혼성화(hybridization) 또는 하나의 폴리머라아제 효소와 복합하는 능력에 있어서 실질적인 감소를 말한다. 일반적으로 이와 같은 감소는 위에서 특정된 범위 내에 있다.

위에서 설명한 바와 같이, 여기서 설명한 서열 결정 응용에 관련된 폴리머라아제 효소의 광 손상은 하나의 초기 스트랜드(nascent strand)에 결합되어 있는 뉴클레오티드의 유사체 상에서 형광 라벨 그룹이 여기(excitation) 되어 있을 때 단중항 산소(singlet oxygen)의 발생에서 일어나며, 그 단중항 산소는 폴리머다아제 효소 등 접촉하는 단백질에 악영향을 발생시킬 수 있다.

단중항 산소를 적합한 파장의 광선(light)에 노출될 때 효과적으로 발생하는 감광 화합물(photo-sensitizer compounds)은 여기서 설명한 선택적인 광 손상 프로세스에서 일반적으로 사용할 수 있다.

다수의 이와 같은 감광제 화함물은 파장 약 600㎚ 이상에서 작용한다. 여기서 설명을 용이하게 하기 위하여, 감광제 화합물들은 적합한 조사/여기에 노출될 때 활성화한다.

일반적으로, 여기서 설명한 바와 같이 감광제 화합물은 활성화할 때 단중항산소 또는 다른 유해 산소 종을 발생한다.

본 발명의 바람직한 국면에서, 그 파장은 감광제 화합물이 제로 모드(zero mode) 도파관에 의해 광의 감쇄(attenuation)를 보충하는 것을 활성화 하도록 하는 범위이며, 따라서 일반적으로 도파관 배열(waveguide arrays)에서 선택적인 상부면 광 손상에 적합하다.

다시 말하면, 여기서 하나의 제로 모드 도파관 또는 도파관 배열(array)에는 그 도파관 상에 설치된 하나의 피복층을 가진 하나의 기질을 포함하며 그 피복층을 통하여 그 하부에 설정되어 있는 투명기질(transparent substrate)에 위치한 도파관 코어(waveguide cores)를 구비하여, 감광제 화합물의 존재하에 있는 피복층의 상부 조명(topside illumination)으로 그 피복층의 상부면에 또는 그 상부면 부근에서 산소 종의 손상이 발생되며, 그 도파관 코어 그 자체 내에서, 즉 그 피복층의 아래에 있는 기질의 표면에 또는 그 표면 부근에서 실제적으로 이와 같이 산소 종의 손상 발생이 없다.

본 발명의 어느 국면에서 설명을 하기 위하여, 하나의 제로 모드 도파관 배열구조를 말할 때, 하나의 기질의 하나의 표면은 일반적으로 그 배열구조의 하나의 전체 노출 표면을 말하며, 그 피복층의 상부면, 그 피복 층내 그 코어의 벽면(wall surfaces), 일반적으로 그 하부에 설정되어 있는 투명기질 상에서 그 코어(cores)의 저부면(bottom surface)을 포함한다.

따라서, 본 발명에서, 그 표면의 어느 일정한 영역이나 그 표면의 다른 영역이 아닌 영역 상에서 분자의 선택적인 광 손상은 분자들이 그 피복층의 상부면 상에서 불활성화 하나 그 코어의 저부면 상에서 불활성화 하지 않는 하나의 위치(situation)를 포함한다.

다수의 감광제는 이 기술분야에서 공지되어 있고, 본 발명의 이 국면에서 유용하며 아래의 것을 포함한다:

클로린(chlorin) e6, 포르피머 소듐(porfimer sodium), 클로로 알루미늄 디술포네이티드 프탈로시아닌, 하이페리신(Hypericin), 로스벤갈(Rose Bengal), 하이포크렐린 에이(hypocrellin A), 하이포크렐린 비(hypocrellin B), 말라키트 그린(Malachite Green), 메로시아닌(Merocyanine) 540, 퀀텀 돗스(quantum dots), 알렉사(Alexa) 633, 알렉사(Alexa) 647, 알파 스크린 도너 비드스(Alpha Screen Donor Beads)(Perkin-Elmer 회사제품), 테트라페닐포르핀, 에이 프탈로시아닌(A Phthalocyanine), 세르코스포린(Cercosporin) 등.

본 발명의 어느 국면에서, 상기 시스템(system), 즉 제로 모드 도파관 배열의 전체 기질(overall substrates)은 이들의 표면상에 그 폴리머라아제 효소를 고정화시킨 다음에 감광제에 노출한다.

그 다음, 그 기질을 선택적으로 조사하여 선택영역에서 감광제만이 단중항 산소를 발생할 수 있도록 한다.

예로서 제로 모드 도파관 배열의 경우, 그 코어영역 내에 광(light)이 깊이 침입하지 않기 때문에 상부면 노출(topside exposure) 결과 그 도파관 배열의 피복층 상부면에서 또는 상부면 부근에서만 단중항 산소(singlet oxyger)가 발생한다.

상기 코어(cores)의 치수(dimensions)로 인하여, 그 단중항 산소가 그 도파관 내에 유의성 있게 확산하여 그 도파관의 저부면에 위치되어 있는 폴리머라아제 효소를 손상하지 않는 것으로 예측된다.

그 결과, 그 피복층의 상부면 상에(또는 상부면 부근이나, 그 코어영역 내에)에 고정화하거나 또는 흡수시킨 단백질, 핵산, 또는 다른 표적분자는 단중항 산소의 레벨을 더 높게 처리시켜, 그 결과 일반적으로 더 이상 유의성 있게 기여하지 않는 지점까지 광 손상되어 하나의 소정의 분석을 방해한다.

위 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 광 손상되는 분자의 타입, 즉 단밸질, 핵산 등과, 소정의 광 손상의 범위는 사용한 감광제, 그 처리상(phase) 중에 있을 때 그 농도 및 광 노출의 시간 및 강도에 따라 일반적으로 조정할 수 있다.

제로 모드 도파관에 의해 설명한바 있으나, 여러 가지의 선택적인 조사전략(illumination strategies)을 사용하여 하나의 기질의 표면상에서 패턴화한 광 손상(patterned photodamage)을 제공할 수 있다. 즉, 하나의 기질의 어느 일정한 선택영역 내에서 분자들을 손상시킬 뿐, 그 기질의 다른 선택영역에서 분자들을 손상시키지 않는다.

예로서, 하나의 광 마스크(photomask)를 사용하여 그 기질 표면의 어느 일정한 영역(certain ragions)만을 조사함으로써 그 영역 내에서만 단중항 산소를 발생한다.

또 변형 예로서, 하나의 레이저 등 하나의 직행 광원(directed light source)을 사용하고 선택조사(selected illumination)를 이용하여 선택영역만을 조사할 수 있다.

비 한정하는 다음의 실시예를 들어 본 발명을 더 설명한다.

Ⅴ. 실시예( examples )

핵산 서열결정 적용에서 단분자 분석치로 인하여, DNA 폴리머라아제계를 사용하여 본 발명에 따라 광 손상 및 그 용액의 악영향(impact)을 확인하였다.

초기 아세이(initial assays)는 3가지의 다른 구성으로 실시하여 폴리머라아제 효소 반응에 대한 광 손상의 범위 및 특성을 확인하였다.

이들의 아세이에서는 하나의 벌크(bulk) DNA 합성 실험, 하나의 평탄 표면 기재(flat surface bssed) 핵산 합성 반응 및 제로 모드 도파관의 하나의 배열 내에서의 합성을 포함하였다.

실시예 1 : 벌크 반응 용량(bulk reaction volumes)에서 광 손상 및 완화

제 1 아세이(first assay)에서 합성 반응 혼합물에서는 하나의 변성(modified) Φ29 DNA 폴리머라아제 효소, 300nM DNA 주형(template), 3 미변성(three native) 뉴클레오사이드 트리포스페이트(각각 10μM에서) 및 하나의 형광 염료 표지 뉴클레오사이드 폴리포스페이트(10uM에서)를 합성 버퍼(synthesis buffer)(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 75mM KCL, 20mM(NH₄)₂SO₄, 10mM BME, 0.7mM MnCl₂)중에 포함시켰다.

각각의 반응을 1분 내지 1시간의 범위 내에 있는 소정의 조사시 간(illumination period) 동안 실온(22℃)에서 실시하였다.

상기 실험에서는 각각 2세트(sets)의 다음 3종의 다른 반응 혼합물을 포함하였다:

(1) 미변성(native), 즉 무표지(unlabeled) 뉴클레오사이드 트리포스페이트만을 사용하는 하나의 합성반응;

(2) 2종의 미변성(native) 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 하나의 알렉사(Alexa) 488 표이 dCTP 유사체(analog) 및 하나의 알렉사(alexa) 568 표지 dTTP를 함유하는 하나의 합성반응;

(3) 2종의 미변성 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 하나의 알렉사(Alexa) 488 표지 dC4P 유사체(analoh)(테트라포스페이트) 및 하나의 알렉사(Alexa) 568 표지 dT4P를 함유하는 하나의 합성반응.

각각의 다른 합성반응 조건에는 파장 488, 568 및 647nm으로 5분간 합성할 때 조사(illumination) 또는 레이저 조사(laser illumination)가 없었고, 이어서 비조사 합성(nonilluminated synthesis)을 60분으로 하였다.

합성한 다음에,그 반응 생성물은 표준조건하에 0.7%의 아가로스겔(agarose gel) 상에서 분리하였다.

도 2A에서는 염색겔(stained gel)(상품명 Sybr Gold)의 화상(image)을 제공한다.

도 2A에서 나타낸 바와 같이, 좌측 레인(lane) 1에서는 분자량의 표준을 포함한다. 그 다음 2개의 레인(lanes)(3 및 4, 레인 2는 블랭크 임)에서는 합성반응 을 포함하며, 그 합성반응은 레이어 조사가 없을 때(-)와 레이저 조사가 있을 때(+) 무표지(unlabelled) 뉴클레오사이드 트리포스페이트(반응조건 1, 상부)만을 함유한다.

그 다음 우측으로 2개 레인을 이동할 경우(레인 5 및 6)에는 동일한 반응을 포함하나, 표지(labelled) 뉴클레오사이드 트리포스페이트(반응조건 2, 상부)를 포함함과 동시에, 가장 우측(right most)에 있는 레인(7 및 8)에서는 합성반응(반응조건 3, 상부)에서 표지(labelled) 뉴클레오사이드 테트라포스페이트 유사체를 포함한다[포스페이트 표지 뉴클레오사이드 폴리포스페이트의 설명에 대해서는 특허문헌 USP 6,399,335와, 공개 미국 특허출원 2003/0124576 명세서 참조; 여기서 참고로 개시 내용 전부를 편집 함].

상기 아가로오스 겔에서 알 수 있는 바와 같이, 다량의 비교적 높은 분자량의 DNA를 그 미변성 반응 중에서 레이저 조사를 하거나, 레이저 조사 없이 합성하였다.

표지 유사체(labelled analogs)를 이용하는 각각의 경우, 그 합성 DNA의 양 및 상대 크기는 미변성 조건 이하이다.

그러나, 특히 이들의 후자의 2가지 반응 각각에서, 레이저 조사결과 생성된 더 높은 고분자량의 DNA 량이 실질적으로 감소한 점에 특징이 있다.

반응조건이 테트라포스페이트 유사체(analogs)의 사용을 제외하고 반응조건 2 및 3과 동일하여도 그 조사 샘플 중에서 상실된 DNA 합성량이 그 표지 트리포스페이트 반응에서 보다 정비례하여 더 많아지는 점에 특징이 있다.

이것은 각각 반응조건에 있어서 조사 샘플과 비조사 샘플에서의 DNA의 비[화상주사(image scanning)에 의해 결정함]로 나타낸다.

특히, 미변성 반응조건 하에 아가로오스 겔에서 조사와 비조사의 DNA 량의 비는 약 1(1.10)이다.

그 반응이 표지(labeled)트리포스페이트 유사체를 함유할 경우, 이 비(ratio)는 0.27로 저하되며, 동시에 테트라포스페이트 유사체를 사용할 경우 그 비가 0.56으로 저하한다.

이들의 데이터에서는 조사(illumination) 중에 그 효소의 활성 사이트(active site)에 플루오로포르(fluorophor)의 보유시간(retention time)에 근접함으로써 광 손상 효과가 발생할 수 있다는 것을 나타낸다.

이와 같은 해석은 유리 염료(free dyes), 즉 그 유사에에 결합(coupling)되지 않는 유리염료로 스파이킹(spiking)된 미표지 뉴클레오사이드 트리포스페이트로 실시한 동일실험에 의해 지지되었으며, 이것은 합성시에 조사의 악영향이 거의 없거나 없었음을 나타내었다.

동일하게, 비여기 파장(nonexciting wavelength)에서 조사하는 형광 유사체(fluorescent analogs)를 사용하는 합성 반응에서는 폴리머라아제 활성에 대한 악영향이 거의 없거나 없음을 나타내었으며, 또 그 여기 및/또는 형광 유사체가 그 폴리머라아제 효소 활성에 대하여, 다소 광 손상에 중개(mediation) 되었음을 나타내었다.

위에서 설명한 여러 가지의 실험에서는 광 손상이 그 알렉사(Alexa) 568 염 료 표지 뉴클레오티드 유사체를 함유한 반응에서 최대이었음을 나타내었고,

또, 추가로 그 알렉사(Alexa) 568 염료가 알렉사(Alexa) 488 염료보타 광 안정성이 덜하다는 보고가 없어 그 암시한 광물리적 효과를 더 보강하였음을 나타내었다.

비 결합성(non-incorporatable) 염료 표지 유사체, 즉 주형(template) 내에서 어느 염기라도 상보성이 아닌 염료 표지 유사체를 사용하는 추가 실험에서는 측정할 수 있는 광 손상이 거의 없거나 전혀 없었다.

상기 실험 설명 전체에서는 폴리머라아제 효소 활성에 대한 악영향(impact)이 그 폴리머라아제 효소의 활성 사이트 내에서 하나의 여기 염기 표지 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)의 존재로부터 발생되어 얻어지며, 그 활성 사이트(site)에서 불가역성 상호작용 또는 그 효소에 대한 일부 손상을 나타낸다는 것을 추가로 명백하게 나타내었다.

염료 표지 테트라포스페이트를 사용하는 실험(상기 반응조건 3)에서는 다음 3가지의 다른 완화처리를 사용하여 위에서 설명한 바와 같이 레이저 조사를 하거나 레이저 조사 없이 반복하였다:

(1) 10mM BME[표준상태 또는 음성조절(negative control)];

(2) 5mM DTT;

(3) 100mM MEA

또, 그 합성 생성물은 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 분리하였으며, 그 생성물의 화상(image)은 도 2B에서 나타내었다.

그 아가로스 겔은 이메지 스캐닝(image scanning) 처리를 하였다[Molecular Dynamics Typhoon 9400, Typhoon scanner Control Version 2를 구비함; 겔 이미지(gel image)는 Molecular Dynamics Image Quant Version 5.2로 정량화 하였음].

이 분석 결과에서는 표준상태에서 어떤 변화도 없이, 즉 10mM BME 만을 포함하여 레이저 조사에 노출될 때 생성물과 상기 레이저 조사가 없을 때 생성물의 비(ratio)가 0.24이었음을 나타내었다.

DTT를 그 반응 혼합물에 첨가하였을 때, 그 비(ration)는 0.59로 향상되었으며, 반면에 MEA의 첨가에서는 5분간 조사에서 광 유발 손상(photo-induced damage)에 대한 완전 또는 거의 완전 보호(비 1.04))를 제공함을 나타내었다.

이들의 데이터에서는 광 손상 완화제로서 환원제의 사용이 레이저 여기 조사(laser excitation illumination)에 의해 발생하는 합성 중에 발생하는 폴리머라아제 활성의 손싱을 방지한다는 것을 나타냄을 입증하였다.

실시예 2: 표면 고정화 효소계(surface immobiliged enzyme systems)에서 광 손상(photodamage) 및 완화(mitigation)

다음으로, 융합 실리카 마이크로스코프 슬라이드(fused silica microscope slide)의 표면상에 GST-태그(tagged)Φ29 폴리머라아제를 피복(coating)시켜 그 폴리머라아제를 그 슬라이드 상에 침착(depositing)하고 아이스(ice) 상에 15분간 그 표면을 배양하였다.

미변성 뉴클레오티드와 10μM 알렉사(Alexa) 488-표지-dCAP와 알렉사(Alexa) 568-표지-dT4P를 사용하고, 동시에 그 슬라이드 상에서 하나의 소형 반원 형상 레이저 스폿(laser spot)을 조사하면서 그 표면상에서 DNA의 주형 의존성 합성(template dependent synthesis)을 실시하였다.

그 혼합물 중에 존재한 단독의 환원제는 10mM BME이었다.

1분간과 5분간 조사하는 위치들을 서로 달리하면서 파장 488㎚(1.1㎽)과 568㎚(1.8㎽)에서 레이저 조사에 상기 슬라이드를 노출하였다.

조사 다음에 이어서 미변성 뉴클레오티드만을 사용하여 60분간 계속하여 합성하도록 하였다.

시브르-골드(Sybr-gold)를 사용하여 합성 DNA가 존재하는 동안 그 슬라이드를 염색하였다.

1분과 5분 후에 조사 슬라이드(illuminated slides)의 화상(images)를 도 3A에서 나타내었다.

도면(도 3A)에서 알 수 있는 바와 같이, 그 반원형상 조사영역에서는 조사 1분 후에만 어떤 합성 DNA라도 결핍되었으며, 조사 5분에는 그 악영향(impact)이 더 커짐을 나타내었다.

비조사 합성(non-illminated synthesis)을 60분간 계속 처리하도록 할 경우에도 합성이 결여되어, 폴리머라아제 활성에 대한 광 손상을 나타낼 뿐만 아니라, 이와 같은 광 손상이 계속되거나 영구적임을 알 수 있다.

하나의 동일한 실험을 광 손상 완화제의 서로 다른 혼합물의 존재하에 또는 그 혼합물의 농도에서 실시하였다.

특히, 위에서 설명한 실시예 1에서와 같이 다음의 다른 완화 처리를 포함한 3가지의 서로 다른 반응 혼합물을 사용하였다:

(1) 10mM BME(표준상태 또는 음성조절)(도 3A에서 나타낸 것과 동일함);

(2) 100mM MEA;

(3) 100mM MEA, 5mM DTT 및 1 ×Go-Cat(1.3μM 글루코오스옥시다아제 및 150mM 카탈라아제).

그 결과를 도 3B에서 나타낸다. 그 도면(도 3B)에서 알 수 있는 바와 같이, MEA를 함유한 반응에서는 1분 및 5분간 조사실험에서 광 손상 폴리머라아제 활성을 나타낸 발광 화상(burned in image)에서 현저한 감소를 나타내었다.

DTT와 GO-Cat의 첨가에서는 1분간 노출에서 식별할 수 없고, 5분간 노출 후에 간신히 식별할 수 있는 지점까지 폴리머라아제 활성에 대한 광 손상 레벨은 더 감소하였다.

GO-Cat의 존재가 광 손상의 실질적인 제거를 제공하나, 이들의 단백질의 비교적 높은 농도의 존재는 어느 응용분야에서 역효과를 가질 수 있다. 즉, 여기서 이와 같은 반응에서는 단백질 등 비교적 낮은 농도의 반응물질을 기재로 하여 관련 반응을 차폐(mask) 할 수 있고, 블록킹(blocking)할 수 있으며, 또는 그 밖에 다른 방법으로 억제할 수 있다.

이와 같이, 하나의 추가실험을 실시하여 사전처리 표면(pretreated surface) 상에서 여러 가지의 광 손상 완화제에 대한 효과적인 환원 농도(reduced levels)를 결정하였다.

간단히 말하면, 선택적인 폴리머라아제 효소의 고정화를 형성하기 위하여 처리한 하나의 표면을 제조하여 GO-Cat의 농도로 적정 실험에 사용하였다.

그 실험 설정을 아래에서 설명하였다.

A. 표면제조(surface preparation)

뉴트라비딘(Neutravidin)을 1×BFA의 용액(0.05%의 Tween 20, 150mM KCl, 25mM 트리스-HCl, pH 7.5, 5mM의 DTT) 중에서 1㎎/ml ~ 0.2㎎/ml으로 희석하였다.

바이오틴(Biotin)-GST 태그(tagged)Φ29 폴리머라아제 효소를 1×BFA 용액 중에서 약 128mM의 농도로 희석하였으며, 그 뉴트라비딘 용액과 폴리머라아제 용액의 동일용량을 합쳐 23℃에서 30분간 배양하였다.

그 다음, 그 뉴트라비딘-폴리머라아제 혼합물을 하나의 PEG 24-바이오틴(Biotin) 변성면을 가진 하나의 가스킷 용융실리카 슬라이드(gasketed fused silica slide) 상에 옮겨 놓은 다음에 하나의 커버 슬립(cover slip)으로 커버하였다.

그 다음으로, 그 슬라이드를 1시간 동안 23℃에서 배양하였다.

배양한 다음, 이어서 그 슬라이드를 3회 1×BFA 용액 중에서 세척하였다.

B. 합성/조사실험(illumination experiments)

상기 GO-Cat 시약을 사용하여 2×MM 시약(2×prb-BME(100mM Tris-HCl pH 7.8, 40mM 암모늄술페이트, 150mM KCl), 200mM MEA, 10mM DTT, 0.4% 글루코오스, 1.4mM MnCl₂, 300mM CL3l 원형상 주형(circular template), 20μM A488 dC4P, 20μM A568 dT4P, 20μM dATP 및 dGTP)으로 1:1 희석하여, 10mM MEA, 5mM DTT 및 0, 0.02×, 0.05× 및 0.1×Go-CAT 시약을 가진 최종 반응 혼합물을 얻었다.

그 다음, 이들의 희석 합성 시약(GO-CAT를 갖거나 갖지 않는 희석한 2×MM)을 상기 가스킷 슬라이드(gasketed slide) 상에 침착(deposition) 하였으며, 그 다음으로 이것을 적합한 위치에서 레이저 스폿(spots)으로 파장 488㎚과 568㎚에서 5분간 조사하였다.

레이저 조사 후, 이어서 그 반응 혼합물을 1×포스트(post) MM 시약(1×prb-BME(50mM Tris-HCl pH 7.5, 20mM 암모늄술페이트, 75mM KCl), 100nM CL3l 원형상 주형, 0.7mM MnCl₂, 2μM A488-dUTP, 8μM dTTP. 10μM dATP, dCTP 및 dGTP)으로 대치시켜 23℃에서 60분간 조사(illumination)없이 배양하였다.

그 결과 얻어진 슬라이드를 1×BFA로 2회 세척하였으며, 삽입 염료(intercalating dye)(상품명 : Sybr Gold)로 염색하고 화상처리(imaging) 하였다.

그 결과 얻어진 화상(images)을 도 3C에 나타낸다.

도면(도 3C)에서 알 수 있는 바와 같이, GO-Cat 시약의 과도하게 낮은 농도(levels)의 사용은 폴리머라아제 활성에 대한 효과적인 악영향을 제공한다.

그러나, 약 0.1×표준농도에서 GO-Cat 시약의 존재로 폴리머라아제 활성 손상에 거의 완전하게 제거한다.

그 다음, 그 화상(image) 데이터를 백그라운드 표준화 크레이터(crater) 강도 용량(volume) 대(vs.) GO-Cat 농도의 함수로 하여 플로팅(plotting)하였다(도 3D).

또, 적합한 보호는 0.1×GO-Cat의 비교적 낮은 농도의 첨가 단백질에서 얻어짐을 나타낸다.

실시예 3 : 나노구조로 형성된 반응성 표면상에서 광 손상 및 완화(photodamage and mitigation on nanostructured reactive surfaces)

도파관(waveguides)의 배열에서 제로 모드 도파관 내에 고정한 DNA 폴리머라아제를 사용하여 위에서 설명한 실험과 동일한 실험을 실시하였다.

위 설명에서와 같이, 나노구조 형성 표면상에 고정한 폴리머라아제 효소에 레이저 조사에 의해 손상을 발생하였는지를 확인하기 위하여 제 1 실험을 지정하였다.

이들의 표면에는 ZMW 배열(array)을 포함하며, 그 배열에서는 폴리머라아제 효소를 그 표면에 흡착하였다.

염료 표지 뉴클레오사이드 테트라 포스페이트(알렉사(Alexa) 488 dC4P 및 알렉사(Alexa) 568 dT4P)를 사용하는 DNA 합성은 레이저 조사(488 및 568nm에서)를 사용하거나 사용함이 없이 실시하여, 그 결과 얻어진 생성물을 다시 염료(상품명 : Sybr Gold)로 염색하였다.

그 배열(arrays)의 화상(images)을 도 4A에서 나타낸다.

그 조사 프로파일(profile)을 제 1 패널(좌측 멀리)에서 나타내며, 동시에 그 조사 합성에서 염색된 DNA 생성물의 화상을 인접 패널(좌측 중간)에서 나타낸다.

도면(도 4A)에서 알 수 있는 바와 같이, 하나의 음성(-) 화상은 그 조사 패턴에 상당하는 조사영역에서 명백하게 알 수 있다.

그 중간 우측 패널과 먼 우측 패널은 비조사(non-illuminated) 도파관 배열을 나타내고, 조사 샘플에서 보다 실질적으로 더 많은 DNA가 존재함을 나타내며, 또, 그 도파관 배열에서 폴리머라아제 효소 활성에 대한 광 유발 손상을 나타낸다.

도 4B는 도파관 배열의 제 1 세트(first set)를 나타내며, 여기서 동일한 합성반응은 추가 완화제 없이(즉, 단독의 10mM BME), 또는 5mM DTT와 100mM MEA의 존재하에서 실시하였다.

도면(도 4B)에서 알 수 있는 바와 같이, 그 DTT와 MEA의 첨가로 레이저 조사에 의해 발생한 폴리머라아제 효소 활성의 손상에 대한 보호를 제공하며, 그 비조사 배열(non-illuminated arrays)에서와 같이 등가량의 DNA 생성물을 실제로 생성하는 반응을 제공함을 나타낸다.

또, 추가 실험에서는 5mM DTT와 100mM MEA의 존재하에서와 같이 현저하지 않으나, MEA 없이 160mM DTT의 존재하에서 손상된 폴리머라아제 활성량의 개선(향상)을 나타낸다.

실시예 4 : 광 손상 완화제의 실시예에 의한 설명(Demonstration of Photodamage mitigating agents)

다수의 다른 첨가제를 실험하여 레이저 조사에 의한 광 손상 효과 감소에서 상대적 효능(efficacy)을 나타내었다.

그 실험에서, DNA 폴리머라아제 효소를 평면상 글라스기질(planar glass substrates)(용융 실리카 현미경 슬라이드) 상에 고정화시켜 DNA 합성이 발생하는 반응조건으로 처리하였다.

또, 각각의 반응 혼합물에는 기본 라인 레벨의 광 손상 완화제(10mM MEA-Ac, 0.1×GO-Cat, 25mM Tris-아스코르베이트)를 포함하였다. 그 반응은 파우어(power)를 변화시키는 레이저 조사에 의해 실시하였다.

그 광 손상 스텝을 밟은 다음에, 이어서 용액 모두를 그 칩(chip)에서 세척하였으며, 통상의 버퍼와 dNTPs로 대치하였다.

또, 그 광 손상 스텝을 밟은 다음에 이어서 하나의 염기 표지(baselabeled) 형광 뉴클레오티드(크로마타이드:chromatide)를 첨가하여 결합 활성(incorporation activity)의 형광 신호를 제공하였다.

활성 효소는 그 DNA에 크로마타이드가 결합하는 것으로 추정되었으며, 반면에 불활성 효소는 이와 같이 추정되지 않았다.

그 효소의 활성은 그 슬라이드 상에서 그 DNA의 상대 형광(relative fluorescence)를 기준으로 하여 측정하였다.

다음 표 1에서는 열거한(listed) 레이저 전력(laser power)에서 각각의 다른 첨가제에 대하여 비조사 조정영역(non-illuminated control region)에 대한 %크로마타이드를 나타낸다.

첨가제	레이저 전력 (μW/μ㎡)	% 크로마타이드 활성
염기	2.5	15
PPD	2.5	58
DABCO	2.5	20
NaN3	2.5	22
BHT	2.5	22
Trolox	2.5	41

위 표에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 첨가제는 그 첨가제가 없을 때 그 반응에 대하여 광 손상의 감소를 나타내는 크로마타이드 결합을 향상시켰다. 특히, 첨가제 Trolox(1mM에서)와 PPD(100mM에서)는 그 염기 라인(baseline) 혼합물보다 100% 개선율 이상 초과하여 제공하였으며, 반면에 다른 첨가제는 일반적으로 그 염기 라인 혼합물보다 약 30% ~ 약 40%의 범위에서 개선율을 제공하였다. 또, 첨가제 Trolox는 PPD와 DABCO보다 형광 유사체(analogs)에 음성(-) 영향을 덜 나타내었다.

따라서, 첨가제 Trolox는 하나의 바람직한 첨가제이다.

본 발명을 설명하기 위하여 구체적으로 기술한바 있으나, 이 기술분야의 당업자에 의해 공지되었나 이해하고 있는 여러 가지의 기술구성변형은 본 발명의 범위 내에 실시할 수 있다는 것을 용이하게 알 수 있다.

본 발명의 명세서에서 명백하게 기술되어 있지 않거나, 불명확한 경우, 여기서 기재한 어느 농도 값이라도 일반적으로 혼합물의 특정성분을 추가할 때 발생하는 어떠한 변환도 없는 혼합물의 값 또는 %로 나타낸 것이다. 이 명세서의 개시에서 언급한 특허문헌과 참고문헌 모두는 참고로 여기에서 편집하여 설명한 것이다.

Claims (29)

1. 하나의 제 1 반응물질(first reactant)과,

   하나의 제 2 반응물질(second reactant)과,

   하나의 광 손상 완화제(photodamage mitigating agent)를 함유하며,

   여기조사(excitation illumination)하에 제 1 반응물질과 제 2 반응물질의 상호작용(interaction)은 광 손상 완화제의 부재(不在)하에 제 1 반응물질이 광 손상을 발생하도록 하는 하나의 조성물.
2. 제 1항에 있어서,

   제 1 반응물질은 제 1 제한 정량(first limited quantity)에서 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서,

   제 1 반응물질은 200nM 미만에서 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서,

   제 1 반응물질은 10nM 미만에서 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1항에 있어서,

   제 1 반응물질은 10pM 미만에서 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1항에 있어서,

   제 1 반응물질은 하나의 표면상에서 고정화(immobilization)하는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 6항에 있어서,

   그 표면은 하나의 광 차단 구성요소(optical confinement)의 하나의 표면으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 7항에 있어서,

   그 광 차단 구성요소는 하나의 제로 모드 도파관(zero mode waveguide)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 1항에 있어서,

   제 1 반응물질은 하나의 제 1 영역(first area) 내에서 차단(confinement)되는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 9항에 있어서,

    제 1 영역 내에서 고정화한 제 1 반응물질의 분자가 1~3개로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 1항에 있어서,

    제 1 반응물질은 하나의 효소(enzyme)을 함유하며,

    제 2 반응물질은 그 효소의 하나의 기질(substrate)을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 1항에 있어서,

    광 손상 완화제는 하나의 항산화제(antioxidant)를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 1항에 있어서,

    광 손상 완화제는 하나의 산소 결핍 효소(oxygen depleting enzyme)를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 13항에 있어서,

    그 산소 결핍 효소는 과산화물 불균화 효소(superoxide dismutase), 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase), 콜레스테롤옥시다아제(cholesterol oxidase), 락테이트옥시다아제(lactate oxidase), 피루베이트옥시다아제(pyruvate oxidase), 크산틴옥시다아제(xanthine oxidase), 프로토카타카우트(protocatachaute) 3,4-디 옥시게나아제(dioxygenase), 카탈라아제(catalase), 고추냉이퍼옥시다아제(horse radish peroxidase) 및 글루타티온퍼옥시다아제(glutathione peroxidase)에서 선택한 하나의 효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제 11항에 있어서,

    그 기질(substrate)은 하나의 형광(fluorescent) 또는 형광 발생(fluorogenic) 기질을 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제 1항에 있어서,

    광 손상 완화제는 하나의 3중항 상태 소광제(triplet state quencher)를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제 1항에 있어서,

    광 손상 완화제는 하나의 산소 포착제(oxygen scavenger) 또는 소광제(quencher)를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제 1항에 있어서,

    광 손상 완화제는 하나의 글루코오스-옥시다아제/카탈라아제 효소계(glucose-oxidase/catalase enzyme system)를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 제 11항에 있어서,

    그 기질(substrate)은 하나의 표면을 포함하며, 그 차단 효소(confined enzyme)는 그 표면에 고정화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 제 1항에 있어서,

    그 광 손상 완화제는 아스코르브산, 디티오트레이톨(DTT), 메르캅토에틸아민(MEA), β-메르캅토에타놀(BME), n-프로필갈레이트, p-페닐렌디아민(PPD), 히드로퀴논, 소듐아지드(NaN₃), 디아조비시클로옥탄(DABCO), 시클로옥타테트라엔(COT), 트롤록스(Trolox) 및 그 유도체, 부틸레이티드히드록시톨루엔(BHT), 과산화물 불균효소(superoxide dismutase), 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase), 콜레스테롤옥시아다제, 락테이트옥시다아제, 피루베이트옥시다아제, 크산틴옥시다아제 및 프로토카타카우트(protocatachaute) 3,4-디옥시게나아제(dioxygenase), 에르고티오네인(ergothioneine), 메티오닌, 시스테인, 베타-디메틸 시스테인, 히스티딘, 트립토판, 메르캅토프로피오닐글리신, 메스나(MESNA), 글라타티온, N-아세틸 시스테인, 캅토프릴, 리코펜(lycopene), 감마-카로텐, 아스타잔틴(astazanthin), 칸타잔틴(canthazanthin), 알파-카로텐, 베타-카로텐, 감마-카로텐 빅신(bixin), 제악산틴(zeaxanthin), 루테인(lutein), 빌리루빈(bilirubin), 빌리베르딘(biliverdin), 토코페롤, 폴리엔디알테히드, 멜라토닌,

    

    -토코페릴숙시네이트 및 그 유사체, 피 리독시넬 및 그 유도체, 히드라진(N₂H₄), 소듐술파이트(Na₂SO₃) 및 히드록실아민의 그룹에서 하나 또는 그 이상의 약제(agent)를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
21. 하나의 관측영역(observation region)을 가진 하나의 기질(substrate)과,

    그 관측영역 내에서 고정화시킨 하나의 제 1 반응물질(first reactant)과,

    여기 조사(excitation illumination)하에 제 1 반응물질과 제 2 반응물질 사이의 상호작용(interaction)이 제 1 반응물질에 광 손상을 발생하도록 하는 그 관측영역 내에 설정된 하나의 제 2 반응물질(second reactant)과,

    그 관측영역 내에 설정된 하나의 광 손상 완화제로 이루어진 하나의 디바이스(device).
22. 하나의 조사반응(illuminated reaction)을 실시하는 방법에 있어서,

    하나의 제 1 반응물질과, 하나의 제 2 반응물질과 하나의 광 손상 완화제를 함유하며, 광 손상 완화제의 부재(不在)하에 발생하는 여기 조사(exitation illumination)에 의해 제 1 반응물질과 제 2 반응물질의 상호작용 결과 광 손상 완화제가 제 1 반응물질의 광 손상량을 감소시키는 반응 혼합물을 설정한 하나의 기질(substrate)을 준비하여,

    그 반응 혼합물을 기질 상에서 여기 조사에 의해 조사하는 것을 특징으로 하 는 방법.
23. 제 22항에 있어서,

    그 반응 혼합물을 조사(illumination) 하면서 제 1 반응물질과 제 2 반응물질 간의 반응을 모니터링(monitoring)하는 스텝(step)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 22항에 있어서,

    그 광 손상 완화제는 아스코르브산, 디티오트레이톨(DTT), 메르캅토에틸아민(MEA), β-메르캅토에타놀(BME), n-프로필갈레이트, p-페닐렌디아민(PPD), 히드로퀴논, 소듐아지드(NaN₃), 디아조비시클로옥탄(DABCO), 시클로옥타테트라엔(COT), 트롤록스(Trolox) 및 그 유도체, 부틸레이티드히드록시톨루엔(BHT), 과산화물 불균효소(superoxide dismutase), 글루코오스옥시다아제(glucose oxidase), 콜레스테롤옥시아다제, 락테이트옥시다아제, 피루베이트옥시다아제, 크산틴옥시다아제 및 프로토카타카우트(protocatachaute) 3,4-디옥시게나아제(dioxygenase), 에르고티오네인(ergothioneine), 메티오닌, 시스테인, 베타-디메틸 시스테인, 히스티딘, 트립토판, 메르캅토프로피오닐글리신, 메스나(MESNA), 글라타티온, N-아세틸 시스테인, 캅토프릴, 리코펜(lycopene), 감마-카로텐, 아스타잔틴(astazanthin), 칸타잔틴(canthazanthin), 알파-카로텐, 베타-카로텐, 감마-카로텐 빅신(bixin), 제악산 틴(zeaxanthin), 루테인(lutein), 빌리루빈(bilirubin), 빌리베르딘(biliverdin), 토코페롤, 폴리엔디알테히드, 멜라토닌,

    

    -토코페릴숙시네이트 및 그 유사체, 피리독시넬 및 그 유도체, 히드라진(N₂H₄), 소듐술파이트(Na₂SO₃) 및 히드록실아민의 그룹(group)에서 선택한 하나의 약제(agent)를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
25. 광 손상 허용시간(photodamage threshold period)보다 더 긴 시간 동안 조사할 때 광 손상에 민감한 하나의 조사반응(illuminated reaction)을 분석하는 시스템(system)에 있어서,

    그 조사반응 시약을 설정한 하나의 기질(substrate)과,

    그 기질을 지지하며 그 기질을 수납(recaiving)하도록 구성된 하나의 재치 스테이지(mounting stage)와,

    그 기질의 하나의 부분 또는 그 이상의 부분과 광 교통(optical communication) 상태에 있도록 위치를 설정시켜 그 기질의 부분을 조사하여 그 기질에서 방사하는 신호들을 검출하는 하나의 광 트레인(optical train)과,

    상기 재치 스테이지 또는 광 트레인을 작동할 수 있게 커플링(coupling)시켜 그 광 트레인과 기질 중의 하나를 다른 하나로 이동시키는 하나의 변환 시스템(translation system)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 시스템(system).
26. 하나의 효소 반응(enzyme reaction)을 실시하는 방법에 있어서,

    하나의 관측영역(observation region) 내에 하나의 효소를 준비하여,

    1종 또는 그 이상의 제 1 광 손상 완화제(first photodamage mitigating agent)의 존재하에서, 여기 조사(exitation illumination)하에 그 효소의 하나의 형광 기질 또는 형광 발생 기질과 그 효소를 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 하나의 염기 신장반응(base extension reaction)을 모니터링하는 방법에 있어서,

    하나의 관측영역(observation region) 내에 하나의 폴리머라아제 효소(polymerase enzyme)를 준비하여,

    1종 또는 그 이상의 제 1 광 손상 완화제의 존재하에서 그 폴리머라아제 효소와 하나 도는 그 이상의 제 1 형광 또는 형광발생 뉴클레오티드 유사체와 접촉하고, 여기 방사선(exitation radiation)의 조사에 응답하여 상기 관측영역에서 방사하는 하나의 형광 신호를 모니터링하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 1종 또는 그 이상의 제 1효소(first enzyme)와 그 제 1효소의 하나의 형광 또는 형광발생 기질(fluorogenic substrate)을 함유하는 하나의 반응 혼합물을 모니터링(monitoring)하는 방법에 있어서,

    여기 조사(excitation illumination)하에 그 효소와 형광 또는 형광발생 기질의 상호작용은 그 효소의 활성을 감소시키며,

    광 손상 허용시간 미만인 제 1 시간(first period) 동안 제 1 관측영역에서 여기 방사선(excitation radiation)을 배향(directing)하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 하나의 기질의 제 1 선택영역 내에 활성분자들(active molecules)을 국재(localization)하는 방법에 있어서,

    기질의 하나의 표면상에 활성분자들을 비선택적으로 설정한 하나의 기질을 구비하여,

    그 기질의 표면상에 하나의 감광제(photosensitizer)를 구비하고,

    그 기질의 제 1 선택영역 이외에 하나 또는 그 이상의 영역은, 제 1 선택영역 이외에 영역 내에서 활성분자들의 실활에 충분한 감광제의 활성화에 충분한 광(light)에 노출하는 것을 특징으로 하는 방법.

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