CN105939708A - 包覆TiO2的上转换纳米颗粒均匀核壳结构及其应用 - Google Patents

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苏启智
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Abstract

本申请公开了一种由半导体材料层包覆的上转换纳米颗粒(UCN)。UCN核作为纳米转换器，将近红外(NIR)光转换为可见光和/或紫外(UV)光，半导体壳作为光催化剂。当被NIR光激发时，UCN将NIR光上转换为不同波长的UV光和/或可见光。UV发射光和包覆TiO2的吸收波长的光谱重叠将TiO2层激活，生成细胞毒性活性氧类(ROS)，所述细胞毒性活性氧类可用于治疗癌细胞的光动力学疗法中。通过改变纳米粒子的包覆层，例如使用聚合物和分散稳定剂，可增加纳米颗粒的稳定性和摄取。

Description

包覆TiO2的上转换纳米颗粒均匀核壳结构及其应用
相关申请
本申请要求于2014年1月6日提交的，编号为61/923858的美国临时申请的权益。通过引用，上述专利申请的全部教导结合于此。
背景技术
传统的荧光物质主要是基于“下转换荧光”：当被高能量的光，通常在紫外(UV)-短波长的可见光范围内激发时，这些荧光物质发射低能量的荧光。与下转换相反的效应也是存在的，即所谓的上转换过程。上转换发光源自一种现象，其中，在反斯托克斯发光过程中，通常在近红外(NIR)范围内的低能量的光被转换为更短波长范围内的较高能量的光。上转换荧光材料通常由具有主晶格的纳米晶体制成，例如掺杂Yb3+、Er3+、Tm3+等三价镧系离子的LaF3、YF3、Y2O3、LaPO4或NaYF4。一个重要的特征是其典型的狭窄的光致发光光谱1，通过掺杂不同浓度的镧系离子2，可以精细地调整发光颜色，使得被980nm NIR光激发后得到在UV、可见光和NIR光波范围内变化的颜色。此外，上转换过程比双光子吸收的效率更高，从而便于使用低廉市售的连续波(CW)激光二极管3进行激发。这些上转换荧光材料的另一个独特的特征是：其优异的光稳定性外加对细胞及脆弱的蛋白质低的光子损害能力(NIR射线是无害的)使长时间活体成像和光活化成为可能4，5。同样引人注意的是使用这些材料时接近零的背景荧光，因为大多数的其他材料，包括生物分子，不具有这种上转换性质6。如果将这种无背底特性与其高量子产率结合3，上转换荧光材料可能是一种非常有前途的发光探针，它可以以惊人的检测灵敏度追踪微量目标分子。另外，用于激发这些材料的NIR光可深入组织中7，进而提供无创成像和深层组织水平的光活化。更重要的是，组成上转换荧光材料的惰性核心元素和引入的毒性相对较小的稀土镧系元素8相对于高毒性金属，如镉-硒量子点，有着独特的优势，进而为体内和临床应用提供了一个安全途径。
目前，光动力疗法(PDT)药物由700nm以下的光谱区域内的UV或可见光激活，该UV或可见光在组织中的穿透深度有限。常规PDT限于平坦型、浅表肿瘤或用内窥镜容易接近的肿瘤，然而实体器官肿瘤的厚度要比当前技术可穿透的深度更大。为了克服使用UV/可见光的传统PDT的深度的局限性，以及使切除大体积实体肿瘤或深部肿瘤成为可能，可以使用处于NIR区域(700nm-1100nm)的光实现最大的组织穿透深度。NIR波长的光较少被表皮黑色素吸收，比短波长光的光散射要少，与可见光比更深地穿入人体皮肤真皮和血液。已被证明，在这个光谱区域内的光可穿透组织深度超过1厘米，而介入组织未观察到损害。因此，使用NIR激活光敏剂的PDT过程在此称为NIR-PDT，可扩展到治疗厚的、大体积的或深部肿瘤，针对不同大小、类型和位置的肿瘤，提供更广泛的治疗选择。几乎所有的目前市场上销售的PDT光敏剂只由UV/可见光激活，将NIR光应用到PDT中需要一个光转换器，所述光转换器能将深度穿透、低能量的NIR光转换为高能量、较短波长的UV/可见光，使得在深度上能与这些光敏剂的激活吸收光谱相匹配。仍然需要开发一种近红外光动力学治疗药物，通过提供更大的NIR光穿透深度，用以克服常规光动力学疗法的局限性,并进一步将所述NIR光上转换为UV/可见光。尤其是，NIR-PDT药物能够生成多种类型活性氧类(reactive oxygenspecies，ROS)，对新型光动力疗法的发展尤其重要，因为这些药物能使多元化摧毁靶细胞机制成为可能。
发明内容
本发明涉及一种由二氧化钛(TiO2)层包覆的上转换纳米颗粒(UCN)。UCN核心作为纳米转换器，将近红外光(NIR)转换为可见和紫外(UV)光，TiO2壳作为光催化剂。当只被单一波长的NIR激发时，UCN将NIR光上转换为不同波长的UV和可见光。发射出的UV和包覆TiO2的吸收波长的光谱重叠将TiO2层激活，生成细胞毒性活性氧类。
附图说明
如附图所示，根据下述对本发明实施例更具体的描述，前述内容将得以明确。
图1A-D示出包覆TiO2的NaYF4:Yb,Tm UCN。图1A是TiO2-UCN的透射电镜图(比例尺,50nm)。图1B是TiO2-UCN在980nm NIR激光激发下的荧光发射谱图。插图示出纯TiO2的吸收谱图(任意单位，(a.u.))。图1C示出在980nm NIR辐照下(2.16W/cm2)TiO2-UCN的ROS产量，由ROS荧光标记物-氨基苯基荧光素(APF)测定。绘制出APF荧光与在980nm NIR激光下暴露时间(t)的关系曲线。数值为平均数±标准差(每组实验重复进行)。图1D为TiO2-UCN生成ROS的机理的示意图(不按比例)。如图1B所示，由980nm NIR光激发后，UCN将NIR光上转化为不同波长的UV和可见光。UV发射光和包覆TiO2的吸收波长的光谱重叠激活TiO2壳，壳电子从价带上被激发到导带上，生成电子空穴对(e--h+)。形成的空穴将水(H2O)分子氧化生成羟基自由基(·OH)，同时电子将氧气(O2)还原得到过超氧阴离子(·O2 -)或过氧化氢(H2O2)。
图2A-2C示出TiO2-UCN荧光的稳定性。不同生理溶液中NIR辐照TiO2-UCN悬浮液的荧光发射光谱(图2A),水中不同时长下NIR辐照TiO2-UCN悬浮液的荧光发射光谱(图2B),酸性水中不同持续时间下NIR辐照TiO2-UCN悬浮液的荧光发射光谱(图2C)。
图3A–3E示出NIR辐照TiO2-UCN悬浮液在水中生成的ROS的类型。分别将丙酮酸钠、二甲基亚砜(DMSO)、钛铁试剂和叠氮化钠等清除剂加入到980nm NIR激光辐照下(2.16W/cm2)的TiO2-UCN悬浮液中，通过APF染料的荧光猝灭，检测生成的过氧化氢(图3A)、羟基自由基(图3B)、超氧离子(图3C)、单线态氧(图3D)的存在。绘制出APF荧光与在980nm NIR激光下暴露时间(t)的关系曲线。数值为平均数±标准差(每组实验重复进行)。与没有加入清除剂的NIR辐照TiO2-UCN相比，*P＜0.05。图3E示出使用特定于单线态氧-单线态氧转换器绿色染料的荧光标记物对NIR辐照TiO2-UCN生成的单线态氧进行验证研究。绘制出染料荧光与在980nm NIR激光下暴露时间(t)的关系曲线。
图4表明TiO2-UCN以干粉储存在室温(RT)下的保质期。在室温下储存不同天数的TiO2-UCN在980nm NIR(2.16W/cm2)下辐照60分钟生成ROS的活性由APF荧光监测，监测进行2个月以上。绘制出其活性与储存天数的关系曲线。
图5示出在不同条件下以干粉储存20天的TiO2-UCN生成ROS的情况。储存前以及在黑暗中4℃下储存20天后、在黑暗中室温下储存20天后或在光下室温下储存20天后的TiO2-UCN在980nm NIR(2.16W/cm2)下辐照60分钟生成ROS的活性由APF荧光检测，绘制出其活性与储存天数的关系曲线。
图6表明TiO2-UCN以干粉储存在4℃下的保质期。在4℃下储存不同天数的TiO2-UCN在980nm NIR(2.16W/cm2)下辐照60分钟生成ROS的活性由APF荧光监测，监测进行2个月以上。绘制出其活性与储存天数的关系曲线。数值为平均数±标准差(每组实验重复进行)。
图7示出以干粉在4℃储存4天、在-20℃储存4天的TiO2-UCN生成ROS的对比图(4℃与-20℃之间，P>0.05)。在980nm NIR辐照下(2.16W/cm2)TiO2-UCN生成ROS的活性由APF荧光检测，绘制出其活性与在980nm NIR激光下暴露时间(t)的关系曲线。
图8表明当浸于水中时，TiO2-UCN生成ROS的活性的稳定性。浸于水中长达24小时，NIR辐照TiO2-UCN(2.16W/cm2、60分钟)生成的ROS由APF荧光检测，绘制出其与在水中浸泡的时间的关系曲线。数值为平均数±标准差(每组实验重复进行)。与在水中浸泡0小时相比，*P＜0.05。
图9A-9C表明当储存在不同条件下再浸于水中24小时后，TiO2-UCN生成ROS的活性的稳定性。浸入水中前，980nm NIR-辐照TiO2-UCN(2.16W/cm2、60分钟)生成的ROS由荧光检测，绘制出其与在980nm NIR激光下暴露时间(t)的关系曲线(图9A)；在黑暗中4℃下储存、在黑暗中室温下储存或在光下室温下储存后浸于水中24小时后，980nm NIR-辐照TiO2-UCN(2.16W/cm2、60分钟)生成的ROS由荧光检测，绘制出其与在980nm NIR激光下暴露时间(t)的关系曲线(图9B)。用在每种条件下储存，浸于水中24小时后的APF荧光(图9B)除以浸泡之前APF荧光(图a)的比例来表示TiO2-UCN生成ROS的活性的下降，并作图。
图10示出当在不同溶剂中浸泡过夜，TiO2-UCN生成ROS的活性的稳定性。在浸泡前以及在乙醇(EtOH)中浸泡过夜、在四氢呋喃(THF)中浸泡过夜、在甲苯中浸泡过夜、在氯仿中浸泡过夜或在无水二甲基亚砜中浸泡过夜后980nm NIR辐照TiO2-UCN生成的ROS用APF荧光检测，并绘制出其与在980nm NIR激光下暴露时间(t)的关系曲线。在ROS实验前，去除相应溶剂，将TiO2-UCN再悬浮于水中。数值为平均数±标准差(每组实验重复进行)。与浸泡前相比，*P＜0.05。
图11A-11E描述TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN的合成示意图(图11A)；TiO2-UCN的透射电镜图(TEM)(图11B)(比例尺：50nm)；Mal-PEG-TiO2-UCN的透射电镜图(TEM)(图11C)(比例尺：50nm)；在不同功率密度NIR激发(光电倍增管(PMT)电压500V)下，在磷酸盐缓冲液(PBS)中100μg/mL TiO2-UCN的荧光光谱(图11D)；插图表明在90W/cm2NIR激发下TiO2-UCN的荧光发射光谱；TiO2-UCN、马来酰亚胺-聚乙二醇-硅烷和马来酰亚胺-聚乙二醇-硅烷共轭TiO2-UCN(Mal-PEG-TiO2-UCN)的傅里叶变换红外(FT-IR)吸收光谱(图11E)。
图12A-12B描述UCN(NaYF4:Yb,Tm)核、包覆二氧化硅的UCN(NaYF4:Yb,Tm@SiO2)、淬火前TiO2-UCN(包覆TiO2的NaYF4:Yb,Tm@SiO2)的TEM图(比例尺：20nm)(图12A)；与体外(2.1W/cm2)和体内(0.5W/cm2)PDT(PMT电压为950V)等量功率密度的NIR激发下PBS中300μg/mL TiO2-UCN的荧光发射光谱(图12B)。
图13A-13F描述TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN的特征。图13A示出在室温下浸泡于不同介质中的100μg/mL TiO2-UCN的平均流体力学尺寸与纳米颗粒浸泡时间的关系曲线，与不含胎牛血清(FBS)的RMPI中TiO2-UCN的尺寸相比，*P＜0.0001。图13B示出添加10％FBS对浸泡于PBS中100μg/mL TiO2-UCN的流体力学尺寸的影响，与浸泡24小时的TiO2-UCN的尺寸相比，*P＜0.0001。图13C示出室温下不同溶液中100μg/mL Mal-PEG-TiO2-UCN的平均流体力学尺寸与时间的关系曲线。图13D示出银染凝胶图像，以检测悬浮于含10％FBS的RPMI或含100％FBS的RPMI中纳米颗粒表面血清蛋白的吸附。水中未改性TiO2-UCN和100％FBS中未改性TiO2-UCN分别作为阴性对照和阳性对照。图13E为PBS中被辐照纳米颗粒和未被辐照纳米颗粒生成ROS的对比图，60分钟后，与未辐照TiO2-UCN和未辐照Mal-PEG-TiO2-UCN生成的ROS相比，*,#P<0.0001。数据值为平均值(n＞2)±标准差。图13F为当不同厚度组织模拟样品存在时，由NIR、UV辐照的1mg/mL Mal-PEG-TiO2-UCN生成ROS的对比图，与ROS相比，*P＜0.05。
图14A-14F描述TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN的特征，例如，在室温下浸泡于不同介质中的100μg/mL TiO2-UCN的平均多分散性指数(PDI)与纳米颗粒浸泡时间的关系曲线(图14A)。图14B表示添加10％FBS对浸泡于PBS中100μg/mL TiO2-UCN的PDI的影响。图14C示出在37℃下浸泡于不同生理溶液的TiO2-UCN的平均流体力学尺寸与时间的关系曲线，所述平均流体力学尺寸用动力光散射进行长达24小时的监测。数据值为平均值(n＞2)±标准差。图14D示出在PBS中浸泡6小时的100μg/mL TiO2-UCN、在PBS中浸泡24小时的100μg/mLTiO2-UCN以及在含10％血清的PBS中浸泡24小时(图14E)的100μg/mL TiO2-UCN的团聚体形成的不同。在室温下不同溶液中100μg/mL Mal-PEG-TiO2-UCN的平均PDI与时间的关系曲线图(图14E)。在PBS中浸泡0小时、6小时、24小时的100μg/mL Mal-PEG-TiO2-UCN的稳定分散体的图像(图14F)。
图15A-15F描述本发明中TiO2-UCN的体外摄取。图15A示出上转换荧光的代表性荧光显微镜图像(列3)，其表明用1mM相应的纳米颗粒培养巨噬细胞1小时后，巨噬细胞对纳米颗粒的摄取；列1和列2分别表示细胞膜和细胞核的荧光(比例尺：50μm)。图15B示出在1小时培养中，巨噬细胞摄取的所述1mM纳米颗粒的荧光强度的对比图，*P＝0.0004。数据是平均荧光强度(n＞3)±标准差。图15C示出，当口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞摄取1mM TiO2-UCN或Mal-PEG-TiO2-UCN后，由ICP-AES分析得到的钛含量的对比图，*P＜0.0001。数据是钛的平均浓度(N＝2)±标准差。图15D为由OSCC细胞培养的经甲氧基-聚乙二醇-硅烷(Met-PEG-TiO2-UCN)或马来酰亚胺-聚乙二醇-硅烷(Mal-PEG-TiO2-UCN)表面改性的1mM TiO2-UCN的荧光强度的对比图，*P＜0.05。数据是平均荧光强度(n＞3)±标准差。图15E示出相对UCN荧光强度，其表明N-乙基马来酰亚胺(NEM)对Mal-PEG-TiO2-UCN的细胞摄取的影响，OSCC细胞在含有或不含有1nM NEM的无血清RPMI中预培养15分钟，用1mM Mal-PEG-TiO2-UCN培养6小时(数据是平均值(n＜6)±标准差，*P＝0.0464)。图15F示出培养3小时后，血清蛋白对OSCC细胞中1mM Mal-PEG-TiO2-UCN的结合和内化的影响，*P＝0.0091。数据是平均荧光强度(n＞3)±标准差。
图16A-16D描述由MTT法检测到的由OSCC细胞培养6小时后的纳米颗粒的暗毒性，*P＝0.0082(图16A)。图16B示出由MTT法检测到的由正常人成纤维(NHF)细胞培养的纳米颗粒的暗毒性，数据是平均值(n＝3)±标准差。图16C示出由台盼蓝染色法检测到的由OSCC细胞培养的纳米颗粒的暗毒性，数据是平均值(n＝3)±标准差。图16C和16D示出用浓度增加的纳米颗粒培养2小时中，人类红细胞(RBC)的溶血率，*P<0.05,**P<0.0001，数据值为平均值±标准差，n＝4。
图17为对用于体外PDT的NIR激光剂量进行优化的条形图。用变化的功率和能量密度的980nm NIR激光对经1mM Mal-PEG-TiO2-UCN处理的OSCC细胞进行辐照。光对照同时进行：用相同的功率和光能量密度对未经过任何纳米颗粒处理的细胞进行辐照。细胞对PDT治疗的反应通过测量其活性进行量化。NIR激光功率1.2W、光能量密度设为675J/cm2、提供最低细胞活性且忽略仅由NIR光引起的细胞死亡(*P＜0.0001)，选为用于所有后续PDT研究的最佳NIR激光剂量。数据为平均值(n＞3)±标准差。
图18A-18C为TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN的对比图。图18A示出在纳米颗粒存在的情况下进行体外PDT后的24小时后，OSCC细胞活性；对照细胞为未处理细胞，假定其细胞活性100％,光对照为仅由NIR光处理的细胞。数据为平均细胞活性％(n＝3)±标准差。图18B示出基于羧基DCF的荧光强度，对ROS生成程度进行量化(数据为平均相对荧光强度(n＝3)±标准差)。图18C示出亮场下活细胞图像，用台盼蓝对比染色表明OSCC细胞的细胞死亡机制，插图示出正凋亡细胞(比例尺：10μm)。
图19A-19C描述细胞摄取、细胞活性和1mM Mal-PEG-TiO2-UCN的体外ROS生成能力的变化，所述Mal-PEG-TiO2-UCN由OSCC细胞培养1小时或6小时。图19A示出上转换荧光的荧光显微镜图像，用以表明Mal-PEG-TiO2-UCN的存在。当Mal-PEG-TiO2-UCN用OSCC细胞培养较短时间(1小时),它们主要位于细胞膜中(箭头)(比例尺：20μm)。图19B示出1mM Mal-PEG-TiO2-UCN在培养1小时、6小时后进行675J/cm2NIR-PDT后细胞活性的对比图，*P＜0.5(数据是平均值(n＝3)±标准差)。图19C示出当培养1小时和6小时的1mM Mal-PEG-TiO2-UCN存在时，进行PDT后，体外ROS生成的对比图。示出绿色荧光的图像(比例尺：25μm)表明ROS荧光标记物-羧基DCF的阳性染色。
具体实施方式
本发明的实施例如下。
“纳米复合材料”指的是与第二种材料结合的纳米颗粒，所述材料对该纳米颗粒，例如，其功能、活性或结构进行改性。例如，第二种材料使得该纳米颗粒能应用到特定的应用中，其中如果不存在第二种材料，该纳米材料不能使用。在某些实施例中，第二种材料包覆在纳米颗粒上。在另一些实施例中，纳米复合材料的尺寸为约30nm-约200nm。在本发明的具体实施例中，纳米复合材料是包覆有中间包覆层，再依次包覆有半导体材料层的纳米颗粒。连接分子，例如，3-氨丙基三甲氧基硅烷，可选择地位于中间包覆层上，半导体层下面。
在此使用的术语“上转换”指的是一种将低能量长波长(例如，近红外光)转换为高能量短波长的光(例如，可见光或UV光)。
“近红外光”指的是波长为700nm-1100nm的光。“可见光”指的是波长为400nm-700nm的光。“紫外光”指的是波长为100nm-400nm的光。
在此使用的“半导体”是一种电导率介于金属和绝缘体间的材料。半导体的电子带结构由低能量“价带”组成，价带部分充满电子，通过一条带隙与高能量“导带”分离。
在此使用的“活性氧类”包括过氧化氢、羟基自由基、超氧阴离子、单线态氧、一氧化氮、过氧自由基、过氧化亚硝基阴离子。
在此使用的“连接基团”是一种用于连接两个或多个基团的原子或小分子。在一个实施例中，连接基团通过一系列的共价键将靶向剂和由半导体材料层包覆的上转换纳米颗粒(UCN)相连。由半导体材料层包覆的上转换纳米颗粒(UCN)可互换地称之为在此所述的纳米复合材料。连接基团与半导体包覆层表面相连。在某些实施例中，连接基团是聚乙二醇。
在一个可选择的实施例中，连接基团用以将UCN与包覆层相连。例如，连接基团是(3-氨丙基)-三甲氧基硅烷(APS)。在可选的实施例中，中间包覆层是硅基组合物，所述硅基组合物包括SiO2和部分水解二氧化硅，例如H2SiO3、H4SiO4、H2Si2O5、H6Si2O7和SiH4O4。
一连接基团，例如，聚乙二醇，赋予包覆半导体的UCN一些优点，例如，提高纳米复合材料在水环境中的分散性，提高纳米复合材料在循环中的寿命使得其到达靶向肿瘤部位的机会更大。在某些实施例中，连接分子，例如APS，使得上转换颗粒的表面或包覆层(例如中间SiO2包覆层)表面带正电荷。颗粒表面带电荷的优势在于，由于相似带电颗粒间的互斥作用，可防止颗粒与其他颗粒间团聚。因此，这些带电颗粒在溶液中实现单分散性。单分散性使得半导体材料包覆单个纳米颗粒，而不是包覆一堆纳米颗粒团聚体导致形成包覆半导体的UCN团聚块体。在另一些实施例中，纳米颗粒表面的正电荷使得SiO2包覆UCN的表面包覆层上的TiO2前驱体发生水解，因此在每个纳米颗粒的表面包覆有均匀一致的TiO2壳层。在一些实施例中，水解步骤中，二氧化硅中间层部分水解，形成包含SiO2以及H2SiO3的层。相应的，在一实施例中，连接基团可以是分散稳定剂。术语“分散稳定剂”指的是包含疏水端和亲水端的物质，当与纳米颗粒相关联时，可阻止纳米颗粒在溶液中团聚。分散稳定剂的一个实例是聚乙二醇(PEG)。
在此使用的“靶向剂”指的是在体外或体内应用中，对生物靶有亲和力的结构。生物靶包括细胞表面受体。在另一些实施例中，生物靶可以是抗原、蛋白或肽。
在此使用的“抗体”是一种识别和中和如细菌或病毒等异物的蛋白质。抗体可以是多克隆或单克隆，术语“抗体”旨在包括多克隆和单克隆抗体。术语“多克隆”和“单克隆”指的是抗体制备的均一化程度，但并不限定于特定的生产方法。此处使用的术语“抗体”还包括抗体的功能片段，例如，嵌合、人源化、灵长类、全或单链抗体的片段。功能片段包括抗原-结合片段。这些片段可以通过酶裂解或重组技术制备。例如，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或具有必要底物特异性的其他蛋白酶也可用于生成片段。使用抗体基因，在其自然终止点的上游引入一个或多个终止密码子，也可以制备多种截断形式的抗体。
在此使用的“亲和体”是一种作为抗体模拟物的小型蛋白质。在某些实施例中，亲和体对特定大蛋白质或肽有结合亲和力。
术语“适配体”同时包括低聚核酸适配体和肽核酸适配体。在某些实施例中，适配体对小分子、蛋白质、核酸、细胞、组织和有机体有结合亲和力。在另一些实施例中，适配体干扰生物过程，例如细胞内蛋白质的相互作用。
术语“治疗”(treat,treatment,treat ing)是指抑制正要治疗的疾病或病症的进程或防止所述疾病或病症。此处使用的治疗可以指大量靶的减少。在一个实施例中，靶或生物靶是癌细胞，且治疗可减少癌细胞数量。
符号“NP@C”，例如NaYF4@TiO2，在本申请中代表一种纳米颗粒，例如，含有如TiO2包覆层的半导体包覆层的NaYF4。
本发明涉及由连续二氧化钛(TiO2)层包覆的均匀上转换纳米颗粒(UCN)的应用，其作为光转换器，将深度穿透、安全、低能量近红外(NIR)光转换为较高能量、较短波长的可见光和紫外光(UV),这些光的波长与包覆TiO2的激活吸收光谱相匹配以生成具有不同应用的活性氧类(ROS)，例如，光动力疗法(PDT)、废水处理、家庭和医院表面杀菌除臭、亲水表面发展为自清洁和防雾涂层、多肽和蛋白质裂解。包覆半导体材料的上转换纳米颗粒在协同无创成像和深部大肿瘤的光动力治疗中有用。在光动力疗法中使用NIR光，通过提供具有更大穿透深度的NIR光和上转化纳米颗粒，将NIR转换为UV/可见光，以帮助克服常规PDT的局限性。
上转换纳米材料，如，共掺杂镧系离子Yb和TM的NaYF4纳米晶体，形成纳米构建物的核，同时TiO2层包覆在核表面形成最终核壳结构TiO2-UCN(图1A)。在此，UCN核作为纳米转换器，将深度穿透NIR光转换为可见光和UV光，而TiO2壳作为光催化剂。当仅由单一980nm波长的光激发，UCN可将NIR光上转换为不同波长的UV和可见光(图1B)。UV发射光和包覆TiO2 9(图1B插图)的吸收波长的光谱重叠将TiO2层激活，生成几种包括羟基自由基、超氧阴离子和过氧化氢的细胞毒性活性氧类(ROS)(图1C),ROS可用于PDT中杀死癌细胞，或用于家庭和医院表面杀菌除臭中杀死微生物；用于废水治理中分解有机污染物；以及裂解肽和蛋白质(图1D)。当悬浮于不同生理溶液中，如水、PBS、含有或不含血清补充的DMEM培养基，在980nmNIR激发下，这些TiO2-UCN的荧光的稳定性的研究表明，它们的荧光发射强度无明显差异(图2A)。有趣的是，当在pH为4的酸性水体中浸泡长达3.5小时，这些颗粒的光稳定性特征仍可以观察到(图2C)，尽管与在水中(pH约6.5)浸泡相同时间相比，荧光强度略有下降(图2B)。在后续下游生物学应用中，这些颗粒被细胞，如内含体或溶酶体吞入其酸性结构中，上述研究发现对此会存在有用的启示。
如前述附图1C所示，在NIR辐照下，TiO2-UCN成功地生成了ROS。在此，染料氨基苯基荧光素(APF)用作ROS指示物。染料APF一直无荧光直至当它与ROS分子反应时被氧化，发出明亮的绿色荧光。将不同含量TiO2-UCN在980nm下每隔20分钟进行辐照，测量染料APF在水中的荧光发射，可以看出随着被辐照TiO2-UCN含量的增加，染料APF荧光强度有明显的相应增加(图1C)。为了确定悬浮于水中的NIR-辐照TiO2-UCN生成的ROS的类型，进行一系列的清除剂实验。
分别将过氧化氢、羟基自由基、超氧阴离子和单线态氧各自的清除剂：丙酮酸钠、DMSO、钛铁试剂和叠氮化钠加入到980nm NIR激光辐照下的TiO2-UCN悬浮液中。加入这些相应清除剂后，APF染料的荧光猝灭证明某一特定类型ROS的存在。如图3A-3C所示，观察到含有清除剂丙酮酸钠、DMSO和钛铁试剂的样品的荧光猝灭(与未添加清除剂的辐照TiO2-UCN相比，P分别是0.02328、0.00766和0.00317)，而含有清除剂叠氮化钠的样品未表现出APF染料的淬灭(图3D)。这表明，光致TiO2-UCN生成一种以上的活性氧类(ROS)，包括过氧化氢、羟基自由基和超氧阴离子。虽然结果表明未生成单线态氧，但加入清除剂叠氮化钠，观察到APF染料荧光增强是相当令人吃惊的。为了避免可能的混杂结果，该研究由另一个实验只使用特异于单线态氧的荧光标记-单线态氧转换器绿色染料进行验证。该实验未检测到NIR-辐照TiO2-UCN悬浮液中单线态氧转换器绿色染料的荧光增加(图3E)，从而验证了清除剂实验结果，即NIR-辐照TiO2-UCN未生成单线态氧。事实上，这与常规PDT形成对比，常规PDT利用由直射可见光激活光敏剂生成的单线态氧杀死癌细胞。这可能对TiO2-UCN-介导PDT杀死细胞的机制有所启示且该机制可能与常规PDT不同。
因为储存条件可能对TiO2-UCN生成ROS的活性有影响，这部分用于研究TiO2-UCN保质期。当TiO2-UCN以干粉形式在室温(RT)下沉化2个多月期间，对其在980nm NIR辐照下生成ROS的活性进行监测。在该储存条件下，可以清楚地观察到TiO2-UCN生成ROS的活性随着时间下降(图4)。根据这一观察，试图寻找一个最佳的储存条件使得TiO2-UCN生成ROS的活性得到最好地保持。设计一个简短的实验，其中纳米颗粒以干粉形式在不同条件下—黑暗中4℃、黑暗中室温或光下室温下储存20天，(图5)。TiO2-UCN在黑暗中4℃下的沉化与其生成ROS的活性的明显降低并不相关。事实上，这与下述形成鲜明的对比，当上述纳米颗粒在室温下黑暗或光照下储存同样时间，其生成ROS的活性似乎会大大降低。现已确定能最好地保持TiO2-UCN生成ROS的活性的最佳条件，然后对在该条件下储存的纳米颗粒的保质期进行大约2个月的监测。尽管在储存前10天，TiO2-UCN生成ROS的活性下降不少，在接下来长达57天的储存期内，其活性水平变稳定。在这里值得注意的是，储存0天时与储存57天时的纳米颗粒生成ROS的活性水平没有明显不同(储存0天与储存57天，P＝0.10247)(图6)。通过将纳米颗粒以干粉在-20℃下储存4天，进一步地试图研究较低温度对TiO2-UCN生成ROS的活性是否有影响。与在4℃下储存相同时间的纳米颗粒相比，并未观察到TiO2-UCN生成ROS的活性存在明显的差异(储存在4℃与-20℃之间，P＝0.4211)(图7)。因此看来，将TiO2-UCN粉末储存在冰箱里足以保持其保质期，从这个意义上看，更低的冰箱温度未必更好。
这些纳米颗粒随后用作活细胞和有机体的PDT试剂，所述PDT试剂主要含有水溶液，测定这些在水中长时间浸泡的纳米颗粒生成ROS的稳定性。在此，将TiO2-UCN在室温下在水中浸泡达24小时，在此期间测定不同时间点处生成ROS的活性。从图8中可以明显看出，TiO2-UCN与水接触，其生成ROS的活性逐渐下降，但仅当浸泡24小时时存在显著性差异(与在水中浸泡0小时对比，24小时时P＝0.04225)。为了延缓与水接触时，TiO2-UCN生成ROS的活性逐渐丧失，尝试使用将其储存在不同条件下的方法。将在不同条件下-黑暗中4℃、黑暗中室温下或光下室温下沉化20天(来自图5所示的之前的研究，在这部分又重新使用，见图9A)的TiO2-UCN粉末浸于水中，悬浮液分别在黑暗中4℃、黑暗中室温下或光下室温中保存24小时。在这些不同的条件下储存24小时后，测定它们生成ROS的活性(图9B)。从图9C中可以明显看出，当这些纳米颗粒的悬浮液储存在黑暗中4℃时，浸于水中的TiO2-UCN生成ROS活性的丧失延缓，ROS的生成量仅降低至77.3％，而与此相对比，当储存在黑暗中室温下或光下室温中时，ROS生成量降低到相当的水平，分别为46.8％和48.1％。因此，为保持生成ROS的活性，最好将水溶液中的TiO2-UCN悬浮液保持冰冷，等待给细胞/动物使用。
认识到当TiO2-UCN与水接触时，会慢慢失去生成ROS的活性，寻找能更好保存TiO2-UCN生成ROS的活性的溶剂变得重要。基于这样的基本原理，在后面的研究部分中，随后使用聚乙二醇(PEG)和癌症特异性靶向剂(这将有助于分别提高其生物相容性和靶向性)等分子对这些纳米颗粒进行表面改性。通常，这些表面改性步骤需要这些纳米颗粒与一定的溶剂长时间接触才能发生接枝/共轭。为了研究哪种溶剂能最好地保存TiO2-UCN生成ROS的活性，将这些纳米颗粒在乙醇(EtOH)、四氢呋喃(THF)、甲苯、氯仿或无水DMSO不同溶剂中浸泡过夜。对它们在不同溶剂中浸泡前后生成ROS的稳定性进行对比。将纳米颗粒浸泡在甲苯、氯仿或无水DMSO中时，它们生成ROS的活性大幅下降(与浸泡前相比，P分别为0.01015、0.00711和0.00746)，而在EtOH或THF中浸泡对这些纳米颗粒似乎不存在这样的影响(图10)。事实上，与浸泡之前的ROS生成量相比，无论是在EtOH还是THF中浸泡的纳米颗粒的ROS生成量似乎几乎不变(与浸泡前相比，P分别为0.97243和0.85389)。因此，EtOH或THF是用于后续表面改性步骤最适合的溶剂。
与现有UCN基PDT药物不同，TiO2包覆在UCN核上形成所定义的核壳结构，其中TiO2层直接用作光敏剂药物。与现有UCN基PDT药物相比，本发明中复合材料和治疗组合物是更好的光动力疗法试剂。具体来说，之前报道的TiO2-UCN纳米复合材料10-12大小不一、分散不均、形状不规则。另外，之前报道的颗粒12在微米范围内，因此，应正确归类为微晶。在生物应用中，这样的结构没有纳米颗粒那么有用，因为它们不容易被体内细胞摄取。在一些研究11中，TiO2半导体成分配置为仅围绕UCN核的纳米颗粒而没有形成UCN核上的连续的TiO2层，进而没有形成在本发明中明确定义的核壳结构。此外，因为光敏剂TiO2直接包覆在UCN表面形成核壳结构，该复合材料并不存在光敏剂分子浸出的问题。这与包覆光敏剂负载介孔二氧化硅的UCN13-15形成对比，其中光敏剂分子只是吸附在二氧化硅壳的孔隙上。还有，光致TiO2生成一种以上的活性氧类(ROS),包括羟基自由基、超氧阴离子和过氧化氢。这种多样性与仅生成单线态氧分子的常规光敏剂分子，如二氢卟吩e6和部花青540形成对比。因此，使用本发明中的复合材料用作光动力疗法的试剂，使多元化摧毁靶细胞机制成为可能，从而该材料比常规光敏剂分子更有效。
本发明中的复合材料有广泛的可能应用。例如，该材料可作为用于大范围的大小、类型和位置的肿瘤的光动力疗法的组合物。因为具有克服常规PDT穿透深度局限性的潜力，使用TiO2-UCN的NIR-PDT能用于厚的、大体积的或深部肿瘤的治疗，从而使得PDT成为更大范围的大小、类型和位置的肿瘤的治疗选择。通过使用安全NIR光激发而不是由有害UV光直接激发对有机污染物进行光氧化活化，TiO2-UCN材料也可以作为废水治理的解毒剂用于环境净化。TiO2-UCN材料在安全NIR光激发(而不是由有害UV光直接激发)下释放ROS因而具有抗菌活性，可用于家庭和医院表面杀菌除臭。在另一应用中，玻璃表面可包覆有TiO2-UCN，经在安全NIR光激发下形成的上转换UV和可见光活化形成疏水表面。这可以用于形成自清洁玻璃和防雾涂层。在另一个实施例中，NIR光活化的TiO2-UCN在溶液或悬浮液中生成的自由基可用于清除脯氨酸存在位点处的含有氨基酸脯氨酸的蛋白质。现有方法需要蛋白水解酶或化学试剂，通常还需要用于终止裂解的第二试剂，与此相对比，这可能为研究人员具有一个高度可调的蛋白质裂解过程提供一种轻便、低廉、快速的替代方法。
用聚乙二醇(PEG)对核壳TiO2-UCN表面改性使其具有稳定性和隐形性能，更有利于生物应用，并因此防止纳米颗粒的细胞杀伤能力饱和。具体地说，在体内和体外，将这些改性TiO2-UCN暴露在NIR下，使得用户可使用本发明所述的纳米颗粒治疗实体肿瘤。
相应地，在一个实施例中，本发明是一种用于光动力疗法的纳米复合材料，包括：上转换纳米颗粒，所述纳米颗粒在近红外光激发下，发射出波长约330nm-675nm的光；和所述纳米颗粒外表面上的连续均匀的外包覆层，所述包覆层包括半导体材料，其中所述纳米颗粒的发射光具有足以将一个或多个电子从半导体材料的价带激发到半导体材料的导带上的波长，并生成至少一种活性氧类(ROS)。
在另一实施例中，所述纳米颗粒包含掺杂约10mol％-约30mol％Yb3+和约0.3mol/％-约2mol/％Tm3+的NaYF4纳米晶体。
在另一实施例中，Y:Yb:Tm摩尔比是79.5：20：0.5。
在另一实施例中，半导体材料是TiO2。
在另一实施例中，所述纳米复合材料还包括含有二氧化硅基组合物的中间包覆层，其中所述中间包覆层位于上转换纳米颗粒和包括半导体材料的外包覆层之间。
在另一实施例中，所述中间包覆层还含有3-氨丙基三甲氧基硅烷。
在另一实施例中，所述纳米复合材料用靶向剂改性。
在另一实施例中，所述靶向剂通过连接基团与所述半导体表面连接。
在另一实施例中，所述连接基团是聚乙二醇。
在另一实施例中，所述靶向剂是亲和体、抗体、适配体、肽或叶酸。
在另一实施例中，本发明是一种用于光动力学疗法的组合物，包括：与包含纳米复合材料的支架相连的靶向剂，其中所述纳米复合材料包括：上转换纳米颗粒，其中所述纳米颗粒在近红外光激发下，发射出波长约330nm-约675nm的光；和所述纳米颗粒外表面上的连续的包覆层，所述包覆层包括半导体材料，其中所述纳米颗粒的发射的光具有足以将一个或多个电子从半导体材料的价带激发到半导体材料的导带上的波长，而且，激发后，半导体材料的能量足够以生成至少一种活性氧类。
在另一实施例中，靶向剂可选择地通过连接基团与所述半导体表面连接。
在另一实施例中，本发明是一种生成活性氧类的方法，包括：用近红外光照射包含上述实施例中任何一项所述的纳米复合材料的样品和一种或多种选自水或氧的氧源一段时间，足以将一个或多个电子从半导体材料的价带激发到半导体材料的导带上，其中所述一种或多种氧源发生氧化还原反应，形成活性氧类。
在另一实施例中，本发明是一种纳米复合材料组合物，包括：多个如上述实施例中任一项所述的纳米复合材料，其中所述纳米复合材料均匀地分布在所述组合物中，而且进一步地，其中所述纳米复合材料的形状和大小均一。
在另一实施例中，所述连接基团是一种分散稳定剂。
在另一实施例中，所述分散稳定剂是PEG。
在另一实施例中，所述分散稳定剂的分子量是2000Da或更高。
在另一实施例中，本发明是一种使用光动力学疗法治疗对象体内生物靶的方法，包括：给对象施用治疗有效量的如上述实施例中任一项所述的纳米复合材料；将所述纳米复合材料暴露在近红外光中足以使所述纳米复合材料颗粒发射出波长约330nm-约675nm的光，这样，生成的至少一种活性氧类治疗生物靶。在一个实施例中，足以将一个或多个电子从半导体材料的价带激发到半导体材料的导带上的波长是980nm。
在另一实施例中，所述生物靶是癌细胞中过度表达的细胞表面受体。
在另一实施例中，所述过度表达的细胞表面受体是表皮生长因子受体。
在另一实施例中，癌细胞是任何来源的异常增殖细胞。
在另一实施例中，癌细胞是一种口腔鳞状细胞。
TiO2-UCN的构建和研究
加入正硅酸乙酯(TEOS)使TiO2壳上的羟基(OH)基团与马来酰亚胺-聚乙二醇-硅烷上的硅烷基团相连，形成Mal-PEG-TiO2-UCN。TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN的透射电子显微镜(TEM)显示：具有轮廓清楚的核壳结构的均匀球形，平均初级粒子尺寸约为50nm(图11B-C)。UCN核的平均直径约为25nm，UCN核由组合厚度为约12.5nm的二氧化硅层和TiO2壳包围(图12A)。在980nm近红外光线的辐照下，TiO2-UCN发射出UV、可见光和NIR光谱区域内的上转换光(图11D和图12B)。UCN的蓝光发射(图11D和图12B中450nm和475nm处的峰)可用于追踪细胞对纳米颗粒的摄取，而对于体内成像，在NIR区域(800nm)的发射可用于捕捉来自较深组织的信号。傅里叶变换红外(FT-IR)吸收光谱证实马来酰亚胺-聚乙二醇-硅烷在TiO2-UCN表面的成功接枝，PEG在约2885cm-1处的特征峰对应C-H伸缩，在约1470-1350cm-1处的特征峰对应C-H弯曲(图11E)。
利用TiO2-UCN的初步研究显示在室温(RT)下，水中和不同生理溶液中有大的团聚体(微米范围内)形成(图13A和图14A-B)。而众所周知的的是，分散在液体中的纳米颗粒的流体动力学尺寸通常比由TEM测得的初级粒子尺寸要大，它们大体上随着时间和温度的变化而增加(图14C),导致团聚体的快速沉积。然而，TiO2-UCN在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基(RPMI)中形成稳定分散体。与在磷酸盐缓冲溶液(PBS)和含有10％FBS的PBS中的团聚特性相对比，发现当缺少FBS时，颗粒尺寸增加超10倍(图13B和图14D)。
表1
在不同溶液中分散后，100μg/mL TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN的即时Zeta电位和多分散性指数(PDI)。
通过测定Zeta-电位研究这些纳米颗粒的表面电荷。当TiO2纳米颗粒分散在水中时，纳米颗粒的表面通常覆盖羟基基团(TiIV+H2O→TiIV-OH+H+)，带上一个负电荷。尽管TiO2-UCN有负Zeta电位，其数值大于-30mV(表1)。通常，需要Zeta电位大于+30mV或小于-30mV，才能提供足够的排斥力来抵消引起颗粒团聚的范德华力的吸引力。据推测，低Zeta电位(范围-25.5±6.8)可能是水中TiO2-UCN流体动力学尺寸增加的原因。在另一方面，在高离子强度的分散介质(如PBS和RPMI)中，纳米颗粒的流体动力学尺寸受Zeta电位和双电层厚度的影响。众所周知的是，当分散在高离子强度的溶液中时17，这些纳米颗粒周围的双电层厚度变小，相应地，出现一个导致大尺寸团聚体的较弱静电互斥力。值得注意的是，TiO2-UCN在PBS中的Zeta电位范围是-24.0±2.3，在不含有FBS的RPMI中的是9.6±1.3。
因此，弱Zeta电位和更小的双电层厚度都可能导致在PBS和RPMI中形成大的团聚体。发现将血清蛋白与TiO2-UCN表面结合形成“蛋白晕”，有助于保持分散稳定性18。TiO2-UCN表面蛋白质的存在形成一个物理空间屏障，防止纳米颗粒的相互接近19。尽管与血清蛋白的结合可能似乎暂时解决团聚问题，但意味着蛋白晕中某些成分会作为调理素20，21。最终，调理素会引起单核巨噬细胞系统的巨噬细胞识别和去除循环中的纳米颗粒，使得纳米颗粒在体内应用的生物有效性降低。因此，需要对TiO2-UCN表面改性，提高其分散稳定性，同时避免调理素的附着。聚乙二醇化构成最有效、最广泛使用的抗调理素化和空间稳定化策略22。通常，需要分子量为2000Da或更大分子量的PEG链以实现隐形特征23，这样，才能保持对吞噬细胞不可见。
因此，使用分子量2000Da的马来酰亚胺-聚乙二醇-硅烷对TiO2-UCN进行表面改性。马来酰亚胺基团作为反应性基团用于与肿瘤靶部分的进一步结合，用于之后纳米颗粒的靶向传输。据知，纳米颗粒的聚乙二醇化降低表面能，最小化纳米颗粒间相互吸引的范德华力，通过增加颗粒间的空间距离形成纳米颗粒稳定分散体24。即使在缺少FBS时，TiO2-UCN的聚乙二醇化获得长达24小时的分散稳定性，具有更小的流体动力学尺寸(～300nm)(图13C和图14E-F)。因为聚乙二醇化进一步降低TiO2-UCN的负Zeta电位(表1)，在Mal-PEG-TiO2-UCN情况下观察到的分散稳定性不是由于静电排斥作用而是由于PEG链间的空间排斥作用来得以保证的。此外，在不同溶液，除了含有10％FBS的RPMI中的TiO2-UCN的多分散指数(PDI)稍大于0.2，Mal-PEG-TiO2-UCN的多分散性指数是小于0.2的，再一次表明稳定分散体的形成(表1)。
通过将纳米颗粒浸泡于含有10％FBS的RPMI和含有100％FBS的RPMI中，然后离心分离粘附有血清蛋白的纳米颗粒，来研究聚乙二醇化降低蛋白质吸附的能力。凝胶电泳和银染显示，聚乙二醇化显著降低血清蛋白在TiO2-UCN表面上的吸附(图13D)。与未辐照纳米颗粒相比，在NIR辐照下，PBS中的TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN都可以生成大量的ROS(图13E)。除此之外，利用不同厚度(范围：6mm-10mm)的组织模拟体，使用上转换UV光间接激发TiO2后，测定NIR光的组织穿透能力和其ROS生成能力，进一步地将此与使用UV光直接激发TiO2的情况相比(图13F)。研究发现，在10mm厚的组织模拟体中，由NIR光辐照生成的ROS只下降36％，由UV光辐照生成的ROS下降超过90％。因此，与使用UV光直接激发TiO2壳相比，使用NIR光间接激发的优点是穿透厚的组织，可进一步突出该纳米构建物在实体或深部肿瘤治疗中的适用性。
巨噬细胞和癌细胞中纳米颗粒的摄取
聚乙二醇的存在也降低了小鼠巨噬细胞对纳米颗粒的识别和摄取。培养巨噬细胞1小时后，摄取的TiO2-UCN比摄取的Mal-PEG-TiO2-UCN多了近4倍(图15A-B)。
TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN与人体口腔鳞状细胞癌(OSCC)共培养不同时间点，洗涤除去非结合的纳米颗粒。随后，细胞被消化，使用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)定量分析消化液中的钛含量。结果发现，虽然聚乙二醇化减少巨噬细胞对纳米颗粒的摄取，但与TiO2-UCN相对比，OSCC细胞对纳米颗粒的摄取显著增强(图15C)。而且，与培养3小时相比，培养6小时后的摄取更为显著。6小时培养结束时，在细胞质中观察到大部分纳米颗粒。然而，与6小时时间点相比，培养24小时后的钛含量下降。此后，一些被摄入的纳米颗粒在24小时内通过胞吐排出去25，26。
经常有争论认为，虽然聚乙二醇化减少巨噬细胞的识别和摄取，它可能反过来减少细胞摄取，降低如纳米传输系统的治疗潜力。然而，观察到癌细胞摄取的Mal-PEG-TiO2-UCN相比TiO2-UCN要多。因为马来酰亚胺基团与巯基快速、特异性地结合，很可能聚乙二醇-马来酰亚胺改性的纳米颗粒能靶向细胞表面巯基，引起细胞内在化增强27。使用聚乙二醇-硅烷如马来酰亚胺-聚乙二醇-硅烷和不含有马来酰亚胺基团的聚乙二醇-硅烷(甲氧基-聚乙二醇-硅烷，2000Da)对TiO2-UCN进行表面改性，并对比在OSCC细胞中细胞结合和内在化效率。结果显示在最早3小时，摄入OSCC细胞的Mal-PEG-TiO2-UCN显著增加(图15D)。当细胞表面巯基用N-乙基马来酰亚胺(NEM)预封端时，观察到癌细胞中Mal-PEG-TiO2-UCN的内化下降5倍(图15E)。与不含有FBS的培养基相比，当存在10％FBS时，Mal-PEG-TiO2-UCN的摄取并未受到显著影响，但当存在50％FBS时，会下降约4倍(图15F)。
纳米颗粒的暗毒性
人体OSCC细胞可用作体外、体内研究的模型，因为这些细胞的表皮生长因子受体在细胞表面过度表达28，可利用这点，将这些开发的纳米颗粒特异性地靶向这些癌细胞。未处理的OSCC细胞和经浓度为1mM的TiO2-UCN或Mal-PEG-TiO2-UCN处理的细胞的细胞活性没有显著不同(图16A)。当浓度为2mM时，尽管其细胞活性仍高于80％，但也明显低于未处理细胞的细胞活性，当浓度非常高，为4mM时，其细胞活性下降50％。同样，除了当浓度高达2mM以上时，未改性TiO2-UCN和表面改性TiO2-UCN的毒性没有显著差异，似乎聚乙二醇化TiO2-UCN的毒性显著低于未改性部分(P＝0.0082)。尽管，由于细胞大小和增长类型的区别，OSCC细胞的细胞摄取和暗毒性不能与正常人成纤维(NHF)细胞相比，纳米颗粒与NHF细胞共培养时，也能观察到相似的暗毒性趋势(图16B)。因为标准MTS([3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)增殖试验只反映线粒体酶活性，基于死亡细胞失去了细胞膜的完整性并且染料可渗透，使用台盼蓝拒染法评价这些纳米颗粒的暗毒性。未处理的OSCC细胞和经1mM TiO2-UCN或Mal-PEG-TiO2-UCN处理的细胞的细胞活性没有显著不同，保持80％以上(图16C)。此后，当浓度为2mM时，减少到60％。因此，在后续体外实验中，纳米颗粒的最大浓度定为1mM。
溶血试验
使用红细胞(RBC)溶解实验对浓度在50μM-4mM范围内的纳米颗粒的生物相容性进行评估。如图16D所示，TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN在血红蛋白释放上都表现出剂量依赖性增加。然而，浓度大于50μM的TiO2-UCN引起的RBC溶解明显大于Mal-PEG-TiO2-UCN。用4mMTiO2-UCN处理的RBC的溶血百分水平为21.7％。另一方面，在研究的浓度范围内，由Mal-PEG-TiO2-UCN引起的血红蛋白释放远低于5％。这表明，PEG改性TiO2-UCN中表现出优异的血液相容性，适用于体内应用。
体外PDT和细胞死亡
在评估合成纳米颗粒的PDT效果之前，有必要优化PDT参数，如光剂量、辐照时间，使得NIR光本身不会杀死细胞。为实现这一点，将OSCC细胞置于不同剂量980nm NIR激光下，以确定细胞能承受的且不利于当纳米颗粒存在时的细胞的剂量。因为，在此，光催化剂TiO2由上转化UV光间接激发(反斯托克斯方案)而不是常规PDT中的直接UV激发，由于上转换过程效率低，所需要的激发功率相对较高29。结果发现，OSCC细胞能耐受的是：NIR激光功率1.2W且连续辐照5分钟20秒(功率密度～2.1W/cm2)、光通量传递675J/cm2(图17)，细胞活性大于95％。同时，在1mM Mal-PEG-TiO2-UCN存在下，使用这种优化的光剂量进行辐照，可杀死约80％的细胞。激光功率的进一步降低，辐照时间的进一步增加不会打破这样一个适当平衡，因此得出这样一个假设，存在UCN核所需要的最小阈值激发功率密度，小于该值时，不能主动上转换和激发壳中的TiO2来生成足够的ROS以有效杀死细胞。另一方面，激发功率密度的进一步增加会引起细胞热衰退。采用优化光参数的OSCC细胞体外PDT表明当浓度为1mM时，Mal-PEG-TiO2-UCN(78％)比TiO2-UCN(56％)引发明显更多的细胞死亡(图18A)。因此，TiO2-UCN的表面改性显著提高体内TiO2-UCN PDT的疗效。
为进一步证明细胞死亡确实由UCN上TiO2壳经光活化后生成的ROS引起的，定量评价在细胞辐照后30分钟内生成的ROS。在980nm光存在下，浓度为1mM的Mal-PEG-TiO2-UCN较TiO2-UCN生成更大量ROS，由于癌细胞对这些纳米颗粒更大量的摄取，PDT疗效更好(图18B)。此外，在Mal-PEG-TiO2-UCN情况下，ROS的生成存在相当大的剂量依赖性。此外，结果发现，当Mal-PEG-TiO2-UCN培养较短时间(1小时),大部分颗粒依附到细胞膜上，细胞对这些纳米颗粒的摄取最小(图19A-C)。然而，6小时培养后，大部分颗粒存在细胞内，主要在细胞质中。当比较细胞活性时，可观察到只用Mal-PEG-TiO2-UCN培养1小时，PDT治疗后，细胞死亡率约为50％。然而，6小时培养后进行PDT治疗，细胞死亡更为明显(>70％)。这个观察与体外纳米颗粒摄取数据一致，6小时培养期后，对纳米颗粒的摄取更高，因此PDT治疗后细胞杀死率更大。
下面的讨论是关于使用本发明中纳米颗粒时细胞死亡机制理论，但并不是为了进行限制。据知，根据细胞类型、PS的本质和位置及光剂量，PDT通过细胞凋亡、坏死和自噬以诱导细胞死亡。未处理的OSCC细胞和仅经NIR光辐照的细胞用台盼蓝染色，在30分钟辐照下，似乎很少的细胞会吸收蓝色染料(图18C)。然而，当这些细胞用Mal-PEG-TiO2-UCN培养6小时，接着用NIR光辐照，在30分钟处理过程中，大多数细胞染成蓝色，说明虽然细胞保持其形状，但细胞膜完整性丧失。NIR光辐照后的6小时，细胞膜渗色和细胞膜完全破裂，表明细胞死亡的坏死途径中严重的细胞损伤。
控制UCN构建物上PS的负载量和获得足量PS的稳定负载已成为阻碍UCN基PDT纳米平台转变为临床上更相当大的进步的主要瓶颈。本发明中的方法和组合物保证形成具有明确定义核壳结构的纳米构建物，其中单个单分散UCN核被含量可精确控制的薄薄的TiO2层围绕着。体外结果清楚地表明这种生物相容的纳米构建物在NIR引发深部组织PDT中具有应用潜力。
实施例
实施例1上转换纳米颗粒的合成
NaYF4：20％Yb，0.5％Tm纳米晶的合成过程如下：将YCl3(0.8mmol)、YbCl3(0.2mmol)和TmCl3(0.005mmol)与油酸6mL和十八烯(ODE)15mL在50mL烧瓶中混合。将溶液加热至160℃形成均相溶液，然后冷却至室温。将含有NaOH(2.5mmol)和NH4F(4mmol)的甲醇溶液10mL缓慢加入到烧瓶中，搅拌30分钟。随后，将该溶液缓慢加热除去甲醇，100℃下脱气10分钟，然后在氮气保护下加热到300℃并保温1小时。当该溶液自然冷却后，使用乙醇将纳米晶从溶液中沉淀出来，用乙醇/水(1：1，v/v)洗涤3次。将CO-520 0.1mL、环己烷6mL和0.01M NaYF4纳米微球的环己烷溶液4mL混合，搅拌10分钟。然后加入IGEPAL CO-520(壬基酚聚氧乙烯(5)醚，分枝)0.4mL和氨水0.08mL，将容器密封并超声20分钟直至形成透明乳液。将正硅酸乙酯(TEOS)0.04mL加入到溶液中，将溶液在600rpm转速下旋转2天。加入丙酮沉淀NaYF4@SiO2纳米微球，纳米微球用乙醇/水(1：1，v/v)洗涤2次，然后储存在水中。
实施例2上转换纳米颗粒上的TiO2包覆层
为了进一步包覆无定形的TiO2层，通过将NaYF4@SiO2接枝(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APS)，使用氨基对二氧化硅表面进行改性。在NaYF4@TiO2纳米结构的典型合成过程中，将NaYF4@SiO2纳米颗粒0.02mmol分散在异丙醇(IPA)10mL、氨水(28wt％)0.3mL和水2.5mL中。然后，将双(乙酰丙酮基)二异丙基钛酸酯溶液(异丙醇中0.001M)2mL缓慢加入到上述溶液中，在室温(20℃)下搅拌24小时。然后，通过离心收集包覆无定形TiO2的纳米颗粒，用IPA溶液洗涤两次。为了获得结晶TiO2壳，在封闭高压釜中，将NaYF4@TiO2纳米颗粒空气气氛中180℃下用乙醇处理24小时。
实施例3荧光分光光度法
使用装备有1200g mm-1光栅和连续波(CW)980nm二极管激光器的SpectroPro2150i分光光度计(Roper Scientific Acton Research,马萨诸塞)测量纳米颗粒的荧光光谱。将纳米颗粒分别再悬浮于水、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、含有10％或不含胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔(DMEM)培养基等不同溶液中，用分光光度计进行测量。
使用马来酰亚胺-聚乙二醇-硅烷对TiO2-UCN进行表面改性。将4mg的马来酰亚胺-聚乙二醇-硅烷(Nanocs公司，美国，纽约)溶于4mL水中，向其中加入溶于4mL乙醇的TiO2-UCN 4mg。随后，加入TEOS 10μL，将溶液在室温下搅拌30分钟。搅拌结束时，向溶液中滴加氨水(28wt％)150uL，在室温下再搅拌3小时。然后在10℃下，将溶液以8000rpm离心10分钟收集Mal-PEG-TiO2-UCN，用乙醇洗涤两次，储存在4℃。为了对比，使用相同的方案，对不含有马来酰亚胺基团的聚乙二醇-硅烷(甲氧基-聚乙二醇-硅烷-2000Da，Nanocs公司，美国，纽约)进行表面改性。
合成的纳米颗粒的表征。使用JEOL 2010透射电镜在200V的加速电压下对合成的纳米颗粒的大小和形貌进行表征。使用装备有1200g/mm光栅和980nm VA-II二极管泵浦固态(DPSS)激光器的SpectroPro 2150i分光光度计(Roper Scientific Acton Research,马萨诸塞)记录荧光光谱。使用岛津IRPrestige-21模型光谱仪(日本岛津公司，日本，京都)记录FT-IR光谱。使用Zetasizer(Nano ZS,Malvern Instruments公司,英国)进行动态光散射，用以测量流体动力学直径、PDI、Zeta电位。去离子水中浓度为1mg/mL的纳米颗粒在水、PBS、RPMI以及含有10％PBS的RPMI进一步稀释(100ug/mL)前，超声20分钟,以确定随时间变化的平均团聚体尺寸。
溶液中ROS生成的测量。为了测量未改性和改性TiO2的ROS生成能力，氨基苯基荧光素(APF)(分子探针，美国)用作指示剂。将PBS中浓度为1mg/mL的UCN超声20分钟，将APF染料加入到UCN悬浮液中，最终浓度为10μM。在使用波长为515nm的紫外可见分光光度计(Photonitech,新加坡)进行辐照之前，测定悬浮液在490nm激发下的荧光，作为时间0小时(t＝0)时的荧光强度。然后将悬浮液在980nm NIR光、功率1.2W下辐照60小时，每隔20分钟，测量荧光。因为生成的ROS的量与APF的荧光强度成正比，荧光强度为曝光时间的函数。
为了证明组织的穿透能力，将不同厚度(6-10mm)的组织模拟体放置于NIR或UV入射光的路径上进行相同的实验。简单地说，使用0.5％(w/v)超纯琼脂糖(Invitrogen)、1％(v/v)的脂肪乳剂10％(kabivitrum)作为散射剂和0.1％(v/v)黑色素作吸收剂制备组织模拟体。与不存在组织模拟体时,使用NIR或UV光直接照射样品相比，当组织模拟体存在时，NIR和UV光的组织穿透和ROS生成能力表示为1mg/mL Mal-PEG-TiO2-UCN在辐照下的ROS生成量的下降百分比。
凝胶电泳和银染。使用含有10％FBS的RPMI和含有100％FBS的RPMI将浓度为1mg/mL的纳米颗粒(TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN)处理24小时。在10％甘油中，悬浮液呈现良好分层，以15000rpm离心15分钟。收集颗粒，再悬浮于200μl去离子水中。使用2×Laemml i样品缓冲液(Bio-Rad公司，美国)处理相同体积的样品，在95℃加热5分钟以减少二硫键。然后，将这些样品加载于5％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶中，在120V下分离SDS-变性蛋白2.5小时。在制造商的指导下，使用皮尔斯银染试剂盒(ThermoScientific，美国)对蛋白带进行银染。
细胞系。OSCC(CAL-27)、小鼠白血病单核巨噬细胞系(RAW 264.7)和NHF细胞(IMR-90)购于美国模式培养物保藏所(ATCC，美国)。细胞在RPMI-1640培养基(OSCC细胞)和DMEM培养基(DMEM)(巨噬细胞和NHF细胞)中培养。用10％胎牛血清、1％青霉素链霉素补充培养基。细胞在含有5％CO2的潮湿大气中保温37℃。
体外巨噬细胞摄取试验。将RAW 264.7小鼠巨噬细胞接种于8孔腔室玻片，细胞密度为25×103个细胞/孔，培养过夜，使细胞粘附于孔的底部。孔中的培养基可替换为10％FBS补充DMEM中的浓度为1mM(270μg/mL)的纳米颗粒(TiO2-UCN或Mal-PEG-TiO2-UCN)悬浮液，且将该悬浮液在37℃培养1小时。然后，将该巨噬细胞用1×PBS冲洗三次以洗去多余的未摄入的纳米颗粒，在冰冷的甲醇中固定10分钟。使用浓度为5μg/mL的麦胚凝集素,Alexa488共轭物(分子探针公司,美国)对质膜染色10分钟。核进一步用500nM碘化丙啶(分子探针公司，USA)染色5分钟。细胞用PBS轻轻地洗三次，使用Vectashield安装培养基(载体实验室，美国，加利福尼亚州)安装。使用装有980nm激光宽场荧光插件(EINST公司，新加坡)的直立的尼康80i荧光显微镜(尼康，日本，东京)在20X目镜(放大200X)，将巨噬细胞对未改性和改性TiO2-UCN摄取成像。在汞弧灯的激发下，利用分别设置的标准的FITC和TRITC滤波器，细胞的质膜和细胞核变得可视。通过使用Image J 1.47v软件(美国国家健康研究所)测量UCN整体荧光强度，来对比巨噬细胞对未改性和改性TiO2-UCN的摄取。
体外暗毒性测量。将OSCC细胞和NHF细胞接种于96孔板，细胞密度为8×103个细胞/孔，培养过夜，使细胞粘附于板的底部。在无菌PBS中制备浓度为1mg/mL的纳米颗粒(TiO2-UCN或Mal-PEG-TiO2-UCN)，超声20分钟，然后在加入到细胞之前，用含有10％FBS的RPMI稀释，浓度变化范围为10μM(2.7μg/mL)-4mM(1.08mg/mL)。细胞进一步在37℃培养6小时，之后，用1×PBS轻轻地洗涤3次，除去纳米颗粒、用新鲜的培养基替换。在37℃下培养24小时之后，采用MTS法，根据提供商的指导，使用CellTiterAQueous单溶液细胞增殖检测(Promega公司，美国，威斯康辛州，麦迪逊)试剂盒确定存活的细胞数。细胞存活率百分比数值是相对于未处理的对照细胞来说的。
台盼蓝染色，将8×104OSCC细胞接种于12孔板，用上述纳米颗粒处理。以1200rpm离心5分钟采集每个孔中的细胞。然后，使用PBS中0.4％台盼蓝溶液染色5分钟,接着用双室血细胞计数池和光学显微镜计数。记录细胞总数和死(蓝色)细胞数，对三个独立细胞计数的平均数进行汇总分析。根据如下公式确定活细胞的百分比。活细胞的百分比＝100×[(细胞总数-死细胞数)/对照未经处理孔中的平均细胞数)]。
溶血试验。雌性balb/c裸鼠，6-8周龄，体重17克，来台湾BioLasco。通过心脏穿刺获取新鲜血液(≈1mL)。本研究中，所有程序得到中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会(IACUC)、新加坡保健集团的认可，符合国际标准。在4℃下，将血浆以1500rpm离心分离得到红细胞(RBC)。分离得到的RBC进一步用无菌PBS离心洗涤3次，直至上清液清澈，并再悬浮于2mL PBS中。然后将PBS中浓度为50μM-4mM的纳米颗粒(TiO2-UCN和Mal-PEG-TiO2-UCN)悬浮液100μL加入到RBS悬浮液100μL中。在37℃下不断摇晃2小时，将该悬浮液在1500rpm下离心15分钟。随后，用酶标仪在波长576nm下对每个离心管中的上清液100μL进行血红蛋白释放分析。在相同实验条件下进行对照实验，其中将RBC悬浮液100μL加入PBS 100μL作为阴性对照，加入到0.5％Triton X-100 100μL作为阳性对照。使用下列公式计算溶血百分比：
溶血(％)＝(OD576样品-OD576阴性对照)/(OD576阳性对照-OD576阴性对照)×100％
纳米颗粒的体外摄取。将OSCC细胞接种于145cm2细胞培养皿中，密度为3×106个细胞每皿，37℃下培养过夜。使用浓度为1mM UCN处理细胞3小时、6小时、24小时；之后，除去含有未内化纳米颗粒的培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次。然后，采集细胞，使用ICP-AES测量钛含量以测量细胞内所摄取的纳米颗粒。
纳米颗粒的吸收成像，将OSCC细胞和NHF细胞接种于8孔室玻片，培养过夜；之后，用浓度为1mM的Mal-PEG-TiO2-UCN处理6小时。然后，将细胞在冰冷的甲醇中固定10分钟；使用麦胚凝集素,Alexa488共轭物和碘化丙啶对质膜和核染色，洗涤，封片，在汞弧灯的激发下，使用尼康80i荧光显微镜(尼康，日本，东京)，40X目镜(放大400X)，标准FITC、TRITC和DAPI滤光镜套件成像。此外，使用Image J 1.47v软件(美国国家健康研究所)测量UCN总体荧光强度，以量化在不同培养条件下OSCC细胞对Mal-PEG-TiO2-UCN和Met-PEG-TiO2-UCN的摄取。为了检验NEM对Met-PEG-TiO2-UCN细胞摄取的影响，在不含血清的RPMI中，用1nM NEM预阻滞OSCC细胞15分钟，然后用1mM Mal-PEG-TiO2-UCN培养6小时。
体外PDT。将OSCC细胞接种于96孔细胞培养板，细胞密度为8×103个细胞/孔。在37℃过夜培养后，使用10μM-1mM范围内的不同浓度的未改性和表面改性TiO2-UCN处理细胞6小时。除去含有未内化纳米颗粒的培养基，用PBS洗涤细胞3次，用新鲜的培养基替换。使用980nm NIR光、功率1.2W、总通量传递675J/cm2下辐照细胞5分钟20秒。将细胞再培养24小时，然后根据提供商的指导，使用CellTiterAQueous单溶液细胞增殖检测(Promega公司，美国，威斯康辛州，麦迪逊)试剂盒确定相对于对照未处理细胞的细胞存活百分比。
体外ROS生成的测量。使用TiO2-UCN或Mal-PEG-TiO2-UCN进行体外PDT之后，在供应商指导下使用oxiselectTM体外ROS/RNS检测试剂盒(cellbiolabs公司，美国)测量ROS的生成量。简单地说，将OSCC细胞接种于96孔细胞培养板，细胞密度为8×103个细胞/孔。在37℃下过夜培养后，使用TiO2-UCN或Mal-PEG-TiO2-UCN处理细胞6小时。之后，除去培养基，用100μL非荧光-2’,7’-二氯荧光素(DCFH)替换1小时。然后，用1×PBS轻轻地冲洗细胞三次，将新鲜的培养基加入到每个孔中，随后使用上述相同光剂量的980nm NIR光进行辐照。通过测量生成的2’,7’-二氯荧光素的量，采用荧光分光光度法测量细胞中生成的ROS,并与预测定DCF标准曲线对比。
细胞死亡模式的评估。为了研究体外PDT后的细胞死亡模式，在处理后间隔不同的时间(30分钟和6小时)，用PBS中0.1％台盼蓝对OSCC细胞轻度复染5分钟。然后，用1×PBS轻轻地洗涤细胞一次，用HBSS封片，立即使用配有尼康DS-Ri l相机的亮场显微镜进行可视化。
统计分析。在所有附图中，数据点表示平均数±标准差(SD)。使用GraphPadPrism6.0软件(GraphPad软件，美国加利福尼亚圣迭戈)进行数据统计分析。使用双尾未成对t检验，或在Bonferroni事后检验之后使用两因素方差分析比较平均数的不同。当P值小于0.05(P＜0.05)时，认为是显著的。
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在这里引用的所有专利的内容，已公布的应用和参考文献通过整体引用包含于此。
通过参考实施例，具体示出和描述了本发明，本领域的普通技术人员应当理解，在不超出所附权利要求书涵盖的本发明的范围的情况下，所公开的实施例可以有不同的形式和内容的变化。

Claims (18)

1.一种用于光动力学疗法的纳米复合材料，包括：
上转换纳米颗粒，其中所述纳米颗粒在近红外光激发下，发射出波长约330nm-约675nm的光；和
所述纳米颗粒外表面上的连续均匀的外包覆层，所述包覆层包括半导体材料，其中所述纳米颗粒的发射光的波长足以将一个或多个电子从半导体材料的价带激发到半导体材料的导带上，而且，被激发后，所述半导体材料的能量足够以生成至少一种活性氧类。
2.如权利要求1所述的纳米复合材料，其中所述纳米颗粒包含掺杂约10mol％-约30mol％Yb3+和约0.3mol/％-约2mol/％Tm3+的NaYF4纳米晶体。
3.如权利要求2所述的纳米复合材料，其中Y:Yb:Tm的摩尔比是79.5：20：0.5。
4.如权利要求1所述的纳米复合材料，其中所述半导体材料是TiO2。
5.如权利要求1所述的纳米复合材料，该纳米复合材料还包括中间包覆层，其中所述中间包覆层位于所述上转换纳米颗粒和包含半导体材料的外包覆层之间。
6.如权利要求1所述的纳米复合材料，其中所述纳米复合材料用靶向剂改性。
7.如权利要求6所述的纳米复合材料，其中所述靶向剂通过连接基团与所述半导体表面连接。
8.如权利要求7所述的纳米复合材料，其中所述连接基团是聚乙二醇。
9.如权利要求8所述的纳米复合材料，其中所述靶向剂是亲和体、抗体、适配体或肽。
10.一种用于光动力学疗法的组合物，包括：
靶向剂，该靶向剂与包含纳米复合材料的支架相连，其中所述纳米复合材料包括：
上转换纳米颗粒，其中所述纳米颗粒在近红外光激发下，发射出波长约330nm-约675nm的光；和
所述纳米颗粒外表面上连续的外包覆层，所述包覆层包括半导体材料，其中所述纳米颗粒的发射光的波长足以将一个或多个电子从半导体材料的价带激发到半导体材料的导带上，而且，被激发后，所述半导体材料的能量足够以生成至少一种活性氧类。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述靶向剂可选择地通过连接基团与所述半导体表面连接。
12.一种生成活性氧类的方法，包括：
用近红外光照射包含如权利要求1所述的纳米复合材料的样品和一种或多种选自水或氧的氧源一段时间，足以将一个或多个电子从半导体材料的价带激发到半导体材料的导带上，其中所述一种或多种氧源发生氧化还原反应，形成活性氧类。
13.一种纳米复合材料组合物，包括：
多个如权利要求1所述的纳米复合材料，其中所述纳米复合材料均匀地分布在所述组合物中，而且进一步地，其中所述纳米复合材料的形状和大小均一。
14.如权利要求7所述的纳米复合材料，其中所述连接基团是一种分散稳定剂。
15.如权利要求14所述的纳米复合材料，其中所述分散稳定剂是聚乙二醇。
16.如权利要求15所述的纳米复合材料，其中所述分散稳定剂的分子量是2000Da或更高。
17.一种使用光动力学疗法治疗对象体内生物靶的方法，包括：
给对象施用治疗有效量的如权利要求1所述的纳米复合材料；
将所述纳米复合材料暴露在近红外光中足以使所述纳米复合材料颗粒发射出波长约330nm-约675nm的光，这样，生成的至少一种活性氧类治疗对象体内的生物靶。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述生物靶是癌细胞中过度表达的细胞表面受体。
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