CN103403188A - 用于降低核酸损伤的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了在选自片段化和检测的核酸加工步骤期间抑制核酸降解的方法，其包括在加工步骤期间使核酸与包含没食子酸、其类似物、衍生物或其混合物的溶液相接触，其中所述接触抑制核酸降解。本文还提供了抑制光诱导的核酸降解的方法。本文还提供了在制备核酸样本期间降低或抑制核酸损伤的方法，其包括在包含一种或更多种化合物的溶液中使样本中的核酸序列片段化，所述化合物抑制样本中核酸序列的降解。

Description

用于降低核酸损伤的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年2月1日提交的美国临时申请No.61/438,522的优先权。本申请也是2011年1月31日提交的美国申请No.13/018,255的部分继续申请并且要求该申请的优先权。这些申请通过引用整体并入本文。
背景技术
用于加工用于测序和其他技术的核酸样本的方法以及在测序和其他技术期间加工核酸样本的方法可将核酸暴露于多种降解或损伤核酸的有害条件，导致核酸样本不能被进一步加工，或者例如在测序的情况下可导致高错误率。
例如，用于测序和其他技术的核酸样本的制备方法常常涉及较大核酸序列片段化为较小核酸序列，这可引起核酸受损，导致例如在测序技术期间核酸的错误鉴定。
通过另一实例，用于检测和表征核酸结构的方法可采用标记方案，该方案依赖于激发态吸光发色团的电磁辐射(EM)发射，其可导致核酸损伤。这样的光致发光方法的实例包括磷光和荧光发射。例如，荧光检测已被用于DNA测序并产生了很大作用，这部分地由于高灵敏度允许单分子检测。
在阵列(array)的情况下进行反复的荧光检测步骤(例如，边合成边测序(sequencing by synthesis))可引起荧光信号强度损失(参见，例如，Fedurco等，WO2006/064199)。通过向检测溶液中添加抗坏血酸盐部分地解决了该问题，从而将可用检测循环数从在不存在抗坏血酸盐的情况下的约8个至10个循环增加至在存在抗坏血酸盐的情况下的约25个循环。作为该信号损失之基础的可能机制有许多，并且可包括单个核酸成员从支持物断裂。
在荧光检测的照射期间核酸损伤可通过许多途径发生。荧光发射通常随与原始照射源相比具有较长波长(较低能量)的光的发射而发生。但是，在其中强EM辐射被荧光团吸收的情况下(例如，在激光诱导的荧光(laser-induced fluorescence，LIF)中)，分子可能吸收两种光子，这可导致与原始激发源相比较小波长的较高能量辐射的发射。该多光子吸收可引起荧光团在UV可见区发射EM辐射，这可有助于核酸碱基二聚作用和/或活性氧簇(reactive oxygen specie)的产生。
例如，已示出，整个细胞暴露于紫外(UV)辐射可通过胸腺嘧啶或胞嘧啶的直接光化学[2+2]光环加成反应提供环丁烷嘧啶二聚体(例如，TT、TC和CC)而引起DNA损伤。这样的直接光环加成反应可发生在UV B和UV C区，其从约100nm延伸至约315nm。
在通过可见区之一部分的UV A区(跨约315nm至约500nm)中，间接机制的复合混合物也可通过另一些细胞组分的光敏作用引起DNA损伤。这样的间接机制可通过反应性物质(reactive specie)例如单线态氧、超氧化物阴离子和铁促羟基自由基(iron-promoted hydroxyl radical)形成导致嘧啶二聚体形成和氧化性DNA修饰。最后，还示出，可通过用三线态氧荧光淬灭激发态荧光团来产生反应性单线态氧。在整个细胞中观察到的由多种活性氧簇引起的直接或间接之嘧啶二聚作用与核酸损伤的任意组合可以是在阵列的情况下观察到的荧光信号强度损失的基本原因。
需要在用于测序和其他技术的核酸的加工期间以及测序和其他技术期间的核酸加工期间降低或抑制核酸损伤。例如，需要降低片段化期间的核酸损伤。另外，对于在边合成边测序中应用来说需要进一步降低荧光信号强度损失，以有助于长核苷酸序列的测序，所述长核苷酸序列包括50个、75个、100个、200个和500个或更多个核苷酸的序列。此外，测序情况下的荧光信号强度损失的解决方案容易地适用于采用多照射步骤的其他核酸检测平台。
发明概述
本文提供了在选自片段化和检测的核酸加工步骤期间抑制核酸降解的方法，其包括在加工步骤期间使核酸与包含没食子酸、其类似物、衍生物或其混合物的溶液相接触，其中所述接触抑制核酸的降解。
本文还提供了抑制光诱导的核酸降解的方法。该方法包括在包含一种或更多种化合物(例如，多酚化合物)之溶液的存在下照射所述核酸的一部分。还提供了检测具有荧光标记之核酸的方法。该方法包括用光照射所述核酸的至少一部分(其中所述光包含合适的波长以诱导荧光发射)，检测荧光发射。任选地，所述化合物是没食子酸、其类似物或衍生物(例如，其低级烷酯)或其混合物。
本文提供了在核酸样本制备期间降低或抑制核酸损伤的方法，其包括在包含一种或更多种化合物的溶液中使样本中的核酸序列片段化，所述化合物抑制样本中核酸序列的降解。还提供了从包含核酸序列的样本中除去受损核酸的方法，该方法包括：提供核酸序列样本，以及(i)用切割受损核酸序列的酶处理样本或者(ii)用选择性地与一种或更多种类型之受损核酸结合的抗体处理样本，其中处理样本使受损核酸从样本中除去。
一个或更多个实施方案的细节在附图和下文的说明中给出。其他特征、目的和优点将因说明和附图以及因权利要求书而显而易见。
附图简述
图1示出代表性的多酚化合物和相关结构在提供保护免受光诱导之降解中的相对有效性的图示。提高的有效性由上(最低)至下(最高)示出。
图2示出代表性的多酚化合物和相关结构在提供保护免受光诱导之降解中的相对有效性的图示。提高的有效性由上(最低)至下(最高)示出。
图3示出相对于通过滤光器(passing filter，PF)的簇(cluster)数目的错误而绘制的图。
图4示出在没食子酸的存在下、在尿素的存在下、以及在没食子酸和尿素的存在下，经75个循环的对照序列的覆盖次数图(coverage plot)。
图5示出在没食子酸的存在下、在尿素的存在下、以及在没食子酸和尿素的存在下，经100个循环的对照序列的覆盖次数图。
图6是示出由Covaris剪切引起的DNA片段化具有随剪切持续时间延长而降低之最大Q值的图。
图7是示出在没食子酸(L1)的存在下、在抗坏血酸盐(L2)的存在下、在无处理(L7)的情况下、以及在HindIII对照消化处理(L8)的情况下，通过Covaris剪切片段化之后的DNA之突变谱(mutationprofile)的图。L4和L6示出通过Covaris剪切片段化然后用FPG(L4)处理或PreCR处理(L6)之后DNA的突变谱。
图8是示出在没食子酸(L1)的存在下、在抗坏血酸盐(L2)的存在下、在无处理(L7)情况下、以及在HindIII对照消化处理(L8)的情况下，通过Covaris剪切片段化之后的DNA之突变谱的图。L4和L6示出通过Covaris剪切片段化然后用FPG(L4)处理或PreCR处理(L6)之后DNA的突变谱。
发明详述
本申请部分地提供在选自片段化和检测的核酸加工步骤期间抑制核酸降解的方法，其包括在加工步骤期间使核酸与包含没食子酸、其类似物或衍生物或其混合物的溶液相接触，其中所述接触抑制核酸的降解。任选地，核酸处于与支持物连接的核酸阵列中。任选地，所述溶液还包含一种或更多种进一步抑制核酸降解的化合物，所述化合物选自：尿素、抗坏血酸或其类似物或衍生物。
任选地，所述加工步骤是检测加工步骤。因此，本申请还提供在检测步骤期间抑制光诱导之核酸降解的方法，其包括在含有一种或更多种化合物(例如，多酚化合物)之溶液的存在下照射核酸的一部分。溶液中一种或更多种化合物的存在抑制光诱导的核酸降解的量。
本申请还部分地涉及检测具有荧光标记之核酸的方法，其包括：a)用具有合适波长的光照射核酸以诱导荧光发射；b)检测荧光发射；并反复重复这些步骤。照射步骤在包含多酚化合物之溶液的存在下实施，并且用于降低光诱导的核酸降解。
任选地，加工步骤是片段化。核酸样本可在多种技术之前进行片段化，所述技术包括但不限于：高通量或快速测序技术，例如边合成边测序和连接法测序(sequencing by ligation)；核酸微阵列检测技术，例如基因芯片和DNA微阵列；以及定量聚合酶链反应(Q-PCR)技术，例如实时聚合酶链反应(PCR)和多重PCR。但是，核酸样本的片段化(例如，通过剪切(例如，水剪切(hydroshearing)、雾化(nebulization)、声波处理(sonication)或声剪切))导致核酸损伤。因此，本文提供了降低或抑制核酸样本制备期间的核酸损伤的方法，其包括在包含一种或更多种化合物的溶液中使样本中的核酸序列片段化，所述化合物抑制样本中核酸序列的降解。还提供了在核酸样本制备期间抑制核酸降解的方法，其包括在一种或更多种化合物的存在下使样本中的核酸序列片段化，所述化合物抑制样本中核酸序列的核酸降解。
如上所述，任选地，制备所述核酸样本以用于测序。与在不存在所述化合物的情况下制备的核酸样本相比，提高了样本中序列信息的保真度。因此，本文还提供了提高测序期间核酸序列信息的保真度的方法。该方法包括提供待测序核酸序列的文库，在一种或更多种化合物(所述化合物抑制核酸降解)的存在下使核酸序列的文库片段化，并对该核酸序列的文库进行测序，与对照相比，核酸序列信息的保真度提高。如全文中所使用的，对照或对照值包含在对照样本(例如，在不存在本文所述化合物的情况下制备的样本)中获得的序列信息的保真度或者可包含已知标准物。
任选地，所提供的方法还包括用切割包含受损核酸的核酸序列的酶处理样本从而从样本中除去任何受损核酸。任选地，所提供的方法还包括用选择性地结合一种或更多种类型之受损核酸的抗体处理样本以从样本中除去任何受损核酸。
因此，在一些特定实施方案中，提供了从包含核酸序列的样本中除去受损核酸的方法。该方法包括：提供核酸序列的样本以及(i)用切割受损核酸序列的酶处理样本或者(ii)用选择性地与一种或更多种类型之受损核酸相结合的抗体处理样本，其中处理样本使受损核酸从样本中除去。任选地，在处理样本之前，在一种或更多种化合物的存在下使样本片段化。任选地，使用一种化合物，或者使用多于一种化合物。任选地，酶是甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶(formamidopyrimidine DNA glycosylase，FPG)。任选地，抗体结合8-氧代-G。切割受损核酸的酶是已知的。此外，特异性地与一种或更多种类型之受损核酸相结合的抗体是已知的并且描述于例如vanLoon和Hubscher,PNAS106(43)：18201-6(2009)中，其通过引用整体并入本文。
用于所提供溶液中的示例性化合物(在图1和2以及表1和2中举例说明)保护核酸免受可在多种测定中进行的检测步骤期间发生的光诱导的降解，所述测定包括例如边合成边测序中的碱基读出(base calling)。在可关闭似乎合理之机械降解途径的多种其他种类化合物中，本文所公开的化合物已被鉴定为成功地改善降解作用(包括光诱导的降解)。这样的化合物种类包括但不限于羟基自由基淬灭剂、活性氧簇(单线态氧、超氧化物阴离子)淬灭剂、氧清除剂(oxygen scavenger)、三线态淬灭剂和孔淬灭剂(hole quencher)。
在一些实施方案中，发现溶液中尿素(含或不含抗坏血酸盐)的存在进一步降低了与多酚化合物一起使用时核酸的降解量。表2和图4及图5示出在尿素和抗坏血酸盐的存在下的该协同作用。虽然当与多酚化合物联合使用时，尿素对降低降解具有显著影响，但是单独使用尿素对于任何这样的保护益处只有很小的影响。
采用具有多酚化合物之溶液的本发明方法在核酸暴露于重复照射和/或强照射时保护核酸的完整性，如可在多种情况下采用的，包括但不限于高通量或快速测序技术，例如边合成边测序和连接法测序；核酸微阵列检测技术，例如基因芯片和DNA微阵列；以及定量聚合酶链反应(Q-PCR)技术，例如实时聚合酶链反应(PCR)和多重PCR。如上所述，尿素的存在可增强多酚化合物在任意这些情况下的保护作用。在本文所公开的实例中，在以阵列形式边合成边测序中溶液的使用特别地降低了荧光信号衰减并且经50至120个重复检测步骤循环提供了较低错误率。
所述溶液(其可以以试剂盒形式提供)还可用于已被用于机械生物化学中的荧光检测技术。例如，荧光偏振已表现为分子相互作用研究中的强大技术，所述分子相互作用包括但不限于受体-配体相互作用(例如激素-受体相互作用)、蛋白质-肽相互作用和DNA-蛋白质相互作用。例如，Singleton等Tetrahedron63(17)：(2007)在研究RecA蛋白与DNA的相互作用时将荧光鸟嘌呤类似物并入寡核苷酸中。用于本文所公开方法的检测溶液可用于实时动态测量(其中使用了荧光团)。由检测溶液提供的针对光诱导之降解的保护性作用无需限于核酸的保护。因此，例如，检测溶液还可用于保护蛋白质、肽、碳水化合物和小分子(其中任一种均易于受在用于测量荧光发射的条件下产生的活性氧簇等影响)的完整性。
本文中使用的术语“核酸”旨在意为共价地连接在一起的至少两个核苷酸。核酸涵盖术语寡核苷酸、多核苷酸及其语法等同体。本发明的核酸一般包含磷酸二酯键，但是在一些情况下，核酸类似物可具有替代骨架，其包含例如磷酰胺(Beaucage等，Tetrahedron49(10)：1925(1993)和其中的参考文献；Letsinger,J.Org.Chem.35：3800(1970)；Sprinzl等，Eur. J.Biochem.81：579(1977)；Letsinger等，Nucl.Acids Res.14：3487(1986)；Sawai等，Chem.Lett.805(1984)；Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.110：4470(1988)；以及Pauwels等，Chemica Scripta26：14191986))、硫代磷酸酯(Mag等，Nucleic Acids Res.19：1437(1991)；和美国专利No.5,644,048)；二硫代磷酸酯(Briu等，J.Am.Chem.Soc.111：2321(1989))、o-甲基亚磷酰胺连接(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：APractical Approach，Oxford University Press)以及肽核酸骨架和连接(参见Egholm，J.Am.Chem.Soc.114：1895(1992)；Meier等，Chem.Int.Ed.)。另一些类似核酸包括具有以下的那些：带正电的骨架(Denpcy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：6097(1995))；非离子骨架(美国专利No.5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.Ed.English30：423(1991)；Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.110：4470(1988)；Letsinger等，Nucleoside&Nucleotide13：1597(1994)；第2和3章，ASC Symposium Series580，"CarbohydrateModifications in Antisense Research,"Y.S.Sanghui和P. Dan Cook编；Mesmaeker等，Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4：395(1994)；Jeffs等，J.Biomolecular NMR34：17(1994)；Tetrahedron Lett.37：743(1996))以及非核糖骨架，包括在美国专利No.5,235,033和5,034,506，第6和7章，ASC Symposium Series580，"Carbohydrate Modifications inAntisense Research"，Y.S.Sanghui和P. Dan Cook编中描述的那些。包含一种或更多种碳环糖的核酸也包括在核酸的定义中(参见，Jenkins等，Chem.Soc.Rev.(1995)，第169至176页)。若干核酸类似物描述于Rawls，C&E News June2，1997，第35页中。所有这些参考文献明确地通过引用并入本文。可进行核糖-磷酸酯骨架的这些修饰以促进标记的添加，或者提高生理环境中这样的分子的稳定性和半衰期。
核酸一般包含四种核苷酸碱基的特定序列：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)。还可存在尿嘧啶(U)，例如当核酸为RNA时作为胸腺嘧啶的天然替代物。尿嘧啶也可用于DNA中。用于本发明的核酸还可包含天然碱基或非天然碱基。鉴于此，天然脱氧核糖核酸可具有选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤中的一种或更多种碱基，核糖核酸可具有选自尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤中的一种或更多种碱基。应理解，用于本文所给出的方法或组合物的脱氧核糖核酸可包括尿嘧啶碱基，核糖核酸可包括胸腺嘧啶碱基。可包括在核酸(不论具有天然骨架或类似结构)中的示例性非天然碱基包括但不限于肌苷、黄嘌呤(xathanine)、次黄嘌呤(hypoxathanine)、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、15-卤代尿嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-巯基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤代取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂腺嘌呤、3-去氮杂鸟嘌呤、3-去氮杂腺嘌呤等。一个特定实施方案可在核酸中使用异胞嘧啶和异鸟嘌呤以降低非特异性杂交，如一般地在美国专利No.5,681,702中所述。
用于核酸中的非天然碱基可具有通用碱基配对活性，其中其能够与任何其他天然存在的碱基进行碱基配对。具有通用碱基配对活性的示例性碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。可使用的其他碱基包括具有与天然存在碱基子组(例如，肌苷)进行碱基配对之活性的那些，其与胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶进行碱基配对。
本文中使用的术语“核酸阵列”指其上或其中设置有多个在空间上可区分的核酸的固体支持物。所述核酸可以以特征的有序模式或随机模式布置。例如，单个特征可以是在空间上分离的核酸分子，或者核酸分子的集合(ensemble)(例如簇)。阵列可以是包含多个为允许加工多个样本而构造之单个阵列的复合阵列(composite array)。单个阵列在本文中称为“子阵列”，其包括核酸特征组。在较大阵列中子阵列出现在不同的区。子阵列本身可以是有序的或无序的。这样的子阵列可任选地在空间上可寻址(addressable)。子阵列可包括相同核酸的簇。由单个子阵列构成的复合阵列的实例是具有孔的微量滴定板，其中板整体是核酸阵列(或复合阵列)，而每个单个孔表示较大复合阵列中的子阵列。
本文中使用的术语“核酸成员”指与支持物结合的单个核酸，其为阵列的一部分和/或复合阵列中子阵列的一部分。
本文中使用的术语“支持物”指用于固定核酸阵列的基底。“支持物”是核酸阵列可与之结合或者核酸可在其上合成和/或修饰的具有刚性或半刚性表面的材料。支持物可包括：任何树脂、微珠(microbead)、玻璃、受控孔度玻璃(controlled pore glass，CPG)、聚合物支持物、膜、纸、塑料制品(plastic)、塑性管或平板(tablet)、塑性珠、玻璃珠、载玻片(slide)、陶瓷制品(ceramic)、硅片(silicon chip)、多孔板、尼龙膜、光纤以及PVDF膜。
支持物可包括任何平的晶片样(wafer-like)基底和具有孔的平的基底，例如微量滴定板(包括96孔板)。示例性的平的基底包括芯片、载玻片、蚀刻基底、微量滴定板和流动池(flow cell)反应器，其包括具有多个微流体通道的多泳道流动池反应器，例如用于cBot测序工作站的八通道流动池(Illumina，Inc.，San Diego，CA)。
支持物还可包括珠，包括磁珠、空心珠和实心珠。珠可以与平的支持物(这样的平的支持物还任选地包含孔)缀合使用。珠或者微球一般指由刚性或半刚性材料制成的小体。该体可具有特征为例如球形、卵形、微球形或另一些可识别颗粒形状(无论具有规则尺寸或不规则尺寸)的形状。特别地，珠的大小包括但不限于直径为约1μm、约2μm、约3μm、约5μm、约10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约60μm、约100μm、约150μm或约200μm。另一些颗粒可以与在本文中针对珠和微球描述的那些相类似的方式使用。
支持物的组成可根据例如连接的形式、化学和/或方法和/或核酸的合成方法而变化。可根据本公开使用的支持物材料包括但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、尼龙、金属以及其他合适的材料。示例性组成包括用于多肽、多核苷酸和/或有机部分合成的支持物和为其赋予的化学官能度。这样的组合物包括例如塑料制品、陶瓷制品、玻璃、聚苯乙烯、三聚氰胺、甲基苯乙烯、丙烯酸类聚合物、顺磁性材料、氧化钍溶胶(thoriasol)、碳石墨、二氧化钛、乳胶(latex)或交联葡聚糖例如SepharoseTM、纤维素、尼龙、交联微团(micelle)和TeflonTM，以及可发现描述于例如来自Bangs Laboratories，Fishers，Inc的“Microsphere Detection Guide”(其通过引用并入本文)中的任何其他材料。支持物颗粒可由以下制成：交联淀粉、葡聚糖、纤维素、蛋白质、有机聚合物(包括苯乙烯聚合物(包括聚苯乙烯和甲基苯乙烯以及其他苯乙烯共聚物))、塑料、玻璃、陶瓷、丙烯酸类聚合物、磁响应材料、胶体、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、尼龙、乳胶或
Figure BDA0000374120810000091
来自Bangs Laboratories，Fishers，Inc.的“Microsphere Detection Guide”(通过引用整体并入本文)是有帮助的指南。在本公开范围内的另一些示例性支持物包括例如描述于美国申请公开No.2002/0102578和美国专利No.6,429,027中的那些，二者都通过引用整体并入本文。
本文中使用的核酸损伤或降解指从其原本预期形式修饰核酸碱基(无论天然的或非天然的)。例如，核酸损伤或降解指其中鸟嘌呤转化为8-氧代-鸟嘌呤的情况，例如通过在核酸样本操作期间产生的活性氧簇。另一些类型的核酸损伤包括但不限于脱碱基位点(abasic site)和胸腺嘧啶和胞嘧啶的均二聚作用和异二聚作用。
脱碱基位点定义为碱基组分已从多核苷酸链中除去的核苷位置。脱碱基位点可在生理条件下通过核苷残余物的水解天然地存在于DNA中，但也可在人工条件下形成。一旦形成，脱碱基位点可以被切割(例如，通过用核酸内切酶或另一些单链切割酶处理，暴露于热或碱)，提供了用于多核苷酸链的位点特异性切割方法。
本文中使用的术语“光诱导的降解”指通过暴露于照明对核酸阵列中的一种或更多种核酸造成的光诱导的损伤。这样的降解包括单个核酸从阵列所连接的支持物完全或部分地除去。例如，光诱导的降解可包括单个核酸中任意核苷酸处的磷酸二酯骨架的切割。这样的降解还可包括核酸碱基或荧光标记的去除或反应，其引起杂交或荧光功能的损失。光诱导的降解还可包括光诱导的核苷酸交联。如可能观察到的，光诱导的降解的结果可表现为当通过重复的检测步骤循环时(例如，当进行边合成边测序时，通过连接和微阵列扫描测序时)，一个或更多个区或核酸阵列的子阵列中荧光检测灵敏度降低。当与术语“抑制”联合使用时，其指在损伤程度上的完全或部分阻断，例如，如可通过所观察到的荧光发射强度所定量的。例如，光损伤可作为荧光信号强度相对于在核酸阵列上进行的重复照射(检测)步骤之次数的函数测量。该方法有时被称为T强度衰减(T intensitydecay)。光损伤的另一评估可测量为错误率相对于在核酸阵列上进行的重复照射(检测)步骤之次数的函数。
本文中使用的术语“检测错误率”指核酸阵列和/或子阵列中一个或更多个荧光标记核酸的鉴定中的错误频率的测量。例如，当在采用多色荧光标记的方案中测量荧光时，错误可通过标记子阵列的错误鉴定而产生，例如，由于子阵列中多个核酸成员的光诱导的降解，信噪比(signal-to-noise)变差。因此，检测错误率随阵列或子阵列的单个核酸成员经多个重复照射循环的连续损失而升高。
本文中使用的术语“照射”指将核酸阵列暴露于照明。例如，该暴露可出于荧光检测的目的。照射可以用激光或类似的光源进行。照射可在UV-可见光谱的选定部分进行，并且可采用一个或更多个波长带滤光器。照射可进行一段时间以收集充足的荧光发射数据。当术语“强的”用于指照明时，其指在照射核酸阵列之一部分期间所使用的功率值(amount ofpower)。强激光照射包含约5毫瓦至约500毫瓦的量和约1W/mm2至约200W/mm2的量的功率密度。
本文中使用的术语“溶液”指包含化合物或本文所述化合物的溶液，其降低片段化诱导的核酸降解或损伤。该溶液在用于例如核酸测序技术中之进一步操作的核酸样本制备期间使用。化合物或用于根据所提供方法使用的化合物可提供作为液体或待在使用前溶于合适溶剂的固体形式。
当加工步骤是检测加工步骤时，本文中使用的溶液也可被称为检测溶液。本文中使用的术语“检测溶液”指包含本发明化合物的溶液，其在核酸阵列暴露于照明之后降低光诱导的降解。检测溶液是在采用照射的检测步骤期间使用的溶液。
本文中使用的术语“缓冲剂”在单独使用时指未用作检测溶液的任何其他缓冲溶液。缓冲溶液包括用于聚合酶反应、杂交、洗涤或在使用本发明所采用的检测溶液之前进行的任何其他操作中的那些。
本文中使用的术语“多酚化合物”指在苯或其他芳环上具有多个羟基(即，酚基团)的芳族化合物。所述苯或其他芳环可任选地被另一些取代基和/或稠合环所取代。示例性多酚化合物包括但不限于没食子酸及其低级烷酯、其单甲醚、及其低级烷酯与单甲醚的组合、焦性没食子酸和氢醌，例如叔丁基氢醌(TBHQ)、2，4，5-三羟基丁酰苯(THBP)。
本文中使用的术语“低级烷酯”指羧酸的C1-C6烷基链酯。在一些实施方案中，“低级烷酯”指羧酸的C1-C4烷基链酯。代表性的酯包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯和己酯。任意前述酯可任选地为支化的。例如，这样的支化的酯包括异丙酯、仲丁酯、异丁酯和叔丁酯。
在一些实施方案中，本发明提供了抑制检测步骤期间光诱导的核酸降解的方法，其包括在具有多酚化合物之溶液的存在下照射核酸。所述溶液抑制光诱导的核酸降解的量。
在一些实施方案中，本发明提供了检测具有荧光标记之核酸的方法，其包括：a)用具有合适波长的光照射核酸以诱导荧光发射；b)检测所述荧光发射；c)重复步骤a)和b)。照射步骤在包含多酚化合物之检测溶液的存在下实施。该检测溶液抑制光诱导的核酸降解。在一些实施方案中，检测溶液包含没食子酸、其低级烷酯或其混合物。在另一些实施方案中，检测溶液包含以下项的混合物：1)没食子酸、其低级烷酯、或其混合物和2)选自尿素、抗坏血酸或其盐、和异抗坏血酸或其盐中的一种或更多种化合物。
本申请的方法包括用于照射步骤期间的溶液。该溶液包含多酚化合物，所述多酚化合物可以是任何具有两个或更多个酚羟基的芳族系统，其中任意一个还可以是低级烷醚。多酚化合物可属于许多结构种类，例如木脂素、单宁、没食子儿茶素(gallocatechin)和类黄酮，例如黄酮醇、黄酮(flavone)、儿茶素、黄烷酮、花青素和异黄酮(isoflavonid)。本发明的多酚化合物可以以糖基化形式存在，其中一个或更多个糖残基与多酚化合物连接。例如，这样的糖基化形式可赋予有用的水中溶解度性质。示例性多酚化合物包括但不限于芹菜素(apigenin)、黄芪甙(astragalin)、花色素苷(aurantinidin)、杜鹃黄素(azaleatin)、紫铆素、咖啡酸、儿茶素、花青素、表儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、没食子酸及其低级烷酯、焦性没食子酸、花翠素、鞣花酸、圣草素、高圣草素、花色素苷(europinidin)、非瑟酸(fisetin)、阿魏酸、高良姜素、染料木素、棉花皮素(gossypetin)、橙皮素(hesperitin)、橙皮苷、氢醌(例如对氢醌、叔丁基氢醌(TBHQ)、2,4,5-三羟基丁酰苯(THBP))、羟基酪醇(hydroxytyrosol)、异鼠李素、异樱花素、山柰酚(kaempferol)、山柰素(kaempferide)、木樨草素、木樨草定(luteolinidin)、锦葵素、杨梅素、桑色素、柚皮素、柚苷、柚皮黄素(natsudaidain)、霍香黄酮醇(pachypodol)、花葵素、芍药素、牵牛色素、间苯三酚、松属素、枳属甙、紫檀碱(pterocarpan)、焦儿茶酚、槲皮素、间苯二酚(resorcinol)、鼠李金、鼠李素、蔷薇色素(rosinidin)、芦丁、芥子醇、樱花素、樱花苷、sterubin和单宁酸。在一些实施方案中，多酚化合物可包括：没食子酸、其低级烷酯，例如没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、其单甲醚，及其低级烷酯与单甲醚的组合、或其混合物。
任选地，在所提供方法的溶液中，所述一种或更多种化合物中的至少一种是抗坏血酸或其盐、类似物或衍生物。抗坏血酸盐在用于测序的检测溶液中的用途已描述于Fedurco等，WO2006/064199中，其通过引用整体并入本文。除非另有指明，否则如本文所使用的术语抗坏血酸盐和抗坏血酸指L-异构体和D-异构体二者及其混合物，包括外消旋混合物。两种光学异构体都能够在所提供的方法中作为化合物起作用。示例性盐包括抗坏血酸钠，例如L-抗坏血酸钠。存在许多可用于所提供方法中的具有活性的已知抗坏血酸盐类似物和衍生物。合适的衍生物和类似物包括其中5-和/或6-羟基被酯化或其他衍生化的那些。或者，5-和/或6-羟基可被其他官能团(例如，卤素或氨基)所替代。另一些衍生物是其中不存在5-和/或6-羟基的那些(即，用氢原子替代羟基)。这样的衍生物的代表性实例包括但不限于6-邻甲苯磺酰基-L-抗坏血酸盐、5-脱氧基-L-抗坏血酸盐、6-溴-6-脱氧-L-抗坏血酸盐、6-氨基-6-脱氧-L-抗坏血酸盐、L-抗坏血酸6-羧酸盐和6-邻抗坏血酸基链烷酸盐(例如6-抗坏血酸基棕榈酸盐(棕榈酰基抗坏血酸盐))。
如上所述，任选地，所述一种或更多种化合物中的至少一种是没食子酸、其衍生物或类似物或其组合。没食子酸在用于测序的检测溶液中的用途已描述于美国序列号13/018,255中，其通过引用整体并入本文。衍生物包括但不限于没食子酸的低级烷酯或单甲醚。本文中使用的术语低级烷酯指羧酸的C1-C6烷基链酯。在一些实施方案中，低级烷酯指羧酸的C1-C4烷基链酯。代表性的酯包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯和己酯。任意前述酯可任选地为支化的。例如，这样的支化酯包括异丙酯、仲丁酯、异丁酯和叔丁酯。
还应认识到，没食子酸的另一些酯衍生物可用于本发明，其中没食子酸酯被赋予了充分的水溶性。在一些实施方案中，通过使用少量共溶剂例如二甲亚砜(DMSO)可实现额外的溶解性。通过采用少量这样的共溶剂，任何没食子酸酯都可有效用于降低光诱导的核酸降解。在一些实施方案中，可以采用水增溶性酯基团，例如没食子酸的PEG酯。在这样一些实施方案中，没食子酸酯可获益于与羧酸相比酯的提高的抗氧化活性，而不牺牲羧酸官能团的有用的水溶性。
任选地，两种或更多种化合物的组合可用于溶液中。优选地，这样的组合中的至少一种化合物是没食子酸或其类似物或衍生物。
一种或更多种化合物或者化合物将以约0.1mM至约5M(包含)的浓度范围存在于溶液中。例如，所述一种或更多种化合物或者化合物将以下述浓度范围存在于溶液中：包括0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、1M、2M、3M、4M和5M，以及约0.1mM至约5M(包含)之间的任何浓度。例如，当采用没食子酸、其类似物、衍生物或其混合物时，溶液的该组分可以以约0.1mM至约200mM的浓度范围存在。
在一些实施方案中，降解可包括氧化性损伤，例如公开于Cooke等，FASEBJ.17(10)：1195-1214(2003)中，其通过引用整体并入本文。例如，在光诱导的降解的情况下，其可包括核酸的任意核苷酸处磷酸二酯骨架的断裂。另一些降解途径可包括8-氧代-2’-脱氧鸟苷的形成、引起杂交或荧光功能损失的核酸碱基或荧光标记的除去或反应、以及光诱导的核苷酸交联。通过活性氧簇自由基(例如羟基自由基)的降解可通过氢原子提取过程(例如，从胸腺嘧啶的甲基或者从2’-脱氧核糖的C-H键)损伤核酸。例如，活性氧簇还可通过与核酸碱基的不饱和键反应来氧化核苷酸。
具有多酚化合物的溶液可通过多种机制抑制光诱导的核酸损伤。不受理论约束，多酚化合物可作为与氧相比更迅速的激发荧光团的荧光淬灭剂，从而降低或防止如方程式1所示的单线态氧的形成：
Figure BDA0000374120810000141
方程式1
如方程式1所示，单线态激发荧光团S1可优先与多酚化合物(PP)反应代替与氧的反应，以提供荧光团回到单线基态S0，同时形成激发态的多酚化合物(pp＊)。本领域技术人员将理解回到基态S0还可以通过系间窜跃(intersystem-crossing)进行到荧光团T1的三线激发态(未示出)。该到达荧光团三线态的非辐射途径可通过与多酚化合物相互作用来促进。最后，转移到多酚化合物的能量可有效地散逸(dissipate)。
或者，通过用氧荧光淬灭所产生的任何单线态氧可与多酚化合物反应以保护核酸的完整性。类似地，如上所述，通过多光子吸收形成的任何活性氧簇(例如超氧化物阴离子或羟基自由基)的形成也可被存在于检测溶液中的多酚化合物所淬灭。多酚化合物可降低或防止光诱导之降解的另一个可能机制是通过截取任何由荧光团通过多光子吸收所产生的高能量UV-可见辐射并使之散逸。在这样的机制中，降低或预防了由高能量发射引起的活性氧簇和/或间接嘧啶二聚的形成。最后，本领域技术人员将理解这些高能量光化学方法可以以任何组合操作。
如上所述，抑制这些光诱导的降解过程指损伤程度的完全或部分阻断，例如，如可通过重复暴露于强照明所观察到的荧光发射强度所定量的。例如，光诱导的降解可作为荧光信号强度相对于在核酸阵列上进行的重复照射(检测)步骤之次数的函数测量，例如在下文所述的边合成边测序实例中。该方法有时被称为强度衰减。光诱导的核酸损伤的另一评估可测量为错误率相对于在核酸阵列上进行的重复照射(检测)步骤之次数的函数。
光诱导的损伤的另一评估可以是测定核酸降解产物。例如，通常使用8-氧代-2’-脱氧鸟苷的测量来评估对核酸的氧化性损伤。损伤还可通过对胸腺嘧啶和胞嘧啶均二聚作用和异二聚作用的程度进行定量来评估。当在固体支持物上采用检测方法时，损伤的抑制可容易地通过将在存在和不存在检测溶液的情况下照射的阵列进行比较以及测量经重复照射循环的荧光信号强度损失来评估。
在一些实施方案中，本发明的方法可适用于溶液中的核酸，而在另一些实施方案中，本发明的方法可适用于与支持物连接的核酸(例如，以阵列形式)。当在支持物上采用核酸时，核酸可以以有序阵列或无序阵列存在。当使用含有一种或更多种所提供化合物的溶液时，从支持物切割掉的核酸的量可以被降低。因此，在一些实施方案中，光诱导的降解包括从核酸阵列中除去核酸成员。
任选地，加工步骤是检测加工步骤，并且检测加工步骤可包括照射核酸。当进行检测步骤时，照射核酸包括使用合适的光源来激发标记(例如荧光标记)。本领域技术人员将理解，存在多种可用标记，并且照射条件(例如，用于照射和检测的波长的选择)将由核酸检测过程中所使用的标记的选择来指导。就每种类型的核苷酸而言，标记可相同，或者各核苷酸可具有独特的标记。标记用于鉴定核酸中核苷酸的特定并入。因此，例如经修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶都可连接不同的荧光团以使得它们彼此间易于区分。当在阵列上测序时，可以使用经标记的核苷酸与未经标记的核苷酸的混合物。合适的标记包括但不限于荧光标记、质量标签、磁性标签等。例如，标记包括生物素、二硝基酚和荧光素。用于本方法的示例性经标记核苷酸描述于WO04/018497和美国专利No.7,541,444和7,057,026中，其通过引用整体并入本文。
可使用合适的接头(linker)使可检测标记(例如荧光团)与核苷酸经核酸碱基相连。合适的荧光团包括描述于WO2007/135368中的那些，其通过引用整体并入本文。接头可以是酸不稳定性的、光不稳定性的或者包含二硫键。示例性标记和连接包括公开于WO03/048387中的那些。如WO2004/018493所述，另一些连接(特别是包含膦-可切割叠氮化物的接头)可用于本发明。
照射用照射源来实施，照射源可包括例如激光或产生足以生成可检测发射的激发光强度的另一些源。照射源可以与波长滤光器的任何组合联合使用。照射步骤在一些实施方案中可以是脉冲的，或者在另一些实施方案中是连续的。光源的强度可以为约5毫瓦至约500毫瓦。例如，光源可以是高能量短弧放电灯(high-energy short arc-discharge lamp)。示例性放电灯包括汞爆发器(mercury burner)(瓦数为50瓦特至200瓦特)和氙爆发器(xenon burner)(75瓦特至150瓦特)以及LED。光源强度的准确选择可取决于荧光团的消光系数(extinction coefficient)。较大消光系数表明在给定波长区光子(也称为量子)的吸收更为可能。量子产率指所发射的光子与所吸收的光子之比，并且通常值为0.1至1.0。量子产率是发射效率的测量。量子产率值低于1是非辐射途径中能量的损失(例如热或光化学反应)而非荧光发射造成的。消光系数、量子产率、光源强度和荧光寿命都是有助于荧光发射之强度和使用的重要因素。
本发明的方法可包括在约360nm至约800nm的范围内进行的照射步骤，光源的功率为约5毫瓦至约500毫瓦。如上所述，在约360nm至约800nm之间，光诱导的降解可通过检测溶液的存在来缓解。这有助于多个荧光团用于同时的荧光发射检测。因此，可实施本发明的方法同时将不同标记并入四种常见碱基。照射步骤可进行约0.1秒至约10分钟的时间，GA为175毫秒至500毫秒，扫描速度为2mm/秒。这样的照射时间可包括脉冲照射或连续照射。
当进行并入不同地标记的核苷酸的多个步骤时，本发明的方法可包括在照射步骤之前用所提供的溶液(例如，检测溶液)代替溶液。例如，在边合成边测序中，可以在照射之前用检测溶液代替用于添加经标记核苷酸的溶液。在另一些实施方案中，检测溶液可用于边合成边测序中的每个步骤(除检测步骤以外还包括洗涤步骤)。
由荧光团发射的荧光可使用合适的检测系统(例如电荷耦合式(Charge-Coupled-Device，CCD)摄像机)在适当的波长处来检测，所述检测系统可任选地与放大装置、荧光成像仪或共聚焦显微镜联合。另一种合适的检测系统采用互补式金属氧化物半导体(complementarymetal-oxide-semiconductor，CMOS)检测器。如果测序在阵列上实施，则可通过使用共聚焦扫描显微镜以用激光扫描阵列的表面来实施并入碱基的检测，从而使与并入核苷酸相连接的荧光标记成像。或者，灵敏的2-D检测器(例如电荷耦合式检测器(CCD))可用于使所产生的信号可视化。该技术特别可用于单分子阵列。可用另一些技术例如扫描近场光学显微术(scanning near-field optical microscopy，SNOM)并且可在使密集阵列成像时使用。对于扫描近场光学显微术的描述，参见Moyer等，Laser Focus World29：10，1993。另一种可用技术是表面特异性的全内反射荧光显微术(total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM)；参见，例如，Vale等，Nature，(1996)380：451-453。
当采用本发明的溶液来边合成边测序时，例如，该方法可包括每个循环向阵列添加另外的荧光标记的核苷酸，并且重复检测步骤。在一些实施方案中，采用重复核苷酸添加和检测步骤的本发明方法可包括至少25个循环，在另一些实施方案中，至少75个循环，以及在另一些实施方案中，至少100个循环。在一些实施方案中，本发明的方法包括将添加和检测步骤重复约100个循环至约1,000个循环的循环数，在另一些实施方案中，约100个循环至约500个循环，在另一些实施方案中，约100个循环至约300个循环。
在测序反应中准确地测序25个或更多、50个或更多、75个或更多、或者100个或更多个连续核苷酸的能力在应用例如基因组重排(genomere-alignment)中是显著的优点。
在一些实施方案中，核酸阵列包括引物模板。核酸“边合成边测序”包含向使用聚合酶以5’至3’方向延长的多核苷酸链依次添加一种或更多种核苷酸以形成与待测序模板核酸互补的延伸的多核苷酸链。示例性测序方法描述于例如Bentley等，Nature456：53-59(2008)，WO04／018497；US7,057,026；WO91／06678；WO07／123744；US7,329,492；US7,211,414；US7,315,019；US7,405,281和US2008／0108082中，其各自通过引用并入本文。在检测步骤中确定存在于一种或更多种所添加核苷酸中的碱基的种类。可以在各核苷酸并入步骤之后确定所添加的碱基的种类。然后，可以使用常规的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对原则推断模板的序列。为了避免疑问，“测序”还可涵盖单核苷酸的并入和鉴定。单碱基种类的确定可用于例如单核苷酸多态性(polymorphism)的计分。
用于测序反应的核酸模板可包括具有游离3’羟基的双链区，其作为测序反应中的引物或另一些核苷酸添加的起点。待测序的该模板区将该游离3’羟基悬于互补链之上。具有游离3’羟基的引物可作为单独的组分(例如，常规的寡核苷酸测序引物)添加，该组分与待测序的模板区杂交。或者，引物和待测序模板链可各自形成部分地自互补的核酸链(其能够形成分子内双链(duplex)，例如发夹环结构)的一部分。向游离3’羟基依次添加核苷酸，导致多核苷酸链以5’至3’方向合成。在各核苷酸添加之后，可以确定已被添加的碱基的性质，从而为核酸模板提供序列信息。
核苷酸并入核酸链(或多核苷酸)指核苷酸通过与核苷酸的5’磷酸基团形成磷酸二酯键与核酸链的游离3’羟基相结合。待测序核酸模板可以是DNA或RNA，或者甚至是包含脱氧核苷酸和核糖核苷酸二者的杂交分子。核酸可包括天然存在核苷酸和／或非天然存在核苷酸以及天然骨架连接或非天然骨架连接。
待测序核酸模板可通过本领域中已知的任何合适的连接方法与固体支持物相连。例如，连接可通过共价相连。如果模板是在固体支持物上的“阵列”，则该阵列可采取任何方便的形式。因此，本发明的方法适用于所有类型的“高密度”阵列，包括单分子阵列和成簇阵列。
在一些实施方案中，在测序时，相对于缺乏所述化合物的对照溶液将检测错误率降低大于约20％。在溶液中存在选自尿素、抗坏血酸或其盐和异抗坏血酸或其盐的情况下，检测错误率进一步降低。在另一些实施方案中，与缺乏多酚化合物的对照相比，溶液将检测错误率降低大于40％，其中选自尿素、抗坏血酸或其盐和异抗坏血酸或盐中的一种或更多种化合物的存在也改善了错误率。在另一些实施方案中，相对于缺乏多酚化合物的对照，溶液将检测错误率降低大于50％。
可以例如，如Bentley等，″Accurate whole human genome sequencingusing reversible terminator chemistry″Nature456：53-59(2008)中所述确定错误率。错误率是每个循环的测序错误，如使用ELAND算法通过phiX序列与phiX标准基因组的比对所确定的，ELAND算法是如Pipeline UseGuide(Illumina，Inc.，San Diego，CA)和Bentley等，Nature456：53-59(2008)中所述的标准渠道分析(standard pipeline analysis)的一部分。
在一些实施方案中，本发明提供了抑制检测步骤期间光诱导的核酸降解的方法，其包括在包含没食子酸、其类似物、衍生物、低级烷酯或其混合物的溶液的存在下照射核酸的一部分。所述溶液降低光诱导的核酸降解的量。没食子酸及其衍生物的使用示于以下实施例I和II中。游离形式的没食子酸能够离子化为羧酸盐，因此，其作为光诱导降解之抑制剂的有效性可取决于系统的pH。相比之下，低级没食子酸酯可在一定范围的pH下显示出相对恒定的有效性。
不受理论约束，本领域技术人员将理解，与酯相比，羧酸基团适当地更吸电子(electron withdrawing)。因此，如果没食子酸和相关化合物起抗氧化作用，则可期望在降低光诱导的降解方面，酯比羧酸表现得稍好些。但是，没食子酸酯的该益处可以被酯的水溶性需要所减弱。鉴于此，可电离羧酸可用于赋予水溶性。这样，在一些实施方案中，本发明的检测溶液提供没食子酸、没食子酸的低级烷酯、或其混合物。
本领域技术人员还将理解，没食子酸的另一些酯衍生物可用于本发明，其中没食子酸酯被赋予了足够的水溶解度。在一些实施方案中，可通过使用少量共溶剂(例如二甲亚砜(DMSO))实现额外的溶解性。通过采用少量这样的共溶剂，任何没食子酸酯都可有效用于降低光诱导的核酸降解。在一些实施方案中，可以使用水增溶性酯基团，例如没食子酸的PEG酯。在这样的一些实施方案中，没食子酸酯可获益于与羧酸相比酯提高的抗氧化活性，不牺牲羧酸官能团的有用的水溶性。
在另一些实施方案中，本发明提供了抑制检测步骤期间光诱导的核酸降解的方法，其包括：在检测溶液的存在下的核酸，所述检测溶液包含：1)没食子酸、其低级烷酯、或其混合物，和2)选自尿素、抗坏血酸或其盐和异抗坏血酸或其盐中的一种或更多种化合物。该检测溶液降低光诱导的核酸降解的量。如实施例I和II中所证实的，尿素在降低光诱导的核酸降解中示出协同作用。未经取代的尿素((NH2)2CO)一般不归类为抗氧化剂，因此，尿素在提供降低光诱导之降解中的协同作用中的作用不易于归因于抗氧化活性。例如，已示出，尿素不提供对抗生理浓度的活性氧簇的明显保护(Glazer,FASEB J.2：2487-2491(1988))。此外，已示出，尿素未提供对抗与单线态氧反应的明显保护(Dahl等，Photochem.Photobi0l.47(3)：357-362(1988))。尿素基本上只吸收低于245nm的UV-可见光区。在该UV光谱区，嘧啶二聚作用是光诱导的核酸损伤的重要途径。但是，如实施例中所提供的，在荧光检测条件下，尿素在提供另外保护以免受光诱导之损伤中的作用尚未被完全理解。
在一些实施方案中，本发明涉及根据前述方法用于使用的试剂盒。因此，本文提供了试剂盒，其可包含：一种或更多种化合物和本文所述的(i)抗体和／或(ii)酶及其组合。所述化合物可包括没食子酸、其类似物、衍生物、低级烷酯或其混合物。在一些实施方案中，试剂盒还可包含另一些化合物、缓冲剂或另一些试剂和／或用于实施用于核酸样本制备之溶液的制备的一组说明书。该试剂盒还可包含一种或更多种核苷酸、能够催化核苷酸并入与待测序核酸模板互补的核酸链的酶、以及适于制备溶液的多酚化合物。该多酚化合物可包括没食子酸、其类似物、衍生物或低级烷酯，或者其衍生物。在一些实施方案中，该试剂盒还包含第二化合物，其选自尿素、抗坏血酸或其盐和异抗坏血酸或其盐。该试剂盒还可包含缓冲盐和用于实施用于荧光实验中之溶液的制备的一组说明书。
本文所述的实施方案可用于多种已知用于检测核酸的方法和／或组合物，其中发生或者怀疑发生光诱导的核酸降解。例如，当检测方法需要核酸重复或长时间暴露于光时，本文所述的方法和组合物特别有用。特别地，通常通过用具有合适波长的光照射样本来诱导由包含荧光标记的核酸发射荧光，从而使用荧光标记之核酸的检测。如本文所述，在这些方法的照射步骤期间，可发生对核酸的损伤。重复或长时间暴露可导致荧光检测灵敏度提高，其可表现为例如检测错误率增加以及信噪比降低。其中方法和／或组合物用于检测重复或长时间暴露于光之核酸的方法的非限制性实例包括高通量或快速测序技术，例如边合成边测序和连接法测序；核酸微阵列检测技术，例如基因芯片和DNA微阵列；以及定量聚合酶链反应(Q-PCR)技术，例如实时聚合酶链反应(PCR)和多重PCR。
一种用于高通量或快速测序的有用方法是边合成边测序(SBS)。需要用光重复或长时间照射核酸的SBS技术包括但不限于：基因组分析仪系统(Illumina Inc.，San Diego，CA)和True单分子测序(tSMS)TM系统(Helicos Biosciences Corporation，Cambridge，MA)。简单来说，许多边合成边测序反应被用于阐明靶序列中靶位置处多个碱基的种类。所有这些反应依赖于使用具有至少两个结构域的靶核酸序列；测序引物将与第一结构域杂交，期望相邻的第二结构域的序列信息。在形成测定复合物之后，使用延伸酶向与第一结构域杂交的测序引物添加dNTP，读取dNTP的每次添加以确定所添加dNTP的种类。这可进行许多个循环。SBS技术例如基因组分析仪系统(Illumina Inc.，San Diego，CA)和True单分子测序(tSMS)TM系统(Helicos Biosciences Corporation，Cambridge，MA)采用经标记的核苷酸来确定靶核酸分子的序列。可以将靶核酸分子与引物杂交，并在聚合酶和包含封闭基团的经标记之核苷酸的存在下进行孵育。延伸引物使得核苷酸被并入。封闭基团的存在只允许一轮并入，即，单核苷酸的并入。标记的存在允许并入的核苷酸的鉴定。可以在每个循环期间添加多个同类单核苷酸碱基，例如用于True单分子测序(tSMS)TM系统(Helicos Biosciences Corporation，Cambridge，MA)中，或者，可以在每个循环期间同时添加全部四种核苷酸碱基，例如用于基因组分析仪系统(Illumina Inc.，San Diego，CA)中，特别是当每个碱基与可区分标记相缔合时。在通过其相应标记鉴定所并入的核苷酸之后，标记和封闭基团二者均可被除去，从而允许进行下一轮的并入和鉴定。确定所添加的核苷酸碱基的种类包括使新添加的经标记之碱基重复暴露于光源，由于特定核苷酸碱基(即，dATP、dCTP、dGTP或dTTP)的添加，所述光源可诱导可检测的发射。本文所公开的方法和组合物对于这样的SBS技术特别有用。
用于高通量或快速测序技术的另一有用方法是连接法测序。连接法测序是公知的测序方法，其需要用光重复或长时间照射二碱基探针(di-baseprobe)。使用边合成边测序的示例性系统包括Applied Biosystems(LifeTechnologies，Carlsbad，CA)的SOLiDTM系统。简单来说，用于通过连接测序的方法包括将测序引物与固定到模板珠(templated bead)的衔接序列(adapter sequence)杂交。一组四个荧光标记的二碱基探针竞争与测序引物连接。通过询问每个连接反应中的每第一个和第二个碱基来获得二碱基探针的特异性。在一系列连接循环之后，除去延伸产物，用与用于第二轮连接循环的第n-1位互补的测序引物重置模板。多个连接、检测和切割循环以决定最终读取长度的循环数进行。连接法测序的方法已由Applied Biosystems在其Agencourt平台中开发(参见，Ronaghi等，Science281：363(1998)；Dressman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：8817-8822(2003)；Mitra等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：55926-5931(2003))。
另外，本文所述的方法和溶液对于由核酸阵列的测序可特别有用，其中可以从阵列上的多个位置同时读取多个序列，这是因为可以基于其可鉴定标记来鉴定每个位置处的每个核苷酸。示例性方法描述于US2009／0088327、US2010／0028885和US2009／0325172中，其各自通过引用并入本文。
本领域已知的其中用光重复或长时间照射核酸的另一些方法包括核酸微阵列检测技术，例如基因芯片和DNA微阵列。本领域中公知当扫描核酸微阵列时，特别是当扫描同一微阵列多于一次时，存在可靠性和一致性问题。但是，可能需要多次扫描以获得经标记核酸的全动力学范围，例如，当使用微阵列来确定基因表达水平时。单次扫描试图捕获给定样本的整个表达范围。当存在广泛范围的表达时，可能不给出整组基因表达的真实图像。例如，样本中的基因可表达少至200份拷贝，而同一样本中的另一基团可表达50,000份拷贝。在这方面，本文所述的方法和组合物在保持核酸经多次扫描之后的完整性中特别有用。
本领域中已知的核酸微阵列检测技术的实例包括但不限于LabCard(ACLARA Bio Sciences Inc.，Santa Clara，CA)；GeneChip(Affymetrix，Inc，Santa Clara，CA)；LabChip(Caliper Technologies Corp，Hopkinton，MA)；由SurePrint技术生产的微阵列(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)；具有电化学传感的低密度阵列(Clinical Micro Sensors Inc.，Pasadena，CA)；LabCD系统(Tecan Trading AG Zurich，Switzerland.)；Omni Grid(Gene Machines，Stillwater，OK)；Q Array(Genetix Ltd.，Boston，MA)；具有液相表达技术的高通量自动化质谱系统(GeneTraceSystems，Inc.，Menlo Park，CA)；热喷射点样系统(thermal jet spottingsystem，Hewlett Packard Company；Palo Alto，CA)；Hyseq HyChip(Hyseq，Inc.，Sunnyvale，CA)；BeadArray(Illumina，Inc.，San Diego，CA)；GEM(Incyte Microarray Systems，Fremont，CA)；可将12至64个点分配在多个载玻片上的高通量微阵列系统(IntelligentBio-Instruments，Waltham，MA)；分子生物学工作站和纳米芯片(Nanogen，Inc.，San Diego，CA)；微流体玻璃芯片(Orchid Cellmark，Inc.，Dayton，OH)；具有四个PiezoTip压电按需滴定点(tip)的BioChipArrayer(Packard Instruments，Inc.，Meriden，CT)；FlexJet(RosettaInpharmatic，Inc.，Kirkland，WA)；MALDI-TOF质谱仪(Sequenome，SanDiego，CA)；ChipMaker2和ChipMaker3(Arrayit Corporation，Sunnyvale，CA)以及如Heller，Annu.Rev.Biomed.Eng.4：129-153(2002)所鉴定和描述的GenoSensor(Abbot Molecular，Des Plaines，Illinois)。基因芯片或微阵列的实例还描述于美国专利公开No：2007-0111322、2007-0099198、2007-0084997、2007-0059769和2007-0059765以及美国专利No.：7,138,506、7,070,740和6,989,267中。
定量聚合酶链反应(Q-PCR)技术例如实时聚合酶链反应(PCR)和多重PCR是表征和定量核酸的公知方法。这样的技术需要将核酸重复或长时间暴露于光，其中本文所述的方法和组合物可用于抑制光诱导的降解。用于进行实时PCR和／或多重PCR的最常用化学品中的五种包括
Figure BDA0000374120810000223
(Life Technologies，Carlsbad，CA)、分子信标(MolecularBeacon)、FRET探针、
Figure BDA0000374120810000224
(Sigma-Aldrich，Inc，St.Louis，MO)和
Figure BDA0000374120810000225
Green(Life Technologies，Carlsbad，CA)。所有这些化学品允许通过产生荧光信号来检测PCR产物。
Figure BDA0000374120810000226
探针、分子信标、FRET探针和
Figure BDA0000374120810000227
依赖于共振能量转移(
Figure BDA0000374120810000229
ResonanceEnergy Transfer，FRET)来通过发荧光染料分子和淬灭剂部分与相同或不同的寡核苷酸底物偶联以产生荧光信号。
Figure BDA0000374120810000221
Green是荧光染料，其在溶液中时表现出很少的荧光，但在与双链DNA结合后发出强荧光信号。
探针依赖于用于PCR的DNA聚合酶之5’-核酸酶的活性来水解与靶扩增子杂交的寡核苷酸。
Figure BDA0000374120810000231
探针是双重标记的寡核苷酸，其具有与5’端相连的荧光报道染料和与3’端相连的淬灭剂部分。通常，
Figure BDA0000374120810000232
探针由18至22bp的寡核苷酸探针组成。这些探针被设计成与PCR产物的内部区杂交。在未杂交状态，荧光报道染料和淬灭分子的接近防止探针检测荧光信号。当进行实时PCR实验时，将与靶序列互补的探针添加到PCR反应混合物中。在PCR期间，探针在正义引物和反义引物之间特异性地退火成PCR产物的内部区。当聚合酶复制其上结合探针的模板时，聚合酶的5’-核酸酶活性切割探针。这将荧光与淬灭染料分离，并且不再发生FRET。因此，荧光在每个循环中增加，与探针切割的量成比例。
如同
Figure BDA0000374120810000236
探针，分子信标也使用FRET以通过与寡核苷酸底物的5’端结合的荧光团和与寡核苷酸底物的3’端结合的淬灭剂来检测和定量所合成的PCR产物。分子信标由4部分组成，即，环、茎(stem)、5’荧光团和3’淬灭剂。环通常为分子信标的18至30个碱基对区，其与靶序列互补。茎序列位于环的两端，并且长度通常为5至7bp。两条茎序列彼此互补。分子信标的5’端包含荧光团，并且分子信标的3’端包含淬灭剂染料，当信标为闭合环形状时，所述淬灭剂染料阻止荧光团发光。当分子信标与靶标杂交时，荧光染料与淬灭剂分开，不发生FRET，在照射之后，荧光染料发光。但是，不同于TaqMan探针，分子信标被设计成在扩增反应期间保持完整，并且必须在每个循环中与靶标再结合以进行信号测量。分子信标可报道匀质溶液中特定核酸的存在。就定量PCR而言，在每次扩增的循环之后，分子信标与扩增靶标结合，并且所得信号与模板的量成比例。
如Didenko，Biotechniques31(5)：1106-1121(2001)所述，FRET探针是设计成与靶DNA上的相邻区杂交的一对荧光探针。选择荧光团使得一个荧光团的发射光谱显著地与另一荧光团的激发光谱重叠。在PCR期间，两个不同的寡核苷酸与靶DNA的相邻区杂交，使得与寡核苷酸偶联的荧光团紧挨着杂交结构。供体荧光团被外部光源激发，然后将其激发能量的一部分传至相邻的受体荧光团。被激发的受体荧光团在不同波长处发光，然后可在特定通道中对其进行检测和测量。光源不能激发受体染料。
就
Figure BDA0000374120810000235
探针而言，使用如Bates等，Molecular Plant Pathology2(5)：275-280(2001)；Hart等，J.Clin.Microbi0l.39(9)：3204-12(2001)和Thelwell等，Nucleic Acids Research28(19)：3752-61(2000)中所述的单一寡核苷酸实现了序列特异性引发(priming)和PCR产物检测。
Figure BDA00003741208100002411
引物是双功能分子，其中引物与探针共价连接。
Figure BDA00003741208100002412
探针保持未杂交态的茎-环构象。荧光团与5’端连接，并且被与3’端偶联的部分所淬灭。茎的3’部分还包含与引物的延伸产物互补的序列。该序列通过不可扩增的单体与特定引物的5’端相连。在不存在靶标的情况下，淬灭剂几乎吸收由荧光团发出的荧光。在初始PCR循环中，由于聚合酶的作用引物与靶标杂交并且发生延伸。在引物延伸之后，特定探针序列能够与其互补物在延伸的扩增子内结合，从而打开发夹环并且将荧光团与淬灭剂分开，这导致发出的荧光增加。在每次连续的扩增循环期间，可在反应试管中检测并测量荧光。
Figure BDA0000374120810000241
Green提供了用于在实时反应中检测和定量PCR产物的最简单和最经济的形式之一。如Zipper等，Nucleic Acids Res.32(12)：e103(2004)所述，Green是不对称的花青染料(cyanine dye)。
Figure BDA0000374120810000243
Green优先结合双链DNA，但将以较低性能对单链DNA进行染色。所得DNA-染料-复合物吸收蓝光(λ最大=488nm)，并发出绿光(λ最大=522nm)。因为该染料优先与双链DNA结合，所以无需设计用于被分析的任意特定靶标的探针。但是，通过SYBR Green的检测需要广泛的优化。因为染料无法区分在PCR期间积累的特异性和非特异性产物，所以随着任何PCR产物积累，荧光增加。
Figure BDA0000374120810000244
Green的优点是其不昂贵、易于使用并且灵敏。缺点是
Figure BDA0000374120810000245
Green将在反应中与任何双链DNA结合，所述任何双链DNA包括引物二聚体和其他非特异性反应产物，这导致靶浓度的过高估计。对于具有良好设计的引物的单一PCR产物反应，
Figure BDA0000374120810000246
Green可工作得极其良好，仅在非常后期的循环中示出假的非特异性背景。类似的花青染料在本领域中是已知的并且包括
Figure BDA0000374120810000247
Green II、SYBRGold、YO(
Figure BDA0000374120810000248
唑黄)、TO(噻唑橙)和PG(PicoGreen)。
Figure BDA0000374120810000249
探针、分子信标和
Figure BDA00003741208100002410
允许在同一样本中测量多种DNA物质，也称为多重PCR，这是因为具有不同发射谱的荧光染料可以与不同探针相连接。多重PCR使得内部控制共同扩增并且允许在单试管同类测定中进行等位基因辨别。这些杂交探针提供用SYBR Green无法获得的辨别水平，因为它们只与PCR中的真正靶标杂交而不与引物二聚体或其他假产物杂交。但是，多重PCR还将需要另外的重复的和长时间照射步骤以定量单个样本的多荧光发射。因此，本文所述的方法和组合物可用于抑制光诱导的核酸降解。
公开了可用于所公开方法和组合物之产物、可与所述产物联合使用、可用于制备所述产物的材料、组合物和组分，或者公开了作为所公开方法和组合物之产物的材料、组合物和组分。本文公开了这些和另一些材料，并且应理解，当公开了这些材料的组合、子组、相互作用、群体等，而每个多种个体以及共同组合和变换的特定参照可能不明确地公开时，每一个都特定地考虑并描述于本文中。例如，如果公开并讨论了嵌合动物，并且讨论了可对嵌合动物作出的许多修改，则除非特别地有相反的说明，否则特别地考虑嵌合动物中每一种和嵌合动物的每种组合和变换以及可能的修改。同样，也特别地考虑和公开这些中的任何子组或组合。该概念适用于本公开内容的所有方面，包括但不限于所公开之组合物或动物的使用方法中的步骤。因此，如果存在多种可进行的另外步骤，则应理解，可以用所公开方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行这些另外步骤中的每一个，并且每种这样的组合或组合的子组特别地被考虑并且应认为是公开的。
在整个本申请中，引用了多个出版物。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请。
已描述了许多实施方案。但是，应理解，可以做出多种修改。因此，其他实施方案在所附权利要求的范围内。
实施例
实施例I.错误率和20个循环强度
该实施例示出了使用八泳道流动池在边合成边测序形式中重复检测循环的错误率。根据HiSeq用户指南并且使用标准Illumina测序试剂(检测溶液除外)，使用在HiSeq仪(Illumina Inc.，San Diego，CA)上设置测序运行的标准过程来产生该实施例中的数据。用于标准方案的方法可得自Illumina，Inc，并且在Bentley等，Nature456：53-59(2008)中引用，其通过引用整体并入本文。简单来说，使用多个荧光标记的经修饰核苷酸来对存在于流动池表面上的扩增DNA簇进行测序。为了起始第一个测序循环，使一个或更多个不同地标记的核苷酸和合适的试剂(例如，DNA聚合酶等)通过流体流动系统流入／流经流动池。并入之后，通过使洗涤溶液流经流动池来洗去未并入的核苷酸。然后，使检测溶液流经流动池，同时使用激光来激发核酸并诱导荧光。然后向流动池中添加去封闭剂以从经延伸和经检测的DNA链除去可逆的终止子基团。然后通过使洗涤溶液流经流动池来洗去去封闭剂。然后，流动池准备好用于下一个以引入如上所述的经标记核苷酸开始的测序循环。将流体步骤和检测步骤重复数次以完成测序运行。
为了产生用于实验的检测溶液，将粉末状受试化合物添加到检测溶液中以达到表1所示的终浓度，如果需要的话则检查并调节pH。使用“图像-循环-泵”特征来测试3种化合物/运行，从而扫描对照检测溶液中的泳道1和2、包含第一受试化合物的检测溶液中的泳道3和4、包含第二受试化合物的检测溶液中的泳道5和6以及包含第三受试化合物的检测溶液中的泳道7和8。比较接受对照检测溶液的泳道与接受包含受试化合物的泳道的强度衰减和错误率。
实施例II.相对于簇PF的错误率
该实施例使用20mM(泳道3和4)、40mM(泳道5和6)和80mM(泳道7和8)以及作为无没食子酸对照的泳道1和2示出了没食子酸剂量响应。
该实验准确地如上文的实施例I所述来实施。图3示出相对于通过滤光器(PF)之簇数目的错误而绘制图。图3中的图示出了就所有没食子酸浓度而言错误率(y轴)的显著剂量依赖性提高。该图还示出通过滤光器的簇的提高在40mM时最佳——与40mM相比，80mM时通过滤光器的簇数目降低。
实施例III.覆盖次数图
该实施例示出参考序列中每个位置的错误。
该实验准确地如实施例I所述实施。图4示出在没食子酸的存在下、在尿素的存在下、以及在没食子酸和尿素的存在下经75个循环的对照序列的覆盖次数图。图5示出在没食子酸的存在下、在尿素的存在下、以及在没食子酸和尿素的存在下经100个循环的对照序列的覆盖次数图。覆盖次数图分析了给定基因组中每个位置(x轴，使用phiX基因组作为标准)处的错误(Y轴)。该数据示出，phiX基因组包含热点(hot-spot)，与其余基因组相比其具有显著较高的错误率。检测溶液中的没食子酸显著地降低某热点的错误率，而未同样多地影响其他热点。在降低错误率方面，尿素本身具有非常小的影响，但与没食子酸示出显著的协同作用，这几乎消除大多数热点中的错误并且甚至降低了主要热点(第4300位周围)的错误，而单独的每种化合物都没有作用。
表1
Figure BDA0000374120810000271
Figure BDA0000374120810000281
Figure BDA0000374120810000291
表2
Figure BDA0000374120810000292
实施例IV.通过在核酸片段化期间并入化合物可防止核酸损伤
测序文库匹配原始基因组序列的保真度可不同，其取决于在从核酸提取到其在测序平台上测序的任何阶段碱基突变的发生频率。该频率为经测序的碱基正确的可能性设置了一个上限。例如，如果在一千次中发生一次突变，则任何碱基均正确的最大置信度(可能性)为千分之一，即，最大为Q30。已观察到通过Covaris剪切片段化的DNA具有随剪切时间延长而降低的最大Q值。参见图6。为了确定化合物是否可用于提高序列文库匹配原始基因组序列的保真度，使用质粒DNA的合并物(poo1)来产生数据。合并12个质粒，每个质粒在模板盒中插入50对不同的碱基对(bp)。在Covaris S2中剪切该合并物，然后通过标准方法成簇，接着在GA测序仪(Illmunia，Inc.，San Diego，CA)上读取配对的75对碱基。然后，由数据计算最大质量计分。特别地，在存在或不存在如下化合物的情况下使用Covaris剪切1μg合并的质粒DNA：a)在50mM没食子酸的存在下使1μg的输入DNA片段化；或者b)在50mM抗坏血酸盐的存在下使1μg的输入DNA片段化。通过以下来制备溶液：向10μlDNA(1μg)中添加60μl的100mM没食子酸或抗坏血酸盐储液，用TE(Tris，EDTA)缓冲剂使体积达到120μl。所使用的covaris参数如下：工作循环(dutycycle)：20％，强度：5，循环／爆发(burst)：200，以及时间：240秒。然后，将这些样本置于流动池上用于测序而无需进一步处理。如下表1和图7及图8所示，通过在剪切反应期间并入没食子酸或抗坏血酸盐可防止核酸损伤。
表3.核酸片段化期间没食子酸和抗坏血酸盐的作用
Figure BDA0000374120810000301
实施例V.通过酶促处理可清除受损的核酸
为了确定通过酶促切割是否可清除受损的核酸，使用Covaris剪切3μg的准确合并物DNA。所使用的Covaris参数如下：工作循环：20％，强度：5，循环／爆发：200，以及时间：240秒。之后，将样本分为每管1μg。用FPG酶如下处理一个试管(1μg)：将10μl的FPG酶(80单位)添加到1×NEB缓冲剂1中的1μgDNA，用牛血清白蛋白(BSA)补充至终体积200μl。或者，用PreCRTM Repair Mix(NEB，Ipswich，MA)处理一个试管。将反应在37℃孵育30分钟。然后，使用Qiagen PCR纯化试剂盒清理反应，并以30μlEB缓冲剂(10mM Tris-Cl，pH8.5)洗脱。如下表2和图2及图3所示，用FPG(切割8-氧代-G损伤处之DNA的酶)处理经Covaris剪切的DNA将样本的最大Q值从38恢复至43，从而从样本中除去受损核酸。
表4.核酸片段化之后FPG的作用
Figure BDA0000374120810000311

Claims (27)

1.在选自片段化和检测的核酸加工步骤期间抑制核酸降解的方法，其包括在所述加工步骤期间使所述核酸与包含没食子酸、其类似物、衍生物或混合物的溶液相接触，其中所述接触抑制所述核酸的降解。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸处于与支持物相连接的核酸阵列中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述没食子酸、其类似物、衍生物或混合物以约10mM至约200mM的浓度存在。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含一种或更多种化合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述化合物选自：尿素、抗坏血酸或其盐、以及异抗坏血酸或其盐。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述化合物进一步抑制所述核酸的降解。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述加工步骤是检测加工步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述检测加工步骤包括照射所述核酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述照射在约360nm至约800nm的范围内进行。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述照射用功率为约5毫瓦至约500毫瓦的光源进行。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述照射进行约0.1秒至约10分钟的时间。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述降解是光诱导的降解。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述光诱导的降解包括从所述核酸阵列中除去核酸成员。
14.根据权利要求7所述的方法，其还包括向所述阵列添加荧光标记的核苷酸以及重复所述检测加工步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述添加所述荧光标记的核苷酸包括使用聚合酶来添加单一的荧光标记的核苷酸。
16.根据权利要求14所述的方法，其还包括将所述检测加工和添加步骤重复至少50、75或100个循环。
17.根据权利要求7所述的方法，其中与对照相比，所述溶液将检测错误率降低大于20％、40％或50％。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述加工步骤是片段化。
19.根据权利要求18所述的方法，其中制备所述核酸以用于测序。
20.根据权利要求19所述的方法，其中与在不存在所述溶液的情况下片段化的核酸相比，所述核酸中序列信息的保真度提高。
21.根据权利要求18所述的方法，其还包括用切割包含受损核酸之核酸序列的酶处理所述核酸以除去任何受损核酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述酶是甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶(FPG)。
23.根据权利要求18所述的方法，其还包括用选择性地与一种或更多种类型之受损核酸相结合的抗体来处理样本以除去任何受损核酸。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗体与8一氧代-G结合。
25.用于降低核酸损伤的试剂盒，其包含一种或更多种化合物和(i)一种或更多种选择性地与一种或更多种类型之受损核酸相结合的抗体或者(ii)一种或更多种切割包含受损核酸之核酸序列的酶。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述化合物选自：没食子酸或其衍生物或类似物、抗坏血酸或其衍生物或类似物、以及尿素。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其还包含一组说明书，所述说明书指导实施用于核酸样本制备之溶液的制备。
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