TWI534431B - 形成具有官能性島狀區之奈米級孔洞的方法 - Google Patents

Description

形成具有官能性島狀區之奈米級孔洞的方法 相關申請案之交互引述

本申請案係主張於2010年4月28日提出申請的第61/329,026號暫准專利申請案之優先權與利益。本申請案係於2009年3月30日提出申請的第12/384,097號美國專利申請案之部分延續，其主張Eid等人於2008年3月31日提出申請之USSN 61/072,641“單分子裝載方法與組成物(SINGLE MOLECULE LOADING METHODS AND COMPOSITIONS)”及Eid等人於2008年12月19日提出申請之USSN 61/139,316“單分子裝載方法與組成物(SINGLE MOLECULE LOADING METHODS AND COMPOSITIONS)”之優先權與利益；其全部揭露內容在此完整地併入本案以為參考資料。

發明領域

本發明係有關於具有官能性島狀區之奈米級孔洞。

發明背景

現今分子生物學與分子醫學中之數種技術，係依賴單一生物分子之分析。該等技術包括DNA與RNA定序、多型性檢測、所感興趣的蛋白質之檢測、蛋白質-核酸複合體之檢測以及其他多者。單分子分析之高靈敏度、高通量及低試劑成本，使得該類型的分析在分子醫學中之從低成本基因體學至高靈敏度標記分析的多種檢測與分析問題方面，成為日益具吸引力的方法。

例如，單分子DNA定序係適用於分析大批的相關DNA，諸如在一基因體之情況。在該等方法的若干者中，將一聚合酶反應隔離在由極小(典型為光侷限)的觀察體積所組成之一陣列內，當聚合酶複製一模板核酸時，其各容許觀察在該陣列的各反應/觀察體積中之個別聚合酶的酵素作用。個別地檢測核苷酸納入事件，最終提供該模板分子的序列。該方法大幅增加定序系統的通量，及亦大幅降低試劑使用成本--至個人化基因體學日益可行之程度。

典型地藉由將聚合酶(或其他)酵素固定或以其他方式定位在一光侷限反應/觀察區域內，諸如在零模式波導(ZMW)陣列中之由極小孔所組成的一陣列，及輸送一模板、引子等至該反應區域，而提供用於單分子核酸定序與其他分析方法之小型觀察體積。有關ZMW陣列及其等應用於單分子分析及尤其核酸定序之說明，請參見例如Korlach等人於期刊“Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.”第105(4)期第1176-1181頁(2008年)之“在零模式波導奈米結構中用於靶向固定單一DNA聚合酶分子之選擇性鋁鈍化作用(Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures)”乙文；Foquet等人於期刊“Journal of Applied Physics”第103期第034301頁(2008年)之“用於檢測單分子之零模式波導的製造作用之改進(Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection)”乙文；Levene等人於期刊“Science”第299期第682-686頁之“用於高濃度的單分子分析之零模式波導(Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrations)”乙文；已公開的第2003/0044781號美國專利申請案；Eid等人(2008年)於Science DOI: 10.1126/science.322.5905.1263b之“自單一聚合酶分子之即時DNA定序(Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules)”乙文；及第6,917,726號美國專利，其中各者就各方面在此完整地併入本案以為參考資料。

進行單分子分析所遭遇之一項困難，係在裝載所感興趣的分子(如模板或其他分析物及/或酵素)至單分子分析裝置的反應/觀察區域時發生。在一個ZMW或其他小型觀察體積中裝載所感興趣的二或多個分子，往往使得從雙重(或雙重以上)裝載區域觀察所得訊號之分析變為複雜。其係因為可能從ZMW或其他觀察體積同時觀察到雙重(或更多)組的訊號，這意味著在來自觀察區域的數據可被使用之前，來自ZMW的訊號已反褶積。更典型地，可藉由各種數據分析方法辨識來自雙重(+)裝載的ZMW之數據，及根本棄置來自裝載不當的ZMW或其他相關觀察體積之數據。

為降低在陣列的相關反應/觀察體積中之多重分子裝載事件的發生率，在技藝中係典型地在該陣列實質上“欠載”所感興趣的分析物分子。當低於37%的所有觀察體積被裝載時，分子在該陣列中的隨機分布導致在大部分的反應/觀察體積中裝載一個或更少的分子。該類型的裝載係稱作“卜瓦松(Poisson)限制式”分析物裝載，這意味著在該陣列添加不足的分子，藉此該分析物在陣列中的卜瓦松式隨機統計分布，係導致在大多數情況下各觀察體積中有一個或更少的分析物。在ZMW方面，先進技藝針對於一範圍的ZMW直徑(如70至100奈米)獲致約30%的單分子佔有率。見上述Foquet(2008年)乙文。就該裝載程度而言，在一典型的ZMW陣列中之約60%的ZMW並未裝載(如不具有分析物分子)。

雖然在大多數情況下，該隨機分布方法係有效確保在一陣列諸如一種ZMW陣列中的各觀察/反應體積中裝載不超過一個的單一模板或酵素(或其他分析物)分子，研發用於增加該等陣列的模板與酵素裝載密度之方法與組成物將是符合需要的。較高的裝載密度將容許在陣列中同時分析更多的分析物分子，增加該等系統的通量，及同時降低分析成本。在完整檢閱下列之際，將明瞭本發明所提供的該等與其他特性。

發明概要

就一些方面而言，本發明提供一種奈米級孔洞陣列，其包含：在其表面上配置有一披覆層之一種透明基板，該披覆層具有多個延伸穿過的奈米級孔洞；各奈米級孔洞具有壁與一基底，其中一隔離層係在奈米級孔洞的壁上及在一部分的基底上；其中該奈米級孔洞之一部分的基底包含由隔離層所包圍之基板的一個島狀區。

在一些實施例中，該基板係包含一種矽基材料。在一些實施例中，該基板係包含一種熔融矽石。在一些實施例中，該基板包含超過10,000個奈米級孔洞。在一些實施例中，該奈米級孔洞係包含具有一種圓形橫向廓型之孔。在一些實施例中，該等孔洞的橫截面尺寸係介於1奈米與500奈米之間。

在一些實施例中，多個奈米級孔洞中之至少一些係包含所感興趣的一個單分子。在一些實施例中，所感興趣的單分子係包含一酵素。在一些實施例中，多個奈米級孔洞中之至少一些係包含與該島狀區連接的一個單一的活性聚合酶酵素、一個單一的活性模板核酸或一個單一的活性引子。

就一些方面而言，本發明提供一種奈米級孔洞陣列，其包含：在其表面上配置有一披覆層之一種透明基板，該披覆層具有多個延伸穿過的奈米級孔洞；各奈米級孔洞具有壁與一基底，及各奈米級孔洞在該孔洞之基底具有島狀區材料的一個島狀區，其中該島狀區並不與該奈米級孔洞的壁接觸。

在一些實施例中，該基板係包含一種透明材料。在一些實施例中，該基板係包含一種矽基材料。在一些實施例中，其中該基板係包含一種熔融矽石。

在一些實施例中，該島狀區材料包含一種金屬。在一些實施例中，該島狀區材料包含金。在一些實施例中，該基板包含超過10,000個奈米級孔洞。在一些實施例中，該奈米級孔洞係包含具有一種圓形橫向廓型之孔。在一些實施例中，該等孔洞的橫截面尺寸係介於1奈米與500奈米之間。

在一些實施例中，多個奈米級孔洞中之至少一些係包含所感興趣的一個單分子。在一些實施例中，所感興趣的單分子係包含一酵素。在一些實施例中，多個奈米級孔洞中之至少一些係包含與該島狀區連接的一個單一的活性聚合酶酵素、一個單一的活性模板核酸或一個單一的活性引子。

就一些方面而言，本發明提供用於在一基板上的奈米級孔洞內製造一個島狀區之一種方法，其包括：提供具有一披覆層之一基板，該披覆層具有多個延伸穿過的奈米級孔洞；在該披覆層上面以保形方式沉積一犧牲層；以定向方式蝕刻該犧牲層，藉此留存奈米級孔洞的壁上之犧牲層，及移除在壁上的犧牲層之間之奈米級孔洞區域的犧牲層；在該基板上沉積一種島狀區材料；蝕刻該島狀區材料，藉此一部分的島狀區材料留存在介於壁間的犧牲層之間之區域中；及移除壁上的犧牲層，藉此在該奈米級孔洞內製造島狀區材料的一個島狀區。

在一些實施例中，該方法包括提供具有一披覆層之一基板，該披覆層具有多個奈米級孔洞；在該披覆層上面以保形方式沉積第一犧牲層；以定向方式蝕刻該犧牲層，藉此留存奈米級孔洞的壁上之犧牲層，及移除在壁上的犧牲層之間之奈米級孔洞區域的犧牲層；在該基板上以定向方式沉積一種島狀區材料；在該島狀區材料上面沉積第二犧牲層；蝕刻該第二犧牲層，以在該奈米級孔洞內的島狀區材料上面留下一部分的第二犧牲層，藉此保護其免於後續的蝕刻步驟；蝕刻該披覆層上面的島狀區材料，藉此一部分的島狀區材料留存在介於壁間的犧牲層之間之區域中；及移除壁上的第一犧牲層及移除第二犧牲層，藉此在該奈米級孔洞內製造島狀區材料的一個島狀區。

在一些實施例中，該基板係包含一種透明材料。在一些實施例中，該基板係包含一種矽基材料。在一些實施例中，該基板係包含一種熔融矽石。

在一些實施例中，該島狀區材料係包含一種金屬。在一些實施例中，該島狀區材料係包含金。在一些實施例中，該犧牲層係包含矽或鍺或矽與鍺。在一些實施例中，該奈米級孔洞係包含具有一種圓形橫向廓型之孔。在一些實施例中，該基板包含超過10,000個奈米級孔洞。

在一些實施例中，該方法進一步包括在該島狀區上選擇性結合一種聚合酶酵素、模板核酸或引子。

在一些實施例中，第一犧牲層與第二犧牲層係包含相同的材料。在一些實施例中，第一犧牲層與第二犧牲層係包含矽或鍺或矽與鍺。在一些實施例中，第一犧牲層與第二犧牲層係包含矽。

就一些方面而言，本發明提供用於在一個奈米級孔洞內形成基板表面的一個島狀區之一種方法，其包括：提供在其上具有一披覆層之一基板，該披覆層具有多個延伸穿過的奈米級孔洞；在該披覆層及該基板的外露部分上以保形方式沉積一隔離層；在該隔離層上面以保形方式沉積一犧牲層；以定向方式蝕刻該犧牲層，藉此留存奈米級孔洞的壁上之犧牲層，及移除在壁上的犧牲層之間之奈米級孔洞區域的犧牲層，暴露出該奈米級孔洞內之一部分的隔離層；蝕刻該奈米級孔洞內之該部分的隔離層，以暴露出一部分的基板；及移除該犧牲層，以在各奈米級孔洞內製造具有由隔離層所包圍之外露基板表面的一個島狀區之一結構。

在一些實施例中，藉由原子層沉積作用(ALD)沉積該隔離層。在一些實施例中，該隔離層係包含一種金屬氧化物。在一些實施例中，該隔離層係包含氧化鋁。在一些實施例中，該基板係包含一種透明材料。在一些實施例中，該基板係包含一種矽基材料。

在一些實施例中，該基板係包含一種熔融矽石。在一些實施例中，該島狀區材料係包含一種金屬。在一些實施例中，該島狀區材料係包含金。在一些實施例中，犧牲層係包含矽或鍺或矽與鍺。在一些實施例中，該奈米級孔洞係包含具有一種圓形橫向廓型之孔。在一些實施例中，該基板包含超過10,000個奈米級孔洞。

在一些實施例中，該方法進一步包括在該島狀區上選擇性結合一種聚合酶酵素、模板核酸或引子。

就一些方面而言，本發明提供用於在一個奈米級孔洞內形成基板表面的一個島狀區之一種方法，其包括：在一種透明基板上沉積一隔離層；在隔離層中形成延伸至基板表面之奈米凹點；沉積、暴露及顯影一阻劑，以在各奈米凹點上面形成一阻劑柱狀體及延伸至各奈米凹點；沉積一披覆層，藉此該披覆層覆蓋該阻劑柱狀體及隔離層的外露區域；及移除該阻劑而導致覆蓋該阻劑柱狀體之該部分的披覆層之剝離，藉此在披覆層中形成一個奈米級孔洞，其係在由隔離層所包圍的基底各具有一個奈米凹點。

在一些實施例中，該基板係包含一種矽基材料。在一些實施例中，該基板係包含一種熔融矽石。在一些實施例中，使用原子層沉積作用(ALD)沉積該隔離層。在一些實施例中，該隔離層係包含氧化鋁。在一些實施例中，隔離層的厚度係介於2奈米與20奈米之間。在一些實施例中，該等奈米凹點具有一種圓形橫向廓型。

在一些實施例中，該等奈米凹點的橫向尺寸係介於5奈米與40奈米之間。在一些實施例中，該奈米級孔洞具有一種圓形橫向廓型。在一些實施例中，該奈米級孔洞的橫向尺寸係介於30奈米與500奈米之間。在一些實施例中，該阻劑係包含一種負型阻劑。在一些實施例中，使用電子束微影技術或紫外線微影技術形成奈米凹點。

在一些實施例中，披覆層係包含一種金屬。在一些實施例中，披覆層係包含鋁。

在一些實施例中，在形成奈米凹點之前，在透明基板上形成對位特徵。在一些實施例中，該對位特徵係包含蝕刻至透明基板中之特徵。

就一些方面而言，本發明提供用於形成在其中具有基板表面的一個島狀區之一奈米級孔洞之一種方法，其包括：提供在其上具有一犧牲層之一種透明基板，該犧牲層具有位於其上之一硬質罩幕層；在該硬質罩幕層上形成圖案及進行蝕刻，以形成多個奈米級特徵；蝕刻該犧牲層以暴露出透明基板的一些區域，藉此犧牲層的蝕刻作用延伸至硬質罩幕層下面，而產生一底切；在透明基板的外露部分及硬質罩幕層特徵的上面以保形方式沉積一隔離層，藉此該隔離層係沉積在懸垂於犧牲層上的硬質罩幕部分之下方；以定向方式沉積一披覆層，留下在外露的硬質罩幕層下面之隔離層的一些部分；及移除犧牲層的剩餘部分、硬質罩幕及隔離層的一些部分與硬質罩幕上面的披覆層；藉此製造奈米級孔洞，其在由隔離層所包圍的奈米級孔洞內包含透明基板的島狀區。

在一些實施例中，該犧牲層係包含矽、鍺或矽-鍺。在一些實施例中，該硬質罩幕係包含PECVD氧化物或氮化物。

在一些實施例中，犧牲層的蝕刻作用係以二個蝕刻步驟進行，第一步驟實質上不具有底切，而第二蝕刻步驟底切該硬質罩幕層。

在一些實施例中，該奈米級孔洞與該奈米級孔洞內的島狀區係各包含一種實質上圓形的橫向廓型。在一些實施例中，該奈米級孔洞的橫向尺寸係介於30奈米與500奈米之間。在一些實施例中，該島狀區的橫向尺寸係介於2奈米與40奈米之間。

在一些實施例中，該隔離層係包含氧化鋁。在一些實施例中，該披覆層係包含一種金屬。在一些實施例中，披覆層係包含鋁。在一些實施例中，該透明基板係包含一種矽基基板。

就一些方面而言，本發明提供用於形成在其中具有島狀區材料的一個奈米級島狀區之一個奈米級孔洞之一種方法，其包括：提供一疊材料，其由下而上包含一透明基板、一島狀區材料層、一犧牲層及一硬質罩幕；在該硬質罩幕層上形成圖案及進行蝕刻，以形成多個奈米級特徵；蝕刻該犧牲層以暴露出島狀區材料層的區域，藉此犧牲層的蝕刻作用延伸至硬質罩幕層下面，而產生一底切；以定向方式沉積一披覆層，留下在外露的硬質罩幕層下面之島狀區材料層的一些部分；蝕刻島狀區材料層的外露部分；及移除犧牲層的剩餘部分、硬質罩幕及硬質罩幕上面之披覆層的一些部分；藉此製造奈米級孔洞，其在由透明基板表面的區域所包圍之奈米級孔洞內包含島狀區材料的島狀區。

在一些實施例中，在蝕刻島狀區材料層的外露部分之前，移除硬質罩幕與硬質罩幕上面之披覆層的一些部分，及在該步驟之後，進行犧牲層的剩餘部分之移除。

就一些方面而言，本發明提供用於形成在其中具有島狀區材料的一個奈米級島狀區之一個奈米級孔洞之一種方法，其包括：提供一疊材料，其由下而上包含一透明基板、一犧牲層及一硬質罩幕；在該硬質罩幕層上形成圖案及進行蝕刻，以形成多個奈米級特徵；蝕刻該犧牲層以暴露出島狀區材料層的區域，藉此犧牲層的蝕刻作用延伸至硬質罩幕層下面，而產生一底切；沉積一隔離層，藉此該隔離層在底切區域下方延伸而達位於底切下面之犧牲層的剩餘部分；以定向方式沉積一披覆層，留下在外露的硬質罩幕層下面之隔離層的一些部分；及移除犧牲層的剩餘部分、硬質罩幕及隔離層的一些部分與硬質罩幕上面的披覆層；藉此製造奈米級孔洞，其在由隔離層區域所包圍之奈米級孔洞內包含基板表面的島狀區。

就一些方面而言，本發明提供製造一種奈米級孔洞陣列之一種方法，其中超過30%的奈米級孔洞包含所感興趣的一個單一活性分子，其包括：製造一種奈米級孔洞陣列，該等奈米級孔洞具有壁與一基底，該基底具有島狀區材料的一個島狀區，該島狀區係由隔離材料所包圍；將所感興趣的分子與該島狀區選擇性結合，藉此一部分的奈米級孔洞係包含所感興趣的一個單分子。在一些實施例中，選擇島狀區之尺寸與所感興趣的分子之尺寸，藉此當所感興趣的一個分子與該島狀區結合時，其在空間上阻斷第二個分子與該島狀區之結合作用。

在一些實施例中，該島狀區具有實質上圓形的橫向廓型，及其直徑係約2奈米至約20奈米。在一些實施例中，所感興趣的單分子係包含所感興趣的一個單一活性分子。在一些實施例中，所感興趣的單分子係包含一酵素。在一些實施例中，所感興趣的單分子係包含一種聚合酶酵素、一種模板核酸或一種引子。在一些實施例中，該島狀區係包含沉積在該奈米級孔洞內的材料。

在一些實施例中，該隔離材料係包含基板的表面。在一些實施例中，該島狀區係包含一部分的基板表面。在一些實施例中，該隔離材料係包含氧化鋁。在一些實施例中，該隔離材料係包含一種矽烷。在一些實施例中，該矽烷係包含一種矽烷-聚乙二醇(矽烷-PEG)。

本發明提供用於控制單一分析物分子諸如核酸模板裝載至反應/觀察體積(諸如一種ZMW陣列的孔)中之方法與組成物。該等方法與組成物係適用於增加單分子分析系統的通量與效率。所提供的基礎方法包括：在反應或觀察體積中創建供一分析物所用的一個單一結合位點；經由催化性或次級結合方法移除多餘的結合位點，調整該分析物的尺寸或電荷；將分析物分子包裝或結合在一顆粒之內(或之上)，其中一個單一的該顆粒係適合放入相關觀察體積中(由於該顆粒的尺寸或電荷及/或觀察體積)；使用非擴散限制式裝載作用；以可控方式裝載該分析物(如使用微射流或光學或電控制)；在觀察體積中進行篩分或選擇電荷(如一陣列中的ZMW尺寸)，以控制何種分析物將適合(在空間上或在靜電上)置入何種陣列孔或孔區域中，如藉由在裝載週期之間掩蔽活性位點而疊代裝載分析物，強化所裝載的分析物之活性，使用自我組合性核酸以在空間上控制裝載，使用核糖體展示技術以控制裝載作用及提供用於分析物篩選之一基礎，調整該反應/觀察體積之尺寸；及其他。該等方法與組成物提供在全部的單分子陣列反應位點裝載單一分析物之可能性(而非如先前技藝使用隨機“卜瓦松限制式”裝載方法所發生之約30%的該等位點)，及亦提供對於陣列孔與分析物位置的尺寸、電荷及/或位置特徵之控制。

因此，本發明提供將一族群之所感興趣的分子或標的分子分配至多個尺寸侷限型反應或觀察區域之方法。所感興趣的分子可選擇性地包含核酸、蛋白質及/或酵素-受質複合體。該等方法包括提供一結構(如一種ZMW、平面基板、小型孔陣列或類似者)，其係包含尺寸侷限型反應或觀察區域及其中各區域具有官能性材料的一個島狀區，及其提供待分配至侷限區域中之所感興趣的分子族群。該等方法包括藉由在個別的反應或觀察區域添加至少一種篩分基團而調整侷限型反應或觀察區域之尺寸，藉此所選定數目的標的分子將適合置入經調整尺寸的區域中。任擇地，可藉由在個別標的分子鏈接至少一種篩分基團而調整該族群的個別標的分子之尺寸，創建一個鏈接篩分基團的標的分子族群(如與所感興趣的一分析物鏈接之顆粒)。相對於尺寸侷限型反應或觀察區域而言，該等篩分基團的尺寸夠大，藉此僅所選定數目的篩分基團如少於10個基團、少於5個基團或如約1個基團，將適合置入該等尺寸侷限區域中。篩分基團可部分地或完全地置入該區域中；相關決定因子係將標的分子部分送至該區域之輸送作用。該等方法因而包括裝載標的分子至該等區域中，藉此可將所選定數目之標的分子置入各區域，從而將標的分子族群分配至多個尺寸侷限型區域中。該等方法選擇性地包括選擇篩分基團或配置該反應區域，藉此一個單一篩分基團將適合置入該反應區域中。選擇性地，該篩分基團或標的分子可包含一種所選的電荷，其可用於以靜電方式控制裝載作用。

尺寸侷限型區域可個別地包含或存在於一陣列的一個單孔內，或存在於一個尺寸定界型基板內，如一種平面或其他基板的一個所選部分。例如，該尺寸侷限型區域可存在於一種光學侷限區域，如一種ZMW的一反應或觀察區域。該標的分子族群較佳分配至一陣列的尺寸侷限型區域(如孔)中，藉此該陣列之至少38%的尺寸侷限型區域(如孔)係僅由一個標的分子佔用。例如，可將標的分子族群分配至該陣列的孔中，藉此該陣列之至少50%或至少75%以上的孔係僅由一個標的分子佔用。選擇性地，該等方法係包括選擇篩分基團或配置該反應區域，其方式係使得一個單一篩分基團適合置入該尺寸侷限型反應區域中。

篩分基團係一種具有所選尺寸的基團，其可用於調節所鏈接的標的分子或所鏈接的島狀區形成顆粒進入一個尺寸侷限型區域。該篩分基團典型地可包含一或多種顆粒，如珠粒、金屬顆粒或奈米顆粒或一或多種聚合物(如一或多種PEG、交聯聚合物、樹枝形聚合物、高分歧化聚合物、星狀聚合物、樹枝狀聚合物、樹枝化基元、核酸、DNA摺紙體、多肽或類似者)。此外，篩分基團可包含一種多醣、聚乙二醇(PEG)、聚(乳酸)、聚(羥乙)酸、玻尿酸、一種核糖體、一種核糖體多肽或一種第1型膠原蛋白。在特定實施例中，篩分基團可包含病毒殼體，如包括含有聚合酶活性的至少一種重組或改質外鞘蛋白之病毒殼體。在一些實施例中，該篩分基團包含由一塗層所包圍之島狀區材料的顆粒，例如，藉由後續可被移除的一種聚合物而在該尺寸侷限型區域內沉積島狀區材料的一個島狀區。例如，島狀區材料的顆粒可為由一種聚合物塗層所包圍的一種金屬或半導體顆粒，藉此在一個尺寸侷限型區域中沉積一種篩分基團。後續可藉由電漿降解該聚合物，導致島狀區顆粒沉積在該尺寸侷限型區域的中央部分。

本發明所提供之方法可用於將聚合酶分配至尺寸侷限型區域。在該等實施例中，篩分基團可包含與各聚合酶鏈接之聚合物尾部，及蛋白酶的酶切位點可位於各聚合物尾部與聚合酶之間，以例如容許自該篩分基團釋出聚合酶。選擇性地，篩分基團可為在轉譯作用期間各與一標的聚合酶結合之核糖體。在尺寸侷限型區域中之聚合酶的一標的族群，可選擇性地構成聚合酶變異體之一種核糖體展示庫，藉此不同的聚合酶變異體係存在於不同的區域。相關地，該等方法可進一步包括針對所感興趣的一或多種性質而篩選該核糖體展示庫的聚合酶。該庫的聚合酶可選擇性地將編碼該聚合酶的一核酸逆轉錄或定序。該核酸係至少最初與一種核糖體相關聯，而該核糖體係至少最初與該聚合酶相關聯。

在一實施例中，該篩分基團在與侷限區域中的結構結合後擴展，而阻止其他篩分基團進入該侷限區域。其可發生在如篩分基團起初大約為球形及在進入篩分區域之內或近側或結合時扁平化之情況。理想地，篩分基團與侷限區域之尺寸係使得一個單一篩分基團可適合置入多個侷限區域中之各者，藉此提供將一個單一標的分子輸送至該尺寸定界型區域。如上所述，個別的篩分基團可完全地或僅部分地置入多個侷限區域中之各者，以將標的分子(如核酸或蛋白質)提供至該區域中。在一個合宜的實施例中，鏈接篩分基團之標的分子係流入該反應/觀察區域中。

篩分基團可選擇性地形成一種尺寸排阻基質，其阻止一個以上的單一標的分子進入該尺寸侷限型反應或觀察區域的一分析或固定區域。該固定區域可包含如官能化矽、金或鋁；該官能化區域可包含如一或多種結合對象；及該篩分基團或分析物可包含如一或多種同源結合對象。在一個適用的實施例中，可在裝載單一標的分子之後，自尺寸侷限型反應或觀察區域移除該篩分基團。

個別的篩分基團可以共價或非共價方式鏈接至侷限區域的壁或鏈接至個別標的分子。例如，篩分基團所鏈接的標的分子可為聚合酶酵素分子，其包含容許篩分基團連接之一種反應性或結合基團，諸如SNAP標籤。在裝載步驟之後，可藉由將個別的篩分基團-標的分子複合體暴露於如pH值的變化、鹽條件的變化、添加一競爭基團、光、熱、一種蛋白酶、一種核酸內切酶、一種核酸外切酶及/或一種電磁場，而選擇性地將個別的篩分基團從個別標的分子或壁切開。

多個尺寸侷限型反應或觀察區域可選擇性地包括預裝載一種單一聚合酶分子之一區域子集、缺乏聚合酶分子之一區域子集，及包含一或多種模板核酸之鏈接篩分基團的標的分子。在該等實施例中，該等方法可包括藉由聚合酶起始模板核酸的複製或轉錄作用，接著將附加的聚合酶蛋白分子裝載到至少一些缺乏聚合酶的構件中，造成包含第二次聚合酶蛋白之經第二次裝載的侷限型觀察或反應區域。然後可進行第二次裝載步驟，其中將附加的鏈接篩分基團之模板核酸裝載至經第二次裝載的區域中。

就一相關方面而言，本發明包含將一族群的核酸或其他分析物分子分配至一種小型孔陣列的多個孔之方法。該等方法包括提供包含多個孔的一種小型孔陣列，及提供結合或包裝一分析物分子族群之顆粒。在該等方法中，該陣列中的多孔係經個別地配置以接受來自顆粒族群的單一顆粒，藉此將顆粒族群送入多孔中之輸送作用係將分析物分子族群分配至多孔中。

在一實例中，本發明提供將一分析物分子(如核酸、聚合酶分子等)族群分配至一種零模式波導(ZMW)的多孔中之方法。該等方法包括提供一種包含多孔的零模式波導，提供可結合或包裝一分析物分子族群之一顆粒族群，及將結合或包裝核酸之顆粒族群輸送至ZMW的孔中。選擇性地，多孔可經個別地配置以各接受單一顆粒。選擇性地，該等顆粒的尺寸係使得單一顆粒可適合置入多孔中之各者。

在實施例中，用於將核酸或其他分析物分配至一個尺寸定界型區域、ZMW或其他陣列的孔中之顆粒，可選擇性地包含病毒殼體，如衍生自一種λ噬菌體、φ29噬菌體、T7噬菌體、T4噬菌體、肌尾噬菌體(Myoviridae)科的一病毒、長尾噬菌體(Siphoviridae)科的一病毒、短尾噬菌體(Podoviridae)科的一病毒之殼體，或包含具有聚合酶活性的至少一種重組外鞘蛋白之一殼體。顆粒可選擇性地包含一種自我組合性DNA結構。例如，用於該等方法中之自我組合性DNA結構，可選擇性地包含長DNA片段、具有大螺旋半徑的DNA、質體、環狀DNA、DNA摺紙結構、DNA網格、包含一個金顆粒的DNA網格、DNA十二面體、謝爾賓斯基(Sierpinski)三角形、DNA八面體或聚鏈接型DNA鷹架。在特定實施例中，該DNA結構可包含一個單一聚合酶結合位點及/或可與一種單一聚合酶分子共價結合。任擇地，該等顆粒可個別地包含一或多種奈米結構、珠粒、聚合物、多醣、聚乙二醇(PEG)、聚(乳酸)、聚(羥乙)酸、玻尿酸、第1型膠原蛋白、核糖體、核糖體多肽或多肽。在輸送之後，可藉由將個別的顆粒-核酸複合體暴露於如前所述的任一或多種條件，而將顆粒從核酸分子切開。該等方法例如可用於輸送島狀區材料的一顆粒至一孔中，其中該顆粒係小於該孔的橫向尺寸，及該輸送方式係使得在該顆粒周圍有外露表面的區域，藉此該顆粒係作用為一個島狀區。

將顆粒族群送至如一種ZMW或一種小型孔陣列的孔中之輸送作用，係包括分配該等顆粒，藉此該ZMW或小型孔陣列之如至少38%的孔、至少50%的孔、至少75%的孔或最佳至少95%以上的孔係由一顆粒佔用。該等方法可藉由在該ZMW或小型孔陣列的孔中進行一定序反應，而進一步包括核酸分子之定序。

本發明所提供之組成物係包括含有一分析物陣列之分析裝置，該等分析物係依一或多項相決定性特徵而排列於陣列中，其方式係使得分析物的單分子存在於該陣列之至少40%的分析區域之各者中。在該陣列上的分析物分子可選擇性地相隔如至少20奈米、至少30奈米、至少40奈米或較佳地至少50奈米。排列該分析物分子之相決定性特徵，可選擇性地包括該陣列中之孔的排列、該陣列中之ZMW的排列、容許分析物進入分析區域之一罩幕、該陣列中之顆粒的排列、包含與該分析物結合的結合基團之顆粒，及/或陣列中之相距至少50奈米的結合位點排列，該等結合位點係配置用以結合個別分析物分子。

本發明所提供之其他組成物係包括一種零模式波導(ZMW)或其他小型孔陣列，其包含多孔及結合或包裝已分配至多孔中的一分析物族群之一顆粒族群。選擇性地，可配置ZMW或其他陣列的孔(或ZMW中的一個觀察/反應區域)以接受僅僅一顆粒。選擇性地，本發明的ZMW或小型孔陣列之至少38%的孔、至少50%的孔、至少75%的孔或最佳地95%以上的孔可被一個顆粒佔用。該等孔中的顆粒可選擇性地包含一或多種珠粒、奈米結構或多肽或上述的病毒殼體。可提供該等顆粒，藉此該等顆粒同時包含形成島狀區的一個部分及不成為島狀區部分之一個部分，例如一種微膠粒之形式。以此述的受控方式將顆粒提供至孔中，及移除不成為島狀區部分之該部分，以將顆粒置入該孔內。在一些情況下，該分析物諸如聚合酶酵素係在沉積期間存在於島狀區材料上；在其他情況下，在顆粒置入該孔中之後，該分析物諸如聚合酶酵素係與島狀區材料連接。

本發明亦提供在一陣列的分析區域中產生單一分析物分子的非隨機分布之方法，如在一種小型孔陣列的孔內之分析區域。該等方法包括將分析物分子選擇性地分配至分析區域中，藉此至少38%的區域係由一個分析物分子所佔用，少於5%(及較佳少於1%或甚至少於0.1%)的分析區域係由一個以上的分析物分子所佔用，及少於62%的分析區域係由少於一個的分析物分子所佔用。核酸分子在該等分析區域中之非隨機分布，可選擇性地為一種非卜瓦松分布。在一個適用的實施例中，該等方法可用於將核酸及/或聚合酶分子分配至一種零模式波導(ZMW)的標的孔中。選擇性地可定序位於該標的孔中的核酸分子。

在一陣列的分析區域中之分析物分子的非隨機分布，可選擇性地包括配置該陣列之所選的分析區域以接受最多一個顆粒，及將包含、結合或包裝該分析物分子之一顆粒族群輸送至該標的區域中，其方式使得至少38%的區域係由該等顆粒所佔用。可選擇性地將顆粒族群輸送至該陣列的分析區域，藉此至少50%、至少75%或最理想地至少95%以上的分析區域係由該等顆粒所佔用。

在一陣列或ZMW的分析區域中產生分析物分子之非隨機分布，可選擇性地包括將一核酸罩幕分配至個別的分析區域中，該分析區域包含將核酸罩幕配置在個別分析區域內之寡核苷酸定位特徵。個別的分析區域可經由該罩幕的所選區域中之一個小孔曝光，該寡核苷酸定位特徵可與罩幕雜合，及單一分析物分子可經由該罩幕中的小孔而與分析區域結合。選擇性地，在分析物分子的結合作用之後，可移除或降解該罩幕。

選擇性地，可藉由提供個別包含一個單一結合基團的核酸顆粒族群及提供可個別與結合基團結合及與個別的分析區域結合之轉接子族群，而在分析區域中產生分析物分子的非隨機分布。理想地，相對於分析區域而言，該等核酸顆粒係大至足以有效抑制一個以上的顆粒與一個分析區域結合。在核酸顆粒及轉接子的族群與該等分析區域之結合作用之後，可進行核酸顆粒的切開作用，該切開作用暴露出在分析區域內所結合的個別單一轉接子。分析物分子然後可有利地與單一轉接子結合。

選擇性地，包含供分析物分子所用的一結合位點之個別奈米結構可在分析區域中製造或分配至其中，其方式使得一個以上的單一分析物分子與該奈米結構之結合作用係在空間上受到抑制。例如，奈米結構可選擇性地為一種夠小的奈米顆粒，藉此抑制一個以上之包含一種聚合酶的單一分析物分子與該奈米顆粒之結合作用。該奈米結構可選擇性地以電化學方式沉積，及當該奈米結構小至足以在空間上抑制一個以上的單一分析物分子與該奈米顆粒之結合作用時，可終止奈米結構之增長。

分析區域中的奈米結構之製造，可選擇性地包括在個別分析區域中形成一單層的小型奈米顆粒，及將個別區域中的小型奈米顆粒聚結成為該區域中的較大型奈米顆粒，藉此在至少一個個別區域中形成至少一個較大型奈米顆粒。選擇性地，可提供包含該等分析區域的小孔之一陣列，及包含所感興趣的一個奈米結構之一微膠粒可分配至該等小孔之各者中，而該微膠粒之尺寸係使其將奈米結構置於該孔的中央。例如，該微膠粒可包含一種聚合物材料的塗層及在其核心具有一個小型(形成島狀區的)奈米顆粒。將微膠粒置入孔中之後，可移除聚合物材料而將奈米顆粒置入該孔中，例如置入該孔的中央區域中，因而在該孔中形成一個材料的島狀區。依此方式所形成之奈米顆粒島狀區可包含一個分析區域。分析物能以特異性方式與奈米顆粒結合，其係在將顆粒置入該孔之前或之後連接。任擇地，該區域中的奈米結構之製造，可包括將顆粒分散於一種光聚合性單體中，將所產生的單體-顆粒溶液輸送該區域中，在該區域中光聚合該單體，及將顆粒固定於該區域中。

選擇性地，可將與一個單一分析物分子結合之單一奈米結構島狀區或奈米結構點，沉積在一陣列的單一分析區域中。該陣列的分析區域可選擇性地包含鄰近該點或島狀區的區域，或其等可包含在該點或島狀區周圍所形成的ZMW。選擇性地，一島狀區或點可包含金-硫-(CH₂)_x(C₂H₄O)_y-生物素，該分析物分子可包含抗生物素蛋白-聚合酶，及該分析物可經由抗生物素蛋白基團與生物素基團的結合作用而與該島狀區或點結合。一奈米結構島狀區或點之製造作用，可包括清潔一熔融矽石或合成石英晶圓；在晶圓上施用一阻劑附著促進劑；以一種正型化學擴增型阻劑旋塗該晶圓；烘烤該正型化學擴增型阻劑；在晶圓上進行電子束微影技術，以在該阻劑中形成一圖案；在微影技術後烘烤該阻劑；顯影該阻劑；進行光阻劑去除作用；沉積金屬以形成點或島狀區；及消除晶圓阻抗。

可使用如電子束微影技術、奈米壓印圖案形成作用、具高的深寬比之物理氣相沉積作用或化學氣相沉積作用，而選擇性地在原地製造一奈米結構島狀區或點。例如，可提供包含一基底材料的一基板、一披覆材料、一方位緩衝控制層及一阻劑；可在該基底層形成一陣列的孔及該等孔延伸通過該阻劑、披覆材料及方位緩衝控制層；及可在陣列上形成一掩蔽膜，以產生部分延伸通過該陣列的孔之頂部之一罩幕，而限制進入各孔底部的一個小直徑區域。可在小直徑區域中沉積奈米結構，及後續可移除該罩幕，藉此提供各包含一個單一奈米結構之孔的一陣列，及該奈米結構係配置而與該孔的分析區域中之一個單一分析物分子連接。在其他實施例中，可提供包含一基底材料的一基板、一披覆材料、一方位緩衝控制層及一阻劑；及可形成延伸通過該阻劑、披覆材料及方位緩衝控制層而達在基底層之孔的一陣列。然後可在該陣列上沉積一掩蔽膜，藉此產生部分延伸通過該陣列之孔的頂部之一罩幕，而限制進入各孔底部的一個小直徑區域。之後，可在小直徑區域中沉積奈米結構，及可移除該等孔的壁，以提供奈米結構的一陣列，該奈米結構係經配置而與該陣列的一分析區域中之一個單一分析物分子連接。

任擇地，與該陣列的一分析區域中之一個單一分析物分子結合的一奈米結構島狀區或奈米結構點之形成或沉積作用，可包括容許在一種小型孔陣列的孔中或在一基板的表面上形成一種不完全的自我組合性單層(SAM)。然後可經由原子層沉積作用而形成通過SAM的一所選區域之一島狀區。在一分析區域中形成一奈米結構之其他方法，係包括在一基板上形成一個多層膜式疊層，形成通過該多層膜式疊層的多層之一孔陣列，在該孔陣列上沉積一間隔膜，將該多層膜式疊層平坦化以移除孔之間的該多層膜式疊層之至少一層，及移除孔內之間隔膜的一些部分，藉此產生該陣列的孔內之奈米結構。選擇性地，可在一基板上形成一個多層膜式疊層，可形成通過該多層膜式疊層的多層之一結構陣列，及可在該陣列上沉積一間隔膜。然後可平坦化該多層膜式疊層以移除該多層膜式疊層的至少一層，及可蝕刻該間隔膜而在該基板上產生奈米結構。

在一陣列的分析區域中產生單一分析物分子的非隨機分布之方法，可選擇性地包括製造一奈米結構陣列，其中該等分析物分子然後與該奈米結構結合，及後續形成分析區域以涵蓋該陣列的奈米結構。奈米結構陣列之製造可選擇性地包括在一基板上形成金屬奈米結構的一陣列。例如，可在該陣列施用一披覆材料，可在披覆層上旋塗一阻劑層，及可移除鄰近金屬奈米結構的阻劑區域。然後可蝕刻該等區域中的披覆層，以暴露出金屬奈米結構，藉此在披覆層中形成一陣列的小孔。

在其他實施例中，藉由製造一種小型孔陣列，能以一種非隨機方式將單一分析物分子分配至分析區域中，其中該等孔的底面包含一種基板材料，及該等孔的壁包含不同於基板材料之一種披覆材料。然後能以一分析物結合材料塗佈該等孔，可蝕刻披覆材料以增加孔的直徑，留下位於個別孔的底部大約中心位置之分析物結合材料，該一小塊的分析物結合材料之尺寸係夠小，藉此抑制一個以上的分析物分子與該小塊結合材料之結合作用。分析物分子然後可與孔中之該小塊的分析物結合材料結合。

任擇地，可將包含與分析物及與分析區域結合之一種低濃度的分析物結合基團之一溶劑，沉積至一分析區域中。可蒸發除去溶劑而將該分析物結合基團沉積在分析區域中，然後該分析物可與分析區域中的分析物基團結合，以產生分析物分子的非隨機分布。在一個適用的實例中，該分析區域可為一種零模式波導(ZMW)，及溶劑的蒸發作用可將分析物結合基團沉積在ZMW的大約中心位置。

選擇性地分配分析物分子之其他方法，可選擇性地包括在該等分析區域施用一溶劑中的一塗料，當旋轉該陣列時蒸發除去溶劑，藉此留下位於分析區域中心之不含塗料的一部分。單一分析物分子然後可與該分析區域的中心結合。理想地，未經塗佈的中心部分係夠小，藉此在空間上抑制一個以上的所選分析物分子與中心區域之結合作用。

可選擇性地以可控方式將單一分析物分子輸送至各分析區域中，以在分析區域中產生分析物分子的非隨機分布。例如，其可包括經由至少一種微米級通道將該陣列的多個分析區域與分析物的至少一種來源流體偶合，及以閘控或調節自該來源至分析區域的流動之一控制模組，而控制該來源與分析區域之間的流動。一控制模組可選擇性地在運作上與配置用以感測一分析物分子自通道流入分析區域之一感測器連接。選擇性地，該分析物可經光學標記，該感測器可包含一種光學感測器，及該控制器可控制位於該來源與分析區域之間之一閥。選擇性地，該感測器可包含檢測通過該感測器的一分析物分子之一種導電度感測器，及各分析物分子可與一介電質奈米顆粒偶合。可選擇性地使用一梯度式光學力或一電阱，而將單一分析物分子輸送至個別的分析區域中。以可控方式將一分析物分子輸送至一分析區域中，可選擇性地阻止附加的分析物分子在分析區域中之結合作用。

選擇性地，將單一分析物分子選擇性地分配至分析區域中之作用，可包括以可控方式將包含供分析物分子所用的一個結合位點之單一分析物分子輸送至各分析區域中。空間位阻抑制作用可藉此阻止一個以上的分析物分子與該顆粒之結合作用。任擇地，該顆粒可包含一個單一分析物分子結合位點。經由如流體控制、一種光學梯度及/或一電阱，而以可控方式將單一顆粒輸送至一分析區域中。可選擇性地使用阱與阱的間距係與分析區域之間的間距相稱之一光學阱陣列，俾以可控方式輸送單一顆粒至分析區域。可選擇性地將多個單一顆粒平行輸送至多個分析區域。

在分配至分析區域中之前，可選擇性地將分析物分子的活性富化。例如，該等分析物分子可為聚合酶分子或包含聚合酶分子。聚合酶的活性富化作用可包括將聚合酶分子與一模板核酸結合，將未結合的聚合酶分子與模板結合型聚合酶分離，藉此從含有模板結合活性的聚合酶分子移除缺乏模板結合活性的聚合酶分子。可複製該模板及與模板結合的聚合酶分子亦可與該模板分離，藉此形成釋出型活性聚合酶分子。(缺乏模板複製活性的聚合酶分子仍繼續與該模板結合。)任擇地，聚合酶分子的活性富化作用可如上述包括從含有模板結合活性的聚合酶分子移除缺乏模板結合活性的聚合酶分子，及容許與模板結合的聚合酶分子複製該模板。基於產生該模板的部分複製體之作用，可將活性聚合酶分子與非活性分子分離。經積極富化的分析物分子可選擇性地與一侷限區域內的島狀區或奈米點反應，以與該光侷限內之一個單一的活性分析物分子連接。

本發明亦提供與一種聚合酶-模板複合體結合之一顆粒。上述的任一特性可適用於該實施例，如該顆粒可為一磁珠。例如，該磁珠可包括一個親和性基團，諸如與聚合酶模板複合體結合之一種鎳-NTA基團，如當聚合酶包含一種同源親和性基團諸如一種重組型聚組胺酸序列之情況。該聚合酶可進一步具有得以自該珠粒切開之特性，諸如鄰近聚組胺酸序列之一個重組型核酸內切酶位點。

在一些情況下，可藉由在一透明表面配置一奈米點陣列及其中奈米點陣列之排列係得以獨立地觀察各個所感興趣的單分子，而在一表面上產生所感興趣的單分子之一陣列。奈米點的尺寸係使得僅一個所感興趣的單分子如一酵素與一個單一奈米點結合。可藉由多種方法將該等點排列成該基板上的奈米點之一陣列，包括使用其中該核心包含奈米點材料或該奈米點材料的一前驅物之一種核殼型聚合物。該奈米點的陣列一旦沉積之後，可使用供所感興趣的分子所用之一種偶合劑，將奈米點選擇性地官能化。該等奈米點然後可暴露於所感興趣的分子，例如其中奈米點與所感興趣的分子之尺寸係使得一個所感興趣的分子與奈米點結合，及在空間上禁止第二個所感興趣的分子與該奈米點的結合作用。可使用一種全內反射螢光(TIRF)系統，或以其中具有各自導向該陣列上的一奈米點之多個小波束之一系統，觀察該奈米點陣列。

就一些方面而言，本發明提供用於形成一官能性島狀區之一種方法，其包括：a)提供包含位於一透明層上面的一披覆層之一基板，其具有延伸通過該披覆層而達該透明層之多個奈米級孔洞，藉此該等孔洞各包含壁與一基底；b)在該基板上沉積其尺寸適合置入多個孔洞中之一核殼型顆粒，藉此在每個孔洞中一般僅沉積一個核殼型顆粒；c)移除該核殼型顆粒的殼，藉此該核殼型顆粒的核心係沉積在該孔洞的基底；d)在該基板上沉積一隔離層；及e)移除核殼型顆粒的核心，以製造由隔離層所包圍之外露基板的一個島狀區。

在一些實施例中，本發明在步驟(a)與(b)之間，進一步包括沉積同時覆蓋該披覆層與該透明層的外露部分之一塗層，藉此在步驟(e)之後，暴露出塗層的一個島狀區。在一些實施例中，該核殼型顆粒包含一個金屬或金屬氧化物核心及一有機外層。在一些實施例中，本發明在步驟(e)之後，進一步包括選擇性地官能化該外露基板的島狀區。

該等實施例之組合明確為本發明的特徵。包含此處所提及的組件之套組，亦為本發明的特徵。

圖式簡單說明

第1(A)-(H)圖係顯示在一陣列內的侷限區域中具有基板的島狀區((A)-(D))或島狀區材料的島狀區((E)-(H))之不同結構。

第2(A)圖係本發明用於將一個單一的活性分子偶合至一侷限區域內之基板的一個島狀區之一種方法的示意圖。

第2(B)圖係顯示將一個單一的活性分子偶合至一侷限區域內之島狀區材料的一個島狀區。

第3圖係使用二犧牲層在一侷限區域內形成一個材料島狀區之一種方法的示意圖。

第4圖係顯示使用一犧牲柱狀體在一侷限區域內形成一個材料島狀區之示意圖。

第5(A)圖提供使用威斯泰克(Vistec) VB300電子束系統與正型化學擴增型阻劑所產生之一陣列的顯微照片。第5(B)圖係顯示用於說明具有一金鍺尖端的鍺奈米線之形成作用的示意圖與顯微照片。第5(C)圖係顯示在一奈米點陣列上形成一種ZMW奈米結構之流程圖與示意圖。

第6圖提供用於固定一種ZMW中的奈米顆粒之一種方法的流程圖與示意圖。

第7A圖提供用於在ZMW中形成奈米顆粒之一程序的示意圖。第7B圖提供用於平坦基板的一種方法流程之示意圖。

第8A圖提供經由沉積一層不完全單層而在ZMW中形成奈米顆粒之一種方法流程的示意圖。用於平坦基板之一種方法流程係示於第8B圖。

第9A圖提供用於在一種ZMW中放置一官能化島狀區之一種方法的示意圖。用於平坦基板之一種相關方法流程係示於第9B圖。

第10圖係顯示用於固定ZMW中的奈米顆粒之一示意方法。

第11圖係使用一犧牲層製造一侷限區域內由隔離材料所包圍之基板材料的一個島狀區之一種方法的示意圖。

第12圖係用於製造一侷限區域內由隔離材料所包圍之基板材料的一個島狀區之一任擇方法的示意圖。

第13圖係顯示用於形成對位特徵之示意圖的一實例。

第14圖係顯示使用一顆粒的沉積作用在一侷限區域內製造基板材料的一個島狀區之一種方法的示意圖。

第15圖係使用一犧牲柱狀體在一侷限區域內形成由一隔離區域所包圍之基板的一個島狀區之一種方法的示意圖。

第16圖係顯示用於在一種ZMW或其他陣列反應區域的底部形成一分析物結合位點之一種化學拋光方法的示例流程圖。

第17圖提供用於在一種ZMW的中心形成一官能化區域之傾斜角蒸發作用實施例的示意圖。

第18圖提供用於富化活性聚合酶之一示例流程圖。

第19(A)-(B)圖提供有關聚合酶富化作用之更多細節。

第20(A)圖係顯示概述本發明用於形成奈米點島狀區之一種方法的維元之一圖，第20(B)圖係顯示概述本發明用於形成透明基板的島狀區之一種方法的維元之一圖。

第21圖(A)-(B)顯示具有基板材料的一個島狀區之一種ZMW的橫截面之透射電子顯微照片影像。

第22圖係顯示在其中心具有由一鋁隔離層所包圍之外露熔融矽石基板的一個島狀區之一種ZMW的橫截面之透射電子顯微照片影像。

第23圖係顯示在其中心具有由一鋁隔離層所包圍之外露熔融矽石基板的一個島狀區之一種ZMW的橫截面之透射電子顯微照片影像。

第24圖係顯示在其中心具有由一鋁隔離層所包圍之外露熔融矽石基板的一個島狀區之一種ZMW的橫截面之透射電子顯微照片影像，其包括該島狀區的尺寸。

詳細說明

本發明所提供之方法與組成物係在小型反應/觀察體積陣列諸如ZMW陣列中提供標的分子(如分析物諸如模板核酸及/或相關酵素諸如聚合酶)的非隨機分布。該等方法與組成物可達到的分析物、試劑及/或反應物之裝載效率，係遠高於使用卜瓦松(卜瓦松)限制式隨機分子裝載方法所典型觀察到者。該等方法一般涉及在該反應/觀察體積中創建供分析物所用的一個單一結合位點，如藉由在該反應/觀察體積中放置或製造一奈米結構，或藉由在該反應/觀察體積中選擇性地形成分析物結合位點。此外，本發明的方法可包括使用一種篩分式輸送系統如顆粒輸送系統，輸送該等分析物分子，以提供用於所感興趣的各分子類型之單分子裝載作用。

亦可組合使用該等基本方法，如可選擇觀察體積的尺寸與分布及聯同一種顆粒輸送系統，來控制與顆粒結合之所感興趣的基團之輸送與留置；可使用結合位點而與篩分基團結合，及疊代裝載可與其他任何方法組合施行等。

本發明大體上係有關藉由在該侷限區域內提供在其上可連接該單一分析物分子之一個“島狀區”，而增進在侷限區域的陣列中之單分子分析物的裝載作用。一個島狀區係侷限區域的一部分，及其所具有的物理或化學性質係不同於包圍該島狀區的侷限區域部分。當侷限區域包含壁時，該島狀區一般與該壁分開。該島狀區可由在此稱為一隔離區域或一隔離材料區域所包圍。該隔離材料具有不同於島狀區材料之一或多種物理及/或化學性質。不同於在該侷限區域內圍繞其四周的部分之島狀區材料的性質，係可用於將所感興趣的分子選擇性地偶合至島狀區域。所產生之島狀區材料的尺寸可使得僅一個單分子與該島狀區連接，例如其中首先連接的單分子阻止第二者之結合作用。藉由控制表面的結合特性與島狀區的尺寸，可增加僅連接一個單一分析物分子之侷限區域的相對數目，而超過藉由隨機連接作用可得之水平。

本發明的島狀區一般位於一基板上，其典型為一種透明基板。在一些情況下，該島狀區包含配置在該基板上面之一材料層或一材料顆粒。在其他情況下，該材料的島狀區所包含的一部分基板係未經塗佈，但其係由一隔離材料區域所包圍。在任一情況下，可選擇性地官能化該島狀區，藉此配置而與一個所感興趣的單一分析物分子結合。在一些情況下，該島狀區可包含沉積在該侷限區域內之一個島狀區材料的顆粒。在該情況下，該分析物分子有可能在沉積至侷限區域上之前與該顆粒偶合。

第1圖係顯示本發明的結構之一些實施例，其在可包括觀察/反應體積的侷限區域內包含島狀區。第1(A)至(H)圖物中之各者係顯示延伸通過一披覆層110而達一種透明基板100之一個單一奈米級孔洞。觀察/反應體積一般係以觀察/反應體積的一陣列之形式存在，例如在一基板上包含數百至數百萬個孔洞。該觀察/反應體積可包含例如零模式波導。基板一般是透明的，以容許從下方照明該等孔洞及容許從下方檢測該等孔洞所發出的光。披覆層一般是一種不透明材料，例如一種金屬或金屬氧化物之一薄層。披覆層的厚度可自約30奈米至約200奈米。在第1(A)至(D)圖中，各孔洞具有由隔離材料所包圍之外露基板130的一個島狀區。隔離材料係不同於透明基板之一材料，其容許選擇性地官能化外露的透明基板。可將透明基板選擇性地官能化，例如使用矽烷化學，以提供用於連接所感興趣的一分析物分子之一或多種偶合基。在一些情況下，侷限區域的陣列將在透明基板100與披覆層110之間包括一層材料。當該層存在時，該島狀區可包含一部分的外露中間層而非基板的一外露部分。該隔離材料可包含一種無機材料，諸如一種金屬氧化物如氧化鋁，或該隔離材料可包含一種有機材料諸如一種聚合物如聚乙二醇。

第1(A)圖顯示一奈米級孔洞，其所具有的一層隔離材料係包圍基板表面的島狀區及亦延伸至該孔洞的壁與該披覆層的上表面。該結構類型可有利於限制待官能化之表面類型的數目。可使用如在此詳細說明之沉積作用與蝕刻製程，來形成該結構類型。第1(B)圖顯示一孔洞，其中外露表面的島狀區係由在該孔洞的基底上之隔離材料所包圍，及該隔離材料實質上並未延伸至該孔洞的壁上或至該披覆層上面。在第1(C)圖中，隔離層120係配置於基板與披覆層之間。在第1(D)圖中，隔離層120係包圍島狀區及延伸至該孔洞的壁，但並未延伸至該披覆層上面。

第1(E)至(H)圖顯示例示性奈米級孔洞，及在其內配置有材料的島狀區140。島狀區材料可為任一適宜材料。島狀區材料一般與構成該基板的材料不同，俾容許將所感興趣的一分析物分子選擇性偶合至島狀區。該奈米級孔洞係延伸通過披覆層110而達透明基板層100。島狀區140係由區域150所包圍，區域150所具有的化學或物理性質係不同於島狀區材料。在一些實施例中，島狀區140包含一種金屬、金屬氧化物或半導體材料。在第1(E)圖中，該孔洞內的島狀區140係由外露表面的區域150所包圍。在第1(F)圖中，島狀區140係包含已沉積在該孔洞內的一顆粒140而在該孔洞內留下圍繞其四週之基板150的區域。可使用造成大部分的孔洞每孔僅具有一顆粒之一種方法來沉積該顆粒，例如藉由沉積具有一核心與一殼之一顆粒，其中該顆粒的尺寸係使得一般僅在各孔中沉積一顆粒，及移除該殼以將核心沉積至該孔洞，藉此該顆粒的核心包含如用於此之島狀區。第1(G)圖係顯示具有沉積在一層170上的一個島狀區之一孔洞，層170係配置在透明基板100上面及係位於透明基板100與披覆層110之間。層170可為一種透明材料，或者若其為薄型如少於10奈米，其可由在較大的厚度並非透明之一種金屬或半導體材料構成。可使用層170，以獲取例如不同於透明基板表面之化學性質。第1(H)圖係顯示一孔洞，其中一材料層170包圍島狀區140及延伸至該孔洞的壁與披覆層的上面。如所示，層170並未延伸至島狀區140下方。在一些實施例中，層170可延伸至島狀區140下方。層170可包含一種無機或有機材料。其可包含例如一種金屬、金屬氧化物、半導體或聚合物。

第(A)至(H)圖中所示之結構，係代表侷限區域內的島狀區結構之實例。還有其他結構可供使用。據瞭解亦可使用所示實施例之各種組合與變化。有關使用來自第1(A)至(H)圖的何種結構或該等結構的何種組合之抉擇，可依用於形成該等結構之方法的效用、適合進行該方法之材料類型及所製造的陣列之性能而定。

該等侷限區域一般具有至少一個奈米級的橫向尺寸。該等侷限區域所包含之奈米級孔洞的橫向尺寸可介於20奈米與300奈米之間或介於40奈米與150奈米之間。島狀區的橫向尺寸係小於奈米級孔洞，藉此島狀區一般不觸及該孔洞的壁。在一些情況下，島狀區的橫向尺寸係奈米級孔洞的對應橫向尺寸之約60%至約2%，或約40%至約10%。在一些實施例中，奈米級孔洞與島狀區各具有一個實質上圓形的橫向廓型。奈米級孔洞具有直徑介於約90奈米至約150奈米之間的一個圓柱狀體形孔洞，而島狀區可具有直徑介於約5奈米與約30奈米之間的一個圓形廓型。該等孔洞的橫向廓型可為實質上圓形，但並非必需如此。在一些情況下，該孔洞的橫向廓型係卵形、橢圓形、三角形、正方形、長方形、多角形或為一長條形式。

可將包含島狀區的侷限區域之陣列配置在微陣列結構上面，以用於增進一分析系統內之光學性能。該等微鏡結構係述於例如於2009年9月25日提出申請之第12/567526號美國專利申請案，其揭露內容就各方面在此併入本案以為參考資料。在一些情況下，該等侷限區域所具有的壁係包含一層非反射性材料，如2009年9月11日提出申請之第61/241700號美國專利申請案所述，其揭露內容就各方面在此併入本案以為參考資料。

使得所感興趣的分析分子與該島狀區連接可具有數項優點。其中一優點係該孔洞內將只有少數或只有一個單分子或複合體。另一優點係在於當連接該島狀區的分析物分子置於該孔洞的中心時，可能有利於檢測。例如，相較於緊鄰ZMW的壁之分子，朝ZMW的中心配置之分子可感受較高的照明強度。此外，相較於位於ZMW的壁之分子，來自鄰近ZMW的中心之一分子可更有效地傳送其發射作用。在一些情況下，分析物分子與包含島狀區的一顆粒或奈米結構之連接，可導致與該分析物相關聯的一標記之發射作用之增強。例如當構成該島狀區的材料係包含一種金屬時，可獲致該類型的增強作用。如參見於2008年3月27日提出申請之第2008/0241866號美國專利申請案。在一些情況下，該類型的增強作用係所欲的。在其他情況下，所欲者係不具有該類型的增強作用，例如以提高再現性。本發明的方法容許使用者製造具有特定應用所需的增強作用水平之一系統。

本發明的陣列與方法係採用奈米級孔洞之陣列，諸如ZMW。該等結構可包含在其上沉積一披覆之一種透明基板。披覆層具有延伸通過其本身而達透明基板之一種奈米級孔洞陣列。披覆層的厚度一般約5奈米至約300奈米，或約40奈米至約150奈米。披覆層可包含一種金屬，諸如鋁、金、鉻、銅、鈦、銀或鉑。

在此處的論述中，一“分析物”分子或所感興趣的分子係在所感興趣的系統中所分析之一分子，如一模板核酸、引子、酵素或類似者。例如，在定序反應中，當調查模板的性質(如其序列)時，該核酸模板可為一分析物分子。然而，模板並非定序反應中之唯一分析物。例如，在該系統中亦檢測定序引子的性質(如引子結合作用/聚合酶起始活性及如一種高產性定序反應所明證)以及酵素性質(如聚合酶活性及亦如一種高產性定序反應所明證)。為方便起見，除非上下文另有說明，審議中之相關分析物可為對於該分析具有活性之任一基團，如一基板、模板、引子、酵素或類似者。所進行的分析係典型為一種光學分析，及該分析係藉由觀察孔洞內標記而進行。在一些情況下，該分析包括觀察一種結合型物種與另一物種在溶液中之交互作用。為了如此進行，溶液中之物種可為經標記的物種，及該分析涉及觀察當該二物種結合在一起而形成一種結合型複合體時之標記。在此，雖然結合型物種可能未經標記，吾等仍可將其稱為一種結合型分析物，因吾等在觀察其結合作用之際正進行其活性之分析。在許多情況下，分析物包含一種複合體，諸如一種酵素-模板複合體或一種酵素-模板-引子複合體或一種酵素-模板-引子-受體複合體。當分析之一部分係觀察複合體時，該複合體的任一組分之連接作用係包含一分析物之連接作用。

第2圖顯示本發明用於連接一個奈米級孔洞內的一個單一分析物分子諸如一酵素之方法的示意圖，其係使用(A)由隔離層220所包圍之基板的一個島狀區230，或(B)由基板表面或隔離層所包圍之一個材料島狀區。在第2(A)圖中，一奈米級孔洞延伸通過披覆210而達基板200。在該孔洞內之外露基板表面的一個島狀區230，係由一層隔離材料220所包圍。在步驟(IA)中，該基板表面係選擇性地與偶合劑240反應。所選擇的偶合劑係主要或僅僅與基板反應，而不與隔離層反應。在步驟(IIA)中，一個單一分析物分子250係藉由與偶合劑240反應而連接該島狀區。在該等孔洞內可獲得高於隨機分布之單一分析物分子，例如島狀區上之小塊偶合劑的尺寸，使得一個第一分析物分子與島狀區的結合作用係在空間上阻止一個第二分析物分子的結合作用。在一些情況下，該分析物分子包含一酵素，諸如一種聚合酶酵素。在一些情況下，該酵素係以一酵素複合體之形式提供，諸如一種聚合酶-模板或聚合酶-引子-模板複合體。在一些情況下，該分析物分子諸如酵素可具有與其連接之此述的篩分基團，以提高其有效尺寸，俾增加對於與第二分析物分子結合之空間位阻性阻止作用。在所感興趣的分子之結合作用之後或之前，可在隔離層塗佈一鈍化層，以阻止與該表面之無意的結合作用。該鈍化層可包含聚乙二醇。

在一些情況下，透明基板200可包含一種矽基材料諸如熔融矽石，及披覆層材料可包含一種金屬層諸如鋁。隔離層220可包含一種無機材料諸如氧化鋁或一種有機材料諸如聚乙二醇(PEG)。例如可使用一種矽烷偶合劑，而選擇性地官能化該熔融矽石島狀區。該矽烷偶合劑將優先與矽石表面反應，及一般不與氧化鋁或PEG表面反應。該分析物分子具有與島狀區上的偶合劑特異性地反應之一官能性。例如，在一些情況下，該矽烷偶合劑包含一種矽烷-PEG-生物素，該分析物分子包含一酵素諸如一種包含生物素的聚合酶，及該酵素係經由一個居間的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白而與島狀區結合。

第2(B)圖係顯示用於將一個單一分析物分子280與該孔洞內由基板表面所包圍的一個材料島狀區260結合之一種類似方法。在步驟(IB)中，島狀區材料係與偶合劑270選擇性地反應。所選擇的偶合劑係主要與或僅僅與島狀區材料反應，而不與基板表面反應。雖然在此以未改質形式顯示，將瞭解在一些情況下，基板表面與披覆表面將經其他層處理，以修飾其等的化學或物理性質。例如，在一些情況下，該等表面中之一或二者可塗佈PEG，以阻止無用的結合作用。在步驟(IIB)中，一個單一分析物分子係藉由與偶合劑270反應而連接該島狀區。在該等孔洞內可獲得的單一分析物分子係比隨機分布多，例如島狀區上之小塊偶合劑的尺寸，使得一個第一分析物分子與島狀區的結合作用係在空間上阻止一個第二分析物分子的結合作用。在一些情況下，該分析物分子包含一酵素，諸如一種聚合酶酵素。在一些情況下，該酵素係以一酵素複合體之形式提供，諸如一種聚合酶-模板或聚合酶-引子-模板複合體。在一些情況下，該分析物分子諸如酵素可具有與其連接之此述的篩分基團，以提高其有效尺寸，俾增加對於與一個第二分析物分子結合之空間位阻性阻止作用。

例如，在一些實施例中，該島狀區材料係包含一種金屬諸如金。金可與一種偶合劑選擇性地反應，例如使用以巰基為端基的試劑，諸如巰基-烷烴-PEG-生物素。分析物分子例如可包含一酵素，諸如在其上已連接一生物素基團之一種聚合酶。該分析物然後可選擇性地與具有一種居間的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白之島狀區上的偶合劑反應。

如技藝中所知，可藉由利用構成該島狀區表面的材料及包圍該島狀區的材料之間之化學差異，進行第2圖的步驟(IA)與(IB)中所說明之選擇性固定化作用。可使用在電荷、極性、氫鍵結及該等表面上的官能基反應性之差異，以獲致選擇性固定化作用。選擇性固定化作用之方法係述於例如於2007年3月29日提出申請至之第11/731,748號美國專利申請案，其揭露內容就各方面在此完整地併入本案以為參考資料。

藉由將核酸或酵素與顆粒或其他篩分(及/或帶電荷)基團締合，如藉由使用顆粒包裝該等核酸或酵素(如其中所論及之顆粒係包含病毒殼體)，或藉由將核酸或酵素與顆粒結合或以其他方式鏈接，可達成將分析物諸如核酸及/或酵素諸如聚合酶送至小型體積陣列諸如ZMW陣列之顆粒/篩分基團調節式輸送作用。可使用多種顆粒類型中之任一者，包括病毒顆粒、蛋白質、蛋白質複合體、珠粒、金屬顆粒、大型分子(如PEG)之類。如下更詳細地論述該等方法中之各者。

在陣列特徵中置入或製造分析物結合性奈米結構

本發明用以增加將單分子分析物裝載至反應區域的一陣列之效率之一種通用方法，係包括在各反應區域內創建供分析物所用的一個單一結合位點，然後將單一結合位點全部裝載。該單一結合位點例如可為在一侷限區域內所沉積或形成的材料之一島狀區，或由一隔離區域所包圍之外露基板表面的一個島狀區。可使用清洗步驟而自陣列移除未結合的分析物，以造成該等結合位點實質上全部裝載分析物，導致每個反應位點裝載一個分析物。其產生反應位點的一陣列，諸如ZMW陣列，及使得該陣列之大部分或所有的反應區域裝載一個所感興趣的單分子分析物。雖然該方法非常適合將單一分析物分子裝載至反應區域中，將理解如藉由在每個反應區域創建一個以上的結合位點及在多重結合位點進行裝載，該相同方法可用於裝載一個以上的分子。

在一例示性實施中，本發明在這方面提供一種通用方法，以用於在ZMW孔/反應區域或其他陣列特徵中製造具有一個單一奈米結構(如一奈米點)的零模式波導(ZMW)或其他反應區域結構。典型的ZMW孔之直徑係介於如約50奈米與約120奈米之間，其係大至足以容納數份的大多數反應分析物(聚合酶分子、模板等)。相對於分析物而言，所製造之該孔或其他反應區域等中的奈米結構係夠小，藉此僅單個分析物單分子可與該奈米結構結合(任擇地，該奈米結構可僅僅包括供所分析物用的一個單一結合位點)。示例奈米結構所包括的島狀區係包含金屬奈米點、金屬奈米結構、介電質奈米結構或半導體材料奈米結構，可使用標準化學物質進行官能化，而展現可與所感興趣的一分析物結合之結合基團。該奈米結構亦可包含具有一化學組成的島狀區及其係由具有另一化學組成的區域所包圍，其中可選擇性地官能化該島狀區，俾與所感興趣的一個單分子或單一複合體連接。

例如，一種官能化金屬奈米點或其他奈米結構之存在，係例如在一反應區域(如一種ZMW)等的底部表面或其他標的部分提供一結合位點，其面積受到充分侷限，藉此可固定一個單一分析物(如聚合酶或其他酵素)，如就DNA定序或其他單分子反應而言。例如，可使用烷烴巰基將貴金屬諸如金、銀或鉑官能化而形成金屬硫醇鹽類，藉而形成供分析物所用的一個結合位點。

選擇性地官能化奈米顆粒或分析物或二者，以將分析物與奈米顆粒連接。同樣地，可將一個居間的結合基團諸如一種生物素或抗生物素蛋白官能化。例如，選擇性地以烷烴巰基官能化此處之核苷酸或多肽，以促進與貴金屬諸如金之連接作用。例如，核苷酸可在其等的3’-端或5’-端官能化(如使得其等與金奈米顆粒連接)。如參見Whitesides於Robert A. Welch基金會於美國德州休士頓舉行之第39屆化學研究奈米相化學會議論文集(Proceedings of the Robert A. Welch Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry)第109-121頁(1995年)乙文；及Mucic等人於期刊“Chem. Commun.”(1996年)第555-557頁乙文。亦選擇性地使用經由烷烴巰基連接策略之官能化作用，以將分析物與其他金屬、半導體或磁性奈米顆粒連接。用於連接分析物與奈米顆粒之附加或代替的官能基，可包括如硫代磷酸酯基(如參見第號美國專利5,472,881)、經取代的烷基矽氧烷(如參見Burwell於期刊“Chemical Technology”(1974年)第4期第370-377頁乙文；Matteucci於期刊“J. Am. Chem. Soc.”(1981年)第103期第3185-3191頁(1981年)乙文及Grabar等人於期刊“Anal. Chem”第67期第735-743頁乙文)。可使用以一個5’硫代核苷或一個3’硫代核苷為端基之核苷酸，以將核苷酸/寡核苷酸連接至固態奈米顆粒。亦參見Nuzzo等人於期刊“J. Am. Chem. Soc.”(1987年)第109期第2358頁乙文；Allara等人於期刊“Langmuir”(1985年)第1期第45頁乙文；Allara等人於期刊“Colloid Interface Sci.”(1974年)第49期第410-421頁乙文；Iler於“矽石化學(The Chemistry Of Silica)”乙書第6章(威利(Wiley)出版公司於1979年出版)；Timmons等人於期刊“J. Phys. Chem.”(1965年)第69期第984-990頁乙文；及Soriaga於期刊“J. Am. Chem. Soc.”(1982年)第104期第3937頁乙文。有關奈米顆粒與分析物的組合之進一步指導，可參見如頒證Sperling等人之第6,979,729號美國專利；頒證Shi等人之第6,387,626號美國專利；及頒證Shi等人之第6,136,962號美國專利；及頒證Mirkin等人之第7,208,587號美國專利。有關適宜的鏈接化學物質之更多細節可見於本文中。

整體策略之一實例係製造包含金奈米結構之一奈米結構陣列，接著藉由使用典型的官能性與結合作用化學物質而將一種聚合酶、模板核酸或其他分析物固定化，如藉此提供一種與分析物結合型奈米結構，如硫化金-(CH₂)_x(C₂H₄O)_y-生物素-抗生物素蛋白-分析物(如硫化金-(CH₂)_x(C₂H₄O)_y-生物素-抗生物素蛋白-聚合酶)。在ZMW孔或其他反應區域中納入金屬奈米結構之作用，並不受限於卜瓦松統計學；因此，聚合酶或其他分析物與奈米結構之結合作用，係提供一陣列中之各具有一個單一的活性聚合酶或其他分析物之反應區域的高產出。

用於製造反應區域中的奈米結構陣列之整體製造方法，係選擇性地使用來自半導體製造、光罩作業及MEMS製造的可用製程技術。例如，可使用電子束微影技術、深紫外線(DUV)微影技術、奈米壓印或其他可用的微影製程或其他可用的圖案成形技術，形成金屬奈米點的一陣列。可取得的商用電子束設備與光阻技術係足以符合尺寸與定位解析度之要求，如威斯泰克(Vistec)VB300電子束系統與正型化學擴增型阻劑。其步驟可例如包括：(1)一熔融矽石或合成石英晶圓之表面清潔作用，如使用習用的工業標準RCA操作程序(亦稱為“標準清潔”或SC-1)，或使用食人魚清潔(亦稱為“食人魚蝕刻”，如使用硫酸與過氧化氫之混合物)，亦參見Rastegar於2005年4月於美國德州奧斯汀舉行之表面處理與晶圓清潔研討會(Surface preparation and Wafer Cleaning Workshop)之“清潔石英板(Clean Quartz Plates)”乙文；(2)施用一阻劑附著促進劑，諸如但不限於六甲基二矽氮烷；(3)旋轉塗佈及在施用後烘烤一種正型化學擴增型阻劑；(4)電子束微影技術；(5)曝光後烘烤；(6)光阻顯影；(7)光阻劑去除作用；(8)金屬沉積作用；及(9)消除阻抗。晶圓製造與微影技術之更多細節如參見美國紐約麥格羅-希爾(McGraw-Hill)出版公司出版之Eynon與Wu(2005年)所著“光罩製造技術(Photomask Fabrication Technology)”乙書；施普林格(Springer)公司出版之Alexe(編輯)、Gsele(編輯)、Gsele(作者)(2004年)之“晶圓鍵合(Wafer Bonding)”乙書，ISBN-10:3540210490；Luo(2004年)所著“用於次微米IC製造之化學機械平面化的整合模型化：自顆粒尺度至特徵、晶粒與晶圓尺度(Integrated Modeling of Chemical Mechanical Planarization for Sub-Micron IC Fabrication:from Particle Scale to Feature,Die and Wafer Scales)”乙書，ISBN-10:354022369X；CRC出版公司出版之Madou(2002年)的“微製造之基礎：小型化之科學(Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization)”乙書第二版；及施普林格(Springer)公司出版之Atherton(1995年)所著“晶圓製造：工廠績效與分析(Wafer Fabrication: Factory Performance and Analysis)”乙書(施普林格工程與電腦科學國際系列)，ISBN-10:0792396197。可用於形成此述結構之微製造方法係述於共審查中之於2009年9月25日提出申請的第12/567,526號美國專利申請案及於2010年3月11日提出申請的第61/312,953號美國專利申請案，其中各者就各方面在此完整地併入本案以為參考資料。

若使用與氧化矽的附著作用通常不佳之金屬諸如金，則可使用汽相沉積作用而沉積一種附著促進劑。供氧化矽上的金所用之附著促進劑的一實例為十八烷基三氯矽烷(Szunerits等人(2006年)第22期第10716-10722頁乙文)。用以增進附著作用之其他替代方案，係包括在金屬化步驟期間使用一種界面金屬諸如鉻或鈦。有關包括蒸汽與薄膜沉積作用之可用的沉積方法之進一步細節，可參見如埃爾塞維爾科學(Elsevier Science)出版公司出版之Harsha(2006年)所著“薄膜的蒸汽沉積作用之原理(Principles of Vapor Deposition of Thin Films)”乙書，ISBN-10: 008044699X；Dobkin與Zuraw(2003年)所著“化學氣相沉積作用原理(Principles of Chemical Vapor Deposition)”乙書，ISBN-10: 1402012489；Mahan(2000年)所著“薄膜之物理氣相沉積作用(Physical Vapor Deposition of Thin Films)”乙書，ISBN-10: 0471330019；諾伊芳斯出版物(Noyes Publications)公司出版之Mattox(1998)所著“物理氣相沉積(PVD)製程手冊(Handbook of Physical Vapor Deposition(PVD) Processing)”乙書(材料科學與製程技術系列)，ISBN-10: 0815514220；及麥格羅-希爾(McGraw-Hill)專業出版公司出版之Smith(1995年)所著“薄膜沉積作用：原理與實務(Thin-Film Deposition: Principles and Practice)”乙書，ISBN-10: 0070585024。

就本發明的一些方面而言，微製造方法可用於製造侷限區域或奈米級孔洞內之材料的島狀區，其係首先藉由：提供具有一披覆層之一基板，其中該披覆層具有延伸通過披覆層而達基板之一奈米級孔洞陣列。在披覆層上沉積一犧牲層。該犧牲層一般係以保形方式沉積，以塗佈該孔洞的壁。在該犧牲層沉積之後，定向蝕刻該犧牲層。定向蝕刻的進行方式係造成移除位於該奈米級孔洞中心的犧牲層區域，而未移除壁上的犧牲層。然後在基板上沉積一個島狀區材料，藉此一部分的島狀區材料得以沉積在因定向蝕刻而開啟之該孔洞的中央區域。然後蝕刻該島狀區材料，藉此留存該孔洞內之一部分的島狀區材料，及藉此暴露出所留存的犧牲層之一些部分。然後移除犧牲層，留下該孔洞內之至少一部分的島狀區材料。該方法在一個奈米級孔洞內製造一個材料的島狀區，而所感興趣的分析物分子可與該島狀區連接。

第3圖提供使用一犧牲間隔物以製造在其內配置有島狀區之一奈米級孔洞之一例示性方法。提供在其表面上具有一披覆層之一種透明基板300。該披覆層具有延伸通過披覆層310而達基板300之奈米級孔洞315的一陣列。基板300一般為一種透明基板。在一些情況下，透明基板包含一種矽基材料諸如熔融矽石(FuSi)或石英。該披覆層例如可為一種金屬，諸如鋁。在步驟(I)中，在披覆層上沉積一個第一犧牲層320。該沉積作用係以一種保形方式進行，藉此以犧牲材料塗佈該孔洞的壁。犧牲材料例如可包含矽、鍺或矽/鍺。依所沉積的材料而定，可使用例如化學氣相沉積作用方法諸如PECVD或LPCVD沉積第一犧牲層。在步驟(II)中，以一定向方式蝕刻該犧牲層。定向蝕刻作用一般造成移除水平表面的犧牲材料，留下塗佈在該孔洞的壁上之犧牲材料。進行第一犧牲320間隔物的沉積作用，以留下橫截面尺寸為W_O之一開口。控制該開口的尺寸將進而控制該島狀區維度的尺寸。該孔洞的壁上之第一犧牲間隔物(T_S)的厚度，係依W_O=W_Z-2T_S而與該開口的尺寸相關，其中W_Z係該孔洞開口的尺寸。由W_I所代表之島狀區尺寸，係與W_O相近，因犧牲層在用於製造島狀區之蝕刻步驟期間係作用為一罩幕。在該步驟中，為確保該島狀區材料的良好附著作用，重要之處可在於自該孔洞內的區域移除所有的第一犧牲材料。

在步驟(III)中，例如以一定向方式沉積一個島狀區材料330。在塗佈該孔洞壁的犧牲層之間的區域中之外露表面的一些部分，係塗佈一部分的島狀區材料。該島狀區材料例如可包含一種金屬，諸如金、銀、鉑、鎳或銅。例如可使用電子束或熱蒸發作用，進行島狀區材料的定向沉積作用。在一些情況下，使用例如鈦或鉻的一晶種層，以增進島狀區材料的附著作用。在步驟(IV)中沉積一種第二犧牲材料340，其方式使得一部分的第二犧牲材料係沉積在該孔洞內之島狀區材料部分的上面。第二犧牲材料可包含矽、鍺或矽/鍺。在一些實施例中，該第一犧牲層與第二犧牲層係包含相同的材料。

在步驟(V)中進行一蝕刻步驟，以移除第二犧牲層及暴露出在披覆層上面之島狀區材料的一些部分。蝕刻之進行方式使得在該孔洞內所留存之第二犧牲材料的部分，係覆蓋在該孔洞內的島狀區材料部分。在步驟(VI)中使用一蝕刻步驟，以移除在披覆層上的島狀區材料部分。其中該島狀區材料係包含金，及典型地使用一種濕式蝕刻步驟。在該步驟中，第二犧牲材料的剩餘部分係覆蓋在該孔洞內的島狀區材料，而阻止其被蝕刻與移除。在步驟(VII)中，移除第一犧牲層與第二犧牲層。該移除作用的進行方式係對於披覆層、島狀區材料及基板具選擇性，藉此在該過程中實質上並未移除該等材料。例如可使用過氧化氫或二氟化氙，進行犧牲間隔物層之移除。該製程導致在該奈米級孔洞內形成一個材料的島狀區360。該島狀區材料在該孔洞內係與壁有間距。島狀區360係由基板表面350的一區域所包圍。基板表面的多個區域典型具有充分不同的化學與物理性質，以提供島狀區材料的特異性官能化作用。

第4圖提供在一孔洞內微製造一個材料島狀區之一種任擇方法，其係採用使用一底切之一種規避間隙式方法。該方法係適合高通量製程。該底切程序提供形成島狀區之一種自我對位方法。可使用一種乾式底切程序，以提供可靠的底切蝕刻。在第4圖中，首先提供在其上表面具有三層之一基板400；首先是一層島狀區材料410，然後是一層犧牲材料420，接著是一層硬質罩幕440。硬質罩幕層例如可為PECVD氧化物或氮化物或此述作為一犧牲層的任一材料。就該製程而言，硬質罩幕層必需不同於其下方的犧牲層，以容許優先蝕刻。在步驟(I)中，在硬質罩幕層形成圖案及進行蝕刻，以形成將用於界定奈米級孔洞之硬質罩幕結構445。接著，在步驟(II)中，使用硬質罩幕層作為一罩幕，蝕刻該犧牲層，以移除未被硬質罩幕覆蓋之犧牲材料的一些部分，及底切該硬質罩幕以形成柱狀體425。該蝕刻製程可分兩個步驟進行，其中一步驟係移除大量的犧牲材料，而第二步驟係進行底切，例如其中第二步驟使用一種乾式蝕刻底切。

在步驟(III)中，沉積一披覆層450。該披覆層可為一種金屬，諸如鋁或一種鋁合金。步驟IV係顯示移除該硬質罩幕層之一選擇性步驟。當硬質罩幕為PECVD氧化物時，可使用例如一種墊蝕刻。可自亞仕蘭(Ashland)化學公司取得墊蝕刻溶液。步驟(IV)係包括例如當硬質罩幕之存在可能造成阻塞而意欲在(V)中使用一個離子研磨步驟之情況。在步驟(V)中，使用犧牲柱狀體及使用披覆層作為一罩幕，而蝕刻島狀區材料層。島狀區材料可包含一種金屬，諸如金。可使用例如離子研磨或使用一種濕式蝕刻，進行島狀區材料之蝕刻。在步驟(VI)中，例如使用過氧化氫、XeF₂或SF₆，移除該犧牲柱狀體。當未採用步驟(IV)時，在一些情況下可藉由蝕刻除掉該犧牲柱狀體，而完成該柱狀體與硬質罩幕之移除。該製程導致在披覆層中形成一孔洞陣列，各孔洞具有由外露基板470所包圍之島狀區材料的一個島狀區460。

在本發明的多個實施例中，係在一種微製造製程中配置犧牲層。構成該犧牲層的材料係依其使用方式及該製程中所用的其他材料而定。適宜的犧牲材料一般所具有的性質係使其可選擇性地被蝕刻與移除，而不蝕刻與移除暴露於該製程部分的其他材料諸如披覆層、基板、島狀區材料等。在一些情況下，犧牲材料係包含一種半導體材料，諸如矽、鍺或矽/鍺。其例如可為非晶質矽、非晶質碳化矽或多晶鍺。在其他情況下，其可包括其他半導體，諸如包括砷化鎵的III-V半導體。在一些情況下，該犧牲層可包含一種金屬，諸如鈦或鎢。該犧牲層亦可包含一種介電質材料，諸如包括矽氧化物、矽氮化物或鈦氮化物之一種金屬氧化物或氮化物。該犧牲層一般為一種無機材料，但在一些情況下，其可包含一種有機材料諸如聚對二甲苯、光阻劑或另一種有機聚合物。在一些情況下，一犧牲層可包含一種旋塗式玻璃，其一般由於高溫熟化需求而非優先考慮者，但其可在一些情況下使用，例如當耐受較高的熟化溫度時。可依適合所欲沉積作用的材料與結構之方式塗佈犧牲層。適宜的方法例如包括化學氣相沉積作用(CVD)、原子層沉積作用(ALD)、濺鍍、蒸發作用、電鍍、無電式電鍍、分子束磊晶法(MBE)或旋轉塗佈。在一些情況下，諸如當犧牲層係用於塗佈孔洞的壁而提供用於形成一個島狀區之一開口時，則以保形方式進行犧牲層的塗佈作用，而非以將產生平坦化塗層之一方式。在一些情況下，諸如當塗佈一個第二犧牲層以保護一個島狀區材料免於在後續步驟中被蝕刻時，沉積該犧牲層及藉此形成一平坦化塗層。

就金奈米點的情況而言，可調節其在一個ZMW或其他反應區域中之直徑與高度，及若未使用附著促進劑，則可藉由將陣列暴露於鍺烷(GeH₄)而達成其與基板的附著作用，如Adhikari等人(2007年)於期刊“J. Appl. Phys.”第102期第94311-94316頁乙文。金係藉由GeH₄--->鍺+2H₂反應催化鍺烷的分解作用(Woodruff等人(2007年)於期刊“Nano Lett.”第7期第1637-1642頁乙文)，而產生如第5A與5B圖所示之具有一個金鍺尖端的鍺奈米線。如第5B圖所示，在鍺烷蒸汽540之存在下，固態/液態奈米顆粒510係位於固態平坦基板520上，導致形成具有由固態/液態奈米顆粒510所組成的一尖端之固態鍺奈米線560。可藉由調節製程條件與暴露於鍺烷之時間，而控制奈米線的直徑與長度。該陣列在暴露於鍺烷之前，基板可暴露於高溫(約300℃)而在基板上形成球體。就該類型的實施例而言，一般不需要固定奈米點，如經由鍺奈米線固定至該基板。

可使用可用的製造方法形成ZMW或其他反應區域陣列結構，如在已完成的奈米結構陣列上形成該反應區域陣列，藉此該奈米結構係位於各反應區域的一所欲部分(如位於一種ZMW陣列中之ZMW孔的底部)。用於製造ZMW陣列或其他適宜的反應區域之一種示例方法可包括：(1)表面清潔作用，清潔方法之類型及工作程序，係基於如在奈米結構陣列的生產作用終結時所用之消除阻抗方法的效用、奈米點對於基板的附著強度及歸因於步驟之間的時間及任何儲存環境所累積之外源污染；(2)一種ZMW(或其他陣列特徵)披覆金屬諸如鋁之沉積作用；(3)旋轉塗佈與在施用後烘烤一種正型化學擴增型阻劑；(4)電子束或其他適宜的微影技術；(5)曝光後烘烤；(6)光阻顯影；(7)光阻劑去除作用；(8)披覆層金屬之蝕刻作用；及(9)消除阻抗及最後清潔作用。該製程的一實例說明請參見第5C圖中所示之流程圖與說明。目前電子束技術之圖像配置或配準誤差，係足以在奈米點陣列上的零模式波導結構提供精確的圖案成形，如在一個6平方英吋的區域上。如參見美國紐約泰勒與法蘭西斯(Taylor and Francis)公司出版之S. Rizvi所編輯的“光罩製造技術手冊(Handbook of Photomask Manufacturing Technology)”乙書中之Saitou(2005年)的“電子束光罩繪圖機(E-Beam Mask Writers)”乙文。例如，來自威斯泰克(Vistec)公司的VB300電子束微影技術系統可達到的圖案成形誤差係小於10奈米。可取得之用於光罩製造的電子束系統諸如該等來自紐富來科技(Nuflare Technology)股份有限公司與JEOL者，係在一個6平方英吋區域上具有可相比的圖像配置面積。美國紐約的麥格羅-希爾(McGraw-Hill)出版公司出版之Eynon與Wu(2005年)所著“光罩製造技術(Photomask Fabrication Technology)”乙書；2007年版國際半導體技術藍圖(International Technology Roadmap for Semiconductors)。改變圖案成形步驟所用的披覆層金屬微影技術、奈米點金屬附著促進劑及基板材料，仍可達成本發明的主要目標。如下提供在陣列區域諸如ZMW中提供奈米結構之示例實施的更多細節。

在陣列中製造或固定化奈米顆粒

本發明的一項特性係達成將所感興趣的單分子裝載至一陣列的分析區域中之有效率的高密度裝載作用之能力。一類的實施例係藉由製造在反應區域中所沉積或製造的一奈米顆粒，而在陣列或反應區域諸如ZMW中達到較高水平的單一(或其他所欲數目)佔用式裝載作用。該奈米顆粒夠小，藉此僅單個(或另一所欲數目)分析物可與該顆粒結合。雖然這種方法特別適用於裝載分析物的單分子，如供單分子反應(如SMS)所用，將理解可在所選的反應區域內沉積或製造一所欲數目的顆粒，以達成任一所欲的特定數目分析物之特定裝載作用。

奈米顆粒選擇性地包括一個容易官能化的表面，以容許連接所感興趣的一分析物。例如，該顆粒可包含金，其能以標準巰基化學物質官能化。個別顆粒係夠小，藉此僅所欲數目的分析物(如一個)可與該顆粒結合，其係由於位於該顆粒表面的分析物之空間位阻交互作用之故。

例如，可藉由第6圖中所示之方法，進行如金屬奈米顆粒的固定化作用。尺寸自10至100奈米的金屬奈米顆粒係懸浮於一種負型光阻劑中，及旋塗於一熔融矽石、合成石英、硼矽酸鹽或一類似的基板上。使用電子束微影技術、深紫外線(DUV)微影技術、奈米壓印或其他可用的微影製程，製造直徑自50至200奈米的柱狀體。在該結構上沉積諸如鋁之一種金屬披覆膜。移除光阻劑，其方式係使得在新創建的各孔中留下一個單一奈米顆粒(如包含一個反應區域(如一種ZMW)。可將生物素/抗生物素蛋白/聚合酶繫留在奈米顆粒上(如金-硫-(CH₂)x(C₂H₄O)y-生物素)。奈米顆粒係夠小，藉此反應區域中之單個聚合酶或其他所感興趣的分析物可適合置於其上，而有效地限制該反應區域中的分析物數目。在後續的分析物裝載期間，該分析物能以相對高的濃度裝載至反應區域中，有效地在大部分或所有的顆粒上裝載一個分析物分子。將反應區域的多餘分析物清洗除去，造成在高百分比的反應區域獲得一個單一聚合酶或其他分析物。

使用定向沉積作用在一個ZMW中沉積一個小型結合位點島狀區

在一示例方式中，提供用於在一陣列特徵(如ZMW)底部或甚至簡單地在一個平坦基板上沉積一個小型島狀區或點之方法、系統及組成物，以創建相決定性特徵的一個異質表面，如供單分子連接之用。如上述，該島狀區/點例如可為一種金屬、介電質或半導體材料，在其上可藉由一連接基分子諸如一種以生物素為端基的聚(乙二醇)烷烴巰基之方式，而固定化一聚合酶或其他分析物，如上所詳述。

就一方面而言，使用一個具高的深寬比之結構及聯同非特異性、定向沉積作用，以使得島狀區夠小及藉此僅一個聚合酶可與一個島狀區結合。其可包括但不限於物理氣相沉積作用(PVD)諸如濺鍍、電子束蒸發作用與熱蒸發作用，或化學氣相沉積作用(CVD)諸如低壓CVD、電漿增強型CVD或高密度電漿CVD。類似的方法曾用於製造具有類似的長度尺度之奈米線，而展現這種方法的基本可行性。如第7A圖所示，藉由在一光阻劑與一披覆膜之間添加一緩衝膜，而創建一個具高的深寬比之圖案。任擇地，可使用一種雙層阻劑取代一種單層阻劑/緩衝劑層，以創建所需的尺寸。當以所欲的深寬比在ZMW孔或其他陣列特徵形成圖案之後，藉由PVD或CVD在整個結構上沉積一膜。藉由使用適宜的深寬比與沉積條件，在該膜上形成一個“土司麵包”型結構，而創建一罩幕及經由其小直徑而限制在該基板上的沉積區域。土司麵包型結構形成周圍的各向同性，如一種ZMW孔，自然地對位在ZMW凹洞中心的島狀區。能以連接基官能化所產生的島狀區表面，而與所欲的酵素如一聚合酶結合。

該整體方法亦可用於形成小型的點，及針對平坦基板上的一個單一聚合酶而確定該點的尺寸。該等基板可用於不需要一種ZMW結構之單分子分析技術中，諸如全內反射螢光(TIRF)。供平坦基板所用的一種方法流程係示於第7B圖中。

在一個ZMW中使用自我組合性單層與原子層沉積作用沉積一個小型結合位點島狀區

在該實施例中，使用不完全成型的自我組合性單層與原子層沉積作用(ALD)，以使得島狀區夠小及藉此僅一個聚合酶可與一個島狀區結合。該等技術係經常應用於形成奈米級電子產品之具類似尺寸的閘控介電質，而展現該方法之可行性。如第8A圖所示，該不完全的單層係作為一罩幕，及用於藉由ALD而在表面上形成一個島狀區。能以連接基官能化該島狀區表面，而與所欲的酵素如一聚合酶結合。不同於其他類型的沉積方法諸如濺鍍、蒸發作用及習用的化學氣相沉積作用(包括但不限於低壓化學氣相沉積作用、高密度電漿化學氣相沉積作用、電漿增強型化學氣相沉積作用等)，ALD係對於表面物種敏感及典型地不形成膜，除非存在與ALD前驅物及氧化劑反應之該等表面物種。藉由選擇用於披覆層膜與基板之適宜單層，ALD膜僅在基板上增長。形成不完全單層之材料諸如十八烷基三氯矽烷的沉積作用係可重複與可控制的，藉此可創建非常小(直徑<30奈米)的開口，而產生供ALD所用的一有效奈米罩幕。如上述，該方法亦可用於形成小型群集，及針對平坦基板上的一個單一聚合酶而確定該群集的尺寸。如上述，該等基板可用於不需要一種ZMW結構之單分子技術，諸如TIRF。用於平坦基板的一種方法流程係示於第8B圖。

有關製造不完全單層之更多細節，可參見如Richter等人於期刊“Phys. Rev. E”(2000年)第61期第607-615頁乙文。有關ALD之進一步細節，可參見Chen等人於期刊“Appl. Phys. Lett.”(2004年)第84期第4017-4019頁乙文。

在一個ZMW中使用一隔離膜沉積小型結合位點島狀區

在該實施例中，使用與用於電晶體間隔膜者類似的一結構作為同時控制該島狀區或點的位置與尺寸之一種自我對位性掩蔽層，以使得如點或島狀區夠小及藉此僅一個聚合酶可與一個島狀區或點結合。該方法使用亦如上述之一間隔膜或犧牲層。如第9A圖所示，藉由暴露於一種正型光阻劑及蝕刻通過三層，而創建一個多層膜式疊層。任擇地，可使用奈米壓印微影技術創建一種正型類阻劑圖案。藉由原子層沉積作用(ALD)或化學氣相沉積作用(CVD)，將間隔膜沉積在蝕刻圖案上。使用一種定向蝕刻，創建在ZMW孔周圍形成各向同性之一個間隔物結構，其自然地對位一空間，而將島狀區膜沉積在該ZMW凹洞的中心。藉由物理氣相沉積作用(PVD)或CVD沉積島狀區材料。將整個疊層平坦化，以暴露出緩衝層與間隔物材料，藉此其等可藉由濕式蝕刻作用移除。存在第9A圖中示為綠膜之一個拋光擋板/濕式蝕刻障壁，以在最後二個步驟期間保護披覆層膜。有關適用於該實施例之進一步細節技術，請參見Cerofolini等人(2005年)於期刊“Microelectr. Eng.”第81期第405頁乙文。

亦可採用該方法，如使用TIRF，而形成亦針對平坦基板上的一個單一聚合酶而確定其尺寸之小型島狀區。供平坦基板所用的一種方法流程係示於第9B圖。在該情況下，若阻劑係單獨使用或聯同緩衝層使用，則低溫ALD係適用於沉積在阻劑結構上之沉積作用。第9A與9B圖所說明之技術產生一島狀區表面，其可經由如與聚合酶結合之連接基而官能化。

使用光阻劑的背面曝光作用在一個ZMW中沉積金屬奈米顆粒

亦可藉由第10圖所示之方法，達成奈米顆粒如金屬奈米顆粒之固定化作用。使用目前的方法製造ZMW之後，尺寸自10至100奈米的奈米顆粒係懸浮於一種負型光阻劑中及旋塗至ZMW結構上。ZMW的背面係暴露於照射而與該阻劑交聯。選擇波長，藉此照明區域係位於ZMW孔的底部。照例移除未交聯的阻劑。藉由灰化或其他方式移除所剩餘的光阻劑，而在ZMW孔中留下奈米顆粒。

藉由更小型奈米顆粒的退火作用而在一標的區域中創建顆粒

在一實施例中，緊密堆積在一表面上之單層小型奈米顆粒可進行退火，以聚結而形成一個單一的較大型顆粒。該技術使用在一陣列的一所欲部分(如在該陣列的ZMW底部)中沉積單層小型奈米顆粒(如直徑1.5奈米的顆粒)之作用，接著進行該試樣之退火作用。該等顆粒在ZMW底部聚結而形成一或多個較大型顆粒，提供用於所感興趣的一分析物之有限數目的結合位點。所產生顆粒之尺寸係依該奈米顆粒單層的組成如間距、密度、顆粒尺寸等而定。可調整該等參數，藉此該顆粒之尺寸僅容許一個單一聚合酶適合置於其上。

使用嵌段共聚物微膠粒奈米微影技術在一個ZMW中沉積一顆金粒

就一方面而言，使用嵌段共聚物微膠粒奈米微影技術，以製造奈米尺寸的金(或其他奈米材料)沉積物之在空間上明確界定的沉積物，其可官能化作為用於結合單一分析物分子之相決定性特徵。在該製造程序中，ZMW(或其他小型陣列特徵)係作為供嵌段共聚物微膠粒的自我組合所用之預先結構化導引，而產生與ZMW(或其他陣列特徵)直徑相稱之尺寸。其在各波導產生一個微膠粒，及亦造成將例如一金點或群集定位在該波導的中心。該等群集係安定與固定的，及呈現用於與如經由上述金式化學物質或其他適宜的化學物質適當標記或衍生之所感興趣的分子偶合之適宜的基板位點。點/群集的小型尺寸(如可製造直徑小至2奈米的金點)確保該分析物係以單分子佔用各ZMW(或其他陣列特徵)，因蛋白質與其他分子典型地大於該金點的最小尺寸，及將在空間上阻止各點與一個以上的分析物分子結合(如T7DNA聚合酶的直徑約為10奈米)；因此，在第一分析物結合之後，其他分析物分子則在空間上難以接近該結合位點。其容許在過量的分析物(如過量的聚合酶)之條件下將一種ZMW或其他陣列反應區域官能化，確保各ZMW或其他陣列區域含有一個單一分析物分子，接著藉由清洗作用移除未結合的酵素。

有關藉由嵌段共聚物微膠粒奈米微影技術所製備的金點之用於與單一蛋白結合的官能化方案之更多細節，可參見如Glass等人(2003年)於期刊“Nanotechnology”第14期第1153-1160頁之“嵌段共聚物微膠粒奈米微影技術(Block copolymer micelle nanolithography)”乙文；Glass等人(2003年)於期刊“Adv. Funct. Mat.”第13期第569-575頁之“藉由使用無機嵌段共聚物微膠粒單層作為供電子束微影技術所用的負型阻劑所製造之微米-奈米結構化界面(Micro-nanostructured interfaces fabricated by the use of inorganic block copolymer micellar monolayers as negative resist for electron-beam lithography)”乙文；Haupt等人(2003年)於期刊“Adv. Mater.”第15期第829-831頁之“使用從無機嵌段共聚物微膠粒的自我組合性結構所形成之模板而創建之奈米多孔性金膜(Nanoporous gold films created using templates formed from self-assembled structures of inorganic-block copolymer micelles)”乙文；及Arnold等人(2004年)於期刊“Chemphyschem.”第5期第383-388頁之“藉由奈米圖案化附著性界面之整合蛋白功能的活化作用(Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces)”乙文。

奈米結構化聚合酶結合位點之電化學增長作用

在一類型的實施例中使用一電流，以促使可用於結合所感興趣的一分析物之一奈米結構之成核增長。在該實施例中，一電極可置於ZMW或其他陣列之下，及在該電極與ZMW之間具有一個透明的導電基板。來自該電極的少量電流促成位於ZMW底部的一個小型奈米結構之成核增長。一旦該結構成核之後，該結構更加可能回應進一步的電流而繼續增長，相較於待成核的另一奈米結構而言。在該結構仍小至僅一個聚合酶或其他分析物適合置於其上之際，關閉電流(停止該結構的增長)。可經由此述之適當化學物質而官能化該奈米結構。當聚合酶或其他奈米結構係以高濃度裝載時，僅一個聚合酶可與各ZMW內的奈米結構結合。

在一個單一ZMW中沉積一個單一核殼型顆粒

如此述，可在諸如ZMW的奈米級孔洞內創建顆粒的島狀區，其係藉由1)將孔洞陣列暴露於核殼型顆粒，其尺寸使得在一個孔洞中沉積一個核殼型顆粒，然後2)移除該殼材，藉此將該核心沉積至孔洞中。所沉積的核心之尺寸，例如直徑自約2奈米至約20奈米，可使得在該孔洞內僅一個所感興趣的分子諸如一酵素與其結合。該核心例如可為一種金屬或金屬氧化物材料。在一些情況下，該核心係由金所組成。該殼一般由即可移除而不損及核心顆粒或奈米級孔洞之一種材料所組成。在一些情況下，該殼包含一種有機聚合物。可製造有機聚合物殼，其造成該核殼型顆粒在溶液中的良好分散性。該溶液可與一奈米級孔洞陣列接觸，藉此在一個奈米級孔洞中一般沉積一個核殼型顆粒。

在沉積作用之後，即可移除有機材料而不損及核心顆粒或奈米級孔洞。可選擇性地使用一電漿、高溫及/或經由氧化作用移除該有機材料。電漿例如可為一種氧化性或一種還原性電漿。在一些情況下，用於移除該殼之處理亦例如經由氧化作用或還原作用而轉變該核心材料。該核心顆粒例如可包含：處於對應的氧化階段之金、鉑、鈀、銀、銦、鐵、鋯、鋁、鈷、鎳、鎵、錫、鋅、鈦、矽及鍺或其混合物。該殼材可包含選自嵌段共聚物、接枝共聚物、微分支聚合物、具有不同分支的星型聚合物、樹枝形聚合物、微凝膠顆粒、星型嵌段共聚物、嵌段星型聚合物及核殼型乳膠聚合物之一種聚合物。在一些情況下，該聚合物為聚苯乙烯-b-聚乙烯氧化物、聚苯乙烯-b-聚(2-乙烯基吡啶)、聚苯乙烯-b-聚(4-乙烯基吡啶)或其混合物。用於製造與沉積該等核殼型聚合物之方法，例如述於頒證Spatz等人之歐洲專利EP 1027157中及述於頒證Moller等人之歐洲專利EP 1244938中。

可如此述官能化所沉積的核心顆粒，以將所感興趣的一個單分子連接至該顆粒。例如，與金屬諸如金偶合之選擇性方法，係技藝中所知及如此處所述。含巰基化合物可用於選擇性偶合至一個金表面。例如，生物素-PEG-烷烴-巰基可選擇性地與該金粒反應。在一些情況下，除了將所感興趣的分子偶合至該表面之外，處理其他表面以阻止所感興趣的分子或其他反應化合物與陣列的其他一些部分之無用的結合作用係有用的。

在一個例示性實施例中，提供在一矽石表面上的一層鋁披覆中之一奈米級孔洞陣列。藉由原子層沉積作用(ALD)，以氧化矽處理該陣列，而在該陣列上產生氧化矽塗層。在其等的核心具有金屬或金屬氧化物鹽類諸如HAuCl₄及具有嵌段共聚物殼之微膠粒係沉積在該陣列上，藉此一般在一個孔洞中沉積一個微膠粒。以電漿處理該陣列，藉此該嵌段共聚物殼被降解及移除，而一個直徑約8奈米至約12奈米的單一金屬顆粒如一金點係沉積至一孔洞中。選擇性地以一種偶合劑諸如生物素-PEG-矽烷-SH官能化該金屬點，諸如一金點。然後使用矽烷化學物質鈍化該表面的剩餘部分，例如使用矽烷-PEG之處理，其中PEG係以甲氧基、羥基或羧酸為端基。然後使用抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白，將其上連接一生物素之所感興趣的分子偶合至該表面。選擇官能化金屬點之尺寸及所感興趣的分子諸如一酵素之尺寸，藉此在各孔洞內一般僅連接一個所感興趣的分子。

在一陣列特徵中形成單一分析物結合位點

與用於將一奈米結構置入一種ZMW(或其他陣列特徵)中以促進一分析物的超卜瓦松裝載作用之方法類似，本發明亦提供用於可將例如一個單一分析物結合至陣列特徵中之結合基的定位方法，而毋需使用一奈米結構來提供結合位點。在該類型的實施例中，分析物分子的結合位點未必位於一官能化顆粒或其他奈米結構上，而是可直接形成在陣列特徵上。例如，使用該類型的實施例，可能在一種ZMW的底部形成可與一分析物分子結合之一個小型官能化區域或島狀區，如其中該官能化區域係小至一次僅一個分析物分子可與該官能化區域結合。

如同上述之方法，將一個單一分析物結合位點置入ZMW或其他陣列反應區域中，使其有可能以所欲數目的分析物分子(聚合酶、模板等)完全裝載該陣列，其係藉由將高濃度的分析物導入該陣列中，然後在與分析物結合位點結合之後，清洗除去該陣列的多餘分析物。正如此處之其他實施例，這種方法特別適於將一個單一分析物分子輸送至一陣列的各反應區域，雖然如有需要，亦可能使用類似方法而在一陣列反應區域中置入一個以上的分析物結合位點。就單分子定序應用而言，通常希望該類型實施例之方法係用於將單一分析物分子裝載至一個ZMW或其他陣列反應區域中。

在一些實施例中，此述之微製造方法可用於在一個奈米級孔洞內製造一官能性島狀區，諸如由一個隔離材料區域所包圍之基板材料的一個島狀區，該基板材料與隔離材料具有充分不同的化學性質，以選擇性地官能化該基板材料而用於結合所感興趣的一個單分子。當基板表面包含一種矽基材料時，可使用矽烷表面化學物質而選擇性地官能化該材料。在一種氧化鋁表面之存在下，該矽烷化學物質可用於官能化一種矽基表面。用於選擇性官能化表面之方法係如在此所詳述者。

第11圖說明本發明的一種方法之一實施例，其係用於在由一隔離層所包圍之一個奈米級孔洞內形成基板的一個島狀區。提供在其上面具有一披覆層1110之一基板1100。該披覆層具有延伸通過披覆層而達基板的奈米級孔洞1105之一陣列。該基板通常是一種透明基板，諸如熔融矽石或石英。披覆層可為一種金屬，諸如鋁或一種鋁合金。在步驟(I)中，在該基板上沉積一隔離層1120。該隔離層一般以一保形層的形式沉積，藉此塗佈該孔洞的壁以及基底。該隔離層一般是比較薄的一層，例如約2奈米至約10奈米厚。可使用原子層沉積作用(ALD)沉積該隔離層。該隔離層可包含一種金屬氧化物材料，諸如氧化鋁。

在步驟(II)中，以保形方式塗佈一犧牲材料1130，藉此其塗佈該孔洞的壁。選擇犧牲層的厚度，藉此留存在經塗佈的壁之間之一開口。該開口的橫向尺寸W_O係示於第11圖中。該開口將用於形成官能性島狀區。該孔洞的壁上之犧牲間隔物的厚度(T_S)，係依W_O=W_Z-2T_S而與該開口的尺寸相關，其中W_Z係該孔洞開口的尺寸。該犧牲材料可包含矽、鍺或矽/鍺。

在步驟(III)中，以一定向(各向異性)方式蝕刻該犧牲層，以暴露出該孔洞內的隔離層表面，但留下該孔洞的壁上之犧牲材料。在步驟(IV)中，蝕刻該氧化鋁隔離層。該蝕刻作用可為一種定向(各向異性)蝕刻。其可使用例如氯氣進行。在一些情況下，該蝕刻可延伸至基板中。

在步驟(V)中，例如使用過氧化氫、XeF₂或SF₆，移除該犧牲材料。該方法在該奈米級孔洞內產生亦稱為一奈米凹點之基板材料的一個島狀區1150，其係由隔離材料1140的一區域所包圍。由W₁所代表之島狀區尺寸，係與W_O相近，因該犧牲層在用於製造該島狀區之蝕刻步驟期間係作用為一罩幕。在一些情況下，在本發明的該實施例與其他實施例中，隔離層將包含氧化鋁，及披覆層將包含鋁金屬。若是這種情況，當鋁金屬暴露在空氣中時一般將具有一氧化鋁塗層，因而不論隔離層已被移除與否，所有的披覆層表面將包含氧化鋁。在意欲後續處理例如將不屬於該島狀區的表面鈍化之情況下，該特性係有用的。當島狀區以外之實質上所有表面皆包含氧化鋁時，可在該等所有表面使用一類型的鈍化化學物質而簡化製程，藉此產生再現性較高、品質較高的基板。

雖然如所示，披覆層1110係直接沉積在該基板1100上，在一些情況下，在該等層之間可存在一層材料。在一些情況下，該附加層將延伸至奈米級孔洞的基底。若是這種情況，在製程結束時，該孔洞內的島狀區可具有該中間層的表面而非外露的基板表面；或除了外露的基板表面之外，還具有該中間層的表面。

第12圖提供用於在奈米級孔洞的一陣列內形成由隔離層所包圍之基板的一個島狀區之一種任擇方法。提供一基板1200。該基板通常為一種透明基板，例如熔融矽石或石英。在步驟(I)中，在該透明基板上沉積一隔離層1210。該隔離層一般是比較薄的一層，例如約2奈米至約10奈米厚。可使用原子層沉積作用(ALD)沉積該隔離層。該隔離層可包含一種金屬氧化物材料，諸如氧化鋁。

在步驟(II)中，形成延伸通過隔離材料之奈米凹點1220的一陣列。該等奈米凹點將成為基板的島狀區，及因而通常比較小；其橫向尺寸係介於約2奈米與約40奈米之間，或介於約5奈米與約20奈米之間。在一些情況下，由於該等特徵的小型尺寸，可使用電子束微影技術或紫外線微影技術來製造該等特徵。當使用電子束微影技術時，可使用來自瑞翁株式會社(Zeon Corporation)的一種電子束阻劑諸如ZEP520A及一種正型阻劑。在其他情況下，使用紫外線之高解析度微影技術可用於界定奈米凹點。可使用反應性離子蝕刻(RIE)，例如使用一種氯氣電漿，進行氧化鋁層的蝕刻作用。在一些情況下，氧化鋁層的蝕刻作用造成部分蝕刻進入透明基板中。在一些情況下，蝕刻進入透明基板中係有利的。進入透明基板中的蝕刻作用一般相當淺，例如進入該基板約1奈米至約25奈米，或約2奈米至約10奈米。

在步驟(III)中使用一阻劑，以在各奈米凹點上面製造一奈米級特徵或柱狀體1230。奈米級特徵1230的尺寸與形狀將決定該奈米級孔洞的尺寸與形狀。例如可使用一種負型阻劑來製造奈米級特徵。當使用電子束微影技術時，可使用來自住友商事株式會社(Sumitomo Corporation)之一阻劑，諸如NEB31。在步驟(IV)中，例如以加熱方式或以電子槍，依定向或直視性方式沉積一披覆層1240。進行沉積作用，藉此在奈米級特徵邊緣留存未被披覆層塗佈之一間隙。步驟(V)係涉及奈米級特徵的移除作用，藉此將奈米級孔洞與奈米凹點上的披覆蓋移除。當使用一阻劑形成奈米級特徵1230時，可使用來自希普勵(Shipley Corporation)公司之一溶劑，諸如1165去除劑。該方法所製造的之奈米級孔洞，係具有由隔離材料1250所包圍之外露基板材料1260的一個島狀區。當披覆層包含鋁時，披覆層若暴露於鋁將造成披覆層表面包含氧化鋁。若是這種情況及該隔離層包含氧化鋁，則可使用一組的鈍化化學物質來處理該外露基板的島狀區以外的表面。

就第12圖中所示之方法而言，有二個分開的微影技術步驟，其中一個步驟係用於製造奈米凹點，而另一步驟係用於製造奈米級孔洞。為確保最終島狀區係鄰近該奈米級孔洞的中心，重要之處在於該二微影技術步驟之間有精確的對位。為確保良好的對位，吾等已發現在該基板中形成配準特徵係有利的。一般在進行第12圖的步驟之前，進行配準特徵之形成作用。在一些情況下，將配準特徵蝕刻在基板中。在其他情況下，將配準特徵沉積在基板中。第13A圖說明用於製造供該程序所用的對位特徵之一種較佳的方法。提供如上述在其上面具有一硬質罩幕層1310諸如鋁之一基板1300，及該硬質罩幕在其上面具有一阻劑1320。在步驟(I)中，將阻劑顯影及形成圖案。在該步驟中可使用來自瑞翁株式會社的一種電子束阻劑諸如ZEP520A。在步驟(II)中，蝕刻該硬質罩幕。當硬質罩幕係鋁時，可使用一種氯化電漿反應性離子蝕刻作用。在步驟(III)中，蝕刻該基板。當基板係熔融矽石時，可使用一種氟電漿進行基板蝕刻作用。可進行蝕刻作用，以提供有效的配準標記。配準標記可具有任一適宜形狀，當從上方檢視時，一般同時具有垂直與水平線。第13(B)圖係顯示具有包含一奈米級孔洞陣列的一個中央區域1340之一代表性基板，該等奈米級孔洞各在其內具有外露表面的一個島狀區。該基板具有四個配準標記1330，各為“+”的形狀。

第14圖係顯示用於製造奈米級孔洞的一陣列之一種任擇方法，該等奈米級孔洞各在其內具有外露表面的一個島狀區。該方法一般涉及在該孔洞中沉積一個單一顆粒，及當在孔洞基底上塗佈一隔離層時，使用該顆粒以掩蔽一部分的孔洞基底，然後移除該顆粒以暴露出該顆粒所掩蔽的表面部分。提供具有通過一披覆層1410之奈米級孔洞1405的一陣列之一基板1400。在一些情況下，在披覆層與透明基板之上，例如藉由原子層沉積作用而在該基板預先塗佈一薄層。該層例如可包含氧化鋁。

在步驟(I)與(II)中，在該奈米級孔洞內沉積比該孔洞更小的一島狀區顆粒。在步驟(I)中，沉積一核殼型顆粒，藉此在一個單一孔洞中一般僅沉積一個核殼型顆粒1420。例如，該核殼型顆粒之尺寸係夠大，使得一旦一顆粒位於一孔洞中之後，該核殼型顆粒在空間上阻止第二個核殼型顆粒沉積至該孔中。該核殼型顆粒可為例如由一種有機聚合物殼所包圍的一種金屬或金屬氧化物核心顆粒。在步驟(II)中，移除該顆粒的殼部分，藉此將對應於該核殼型顆粒的核心之一個單一小型顆粒1425沉積至該孔洞中。可將殼移除，例如藉由一種電漿處理而選擇性地降解構成該殼的有機材料。在一些情況下，該核心顆粒係簡單地沉積至該孔洞中；在其他情況下，該核心在殼移除期間被轉變，例如自一鹽類或氧化物還原成一金屬。雖然在第14圖中之單一顆粒的沉積作用係使用一種核殼型顆粒進行，據瞭解沉積作用能以其他方式進行，包括此述之使用其他篩分基團而提供一個形成單一島狀區的顆粒之沉積作用。

在步驟(III)中，沉積一隔離層1430以塗佈包圍該顆粒之基板區域。該沉積作用能以保形方式進行，藉此如第14圖所示塗佈該孔洞的壁。在其他實施例中，該隔離層係以定向方式沉積，以選擇性地塗佈橫向表面；及在其他實施例中可進行沉積作用，藉此隔離層係選擇性地在基板表面上增長。該顆粒係作用為一罩幕，以阻止隔離層沉積在該孔洞基底的中央部分上。該隔離層可包含一種無機或有機材料。該隔離層例如可包含一種金屬氧化物，諸如氧化鋁或氧化矽。在一些情況下，該隔離層可包含使用原子層沉積作用(ALD)所沉積的氧化鋁。當該基板係一種矽基材料諸如熔融矽石及該顆粒包含一種金屬諸如金時，可選擇性地在該基板及/或披覆層上沉積一種氧化物諸如氧化鋁，而毋需實質上沉積在該金屬顆粒上。如上述在一些情況下，在步驟(I)之前，該基板具有位於該基板上的諸如一種ALD層之一層。在該等情況下，一隔離層的沉積作用係使用與第一塗層不同的一種材料。在一些實施例中，例如在該等顆粒的沉積作用之前，在基板上塗佈一種氧化鋁ALD層，及在步驟(III)中沉積一種矽烷諸如PEG-矽烷而作為被該顆粒所掩蔽的一隔離層。

在一例示性方法中，一顆粒諸如金係沉積在一矽石表面上之鋁披覆層的孔洞中。在包圍該顆粒之矽石表面的一些部分上，沉積一種矽烷鈍化層例如一種矽烷-聚乙二醇，以作用為隔離層。在另一個選擇性步驟中，亦使用一種磷酸酯或膦酸酯化合物諸如Albritect^TM CP30或聚乙烯基膦酸(PVPA)鈍化披覆層。適宜的矽烷與含磷酸酯化合物係述於例如第2008/0032301號美國專利申請案，其係就各方面在此併入本案以為參考資料。在另一例示性方法中，在具有一矽石表面的鋁披覆層中之一孔洞陣列上，施用一塗層諸如氧化矽(SiO_X)塗層或氧化鋁塗層。該塗層在該陣列上提供均一性表面化學。沉積顆粒諸如金粒，藉此在各孔洞中通常僅一個顆粒。當沉積氧化矽塗層時，則使用矽烷化學物質，以在該陣列上產生一隔離層。例如，在未被該顆粒所掩蔽的表面上沉積一種矽烷-PEG。所用的矽烷-PEG能以甲基為端基、以羥基為端基或以羧基為端基。當使用氧化鋁塗層時，可使用膦酸酯或磷酸酯化學物質，以將未被該顆粒所掩蔽的氧化鋁塗層區域鈍化。

該隔離層一旦沉積之後，在步驟(IV)中將顆粒移除，以暴露出該表面被顆粒所掩蔽的部分。移除該顆粒及暴露出在該表面上的一個島狀區1450，其所具有的表面化學係不同於其周圍的隔離層1440，而容許一個所欲的分子選擇性偶合至該島狀區上。當外露的島狀區包含一種矽石表面時，可使用矽烷化學物質以選擇性地官能化該島狀區。例如，一種生物素-PEG-矽烷將選擇性地與島狀區表面結合，而實質上未與包含經PEG塗佈的表面之一隔離層結合。當外露的島狀區包含氧化鋁時，可使用膦酸酯化學物質以選擇性地連接一種偶合劑，例如使用一種生物素-PEG-膦酸酯或一種生物素-PEG-PVPA。可將顆粒移除，例如藉由選擇性地蝕刻或溶解該顆粒。當該顆粒包含金時，可使用例如一種碘/碘化鉀蝕刻劑或一種氰化鉀式蝕刻劑。該核心可包含其他金屬，諸如鉑、鎳或鋁。當所沉積的顆粒包含鋁時，可使用磷酸酯式蝕刻劑來移除該顆粒。當所沉積的顆粒包含鎳時，可使用一種三氯化鐵蝕刻劑。

藉由控制該核殼型顆粒的核心尺寸，可改變該掩蔽顆粒之尺寸。核殼型顆粒之核心與殼的尺寸之控制係技藝中所知，例如藉由形成具有含金屬鹽類的核心之微膠粒。如參見頒證Spatz等人之歐洲專利EP 1027157及參見頒證Moller等人之歐洲專利EP 1244938。例如，可使用調配物中之金屬鹽類諸如HAuCl₄或Pt(OAc)₂的相對量，來控制所沉積的金屬顆粒之尺寸。藉由控制組成與溶劑條件，可控制殼的尺寸，例如藉由控制用於形成微膠粒之嵌段共聚物的分子量。在一些情況下，該掩蔽顆粒的直徑係約2奈米至約40奈米。在一些情況下，該掩蔽顆粒的直徑係約4奈米至約20奈米。在一些情況下，該掩蔽顆粒的直徑係約5奈米至約15奈米。

在一些情況下，在例如以一種官能化劑諸如生物素-PEG-矽烷將該島狀區官能化之後，可藉由專門移除披覆層的官能化劑之一作用劑，移除與披覆層而非與島狀區結合之任何過量的官能化劑。該等作用劑可包含酸性化合物，尤其是包含磷酸鹽或膦酸鹽基之化合物。在一些情況下，用於專門移除披覆層的官能化劑之作用劑係一種以膦酸酯封端的聚合物，諸如來自羅地亞(Rhodia)股份有限公司的聚乙烯基膦酸(PVPA)、阿柏利泰(Albritect) CP-30、阿柏利泰CP-10、阿柏利泰CP-90、阿侉利特(Aquarite) ESL或阿侉利特EC4020。

第15圖說明本發明在一孔洞陣列中的一孔洞內用於形成由一隔離層所包圍之基板的一個島狀區之一種方法的另一實施例。提供具有一犧牲層1510與一硬質罩幕層1520之一基板1500。在步驟(I)中，在硬質罩幕層形成圖案及蝕刻以製造特徵1525之一陣列，其將用於界定一奈米級孔洞陣列。在步驟(III)中使用硬質罩幕層作為一罩幕，蝕刻該犧牲層，以移除未被硬質罩幕覆蓋之犧牲材料的一些部分，及底切該硬質罩幕以形成柱狀體1540。該蝕刻製程可分兩個步驟進行，其中一步驟係移除大量的犧牲材料，而第二步驟係進行底切，例如其中第二步驟係使用一種乾式蝕刻底切。在步驟(III)中，沉積一層隔離材料1550。沉積該隔離材料，藉此其在懸垂的硬質罩幕層下方延伸而達犧牲層的柱狀體1540之基底。隔離材料例如可為使用濺鍍作用所沉積的氧化鋁。在步驟(IV)中，沉積一披覆層1560。該披覆層可為一種金屬，諸如鋁或一種鋁合金。沉積該披覆層材料，藉此其並未在懸垂的硬質罩幕層下方延伸，而在披覆層邊緣與柱狀體之間產生一空白區域。可使用蒸發作用沉積隔離材料。在步驟(V)中移除犧牲層與硬質罩幕層，造成移除隔離層的一些部分及硬質罩幕的一些部分上之披覆層。在一些情況下，例如使用過氧化氫、XeF₂或SF₆，進行犧牲層的蝕刻作用。該方法導致形成一奈米級孔洞，其具有在基底係由一隔離材料區域所包圍之基板表面的一個島狀區。

化學拋光一種ZMW或其他陣列特徵以留下一個小型分析物結合位點

在一種方法中，使用化學拋光以在一個ZMW或其他陣列反應區域的底部形成一個分析物結合位點。第16圖係顯示該方法之一示例流程圖。在基板1610(如一種玻璃、石英或矽基板)上的披覆材料1600(如鋁)中，形成反應區域1620(如ZMW)或其他陣列特徵的一個初始陣列。初始披覆層的厚度係大於一個最終陣列中之披覆層的最終所欲厚度，及反應區域1620(如披覆層中的孔)等之直徑係小於最終的所欲陣列區域(如該等孔係小於形成一個ZMW陣列之ZMW)。

第16圖子圖(b)中所示方法之第一步驟，係將官能化材料1630諸如peg-矽烷(如生物素-peg-矽烷)沉積在經披覆材料1600覆蓋之基板1610的表面(有關適宜的鏈接化學物質之更多細節可參見本文)。官能化材料係沉積在鋁上以及在披覆層材料中之孔1620的底部之玻璃或矽表面上，但在化學拋光期間被移除。

藉由將官能化披覆基板浸入高溫的膦酸浴(如90℃的聚乙烯基膦酸)中，而提供拋光步驟。該酸不均一地蝕刻(如鋁)披覆1600。位於該孔的底部之表面如玻璃、熔矽、石英或類似者，不容易受到膦酸之侵蝕。示於第16圖子圖(c)之所產生的結構，係由一個經膦酸酯處理的ZMW(或其他特徵)陣列所組成，其所具有之一個官能化中心的直徑係大於通過披覆層的原始孔。藉由控制初始披覆厚度、材料及孔直徑，可能在熔融矽石表面的中央產生一個非常小的官能化區域。該官能化區域之尺寸可小至僅一個經適當官能化的單一分析物可與該小型官能化區域結合。例如，若該分析物的直徑係近似10至15奈米，則官能化區域可近似或少於如約10至25奈米以下。

該一表面係在一種在其他情況鈍化的ZMW之底部中用於達成一個單一的活性分析物(如聚合酶)之超卜瓦松裝載作用之一理想平臺。若官能化區域夠小，則在各ZMW內可結合例如僅一個聚合酶。

藉由蒸發作用在一陣列特徵諸如一種ZMW中沉積一個小型分析物結合位點

在一實施例中使用一蒸發策略，以在一種ZMW或其他陣列特徵的中央留下一官能化區域。該陣列的ZMW孔係裝有含低濃度溶質的一滴溶劑(水或適合官能化作用化學的其他溶劑)。該溶質係同時可與表面及分析物結合(如可與一種DNA聚合酶結合)之一連接基分子。當該滴自表面蒸發至中心時，該連接基係在ZMW或其他陣列特徵的中心濃縮。該連接基最後在該陣列的ZMW中心沉澱。該連接基可藉由加熱、暴露在光線下或其他任何適宜的連接基固定方法，而以化學方式吸收至ZMW。藉由最佳化連接基的濃度與溶劑，可能在ZMW或其他特徵中形成該連接基之一個非常小型的區域，如小至僅一個分析物單分子可與該區域結合。

如藉由將分析物流至該陣列上，而在ZMW或其他陣列特徵中沉積聚合酶或其他分析物。清洗除去游離的分析物，留下與ZMW的中心結合之一分析物。

傾斜角蒸發作用

在上述方法的一個變異形式中，使用傾斜角蒸發作用以掩蔽掉一陣列特徵的一部分(如掩蔽掉一個ZMW之底部表面的一部分)，留下可經官能化而用於結合分析物之一個小型未掩蔽區域。所產生的官能化區域可小至僅一個單一分析物可與該區域結合。在該實施例中，在陣列特徵中(如在該陣列的ZMW中)，進行一塗層的蒸發作用。若該試樣在一蒸發器中傾斜，ZMW的一部分底部係未被塗層覆蓋。若該試樣在蒸用期間旋轉(第17圖)，則可能在不含有塗層的ZMW之中心形成一個未經塗佈的島狀區(這種方法典型地保留ZMW底部的中心未經塗佈，其係適合需要的)。然後可在該島狀區添加供分析物所用的一個結合位點(如聚合酶)。該結合位點僅與在未經塗佈的島狀區之區域之ZMW或其他陣列特徵的底部連接，亦即在底部其他部分上的塗層係阻斷經塗佈區域的官能化作用。該結合位點可夠小，藉此僅一個單一聚合酶或其他分析物將輕易地與其結合。

非隨機裝載作用

本發明的一個較佳部分係包括將核酸、酵素及其他分析物非隨機(及非卜瓦松限制式)輸送至一陣列的孔或其他反應區域中。一般而言，可配置本發明的分析物(及/或陣列組分)，藉此輸送一個單一分析物(或其他所欲數目的分析物)至各區域。其可依此述數種方式中之任一者達成，包括藉由將基團偶合至分析物以在空間上及/或在靜電上阻止裝載一個以上的分析物，或如藉由在陣列區域中納入供分析物所用的一個單一結合位點，或如藉由分析物的疊代裝載作用，或如藉由主動控制分析物的裝載作用，或如藉由該陣列用以控制分析物裝載之暫時性或永久地配置特徵。在此詳細論述該等與其他程序。相較於其中藉由陣列整體之欠載而產生分析物的單分子分布之隨機裝載方法，此處的方法容許實質上更全面地將單分子分析物裝載至陣列中。如先前所指出，僅當少於約36%的所有觀察體積被裝載時，分析物在陣列中之隨機分布導致在大部分的反應/觀察體積中裝載一個或更少的分析物。該類型的卜瓦松限制式分析物裝載作用導致在該陣列中添加夠少的分子，藉此分析物分子在該陣列中之一種卜瓦松式隨機統計分布造成各觀察體積具有一個或更少的分析物(在大多數情況下)。先前技術針對於一範圍的ZMW直徑(如70至100奈米)已獲致約30%的單分子佔有率。參見此處之Foquet(2008年)乙文。若使用該等隨機裝載方法，則一個ZMW陣列中約有60%的ZMW並未裝載(亦即不具有分析物分子)。

本發明的各種方法可提供所感興趣的相關分析物之高達100%的裝載頻率。該等高裝載效率係可能的，如因為該陣列典型地並未在該陣列的一分析區域中接受及/或結合一個以上的分析物(如藉由各孔分配或產生一個分析物結合顆粒或一孔的各分析區域分配或產生一個顆粒)，或因為分析物輸送至該孔或其他陣列區域之輸送作用受到控制。藉由延長適當的培養時間及/或增加顆粒濃度，而達成更完全的裝載作用。嫻熟技藝者當然可選擇在該陣列之少於100%的孔中裝載。本發明之典型顆粒式陣列可包括超過30%，通常超過37%(近似達到最大單一分析物分子佔用率之卜瓦松隨機裝載限值)，典型地38%以上，經常高達50%以上及較佳高達60%、70%、80%或90%以上之該陣列的孔，係在各孔的一分析區域中裝載一個單分子(或任擇地即為各具有一個單一分析物分子之該等孔)。在一些情況下，所固定的一分析物分子係包含一種生物分子，諸如聚有一活性的一種酵素。當使用一種活性生物分子諸如一酵素時，一般所欲者係該酵素具有活性，藉此其可進行其自然功能，諸如催化一種化學反應。本發明的方法、基板及系統不僅容許在孔內達到較高水平的單分子裝載作用，亦容許較高水平的活性單分子裝載作用。因此，典型地38%以上，經常高達50%以上，及較佳高達60%、70%、80%或90%以上之該陣列的孔，係在各孔的一分析區域中裝載一個單一的活性分子。用於達成顆粒的非隨機裝載作用之種類繁多的方法、系統及組成物係說明於本文中。

待裝載分析物之陣列特徵係依所論及的應用與可用的設備而定。陣列可包括之特徵諸如孔、凹處、凹槽、波導、零模式波導、腔、微射流通道、溝、磁化區域、未磁化區域、蝕刻結構、機械加工結構、掩蔽式或未掩蔽式分析區域、容許分析物進入任一分析區域之罩幕、陣列中的顆粒或其他分析物結合位點之排列、陣列中之相距如至少50奈米及配置用於結合個別分析物分子的結合位點之排列及可如此述方法裝載分析物之其他眾多特徵。該等特徵之排列可提供一種物理相決定特徵，如待裝載分析物之位置的一種規則性或可理解性圖案。例如，可將分析物分子裝載至以一規則性或所選間距安置該等特徵之陣列中之ZMW或其他特徵中，如至少相距20奈米、至少相距30奈米、至少相距40奈米、至少相距50奈米、至少相距60奈米、至少相距70奈米、至少相距80奈米、至少相距90奈米；至少相距100奈米；至少相距150奈米、至少相距200奈米、至少相距250奈米、至少相距300奈米、至少相距350奈米、至少相距400奈米、至少相距450奈米或相距500奈米以上。應明白如有需要，陣列中之陣列特徵的間距當然可進一步加大，雖然其可能降低該陣列特徵的密度，及其進而可能降低包含該等陣列特徵之系統的整體通量。相決定特徵可為陣列特徵的簡單位置，如位於特徵的一規則排列式物理陣列中央之陣列特徵的間距，或可為一種邏輯上可理解的更複雜排列，如其中該陣列特徵係依使用來自該陣列的訊號之光學掩蔽作用之一方式而排列，及/或用以指派何種特徵貢獻於該陣列的一“邏輯相”之數據反摺積演算法。

將分析物送至陣列之顆粒與其他篩分基團調節式輸送作用

可選擇顆粒或其他篩分基團，藉此一個單一顆粒/基團係適合置入一種小型孔陣列之一個單一孔/觀察體積(如ZMW)中。用於篩分陣列孔來接受顆粒或基團之篩分方法，係更詳細地論述如下；就直徑與深度而言，一般可能將孔的尺寸控制在數奈米內；使用可取得的方法，可達成大約10奈米至超過200奈米的ZMW陣列(如參見Foquet等人(2008年)於期刊“Journal of Applied Physics”第103期第034301頁(2008年)之“用於檢測單分子之零模式波導的製造作用之改進”乙文；Eid等人(2008年)於ScienceDOI: 10.1126/science.322.5905.1263b之“自單一聚合酶分子之即時DNA定序”乙文)。顆粒/基團之尺寸係受到用於包裝或結合所感興趣的分析物之顆粒或其他基團的類型之影響。

分析物

使用此述之方法與組成物，可將多種分析物或所感興趣的分子輸送至反應/觀察區域。其等包括酵素基板、核酸模板、引子等，以及多肽諸如酵素(如聚合酶)。

種類繁多的核酸可為此述方法中之分析物。其等包括選殖型核酸(DNA或RNA)、表現型核酸、基因體核酸、擴增型核酸cDNA之類。有關核酸之包括分離作用、選殖作用及擴增作用的細節，可參見由美國加州聖地牙哥之學術出版(Academic Press)有限公司出版之Berger與Kimmel的“酵素學之分子選殖技術、方法指南(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology)第152冊”乙書(Berger參考文獻)；由美國紐約州冷泉港之冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)出版社於2000年出版之Sambrook等人的“分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)”乙書(第三版)第1至3冊(“Sambrook”參考文獻)；由格林出版(Greene Publishing Associates)有限公司與約翰威利父子(John Wiley & Sons)有限公司共同出版之“當前操作程序(Current Protocols)”中之F.M. Ausubel等人所編輯之“分子生物學中之當前操作程序(Current Protocols in Molecular Biology)”乙書；由CRC出版公司出版之Ceske編輯之“生物學與醫學之分子與細胞方法手冊(Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine)”第二版中之Kaufman等人(2003年)乙文(Kaufman參考文獻)；及由美國冷泉港的修曼納出版(Humana Press)有限公司出版之Ralph Rapley所編輯(2000年)的“核酸操作程序手冊(The Nucleic Acid Protocols Handbook)”乙書(Rapley參考文獻)。

同樣地，亦可使用此述之方法輸送種類繁多的蛋白，如酵素。蛋白之類型可為可分析其在溶液中與基板的結合作用之結合性蛋白。其等可包含例如受體蛋白及身為藥物潛在標的之蛋白。已知多種蛋白之分離與檢測方法，及可用於例如從表現本發明的重組型聚合酶之細胞的重組培養中，分離酵素諸如聚合酶。技藝中已知多種蛋白的分離與檢測方法，包括如下列所闡述者：由美國紐約的施普林格((Springer-Verlag)出版社出版(1982年)之R. Scopes所著“蛋白質純化作用(Protein Purification)”乙書；由美國紐約的學術出版有限公司出版(1990年)之Deutscher所著“酵素學方法第182冊：蛋白質純化作用指南(Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification)”乙書；由學術出版有限公司出版之Deutscher(1997年)所著“蛋白之生物分離作用(Bioseparation of Proteins)”乙書；由美國紐約的威利-利斯(Wiley-Liss)公司出版之Bollag等人(1996年)所著“蛋白質方法(Protein Methods)”乙書第二版；由美國紐澤西州的修曼納出版有限公司出版之Walker(1996年)所著“蛋白質操作程序手冊(The Protein Protocols Handbook)”乙書；由英國牛津的牛津IRL出版社出版之Harris與Angal(1990年)所著“蛋白質純化作用之應用：一種實用方法(Protein Purification Applications: A Practical Approach)”乙書；由英國牛津的牛津IRL出版社所出版之Harris與Angal所著“蛋白質純化方法：一種實用方法(Protein Purification Methods: A Practical Approach)”乙書；由美國紐澤西州的施普林格公司出版之Scopes(1993年)所著“蛋白質純化作用：原理與實務(Protein Purification: Principles and Practice)”乙書第三版；由美國紐約的威利-VCH(Wiley-VCH)公司出版之Janson與Ryden(1998年)所著“蛋白質純化作用：原理、高解析度方法及應用(Protein Purification: Principles,High Resolution Methods and Applications)”乙書第二版；及由美國紐澤西州的修曼納出版有限公司出版之Walker(1998年)之“蛋白質操作程序光碟(Protein Protocols on CD-ROM)”；及其中所引述的參考文獻。有關蛋白質的純化與檢測方法之更多細節，可參見學術出版有限公司(2000年)出版之Satinder Ahuja所編輯之“生物分離作用手冊(Handbook of Bioseparations)”乙書。Sambrook、Ausubel、Kaufman及Rapley提供更多有用的細節。

酵素可為可與一表面良好地偶合之任一適宜酵素。實例包括聚合酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶、解旋酶、激酶、半胱胺酸天門冬胺酸酶、磷酸酶、末端轉移酶、核酸內切酶、核酸外切酶、去氫酶、蛋白酶、β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶及螢光素酶。適宜的酵素實例包括一種Taq聚合酶、核酸外切酶缺陷型Taq聚合酶、大腸桿菌(E. coli)的第一型DNA聚合酶、DNA聚合酶克列諾(Klenow)片段、逆轉錄酶、野生型Φ29聚合酶、突變型Φ29聚合酶、核酸外切酶缺陷型Φ29聚合酶、T7DNA聚合酶及T5DNA聚合酶。

與表面結合時具有活性的聚合酶與其他酵素係適用於其中該酵素係固定在一表面之單分子定序反應(如固定在例如一個ZMW的一反應/觀察區域中之一顆粒或一孔)，如在一個ZMW中所進行者，及其等的相關說明請參見Hanzel等人之WO 2007/075987“具活性之表面偶合型聚合酶(ACTIVE SURFACE COUPLED POLYMERASES)”及Hanzel等人之WO 2007/075873“最佳化表面連接型蛋白的活性之蛋白質工程策略(PROTEIN ENGINEERING STRATEGIES TO OPTIMIZE ACTIVITY OF SURFACE ATTACHED PROTEINS)”。有關適用於定序方面之可納入適當標記核苷酸之聚合酶的說明，如參見Hanzel等人之WO 2007/076057“用於核苷酸類似物納入作用之聚合酶(POLYMERASES FOR NUCLEOTIDE ANALOGUE INCORPORATION)”。有關使用ZMW之單分子定序應用的進一步說明，請參見Levene等人(2003年)於期刊“Science”第299期第682-686頁之“用於高濃度單分子分析之零模式波導”乙文；Eid等人(2008年)於Science DOI: 10.1126/science.322.5905.1263b之“自單一聚合酶分子之即時DNA定序”乙文；Korlach等人(2008年)於期刊“Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.”第105(4)期第1176-1181頁之“在零模式波導奈米結構中用於靶向固定化單一DNA聚合酶分子之選擇性鋁鈍化作用”乙文；Foquet等人(2008年)於期刊“Journal of Applied Physics”第103期第034301頁之“用於檢測單分子的零模式波導之製造作用之改進”乙文；“用於高濃度的單分子分析之零模式波導(Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrations)”之第7,033,764號、第7,052,847號、第7,056,661號及第7,056,676號美國專利，其全部揭露內容就各方面在此完整地併入本案以為參考資料。

顆粒與其他篩分基團

諸如顆粒之篩分基團可包括生物或非生物顆粒材料(或二者)。因此，病毒成分係包括在如上述的本發明目的之顆粒定義內。一般而言，待輸送至本發明的陣列之顆粒或其他篩分基團，可由至少可暫時性偶合/締合至所感興趣的一分析物(如一DNA或一酵素諸如一聚合酶)或與其偶合/締合之任一散體材料所形成，以用於輸送至所感興趣的陣列。適用的顆粒包括多種聚合物與陶瓷珠、自我組合結構諸如核酸摺紙體(如在此所詳述)以及金屬、玻璃、鐵氟龍或氧化矽顆粒。亦可使用PEG或其他大型聚合物，以提供一種適當的顆粒/篩分基團。例如，可使用聚合物、蛋白質、核酸、聚合物珠粒、矽石珠粒、陶瓷珠、玻璃珠、磁珠、金屬珠粒及有機樹脂珠粒，以提供本發明的上下文中之顆粒。該等顆粒基本上可具有任何形狀，如球形、螺旋形、橢球體、棒狀、錐形、盤狀、立方體、多面體或其組合。選擇性地，其等係成形而個別地適合置入相關陣列的相關孔(如ZMW)中；相關顆粒的形狀亦可用於決定該顆粒在相關孔中之方位，如藉由將該孔的壁成形而順應該顆粒。該等顆粒可選擇性地偶合至促進分析物的表面連接作用之多種試劑，如親和性基質材料或類似者，如核酸合成/偶合試劑、肽合成/偶合試劑、聚合物合成試劑、核酸、核苷酸、鹼基、核苷、肽、胺基酸、各種單體、生物試樣材料、合成分子或其組合物。除了輸送所感興趣的分析物之外，顆粒選擇性地在所感興趣的陣列內作為多種其他用途，包括作用為“空白”或其他對照顆粒、校準顆粒、試樣輸送顆粒、試劑顆粒、試驗顆粒等。

在此所用的顆粒典型地包含一核心例如由島狀區材料所組成者及一殼。確定包括核心與殼的整個顆粒之尺寸，藉此其可輸送至侷限區域及將一個顆粒輸送至一個區域。其可藉由例如適當地篩分顆粒以供適合置入該侷限區域而達成。亦可控制所輸送顆粒之條件，諸如溶液中的顆粒濃度、沉積模式及沉積作用的時間與溫度，藉此高百分比的侷限區域中僅具有一個顆粒。一旦以一種單一顆粒方式將顆粒送入侷限區域後，可移除該顆粒的殼，以將核心材料沉積至侷限區域中。例如，該殼可包含可從該核心溶解或降解之一種有機材料諸如一種聚合物，而將核心沉積在該侷限區域內。可控制移除該殼之條件，藉此該核心係沉積在該侷限區域內的一個中央區域中，而在該侷限區域諸如一孔或ZMW內製造核心材料的一個島狀區。在一些情況下，在沉積作用之前，該分析物即位於該核心上。在其他情況下，在該核心沉積為一個島狀區之後，該分析物將連接至該核心。例如，可選擇將該核心形成一個島狀區，其尺寸使得由於空間位阻限制，一般僅一個分析物分子或僅一個活性分析物分子將連接至一個單一島狀區。

確定顆粒與其他篩分基團之尺寸，以適合選擇性地個別置入陣列反應/觀察位點(如一種ZMW或其他孔的反應/觀察部分)中。因此，顆粒的尺寸範圍將依應用而定，如至少一個橫截面維度係約1至500奈米。ZMW應用中的典型尺寸係至少一維度自約5奈米至約150奈米，如約25至約100奈米。在一個適用的實施例中，適用顆粒的至少一維度係約50奈米至約100奈米。據瞭解溶液中之一種聚合物塗層具有擴展進入該溶液中之傾向，藉此該顆粒的外緣並非一固態壁。在一些情況下，顆粒之尺寸可由其流體力學半徑所代表。

本發明之陣列的顆粒基本上可包含可移動進入陣列孔(如ZMW)中之任何材料。示例顆粒包括病毒顆粒以及自我組合結構；大型核酸或多肽複合體(包括如核糖體)；聚合物、陶瓷或金屬顆粒、珠粒之類。例如，可使用聚合物珠粒(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠、尼龍以及其他多者)、矽石或矽珠粒、陶瓷珠、玻璃珠、磁珠、金屬珠粒及有機化合物珠粒。可取得眾多種類的商品化顆粒，如層析法典型所用者(如參見西克瑪艾爾迪希(Sigma-Aldrich)公司(美國密蘇里州聖路易市)、蘇沛可(Supelco)分析公司(美國賓州貝爾豐特(Bellefonte)；如經由西克瑪艾爾迪希公司銷售者)之產品目錄)，以及如由英杰(Invitrogene)公司所供應之親和性純化作用所常用者(如各種磁性Dynabeads^TM，其通常包括偶合試劑)。有關基質材料之論述，亦參見如學術出版有限公司出版之Hagel等人(2007年)所著“製程層析法手冊第二版：顯影、製造、驗證與經濟學(Handbook of Process Chromatography,Second Edition: Development,Manufacturing,Validation and Economics)”乙書第二版，ISBN-10: 0123740231；威利資訊網路(Wiley-Interscience)公司出版之Miller(2004年)所著“層析法：概念與對比(Chromatography: Concepts and Contrasts)”乙書第二版，ISBN-10: 0471472077；學術出版有限公司出版之Satinder Ahuja(2002年)所著“層析法與分離科學(SST)(分離科學與技術)(Chromatography and Separation Science(SST)(Separation Science and Technology))”乙書，ISBN-10: 0120449811；VCH出版有限公司出版之Weiss(1995年)所著“離子層析法(Ion Chromatography)”乙書；約翰威利父子(John Wiley and Sons)出版公司出版之Baker(1995年)所著“毛細管電泳(Capillary Electrophoresis)”乙書；馬賽爾德克(Marcel Dekker)有限公司出版之Marcel Dekker與Scott(1995年)所著“層析法之技術與實施(Techniques and Practices of Chromatography)”乙書。

將顆粒輸送至陣列

可藉由一般用於輸送分析物分子至陣列之方法，將顆粒輸送至一陣列。例如，輸送方法可包括將顆粒懸浮於一液體，及將所產生的懸浮液流入該陣列的孔中。其可包括簡單地將相關懸浮液吸移至該陣列的一或多個區域上；或可包括更主動的流動方法，諸如電導向或壓力式液體流動。在一個適用的實施例中，顆粒係流入該陣列的所選區域中，如其中一個特定的顆粒類型係在該陣列的一個特定區域進行分析。其可藉由掩蔽技術達成(施用一罩幕以引導液體流動)，或藉由主動流動方法諸如電導向或壓力式液體流動，包括藉由噴墨印刷方法。用於輸送核酸與相關試劑至陣列之噴墨與其他輸送方法，可參見如Kimmel與Oliver(編輯)(2006年)之”DNA微陣列A部分：陣列平臺與濕式工作臺操作程序，第410冊(酵素學方法)(DNA Microarrays Part A: Array Platforms & Wet-Bench Protocols,Volume 410(Methods in Enzymology)”乙書，ISBN-10: 0121828158；CRC出版公司出版之Lee(2002年)所著“微滴生成作用(奈米與微米科學、工程學、技術及醫學)(Microdrop Generation(Nano-and Microscience,Engineering,Technology and Medicine))”乙書，ISBN-10: 084931559X；及Heller(2002年)於期刊“Annual Review of Biomedical Engineering”第4期第129-153頁之“DNA微陣列技術:裝置、系統及應用(DNA MICROARRAY TECHNOLOGY: Devices,Systems,and Applications)”乙文。亦可使用微射流來輸送分析物；該等方法係如在此所詳述者。簡單地藉由將相關懸浮液吸移至該陣列的正確區域中，一陣列的區域亦可成為輸送作用之選擇性標的。

該等陣列可納入液體通道或與液體通道連接，該液體通道係如可控制或引導液體流入該陣列的所選區域之微米通道。任擇地，液體輸送方法可與陣列本身分立，如使用一種列印頭、手動吸移器或機械吸移器系統。可取得多種自動化液體輸送系統，及即可用於本發明中。

疊代分析物裝載作用

在一類型的實施例中，經由疊代裝載程序，在陣列反應區域諸如一種ZMW陣列的ZMW中達到高密度的單分子分析物。一般而言，該等程序例如包括使用標準的隨機分析物裝載方法進行第一裝載循環，接著進行標定在第一裝載循環中未裝載的陣列區域之後續裝載循環。可重複該等疊代裝載程序，直至所有的所欲陣列區域達到實質上完全的單分子裝載作用為止。

一般而言，在各裝載循環之後，如經由一種活性分析法(如藉由檢測SMS定序反應)，或經由檢測與該分析物結合的一標記，而檢測所感興趣的分析物之存在。未包含分析物之區域係標定進行附加的裝載作用，如藉由引導流至該等區域(如使用此述之微射流或光阱或電阱)，或簡單地藉由掩蔽已裝載區域及裝載未掩蔽區域。

例如，可進行在陣列區域內產生分析物的標準統計分布之隨機裝載方法。例如可使用一種經螢光標記的聚合酶(或使用其他任何類型的可檢測標記)，進行聚合酶裝載作用。在沉積作用之後，將陣列成像(檢測該等標記)，以檢測哪個陣列區域(如哪個ZMW)僅含有一個聚合酶(可藉由各陣列位點的標記訊號大小而區分單一裝載相對於多重裝載)。如使用此述之微影方法創建一罩幕，藉由該罩幕保護僅含有一個聚合酶的該等陣列區域(如ZMW)。清洗其餘的ZMW，以自多重裝載的ZMW移除聚合酶。重複該方法，直至實質上所有的陣列區域皆裝載分析物為止。例如，在二個回合之後，約60%的ZMW可含有單個聚合酶(若裝載方法係使用標準卜瓦松統計學，則約0.37+0.37*0.63)。在三個回合之後，約75%的ZMW將僅含有一個聚合酶。在四個回合之後，約84%。在五個回合之後，約90%。在六個回合之後，達成約94%裝載。如有需要，可在一定序或其他反應之前，將聚合酶的標記切除。

任擇地，各步驟可採用亞卜瓦松裝載作用(如低於約37%的卜瓦松限值)，以確保在各反應週期中實質上並無多重裝載的ZMW。在該情況下，毋需區分單一裝載與雙重裝載的陣列區域-反之可掩蔽所有標記的反應位點，及在未標記的位點上重複裝載過程。

活性分析物之富化作用

典型的分析物試樣含有活性與非活性形式的分析物。例如，聚合酶酵素的一典型溶液含有多份的活性與非活性聚合酶分子。在本體溶液分析法中，存在可在該反應作用之多份的分析物，其一般也不是一個顯著的問題，最多將分析物的活性標準化可能有益於定量之目的。然而，在單分子分析法中，在用於形成單分子反應之分析物分子的一來源中存在一部分的非活性分子係不良的，因為在一特定單分子反應中存在非活性分析物分子，將有效地殺滅該反應。

因此，所欲者係具有經富化的活性分析物分子之一分析物來源。例如，使用如可進行DNA延伸作用之聚合酶的一富化族群，來形成單分子定序反應係有益的，藉此在一個SMS反應中所固定化的所有聚合酶分子皆具官能性。不當活性分析物諸如一些缺陷型聚合酶，亦可具有除了簡單的無活性之外之不良特性，如增加與標記類似物的結合作用，其可混淆SMS反應的讀數；因此，積極地清除不當活性以及非活性分析物亦為有益的。

一般而言，用於負向選擇不當活性分析物之多種篩選步驟中之任一者加上用於隔離活性酵素之正向篩選步驟，可用於達成活性分析物之富化。例如，可負向選擇結合但不釋出一模板之聚合酶，而篩選出結合及延伸一模板之聚合酶。可負向選擇完全不與模板結合的聚合酶。用以分離與模板結合型及未與模板結合型部分之離心作用或簡單的尺寸或親和性純化作用，可用於自非活性酵素中純化出活性酵素。類似的方法可用於選出或棄選待定序的模板核酸，如藉由將交聯型與非交聯型核酸或類似者分離。

在一實例中，本發明提供用於富化一特定試樣中的活性聚合酶(如Φ29聚合酶)部分之一操作程序。聚合酶試樣首先與具有在寡核苷酸的5’端結合的一種FAM或半抗原之一種“雙頭模板”培養。聚合酶與模板的濃度係至少約為模板-Pol解離常數的10 x Kd，及聚合酶略為過量以確保接近100%的模板結合作用。官能性聚合酶分子係與模板結合，但非官能性、無活性聚合酶或污染性蛋白質則不然。將與FAM抗體結合的珠粒(或與半抗原結合的另一抗體)混合與離心，及將上清液棄置而移除非官能性(非模板結合型)蛋白質。將珠粒再度懸浮及添加用於DNA延伸作用之試劑(二價金屬.dATP、dCTP、dGTP、dTTP)以及一種陷阱分子，其係DNA或肝素及其濃度係比雙頭模板過量數倍。讓該反應進行數分鐘，以容許聚合酶延伸該DNA。活性、高產性聚合酶催化dNTP納入作用與延伸DNA，及當其到達(線性)雙頭模板的末端時而最終與模板分離。該等活性聚合酶與陷阱分子結合及並未與任一游離的“雙頭模板”重新結合。非高產性或非催化性聚合酶保持與模板結合。藉由離心作用分離活性、高產性聚合酶，其使得與非高產性酵素及模板結合之珠粒形成丸狀，而留下活性、高產性聚合酶在上清液中。富化活性聚合酶之另一種方法係使用與陷阱分子(DNA或肝素)結合的磁珠。該磁珠係與用於DNA延伸作用的試劑一起添加。從模板解離的活性聚合酶係與磁珠上的陷阱分子結合。然後自反應混合物中分離出磁珠。如在透析期間，藉由解離陷阱分子而回收活性聚合酶。

如使用φ29作為一示例聚合酶之用於富化活性聚合酶的一示例流程圖，係示於第18圖中。第19(A)至(B)圖提供一示例富化操作程序。如圖所示，可富化聚合酶諸如一種φ29聚合酶與一模板(線性、圓形等)結合之能力。如藉由離心作用分離結合型(活性)與未結合型(失效)聚合酶。例如，該聚合酶可與結合受體如用於生物素的鏈黴抗生物素蛋白、用於FAM的抗體之珠粒混合，及進行培養。該等珠粒然後形成丸狀，及將含有未結合或非活性聚合酶的上清液棄置。藉由添加dNTP與二價陽離子(鎂⁺⁺或錳⁺⁺)而起始聚合作用，及例如使用離心作用而再次將活性與非活性聚合酶分離。在另一實例中，因接合型聚合酶在37℃係比非接合型聚合酶安定，而提供一種另外的富化選擇作用方案。在裝載前之熱處理增加高產性聚合酶：模板複合體之比例，導致增進裝載作用。鈣²⁺離子與同源核苷酸類似物之添加作用，可用於進一步增進裝載。同樣地，在添加模板之前，可進行鏈黴抗生物素蛋白-聚合酶複合體之預製與純化作用，以進一步提高活性聚合酶的裝載作用。

有關鏈接化學物質之進一步細節

本發明之陣列內的結合表面及/或顆粒可呈現供多種可用的鏈接化學物質中任一者所用之一固態或半固態表面，而容許所感興趣的生物分析物與待分配至陣列中之顆粒構件結合。種類繁多之天然與合成的有機與無機聚合物可使用作為固態表面之材料。說明性聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(對酞酸乙二酯)、縲縈、尼龍、聚(丁酸乙烯酯)、聚二氟亞乙烯(PVDF)、聚矽氧類、聚甲醛、纖維素、乙酸纖維素、硝化纖維素之類。所用的其他材料包括紙類；陶瓷類諸如玻璃、熔矽、石英；金屬類諸如金、類金屬、半導電材料；水泥類或類似者。此外，亦可使用來自基質的物質，諸如蛋白質(如明膠)、脂多醣、矽酸鹽、瓊脂糖及聚丙烯醯胺。亦提供蛋白質式顆粒，如使用與所感興趣的分析物中所納入的特異性識別成分結合之抗體。

可使用種類繁多的鏈接化學作用，以將分子與種類繁多的分子、固態或半固態顆粒載體元件鏈接。該等化學作用可在原地(亦即在陣列中)進行，或在將顆粒導入陣列之前進行。用於將分子與一固態載體鏈接之所有可能的鏈接化學作用之說明，係不切實際與不必要的。預期嫻熟技藝者可依所規劃之應用，而輕易地選擇適當的化學作用。

在一個較佳的實施例中，本發明的顆粒或結合表面係包含矽酸鹽元件(如玻璃或矽酸鹽珠粒)。可取得適用於官能化該等表面之多種商品化矽式分子。如參見美國賓州布里斯托(Bristol)的聯合化學技術(United Chemical Technologies)公司之矽化合物登錄與述評(Silicon Compounds Registry and Review)。此外，因該領域中的技術發達，該等嫻熟技藝者將可選擇供一特定目的所用之一適當分子。能以商品購得、從頭合成或可藉由一可取得的分子之改質作用形成適當的分子，而製造具有所欲結構及/或特徵者。

一基板連接基係經由多種化學鍵中之任一者而與固態基板連接。例如，該連接基係例如經由具有(聚)三氟氯乙烯表面之基板而使用碳-碳鍵選擇性地與固態基板連接；或使用矽氧烷鍵(例如使用玻璃或氧化矽作為固態基板)。在一實施例中，經由帶有三氯矽基或三烷氧矽基的衍生化試劑之反應，而形成與基板表面的矽氧烷鍵。當在溶液中呈現一種連接型聚合物係符合需要時，特定鏈接基之選擇係基於例如其親水/疏水性質。適於與一鏈接基連接之基團包括胺、羥基、巰基(如在金粒之情況)、羧酸、酯、醯胺、異氰酸鹽及異硫氰酸鹽。較佳的衍生化基團包括胺基烷基三烷氧基矽烷、羥基烷基三烷氧基矽烷、聚乙二醇、聚乙烯亞胺、聚丙烯醯胺、聚乙烯醇及其組合物。

經由非限制性實例，可將數種矽氧烷官能化試劑上的反應性基團轉化為其他適用的官能基：

1.　羥基烷基矽氧烷(甲矽烷基化表面，以二硼烷官能化，及以過氧化氫來氧化該醇)；

a.　烯丙基三氯矽烷→→3-羥基丙基

b. 7-辛-1-烯基三氯矽烷→→8-羥基辛基

2.　二醇(二羥基烷基)矽氧烷(甲矽烷基化表面及水解成為二醇)

a. (環氧丙基三甲氧基矽烷→→(2,3-二羥基丙基氧)丙基

3.　胺基烷基矽氧烷(不需要中間的官能化步驟之胺類)

a. 3-胺基丙基三甲氧基矽烷→胺基丙基

4.　二聚合仲胺烷基矽氧烷

a.　雙(3-三甲氧基矽基丙基)胺→雙(矽氧基丙基)胺。

如參見戈登與布里奇(Gordon & Breach)公司於1980年出版之Leyden等人之“甲矽烷基化表面論文集(Symposium on Silylated Surfaces)”乙書；Arkles於期刊“Chemtech”第7期第766頁(1977年)乙文；及普列南(Plenum)公司於1982年出版之Plueddemann所著“矽烷偶合試劑(Silane Coupling Reagents)”乙書。該等實例係屬說明性質，而不限制適用於本發明之反應性基團互相轉換作用之類型。其他起始材料與反應流程將是該等嫻熟技藝者所顯而易見的。

可與一衍生化顆粒或結合表面連接之組分，係包括核酸諸如DNA、多肽(如酵素諸如聚合酶)、模擬物、大型與小型有機分子、聚合物及其組合物。例如，帶有一電荷之基團可輕易地與一顆粒偶合。例如，帶電荷的基團可為一種羧酸鹽、季胺或身為具有一個帶電荷或可能帶電荷的側鏈之一種胺基酸的一組分之質子化胺。該等胺基酸可具有天然存在的一結構，或者其等可為非天然結構(亦即合成者)。適用之天然存在的胺基酸包括：精胺酸、離胺酸、天門冬胺酸及麩胺酸。使用該等胺基酸的一組合物之表面，亦可用於本發明中。此外，包含具有一個帶電荷或可能帶電荷側鏈的一或多種殘基之肽類係適用的塗層組分，及其等可使用精胺酸、離胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸及其組合物合成。適用的非天然胺基酸能以商品取得或可使用技藝中所認可的方法合成，諸如可用的正交元素系統。在其中使用具有一酸性或鹼性側鏈的一胺基酸基團之該等實施例中，可經由標準肽合成方法或其容易獲得的變體，而使得該等基團與帶有一反應性基團的一表面連接。如參見英國牛津的牛津大學出版公司於1992年出版之Jones所著“胺基酸與肽合成作用(Amino Acid and Peptide Synthesis)”乙書。

當蛋白質與顆粒或結合表面連接時，後續亦可能在該蛋白質上連接一核酸。例如，與特定DNA序列特異性結合之多種蛋白質，可用於將DNA鏈接至顆粒或結合表面。實例係包括如上述之殼體包裝型蛋白以及多種抗體。同樣地，核酸可與顆粒連接及用於結合所感興趣的多肽。就與顆粒或結合表面上的蛋白質鏈接之目的而言，可使用上述的該等方法將連接基添加至DNA，如將包裝位點添加至分析物核酸之情況下。

亦可將鏈接基置於本發明的顆粒上。用於本發明之鏈接基可具有一範圍的結構、取代基及取代模式。其等例如可衍生自懸掛於連接基主鏈或與其不可分割之含有氮、氧及/或硫的基團。實例包括聚醚類、聚酸類(聚丙烯酸、聚乳酸)、多元醇類(如丙三醇)、多胺類(如精胺、精三胺)及具有一個以上的氮、氧及/或硫基團之分子(如1,3-二胺基-2-丙醇、牛磺酸)。可鏈接DNA與蛋白質之連接基的特定實例，係包括：(1)在DNA上納入O6-苄基鳥糞嘌呤類似物及在蛋白質上納入一個SNAP標籤(Stein等人(2007年)於期刊“Chembiochem”第8期第2191-2194頁之“用於試管內蛋白質演化之一種共價化學基因型-表現型鍵結(A Covalent Chemical Genotype-Phenotype Linkage for in vitro Protein Evolution)”乙文)。可供利用之另一已知的強力DNA-蛋白質連接作用，係位於DNA複製作用終止子的Ter序列與Tus蛋白質之間，如Coskun-Ari與Hill(1997年)於期刊“JBC”第272期第26448-26456頁之“大腸桿菌之Tus-Ter複合體中之序列特異性交互作用及鹼基對取代作用對於DNA複製作用停止之效應(Sequence-specific Interactions in the Tus-Ter Complex and the Effect of Base Pair Substitutions on Arrest of DNA Replication in Escherichia coli)”乙文中所述。

在本發明的一實施例中，用於將材料與本發明的顆粒偶合之偶合作用化學物質係光可控制式，亦即採用光反應性化學物質。用以活化分子與基板的偶合作用之光反應性化學物質與掩蔽策略之使用以及其他光反應性化學物質，係一般所知的(如用於半導體晶片製造作用及用於生物聚合物與固相材料的偶合作用)。光斷鍵性保護基與光掩蔽作用之使用係容許顆粒類型之切換，亦即藉由改變存在於該陣列構件上的基板之存在(亦即回應光)。在種類繁多的適用保護基之中，係包括硝基藜蘆基(NVOC)-甲基硝基藜蘆基(Menvoc)、烯丙氧基羰基(ALLOC)、茀基甲氧基羰基(FMOC)、-甲基硝基-向日葵氧基羰基(MeNPOC)、-NH-FMOC基、三級丁基酯類、三級丁基醚類之類。各種例示性保護基(包括光斷鍵性與非光斷鍵性基)係述於例如IRL出版公司出版之Atherton等人(1989年)所著“固相肽合成作用(Solid Phase Peptide Synthesis)”乙書，及美國紐約的約翰威利父子(John Wiley & Sons)公司出版之Greene等人(1991年)所著“有機化學中之保護基(Protective Groups In Organic Chemistry)”乙書第二版。在固態載體上的核酸與肽合成作用中使用該等與其他光斷鍵性鏈接基，係一種行之有效的方法。

將顆粒繫留至陣列之作用

可在該等顆粒中納入容許將顆粒繫留至該陣列的孔之特徵。在將分析物固定至顆粒的上下文中所論及之任一適用的鏈接化學物質，係適用於將顆粒鏈接/繫留至陣列的表面之問題。將官能化區域納入一個ZMW的壁中之裝置、方法及系統，如藉由將一環狀金環納入ZMW的壁中，係述於如Foquet等人之“用於選擇性固定化活性分子之基板與方法(SUBSTRATES AND METHODS FOR SELECTIVE IMMOBILIZATION OF ACTIVE MOLECULES)”(於2007年3月7日提出申請之USSN 60/905,786及於2008年3月5日提出申請之USSN 12/074,716)。

該等顆粒可包括用於鏈接至相關陣列表面之適當官能度。例如，巰基化學物質可用於將蛋白質鏈接至表面。重組蛋白諸如病毒殼體總成亦可包括具有多種鏈接化學物質中的任一者之非天然胺基酸，如在包括容許非天然胺基酸的位點特異性表現作用之正交元素之一宿主細胞中表現之情況。可用於納入非天然胺基酸及包括具有反應性基團的胺基酸之正交元素的系統，係述於Wang等人(2006年)於期刊“Annu Rev Biophys Biomolec Struct”第35期第225-249頁之“擴增遺傳編碼(Expanding the genetic code)”乙文；Wang與Schultz(2005年)於期刊“Angewandte Chemie Int. Ed.”第44(1)期第34-66頁之“擴增遺傳編碼(Expanding the Genetic Code)”乙文；Xie等人(2005年)於期刊”Methods”第36期第227-38頁之“一種擴增性遺傳編碼(An expanding genetic code)”乙文；及Xie等人(2006年)於期刊”Nat Rev Mol Cell Biol”第7期第775-82頁之“一種用於蛋白質之化學工具套組：一種擴增型遺傳編碼(A chemical toolkit for proteins: an expanded genetic code)”乙文。

在顆粒之情況下，包含一種反應性/鏈接基之一胺基酸的位點特異性納入作用，係可用於特異性地訂定該顆粒相對於該陣列孔之方位。例如，該陣列孔可包括可與該顆粒的一特定部分偶合之一特定的官能化區域(如上述之一金帶)。例如，當顆粒係一病毒顆粒時，該尾部或殼體可納入一或多種反應性/鏈接基，以訂定該殼體相對於該孔(及/或相對於其他分析組件，諸如表面固定式酵素，如表面固定式聚合酶)之方位。

讀取該分析物

在本文之實施例中，分析物分子係選擇性地與一顆粒、結合位點或其他實體複合，及在該陣列的一反應位點、孔、ZMW或其他觀察體積或區域中分析。在最簡單的情況下，其係簡單地藉由進行相關閱讀反應(如使用一聚合酶之一複製聚合反應)而達成；在該閱讀期間，該分析物係選擇性地與該顆粒等複合。在該顆粒或其他偶合型基團不抑制相關閱讀組分的作用之情況下，其係特別實用，該閱讀組分係諸如在一DNA模板分析物上作用的一聚合酶分析物。在包括多種噬菌體之一些病毒顆粒之情況下，聚合酶可捕獲可能從殼體突出之分析物DNA，及當其合成一互補股時可自殼體將其拉出，如在一定序反應期間。此外，活性酵素可保持與顆粒結合，或可自一顆粒轉移至該反應/觀察區域中的一結構。參見Hanzel等人之WO 2007/075987“表面偶合型活性聚合酶(ACTIVE SURFACE COUPLED POLYMERASES)”，及Hanzel等人之WO 2007/075873“最佳化表面連接型蛋白的活性之蛋白質工程策略(PROTEIN ENGINEERING STRATEGIES TO OPTIMIZE ACTIVITY OF SURFACE ATTACHED PROTEINS)”。同樣地，一聚合酶或其他閱讀酵素可與其他顆粒結合型分析物(如酵素受質)結合，及毋需與顆粒分離即可作用在其等上。然而，亦可使用替代方法，其中一分析物在參與一相關反應之前，係與該顆粒或其他基團分離。

可自本發明的上下文中取得將分析物與顆粒分離之方法。例如，在一分析物DNA輸送至一陣列孔之後，可使用一限制酶將一分析物DNA與顆粒切開。同樣地，可使用一種位點特異性蛋白酶，而將一多肽連接基切開。在另一種方法中，可使用光斷鍵性連接基，以將分析物與顆粒偶合；在暴露於光時，該斷鍵性連接基被切開而釋出分析物。連接基亦可納入可因pH值改變、存在一酶切分子或類似者而特異性斷鍵之鍵結。在殼體輸送至陣列孔之後，可使用化學或酵素方法將病毒殼體從核酸分解除去。該等方法中之任一者(或其組合物)，可造成以受控方式從所感興趣的顆粒釋出分析物分子。

一旦進行分析物與其所結合者之任何所需或所欲的分離作用之後，該分析物可被讀出，或可參與在正規單分子分析物監測期間用於讀出該陣列的任一典型方法之系統。例如，在一個ZMW中的定序作用之情況下，一聚合酶可束縛在進行該定序反應之波導中；及使用經適當標記的核苷酸之納入作用而測定分析物核酸之序列。有關可納入適當的標記核苷酸之聚合酶的說明，如參見Hanzel等人之WO 2007/076057“用於核苷酸類似物納入作用之聚合酶(POLYMERASES FOR NUCLEOTIDE ANALOGUE INCORPORATION)”。有關與表面結合時具有活性的聚合酶及其係適用於其中該酵素係固定在一表面之單分子定序反應如在一零模式波導中所進行者之說明，請參見Hanzel等人之WO 2007/075987“表面偶合型活性聚合酶(ACTIVE SURFACE COUPLED POLYMERASES)”及Hanzel等人之WO 2007/075873“最佳化表面連接型蛋白的活性之蛋白質工程策略(PROTEIN ENGINEERING STRATEGIES TO OPTIMIZE ACTIVITY OF SURFACE ATTACHED PROTEINS)”。有關使用ZMW之單分子定序應用的進一步說明，請參見Levene等人(2003年)於期刊“Science”第299期第682-686頁之“用於高濃度單分子分析之零模式波導”乙文；Eid等人(2008年)於Science DOI: 10.1126/science.322.5905.1263b之“自單一聚合酶分子之即時DNA定序”乙文；第7,033,764號美國專利、第7,052,847號美國專利、第7,056,661號美國專利及第7,056,676號美國專利，其全部揭露內容就各方面在此完整地併入本案以為參考資料。

一般而言，可使用此述之方法，將分析物諸如核酸或多肽分配至陣列孔中。一旦將分析物安置至適當的孔中，可在分析物分析期間使用目前所用之多種不同的分析物讀數格式。其等包括螢光測量、表面螢光測量之類。有關陣列讀數格式之論述，如參見Kimmel與Oliver(編輯)(2006年)之“DNA微陣列A部分：陣列平臺與濕式工作臺操作程序，第410冊(酵素學方法)”乙書，ISBN-10:0121828158；Kimmel與Oliver(編輯)(2006年)之“DNA微陣列B部分：數據庫與統計學(DNA Microarrays,Part B: Databases and Statistics)，第411冊(酵素學方法)”乙書，ISBN-10: 0121828166；由MIT出版公司出版之Alan R. Kohane等人(2005年)之“用於綜合基因體學之微陣列(Microarrays for an Integrative Genomics)”乙書，ISBN: 0262612100；由DNA出版公司出版之Hardiman(2003年)之“微陣列方法與應用(Microarrays Methods and Applications)(螺帽與螺栓系列)”乙書；由劍橋大學出版社出版之Baldi與Hatfield(2002年)之“DNA微陣列與基因表現作用(DNA Microarrays and Gene Expression)”乙書，ISBN: 0521800226；由冷泉港實驗室出版社出版之Bowtell與Sambrook(編輯)(2002年)之“DNA微陣列：分子選殖手冊(DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual)”乙書，ISBN: 0879696257；由劍橋健康科技研究所(Cambridge Healthtech Institute)出版之“微陣列與相關技術：基因體學研究之小型化與加速(Microarrays and Related Technologies：Miniaturization and Acceleration of Genomics Research)”乙書(2001年5月1日)，ISBN：B00005TXRM；由修曼納出版有限公司出版之Rampal(編輯)(2001年)之“DNA陣列：方法與操作程序(DNA Arrays：Methods and Protocols)”乙書(分子生物學方法第170冊)，ISBN：089603822X；由伊顿出版公司出版之Schena(2000年)之“微陣列生物晶片技術(Microarray Biochip Technology)”乙書，ISBN：1881299376；及由牛津大學出版社出版之Schena(編輯)(1999年)之“DNA微陣列：一種實用方法(DNA Microarrays：A Practical Approach)”乙書，ISBN：0199637768。一般而言，存在多種的商品化陣列讀數器，或可修改以讀取本發明的陣列。

實例 第1例：用於製造島狀區材料的奈米級島狀區之尺寸值

第4圖中所說明之方法係有關於在奈米級孔洞內製造奈米點的島狀區。第20A圖係說明用於第4圖所說明之方法的相關尺寸值之一圖。下列第1表顯示用於製造直徑大約10奈米的一個金奈米點之參數值。由於在金濕式蝕刻期間所產生之底切，金點的尺寸可小於犧牲柱狀體的直徑。

第2例：用於製造基板表面的奈米級島狀區之尺寸值

第15圖中所說明之方法係有關於在一個奈米級孔洞內形成由一隔離層所包圍之基板的島狀區。第20B圖係說明用於第15圖中所說明之方法的尺寸值之一圖。第2表顯示用於製造直徑大約10奈米的一個島狀區之參數值。

第3例：金奈米點島狀區

第21圖係顯示在其等內配置有金點的一種奈米級孔洞陣列之代表性孔洞的掃描式電子顯微照片。使用第3圖中所說明之方法形成該等結構。第21A圖顯示通過一奈米級孔洞之橫截面。第21B圖顯示自奈米級孔洞上方所拍攝之掃描式電子顯微照片，其顯示金奈米點係位於該孔洞的基底。從在熔融矽石基板上具有100奈米厚的鋁之一個ZMW開始，在300℃沉積30奈米的PECVD非晶質矽，接著在室溫與9微托進行7奈米的金/鉻蒸發作用。可如第3圖或藉由金的傾斜式離子研磨作用，而移除位於ZMW上面的金/鉻。最後，在二氟化氙中移除犧牲層。

第4例：由隔離層所包圍之外露基板的島狀區

第22圖係顯示具有由隔離層(氧化鋁)所包圍之外露基板(熔融矽石)的一個島狀區之一孔洞的橫截面之透射電子顯微照片。使用第12圖與第13圖中所說明之一種方法形成該結構。將鋁沉積在一個熔融矽石基板上。在鋁的上面沉積一層電子束阻劑ZEP520A。顯影該阻劑，以在將形成該等孔洞的區域外之基板上製造四個十字形配準標記。構成該等對位標記的線寬約為5微米。使用一種氯化電漿反應性離子蝕刻，以蝕刻該鋁層的外露部分。然後使用一種氟電漿，及使用鋁作為一硬質罩幕而蝕刻熔融矽石的外露部分。蝕刻延伸進入熔融矽石基板約1微米。然後移除阻劑與鋁。將鋁移除，及使用一種食人魚蝕刻作用清潔該表面。

使用原子層沉積作用(ALD)，在具有配準標記的該基板上沉積厚度約5奈米的一層氧化鋁。然後在該氧化鋁層上沉積一種電子束阻劑ZEP520A。將阻劑形成圖案、顯影，及使用反應性氯離子蝕刻電漿蝕刻該氧化鋁層，以形成直徑約30至40奈米的奈米凹點。使用一種氧電漿移除該阻劑，及使用1165溶劑進行濕式清潔。將一種負型阻劑NEB31沉積、形成圖案、顯影，以形成界定該奈米凹點上面的奈米級孔洞之柱狀體。使用配準標記，將柱狀體與奈米凹點結構對齊。然後使用熱或電子槍沉積作用來沉積鋁。使用例如1165之一溶劑來溶解該阻劑柱狀體及剝離該柱狀體上的披覆層部分，以製造第22圖中所示的結構。在第22圖中可以看出，奈米凹點之蝕刻延伸進入該熔融矽石基板達數奈米。

第5例：由隔離層所包圍之外露基板的島狀區

第23與24圖顯示具有由一個氧化鋁隔離層所包圍之熔融矽石的一個島狀區之奈米級孔洞(ZMW)的橫截面之透射電子顯微照片。使用第11圖中所說明之一種方法形成該等結構。披覆層1110係一層約100奈米厚的鋁。隔離層1120係藉由ALD在300℃沉積之一層約3.5奈米厚的氧化鋁。犧牲層1130係藉由ALD在300℃沉積之厚度約30奈米的非晶質矽，及使用一種科林(Lam)9600蝕刻機進行蝕刻。然後使用二氟化氙移除犧牲層，二氟化氙係在鋁與熔融矽石存在下選擇性地蝕刻該犧牲層。第24圖係第23圖之特寫圖，其所選擇的W_I約為26.5奈米。

雖然本發明在前述部分已就清晰與理解之目的說明一些細節，嫻熟技藝者在閱讀本揭露內容時將明瞭可進行形式與細節的各種變化，而不偏離本發明的真正範圍。例如，可使用上述所有技術與儀器之各種組合。例如，能以所述之陣列孔篩分方法進行顆粒輸送作用。在本申請案中所引述之所有出版物、專利、專利申請案及/或其他文獻係就各方面在此完整地併入本案以為參考資料，如同各項個別出版物、專利、專利申請案及/或其他文獻係個別與分開地就各方面併入本案以為參考資料。

100．．．透明基板

120．．．隔離層

140．．．島狀區

170．．．層

210．．．披覆

110．．．披覆層

130．．．外露基板

150．．．區域

200．．．基板

220．．．隔離層

230．．．島狀區

250．．．單一分析物分子

270．．．偶合劑

300．．．基板

315．．．奈米級孔洞

330．．．島狀區材料

350．．．基板表面

400．．．基板

420．．．犧牲材料

440．．．硬質罩幕

450．．．披覆層

470．．．外露基板

520．．．基板

560．．．鍺奈米線

1105．．．奈米級孔洞

1120．．．隔離層

1140．．．隔離材料

1200．，．基板

1220．．．奈米凹點

1240．．．披覆層

1260．．．外露基板材料

1310．．．硬質罩幕層

1330．．．配準標記

1400．．．基板

240．．．偶合劑

260．．．材料島狀區

280．．．單一分析物分子

310．．．披覆層

320．．．第一犧牲層

340．．．第二犧牲材料

360．．．材料島狀區

410．．．島狀區材料

425．．．柱狀體

445．．．硬質罩幕結構

460．．．島狀區

510．．．奈米顆粒

540．．．鍺烷蒸汽

1100．．．基板

1110．．．披覆層

1130．．．犧牲材料

1150．．．島狀區

1210．．．隔離層

1230．．．奈米級特徵或柱狀體

1250．．．隔離材料

1300．．．基板

1320．．．阻劑

1340．．．中央區域

1405．．．奈米級孔洞

1410．．．披覆層

1425．．．單一小型顆粒

1440．．．隔離層

1500．．．基板

1520．．．硬質罩幕層

1540．．．柱狀體

1560．．．披覆層

1610．．．基板

1630．．．官能化材料

1420．．．核殼型顆粒

1430．．．隔離層

1450．．．島狀區

1510．．．犧牲層

1525．．．特徵

1550．．．隔離材料

1600．．．披覆材料

1620．．．反應區域

第1(A)-(H)圖係顯示在一陣列內的侷限區域中具有基板的島狀區((A)-(D))或島狀區材料的島狀區((E)-(H))之不同結構。

第2(A)圖係本發明用於將一個單一的活性分子偶合至一侷限區域內之基板的一個島狀區之一種方法的示意圖。第2(B)圖係顯示將一個單一的活性分子偶合至一侷限區域內之島狀區材料的一個島狀區。

第3圖係使用二犧牲層在一侷限區域內形成一個材料島狀區之一種方法的示意圖。

第4圖係顯示使用一犧牲柱狀體在一侷限區域內形成一個材料島狀區之示意圖。

第5(A)圖提供使用威斯泰克(Vistec) VB300電子束系統與正型化學擴增型阻劑所產生之一陣列的顯微照片。第5(B)圖係顯示用於說明具有一金鍺尖端的鍺奈米線之形成作用的示意圖與顯微照片。第5(C)圖係顯示在一奈米點陣列上形成一種ZMW奈米結構之流程圖與示意圖。

第6圖提供用於固定一種ZMW中的奈米顆粒之一種方法的流程圖與示意圖。

第7A圖提供用於在ZMW中形成奈米顆粒之一程序的示意圖。第7B圖提供用於平坦基板的一種方法流程之示意圖。

第8A圖提供經由沉積一層不完全單層而在ZMW中形成奈米顆粒之一種方法流程的示意圖。用於平坦基板之一種方法流程係示於第8B圖。

第9A圖提供用於在一種ZMW中放置一官能化島狀區之一種方法的示意圖。用於平坦基板之一種相關方法流程係示於第9B圖。

第10圖係顯示用於固定ZMW中的奈米顆粒之一示意方法。

第11圖係使用一犧牲層製造一侷限區域內由隔離材料所包圍之基板材料的一個島狀區之一種方法的示意圖。

第12圖係用於製造一侷限區域內由隔離材料所包圍之基板材料的一個島狀區之一任擇方法的示意圖。

第13圖係顯示用於形成對位特徵之示意圖的一實例。

第14圖係顯示使用一顆粒的沉積作用在一侷限區域內製造基板材料的一個島狀區之一種方法的示意圖。

第15圖係使用一犧牲柱狀體在一侷限區域內形成由一隔離區域所包圍之基板的一個島狀區之一種方法的示意圖。

第16圖係顯示用於在一種ZMW或其他陣列反應區域的底部形成一分析物結合位點之一種化學拋光方法的示例流程圖。

第17圖提供用於在一種ZMW的中心形成一官能化區域之傾斜角蒸發作用實施例的示意圖。

第18圖提供用於富化活性聚合酶之一示例流程圖。

第19(A)-(B)圖提供有關聚合酶富化作用之更多細節。

第20(A)圖係顯示概述本發明用於形成奈米點島狀區之一種方法的維元之一圖，第20(B)圖係顯示概述本發明用於形成透明基板的島狀區之一種方法的維元之一圖。

第21圖(A)-(B)顯示具有基板材料的一個島狀區之一種ZMW的橫截面之透射電子顯微照片影像。

第22圖係顯示在其中心具有由一鋁隔離層所包圍之外露熔融矽石基板的一個島狀區之一種ZMW的橫截面之透射電子顯微照片影像。

第23圖係顯示在其中心具有由一鋁隔離層所包圍之外露熔融矽石基板的一個島狀區之一種ZMW的橫截面之透射電子顯微照片影像。

第24圖係顯示在其中心具有由一鋁隔離層所包圍之外露熔融矽石基板的一個島狀區之一種ZMW的橫截面之透射電子顯微照片影像，其包括該島狀區的尺寸。

100．．．透明基板

110．．．披覆層

120．．．隔離層

130．．．外露基板

140．．．島狀區

150．．．區域

170．．．層

Claims (60)

1. 一種用於在一基板上的奈米級孔洞內製造一個島狀區之方法，其包括：提供具有一披覆層之一基板，該披覆層具有多個奈米級孔洞；在該披覆層上面以保形方式沉積第一犧牲層；以定向方式蝕刻該犧牲層，致使犧牲層留存在奈米級孔洞的壁上，且移除介於在壁上的犧牲層之間之奈米級孔洞區域的犧牲層；在該基板上以定向方式沉積一種島狀區材料；在該島狀區材料上面沉積第二犧牲層；蝕刻該第二犧牲層，以在該奈米級孔洞內的島狀區材料上面留下一部分的第二犧牲層，藉此保護其免於後續的蝕刻步驟；蝕刻該披覆層上面的島狀區材料，致使一部分的島狀區材料留存在介於壁間的犧牲層之間之區域中；移除壁上的第一犧牲層及移除第二犧牲層，藉此在該奈米級孔洞內製造島狀區材料的一個島狀區。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該基板係包含一種透明材料。
3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該基板係包含一種矽基材料。
4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該基板係包含一種熔融矽石。
5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該島狀區材料係包含一種金屬。
6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該島狀區材料係包含金。
7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該犧牲層係包含矽或鍺或矽與鍺。
8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該奈米級孔洞係包含具有一種圓形橫向廓型之孔。
9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該基板係包含超過10,000個奈米級孔洞。
10. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括在該島狀區上選擇性結合一種聚合酶酵素、模板核酸或引子。
11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中第一犧牲層與第二犧牲層係包含相同的材料。
12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中第一犧牲層與第二犧牲層係包含矽或鍺或矽與鍺。
13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中第一犧牲層與第二犧牲層係包含矽。
14. 一種用於在一個奈米級孔洞內形成基板表面的一個島狀區之方法，其包括：提供在其上具有一披覆層之一基板，該披覆層具有多個經其延伸穿過的奈米級孔洞；在該披覆層及該基板的外露部分上以保形方式沉積一隔離層； 在該隔離層上面以保形方式沉積一犧牲層；以定向方式蝕刻該犧牲層，致使犧牲層留存在奈米級孔洞的壁上，且移除介於在壁上的犧牲層之間之奈米級孔洞區域的犧牲層，暴露出該奈米級孔洞內之一部分的隔離層；蝕刻該奈米級孔洞內之該部分的隔離層，以暴露出一部分的基板；移除該犧牲層，以在各奈米級孔洞內製造具有由隔離層所包圍之外露基板表面的一個島狀區之一結構。
15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該隔離層係藉由原子層沉積作用(ALD)沉積。
16. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該隔離層係包含一種金屬氧化物。
17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該隔離層係包含氧化鋁。
18. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該基板係包含一種透明材料。
19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該基板係包含一種矽基材料。
20. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該基板係包含一種熔融矽石。
21. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該島狀區材料係包含一種金屬。
22. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該島狀區材料係包 含金。
23. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該犧牲層係包含矽或鍺或矽與鍺。
24. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該奈米級孔洞係包含具有一種圓形橫向廓型之孔。
25. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該基板係包含超過10,000個奈米級孔洞。
26. 如申請專利範圍第14項之方法，其進一步包括在該島狀區上選擇性結合一種聚合酶酵素、模板核酸或引子。
27. 一種用於在一個奈米級孔洞內形成基板表面的一個島狀區之方法，其包括：在一種透明基板上沉積一隔離層；在隔離層中形成奈米凹點，其延伸至基板表面；沉積、暴露及顯影一阻劑，以在各奈米凹點上面形成一阻劑柱狀體及延伸至各奈米凹點；沉積一披覆層，致使該披覆層覆蓋該阻劑柱狀體及隔離層的外露區域；移除該阻劑而導致覆蓋阻劑柱狀體之該部分的披覆層之剝離，藉此在披覆層中形成一個奈米級孔洞，其係在由隔離層所包圍的基底各具有一個奈米凹點。
28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該基板係包含一種矽基材料。
29. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該基板係包含一種熔融矽石。
30. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該隔離層係使用原子層沉積作用(ALD)沉積。
31. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該隔離層係包含氧化鋁。
32. 如申請專利範圍第27項之方法，其中隔離層的厚度係介於2奈米與20奈米之間。
33. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該等奈米凹點具有一種圓形橫向廓型。
34. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該等奈米凹點的橫向尺寸係介於5奈米與40奈米之間。
35. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該奈米級孔洞具有一種圓形橫向廓型。
36. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該奈米級孔洞的橫向尺寸係介於30奈米與500奈米之間。
37. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該阻劑係包含一種負型阻劑。
38. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該奈米凹點係使用電子束微影技術或紫外線微影技術形成。
39. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該披覆層係包含一種金屬。
40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中披覆層係包含鋁。
41. 如申請專利範圍第27項之方法，其中在形成奈米凹點之前，在透明基板上形成對位特徵。
42. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該對位特徵係包含 蝕刻至透明基板中之特徵。
43. 一種用於形成在其內具有基板表面的一個島狀區之一奈米級孔洞之方法，其包括：提供在其上具有一犧牲層之一種透明基板，該犧牲層具有位於其上之一硬質罩幕層；在該硬質罩幕層上形成圖案及進行蝕刻，以形成多個奈米級特徵；蝕刻該犧牲層以暴露出透明基板的一些區域，致使犧牲層的蝕刻作用延伸至硬質罩幕層下面，而產生一底切；在透明基板的外露部分及硬質罩幕層特徵的上面以保形方式沉積一隔離層，藉此該隔離層係沉積在懸垂於犧牲層上的硬質罩幕部分之下方；以定向方式沉積一披覆層，留下在外露的硬質罩幕層下面之隔離層的一些部分；移除犧牲層的剩餘部分、硬質罩幕及隔離層的一些部分與硬質罩幕上面的披覆層；藉此製造奈米級孔洞，其在由隔離層所包圍的奈米級孔洞內包含透明基板的島狀區。
44. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該犧牲層係包含矽、鍺或矽-鍺。
45. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該硬質罩幕係包含PECVD氧化物或氮化物。
46. 如申請專利範圍第43項之方法，其中犧牲層的蝕刻作用係以二個蝕刻步驟進行，第一步驟實質上不具有底切，而 第二蝕刻步驟底切該硬質罩幕層。
47. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該奈米級孔洞與該奈米級孔洞內的島狀區係各包含一種實質上圓形的橫向廓型。
48. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該奈米級孔洞的橫向尺寸係介於30奈米與500奈米之間。
49. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該島狀區的橫向尺寸係介於2奈米與40奈米之間。
50. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該隔離層係包含氧化鋁。
51. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該披覆層係包含一種金屬。
52. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該披覆層係包含鋁。
53. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該透明基板係包含一種矽基基板。
54. 一種用於形成在其內具有島狀區材料的一個奈米級島狀區之一奈米級孔洞之方法，其包括：提供一疊材料，其由下而上包含一透明基板、一島狀區材料層、一犧牲層及一硬質罩幕；在該硬質罩幕層上形成圖案及進行蝕刻，以形成多個奈米級特徵；蝕刻該犧牲層以暴露出島狀區材料層的區域，致使犧牲層的蝕刻作用延伸至硬質罩幕層下面，製造與底 切；以定向方式沉積一披覆層，留下在外露的硬質罩幕層下面之島狀區材料層的一些部分；蝕刻島狀區材料層的外露部分；移除犧牲層的剩餘部分、硬質罩幕及硬質罩幕上面之披覆層的一些部分；藉此製造奈米級孔洞，其在由透明基板表面的區域所包圍之奈米級孔洞內包含島狀區材料的島狀區。
55. 如申請專利範圍第54項之方法，其中在蝕刻島狀區材料層的外露部分之前，移除硬質罩幕與硬質罩幕上面之披覆層的一些部分，及在該步驟之後進行犧牲層的剩餘部分之移除。
56. 一種用於形成在其內具有島狀區材料的一個奈米級島狀區之一奈米級孔洞之方法，其包括：提供一疊材料，其由下而上包含一透明基板、一犧牲層及一硬質罩幕；在該硬質罩幕層上形成圖案及進行蝕刻，以形成多個奈米級特徵；蝕刻該犧牲層以暴露出島狀區材料層的區域，致使犧牲層的蝕刻作用延伸至硬質罩幕層下面，製造與底切；沉積一隔離層，藉此該隔離層在底切區域下方延伸而達位於底切下面之犧牲層的剩餘部分；以定向方式沉積一披覆層，使得在硬質罩幕層下面之隔離層的一些部分外露；移除犧牲層的剩餘部 分、硬質罩幕及隔離層的一些部分與硬質罩幕上面的披覆層；藉此製造奈米級孔洞，其在由隔離層區域所包圍之奈米級孔洞內包含基板表面的島狀區。
57. 一種用於形成一官能性島狀區之方法，其包括：(a)提供包含位於一透明層上面的一披覆層之一基板，其具有延伸通過該披覆層而達該透明層之多個奈米級孔洞，致使該等孔洞各包含壁與一基底；(b)在該基板上沉積其尺寸適合置入多個孔洞中之一核殼型顆粒，致使在每個孔洞中一般僅沉積一個核殼型顆粒；(c)移除該核殼型顆粒的殼，藉此該核殼型顆粒的核心係沉積在該孔洞的基底；(d)在該基板上沉積一隔離層；及(e)移除核殼型顆粒的核心，以製造由隔離層所包圍之外露基板的一個島狀區。
58. 如申請專利範圍第57項之方法，其在步驟(a)與(b)之間進一步包括沉積同時覆蓋該披覆層與該透明層的外露部分之一塗層，藉此在步驟(e)之後，暴露出塗層的一個島狀區。
59. 如申請專利範圍第57項之方法，其中該核殼型顆粒係包含一個金屬或金屬氧化物核心及一有機外層。
60. 如申請專利範圍第57項之方法，其在步驟(e)之後，進一步包括選擇性地官能化該外露基板的島狀區。