CN113318228A

CN113318228A - 光催化/光热剂及其在制备用于肾癌光动力/光热疗法药物中的应用

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Publication number: CN113318228A
Application number: CN202110514535.0A
Authority: CN
Inventors: 徐岩; 杨成宇; 杨东江; 朱玉坤
Original assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Current assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2021-08-31

Abstract

本发明提供了一种光催化/光热剂及其在制备用于肾癌光动力/光热疗法药物中的应用，属于纳米药物技术领域。本发明提供的光催化/光热剂为具有核‑壳结构的单一的锐钛矿相二氧化钛/红磷纳米棒。本发明通过采用核‑壳结构既通过在二氧化钛的表面及其内部引入红磷可调节二氧化钛的响应光范围，有效拓展了二氧化钛纳米棒的吸收光谱到了可见光的范围，同时红磷可在近红外光催化下产生热量，有效杀死肾透明细胞癌细胞，从而可应用于肾细胞癌光动力/光热疗法中。

Description

光催化/光热剂及其在制备用于肾癌光动力/光热疗法药物中的应用

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，尤其涉及一种光催化/光热剂及其在制备用于肾癌光动力/光热疗法药物中的应用。

背景技术

肾细胞癌是临床常见肿瘤，每年全球有大约270,000例肾细胞癌及 116,000例肾细胞癌相关死亡病例被报道。在这些报告的病例中，肾透明细胞癌占比高达70-80％。由于肾透明细胞癌对化疗不敏感，术后易复发，因此寻找有效的肾透明细胞癌治疗手段是亟需解决的问题。

光动力治疗是一种新兴的治疗手段，已被广泛应用于皮肤疾病、视网膜疾病及肿瘤的治疗。在光动力治疗中，光催化剂在光照下可产生活性氧而杀死细胞或病菌，由于肾透明细胞癌细胞与正常细胞对活性氧的耐受差异，光动力治疗具有治疗肾透明细胞癌的潜力。光热治疗也是新兴的癌症治疗手段之一，在激发光照射下，光热剂可产生局部热量而杀死细胞。与现有的热消融治疗相比，光热治疗更加精准、副作用更小且复发率低。

二氧化钛是良好的光催化剂，特别是一维二氧化钛纳米材料，其良好的光催化性能已经被用于表面杀菌、污水处理及光电领域。在各种晶相的二氧化钛中，锐钛矿表现出了最良好的光催化性能。Zhang S等人证实在紫外光的照射下，锐钛矿型二氧化钛纳米纤维可有效杀死离体的宫颈癌细胞。虽然如此，由于二氧化钛的禁带较宽，其只能由紫外光激发产生光生电荷-空穴对，然而，由于紫外光穿透力较差，很难穿透组织，因此其不适用于深部肾透明细胞癌的治疗。近红外光是一种穿透力较强且无显著组织杀伤能力的激发光，适用于激发深部肿瘤的光热治疗。如何拓展二氧化钛的响应光范围至近红外光区域对于光催化治疗领域将是一个亟需解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种光催化/光热剂及其在制备用于肾癌光动力/光热疗法药物中的应用，通过在二氧化钛的表面及其内部引入红磷可调节二氧化钛的响应光范围，有效拓展了二氧化钛纳米棒的吸收光谱到了红外光的范围，红磷的掺杂可使二氧化钛在近红外光催化下产生活性氧，同时红磷可产生热量，有效杀死肾透明细胞癌细胞，从而可应用于肾细胞癌光动力/光热疗法中。

为了达到上述目的，本发明提供了一种光催化/光热剂，所述光催化/光热剂为具有核-壳结构的单一的锐钛矿相二氧化钛/红磷纳米棒。

作为优选，所述红磷在二氧化钛/红磷纳米棒中的引入/掺杂量为 15％-25％，命名为TiO₂@RP-15％、TiO₂@RP-20％和TiO₂@RP-25％。

本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的光催化/光热剂在制备用于肾癌光动力/光热疗法药物中的应用。

作为优选，所述二氧化钛/红磷纳米棒分散在pH-7.4的PBS溶液中的Zeta 电位分别为TiO₂@RP-15％：-25mV，TiO₂@RP-20％：-22mV，TiO₂@RP-25％：-23 mV。

作为优选，所述二氧化钛/红磷纳米棒分散在pH＝7.4的PBS溶液中对肾细胞的安全浓度为不超过20μg/mL。作为优选，所述肾细胞选自肾透明细胞癌细胞OS-RC-2、肾透明细胞癌细胞786-O及人肾小管上皮细胞HK2中的至少一种。

作为优选，所述二氧化钛/红磷纳米棒分散在pH＝7.4的PBS溶液中，经近红外光808nm、光照强度0.85W/cm²、照射时间5min时，产生的热量分别为：TiO₂@RP-25％达到44.1℃；TiO₂@RP-20％达到43.4℃；TiO₂@RP-15％达到39.3℃。

作为优选，所述二氧化钛/红磷纳米棒分散在pH＝7.4的PBS溶液中，经近红外光808nm、光照强度0.85W/cm²、照射时间5min时，单线态氧特异性探针O22的荧光强度可反映产生单线态氧的效率，荧光强度分别约为： TiO₂@RP-25％：41590；TiO₂@RP-20％：43247；TiO₂@RP-15％：46078。

作为优选，所述二氧化钛/红磷纳米棒在以20μg/mL的浓度与肾细胞共同培养24小时候，于近红外光808nm、光照强度0.85W/cm²、照射时间5min 时，对细胞的杀伤效率分别为：

TiO₂@RP-25％处理的肾透明细胞癌细胞OS-RC-2和肾透明细胞癌细胞 786-O的杀伤效率为50％以上，处理的人肾小管上皮细胞HK2的杀伤效率为 24％；

TiO₂@RP-20％处理的肾透明细胞癌细胞OS-RC-2的杀伤效率为37％，肾透明细胞癌细胞786-O的杀伤效率为46％，处理的人肾小管上皮细胞HK2的杀伤效率为21％；

TiO₂@RP-15％处理的肾透明细胞癌细胞OS-RC-2和肾透明细胞癌细胞 786-O的杀伤效率为约为36％，处理的人肾小管上皮细胞HK2的杀伤效率为 19％。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明提供的光催化/光热剂为单一的锐钛矿相二氧化钛/红磷纳米棒，通过采用核-壳结构既通过在二氧化钛的表面及其内部引入红磷可调节二氧化钛的响应光范围，有效拓展了二氧化钛纳米棒的吸收光谱到了可见光的范围，同时还克服了红磷产生的光生电荷-空穴对极易复合问题；

2、本发明提供的光催化/光热剂通过二氧化钛/红磷纳米棒中的红磷产生的光生电荷快速扩散至二氧化钛上而产生空穴，空穴剥夺纳米棒表面接触物质的电子而氧化产生活性氧，同时，红磷的掺杂也可使二氧化钛在近红外光催化下产生活性氧并产生热量，有效杀死肾透明细胞癌细胞，从而可应用于肾细胞癌光动力/光热疗法中。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的红磷/二氧化钛的表征图，图1a为二氧化钛/红磷纳米棒由蒸发沉积法合成示意图，图1b为纳米棒的XRD图，图1c， d为纳米棒的形貌图，图1e为纳米棒中各元素的分布，图中TiO₂表示二氧化钛，RP表示红磷，下同；

图2为本发明实施例所提供的红磷/二氧化钛在PBS中的Zeta电位检测；

图3为本发明实施例所提供的红磷/二氧化钛在应用于治疗前的性能测试；其中，图3a为材料对两种人肾透明细胞癌细胞(OS-RC-2、786-O)及人肾小管上皮细胞(HK2)细胞的毒性检测；图3b为808nm的近红外光(0.85 W/cm²)照射5min对三种细胞的毒性检测；图3c,d为808nm的近红外光(0.85 W/cm²)照射纳米棒5min所产生的热量检测；图3e为808nm的近红外光(0.85 W/cm²)照射纳米棒5min所产生的单线态氧的检测，其中¹O₂表示单线态氧；

图4为本发明实施例所提供的所合成纳米棒体外杀死肾透明细胞癌细胞的检测，其中，图4a为治疗后细胞毒性的检测；图4b-d为治疗后三种细胞的形态观察，其中NIR表示近红外光(下同)；

图5为本发明实施例所提供的治疗后肾透明细胞癌细胞凋亡的检测，其中，图5a为治疗后caspase-3表达水平的检测；图5b、c为治疗后OS-RC-2 细胞和786-O细胞的PI染色的结果，BF表示白光，merge表示合并；

图6为本发明实施例所提供的治疗后细胞中的活性氧的检测，其中，图6a、b分别为786-O和HK2细胞的DCFH-DA探针检测，图6c为Image J分析的图6a、b中各组的荧光强度；

图7为本发明实施例所提供的治疗后OS-RC-2细胞中单线态氧的检测；

图8为本发明实施例所提供的所建立的裸鼠皮下肾透明细胞癌模型图；

图9为本发明实施例所提供的治疗后深部肾透明细胞癌细胞被杀伤情况，其中，图9a为治疗后瘤体温度，图9b为治疗后深部肾透明细胞癌细胞的 TUNEL染色，其中箭头所示为凋亡阳性细胞；

图10为本发明实施例所提供的治疗后各器官的HE染色图，其中，图10a为正常对照组荷瘤小鼠，图10b为治疗组荷瘤小鼠。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 TiO₂/RP纳米棒合成及表征检测

首先把红磷粉末在200℃下水热12h以除去氧化层，用去离子水冲洗后充分干燥，将所得团块研磨以得到红磷粉末。将H₂Ti₃O₇分别和不同质量的红磷粉末置于研钵中充分研磨并混合均匀，加入去离子水后使用超声混合均匀并冷冻干燥。将得到的粉末转移到石英安瓿瓶中，在真空条件下密封。将密封后的安瓿瓶置于马弗炉中在600℃下焙烧烧5h，然后冷却至280℃，在此温度下焙烧2h。待冷却至室温后，分别用二硫化碳、无水乙醇和去离子水多次冲洗。以红磷含量的不同将所得的TiO₂@RP纳米棒复合材料标记为 TiO₂@RP-15％，TiO₂@RP-20％，TiO₂@RP-25％。此外，焙烧过程中红磷也会掺杂入二氧化钛纳米棒中。可以理解的是，TiO₂/RP纳米棒的合成方法可不局限于上述方法，只能能够合成得到预期纳米棒即可。

使用XRD检测纳米棒的晶相，透射电镜观察纳米棒的形貌，XPS检测元素分布。结果显示，通过与锐钛矿相二氧化钛(JCPDS：21-1272)标准卡比较发现，所合成的纳米棒为单一的锐钛矿相二氧化钛(图1b)，形状呈现为直径约为50nm的纳米棒(图1c)，在蒸发沉积过后，红磷沉积在了二氧化钛表面，形成了红磷-二氧化钛的壳-核结构(图1d)，此外，在蒸发沉积过程中，磷元素也掺杂入了纳米棒中(图1e)。因此，所合成的纳米材料为纯净的锐钛矿相并且成功引入红磷表面及红磷掺杂的纳米棒。

实施例2 TiO₂/RP纳米棒性能检测

此部分检测了纳米棒自身的毒性、近红外光自身的毒性、在近红外光照射下纳米棒产生局部热量及单线态氧的能力。首先将不同浓度的纳米棒制成 PBS分散剂，使用ZETASIZER Nano-ZS90分析仪检测三种纳米棒在PBS (pH＝7.4)中的Zeta电位。在细胞毒性检测实验中，将人肾透明细胞癌细胞 (OS-RC-2、786-O)及人肾小管上皮细胞(HK2)分别接种于96孔细胞培养板的不同孔中，待细胞汇合度达到70％后将细胞分为对照组、纳米棒处理组。分别向纳米棒处理组的三种细胞不同孔中加入梯度浓度(5μg/mL，10μg/mL， 20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL)的三种TiO₂@RP纳米棒，在共孵育24h 后将含有纳米棒的培养基去除，加入100μL无血清培养基及10μLCCK-8溶液，在37℃环境中避光孵育2h后检测各孔的吸光度，以纳米棒处理组与对照组的吸光度比值计算细胞毒性以确定三种纳米棒的安全浓度。在近红外光毒性实验中，同上方法接种细胞后，使用808nm近红外光(0.85W/cm²)照射三种细胞5min后吸出原有培养基，同前方法使用CCK-8法检测细胞毒性。然后将安全浓度下的三种纳米棒分散剂分别置于24孔板不同孔中，启动808nm近红外光照射安全浓度下的纳米棒分散剂5min，照射结束后分别用温度成像仪检测局部热量产生。在单线态氧的生成效率检测中，将三种纳米棒分散剂置于1.5mL EP管中，同上条件照射5min后将EP管在1200rpm下离心2min，取各组上清混匀，将0.2mL混匀的上清液置于侧壁不透光的96孔板中并向孔中加入百奥莱博单线态氧探针O22，使探针最终浓度稀释100倍，室温避光孵育3h后使用荧光酶标仪检测各孔单线态氧探针荧光强度的情况。

结果显示，当纳米棒分散到PBS中时(图2)，本发明所合成的纳米棒带负电，这使得其可沉积于细胞膜而不进入细胞，从而避免了强烈的细胞毒性损伤。当分散剂的浓度不超过20μg/mL时，纳米棒对三种细胞的毒性均较小，于是20μg/mL确定为所合成纳米棒的安全浓度(图3a)。经过5min的近红外光照射后，三种细胞的细胞活力未见显著下降(图3b)。在光照5min后，局部温度可达39.3-44.1℃，而相同条件下照射二氧化钛纳米棒后未见明显的温度升高(与PBS相比较，图3c,d)，研究表明43℃左右时癌细胞对温度更加敏感，而正常细胞可在47℃下耐受超过一小时。此外，在近红外光照射下，纳米棒还可以产生单线态氧(图3e)，其可以通过破坏细胞膜而杀死细胞。

实施例3 TiO₂/RP纳米棒在近红外光照射下在体外杀死肾透明细胞癌细胞

3.1 TiO₂/RP纳米棒催化的光动力/光热治疗造成的细胞毒性

将三种细胞接种于96孔板的不同孔中(每孔5000个)，待汇合度达到 70％-80％后更换新鲜培养基并把三种纳米棒分别加入到不同孔中，使他们的终浓度为20μg/mL。三种纳米棒分别与三种细胞在细胞培养箱中共孵育24h 后启动近红外光的照射，同前条件照射5min后，小心将纳米棒洗去，同前方法使用CCK-8法检测细胞的毒性。

结果显示，在治疗后，50％以上的TiO₂@RP-25％处理的OS-RC-2和786-O 细胞被杀死；TiO₂@RP-20％处理的OS-RC-2细胞死亡率约37％，786-O细胞约46％；TiO₂@RP-15％也显示出肾透明细胞癌细胞杀伤能力，OS-RC-2和 786-O细胞的死亡率均约为36％。TiO₂@RP纳米棒导致的HK2细胞的最大光催化毒性约为24％(图4a)。由此可见所合成的纳米棒催化的光动力/光热治疗对肾透明细胞癌细胞杀伤效率较高且对肾小管上皮细胞损伤较小。

3.2 TiO₂/RP纳米棒催化的光动力/光热治疗造成的细胞形态变化

将三种细胞分别别接种于24孔细胞培养板不同孔中(每孔4×10^6个)，同3.1中方法处理三种细胞后使用PBS轻柔冲洗细胞后加入0.5mL完全培养基，最后将细胞置于相差显微镜下进行细胞形态的观察。

结果显示，正常培养状态下，健康细胞附着在培养板上，呈现出伸展、丰满的形状。在808nm近红外光照射5min后所有的细胞几乎没有发生形态变化。在与20μg/mL TiO₂@RP-25％纳米棒共孵育后24h后，大多数OS-RC-2， 786-O和HK2细胞均维持正常形态，只有少数细胞死亡并脱离培养板呈现出明亮的球形形态。在与TiO₂@RP-25％(20μg/mL)共孵育24h并在808nm近红外光下暴露5min后观察了OS-RC-2和786-O细胞形态的变化，光催化反应后OS-RC-2和786-O细胞发生了包括细胞收缩、微绒毛减少、细胞质空泡样变等一系列病理变化，部分细胞形态模糊甚至崩解，显微镜下可见零散的细胞碎片。同时，仅有部分HK2细胞经光动力/光热治疗后呈现明亮的球形形态，且视野内未观察到明显的细胞崩解和细胞碎片(图4b-d)。

3.3 TiO₂/RP纳米棒催化的光动力/光热治疗造成的细胞凋亡

将OS-RC-2和786-O细胞接种于6孔板细胞培养板中，同3.1方法使用 TiO₂@RP-25％纳米棒及808nm近红外光处理后，使用PBS轻柔冲洗细胞3次，每孔加入0.5mLTRIzol溶液并在冰上充分吹打，然后将溶液分别置于无RNA 酶的EP管中。将EP管在低温离心机中以4℃、12000g离心15min，吸出上清置于新的1.5mL无RNA酶EP管中。向EP管中加入200μL的氯仿并混匀，室温放置15min后在低温离心机中以4℃、12000g离心15min，取上清液置于新的1.5mL无RNA酶EP管中，加入等量的异丙醇并混匀，室温放置10min 后在低温离心机中以4℃、12000g离心15min，弃上清并加入1mL75％乙醇并振荡EP管，吸出上清后充分晾干沉淀，加入适量DEPC处理水以获取总RNA 溶液。将获取的RNA溶液置于酶标仪中检测浓度、260nm及280nm处吸光度，若样品浓度大于200ng/μL且OD260/280位于1.8～2.0之间则为合格样品。将 700ng合格的RNA样品置于50μL无RNA酶EP管中，加入2μL gDNA Eraser 溶液并用无酶水补足10μL，将上述EP管置于热力循环仪中，在42℃下反应 2min，反应结束后加入10μLMasterMix溶液，并依次在37℃下反应15min， 85℃下反应5sec以完成逆转录。将2μL获取的cDNA溶液分别置于八联管中，并加入12.5μL STBR Premix EX Taq溶液、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物及9.5μL无酶水。将上述体系置于RT-qPCR系统中在如下条件下依次反应：95℃30sec；95℃5sec，60℃30sec，此过程重复共40循环。反应结束后使用2^-ΔΔCT法分析各Caspase-3的表达变化，共进行三次实验，两组间比肩使用t检验，多组间比较使用方差分析，p＜0.05认为有统计学意义。所用引物见表1。在PI染色实验中，将OS-RC-2、786-O及HK2细胞分别接种于24 孔细胞培养板的不同孔中，待细胞汇合度达到70％时，分别将两种肾透明细胞癌细胞同上处理后，使用PBS轻柔冲洗各组细胞，冲洗结束后以1:10的比例向各孔中分别加入30μL 40μM的PI溶液。37℃避光染色20min后再次用 PBS冲洗细胞2次并将各组细胞置于荧光显微镜下，在535nm激发光、615nm 发射光及BF下观察细胞并拍照。

表1 RT-qPCR反应引物

结果发现，与对照组相比，808nm近红外光处理5min及三种TiO₂@RP 纳米棒处理24h仅引起OS-RC-2和786-O细胞中Caspase-3mRNA的表达量轻微升高。而与对照组相比，TiO₂@RP纳米棒+近红外光显著上调了Caspase-3 表达量。在所制备的三种TiO₂@RP纳米棒中，TiO₂@RP-25％引起的Caspase-3 表达量上调最显著，TiO₂@RP-20％次之，TiO₂@RP-15％引起的Caspase-3表达量上调最低，这与细胞毒性研究结果一致(图5a)。在白光下可见与肾透明细胞癌细胞共孵育24h后，三种TiO₂@RP纳米棒均可附着并积累于肾透明细胞癌细胞上。经PI染色后，TiO₂@RP纳米棒+近红外光处理的OS-RC-2和 786-O细胞均可见大量白色荧光区域，说明这些细胞处于凋亡晚期。然后，将这些白色荧光区域与对应的白光下的图像拼合，在拼合的图像中可见，在 TiO₂@RP纳米棒+近红外光处理组中，大多数凋亡的OS-RC-2和786-O细胞为TiO₂@RP纳米棒附着的细胞。在仅用TiO₂@RP纳米棒而未使用近红外光照射处理的细胞中，虽然也可见TiO₂@RP纳米棒在细胞上聚积，但在这些材料附着的细胞中未见大量的凋亡信号。由此可见只有在经过808nm近红外光处理后的TiO₂@RP纳米棒可杀伤癌细胞(图5b、c)。

3.4 TiO₂/RP纳米棒催化的光动力治疗产生的活性氧检测

将OS-RC-2及HK2细胞分别接种于24孔细胞培养板的不同孔中，待细胞汇合度达到70％时，同上处理后进行ROS及单线态氧检测。用无血清培养基将DCFH-DA探针稀释备用，同上操作处理细胞后使用PBS冲洗细胞并加入稀释的DCFH-DA探针及无血清培养基，使探针终浓度为10μM，避光培养30min后使用Ixplore Spin荧光显微镜在激发波长502nm发射波长530nm 下观察细胞并拍照，使用ImageJ软件计算荧光强度。对照组加入等量的PBS及培养基，其余操作与材料处理组相同。使用单线态氧特异性探针检测各组细胞中的单线态氧情况。将百奥莱博单线态氧特异性探针O22加入各孔中，使其浓度最终稀释100倍，在37℃避光培养4h后使用PBS轻柔冲洗细胞。最后将细胞置于荧光显微镜下在激发波长488nm、发射波长526nm下观察并拍照。

结果显示，对照组和近红外光处理组均未观察到明显的浅色荧光，而在 TiO2@RP-25％纳米棒处理的三种细胞中只检测到荧光强度微弱的浅色荧光区域。然而，与其他组相比，TiO₂@RP-25％纳米棒+近红外光处理的OS-RC-2 细胞中可见大面积的强度更强的浅色荧光。而TiO₂@RP-25％纳米棒+近红外光处理的HK2细胞中的浅色荧光强度低于OS-RC-2细胞。所有显示强荧光的细胞都呈球形，表明它们已经死亡。此外，在TiO₂纳米棒+近红外光处理的 OS-RC-2或HK2细胞中并未检测到比仅用TiO₂处理组更显著的ROS信号(图 6a、b)。使用ImageJ软件对以上各组细胞荧光强度进行定量分析，结果与上述分析一致(图6c)。此外，与仅对照组相比，大多TiO₂@RP纳米棒+近红外光处理的OS-RC-2细胞中均可检测到单线态氧引起的浅色荧光，而在仅用近红外光和仅用TiO₂@RP纳米棒处理的OS-RC-2细胞中则未见明显的单线态氧引起的荧光信号(图7)。

实施例4 TiO₂/RP纳米棒在近红外光照射下治疗小鼠深部肾透明细胞癌

4.1裸鼠皮下肾透明细胞癌模型的建立

将生长状态好的786-O细胞扩大培养，以每只裸鼠5×10^{^6}个细胞的量准备细胞。当细胞培养到足够数量且状态较好时准备皮下接种。接种前一晚更换新鲜细胞培养基，并将分装的基质胶置于4℃冰箱中解冻过夜。将含有EDTA 的胰蛋白酶稀释为0.125％的浓度备用。去除准备好的786-O细胞原有培养基，使用PBS轻柔冲洗后每瓶细胞加入1mL稀释的含有EDTA的胰蛋白酶在37℃ 环境中适度消化，待细胞刚刚脱离瓶底时立即使用完全培养基终止消化，轻拍培养瓶侧壁使细胞完全脱离培养瓶。将含有细胞的悬液吸出并置于15mL离心管中以1000rpm离心5min后去除上清液，使用150μL PBS与基质胶的1:1 混合液均匀重悬细胞并置于4℃环境中备用。使用1％的戊巴比妥钠溶液以100 μL/10g的量麻醉裸鼠，麻醉后将裸鼠置于恒温操作台上，使用75％酒精消毒注射部位2次。使用1mL一次性无菌注射器吸取150μL的细胞悬液于裸鼠腋下部位进行皮下注射，注射完毕后立即使用无菌棉签适度按压针孔直到无液体流出，继续将裸鼠置于恒温操作台上直到裸鼠完全苏醒。最后将注射完成的裸鼠放回鼠笼观察。

结果显示在注射2～4周后，所有小鼠的注射部位均出现明显隆起(图8)。

4.2深部肿瘤的杀伤。

在成功建立裸鼠皮下肿瘤模型后，将荷瘤小鼠分为对照组、纳米棒组、近红外光组及纳米棒+近红外光组，每组5只小鼠。向纳米棒组及纳米棒+近红外光组荷瘤小鼠肿瘤内多点注射500μg/mL的TiO₂@RP-25％纳米棒，每只小鼠注射每日注射150μL。注射后启动808nm近红外光照射近红外光组及纳米棒+近红外光组的荷瘤小鼠，每只照射10min，照射后使用TiS20温度成像系统检测各组荷瘤小鼠温度并拍照。连续光动力/光热治疗7d后将各组小鼠颈椎脱臼处死，取肿瘤组织及心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏样品放入4％多聚甲醛中充分浸泡备用。将在4％多聚甲醛中固定24h以上的组织样品取出，在通风橱内用手术刀修剪组织，尽量使组织表面平整，将处理好的组织样品置于脱水盒内，依次使用75％酒精脱水4h，85％酒精脱水2h，90％酒精脱水2h， 95％酒精脱水1h，无水乙醇脱水30min(2次)，二甲苯处理10min(2次)，蜡处理1h(3次)。将上述浸蜡的组织置于包埋机中进行石蜡包埋。先将融化的蜡转移到包埋框内，将组织置入未凝固的蜡中并标记。将上述包埋框置于冻台(-20℃)中冷却后取出并用手术刀修整蜡块。将上述蜡块置于石蜡切片机中进行切片，使每片切片厚度为4μm。将上述切片浮于摊片机中(40℃) 展平并用玻璃载玻片将切片捞起放入烘箱内(60℃)烤干，标记后常温放置备用。使用TUNEL法检测深部肿瘤切片中细胞凋亡的情况，取各组裸鼠肿瘤切片样品在室温下放入依次二甲苯中浸泡10min，无水乙醇浸泡5min(2次)， 85％乙醇浸泡5min，75％乙醇浸泡5min，双蒸水浸泡5min。然后用PBS轻柔清洗样品，用组化笔勾沿着组织边缘画出与组织间隔3mm的圈。每片样品滴加100μL20μg/mL的Proteinase K溶液，待其覆盖全部组织范围后将样品置于37℃环境中孵育20min。孵育完成后用PBS清洗样品5min(重复3次)。处理完成后去掉样本上多余的液体后，向切片上滴加将适量3％的H₂O₂溶液使其充分浸润组织区域。H₂O₂室温处理20min后同上使用PBS清洗3次。清洗后向每个样品滴加50μL Equilibration Buffer并使其充分覆盖组织区域，室温放置30min。孵育结束后充分移除Equilibration Buffer并向每份组织样本上加入56μL TdT孵育缓冲液，将样品置于湿盒内并在37℃避光孵育2h。孵育结束后立即使用PBS清洗5min(重复6次)。用滤纸吸去PBS后甩干切片。向甩干的切片上滴加100μLStreptavidin-HRP反应液并将样品置于37℃环境中孵育30min，孵育结束后立即使用PBS清洗5min(重复3次)。向样品上滴加 100μL新鲜配制的DAB工作液显色，然后用清水清洗样品终止反应。清洗完毕后将样品切片放入装有苏木素染色液的染色缸内染色1min，染色结束后先用双蒸水清洗切片，然后用1％盐酸酒精进行浸染2sec，再次用双蒸水清洗后将样品切片浸入0.67％氨水溶液进行反蓝，然后使用双蒸水再次冲洗。将以上处理的切片浸入无水乙醇中脱水5min(重复4次)，再浸入二甲苯中透明 10min，最后使用中性树脂封片，待烘干后使用倒置显微镜观察各样品并拍照。使用HE染色法处理各器官切片来观察各器官损伤情况，同上方法使用二甲苯脱蜡并使用从低到高浓度的酒精进行依次浸泡以水化。将处理后的切片浸入装有苏木精的染缸进行染色5min后用流水冲洗以去除多余染料，再使用0.1％盐酸乙醇分化，分化后用流水清洗。苏木精染色完成后再将切片浸入装有伊红染色液的染缸染色5min，同上用流水冲洗。伊红染色结束后将切片依次浸入75％酒精脱水30min，85％酒精脱水30min，90％酒精脱水30min，95％酒精脱水30min，无水乙醇脱水1h。最后将切片浸入二甲苯中透明30min并用树脂进行封片，结束后使用倒置显微镜观察各样品并拍照。

结果显示，TiO₂@RP纳米棒+近红外光组荷瘤小鼠肿瘤内最高温度达到了48.5℃，仅经过相同强度的近红外光照射相同时间后，荷瘤小鼠肿瘤内最高温度为39.8℃，而正常对照组的荷瘤小鼠肿瘤内最高温度仅为35℃(图9a)。在150μL TiO₂@RP-25％(500μg/mL)和10min的近红外光连续治疗7d后，各组荷瘤小鼠的肿瘤样品进行了TUNEL染色，对照组图像中偶见数个生理性凋亡的细胞，近红外光组样本未见凋亡阳性的肾透明细胞癌细胞。虽然在 TiO₂@RP-25％纳米棒处理的肿瘤组织中可检测到凋亡的肾透明细胞癌细胞，但近红外光处理后，在TiO₂@RP-25％纳米棒周围可见更多大量凋亡细胞。此外，TiO₂@RP-25％纳米棒+近红外光组较大的肾透明细胞癌细胞核数量相较对照组减少，且可见染色质的收缩(图9b)。根据HE染色结果，TiO₂@RP-25％纳米棒催化的光动力/光热治疗后，荷瘤小鼠的肾脏、心脏、肝脏、肺脏和脾脏未见明显组织损伤(图10)。

Claims

1.光催化/光热剂，其特征在于，所述光催化/光热剂为具有核-壳结构的单一的锐钛矿相二氧化钛/红磷纳米棒。

2.根据权利要求1所述的光催化/光热剂，其特征在于，所述红磷在二氧化钛/红磷纳米棒中的引入/掺杂量为15％-25％，命名为TiO₂@RP-15％、TiO₂@RP-20％和TiO₂@RP-25％。

3.根据权利要求1或2所述的光催化/光热剂在制备用于肾癌光动力/光热疗法药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述二氧化钛/红磷纳米棒分散在pH为7.4的PBS溶液中的Zeta电位分别约为TiO₂@RP-15％：-25mV，TiO₂@RP-20％：-22mV，TiO₂@RP-25％：-23mV。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述二氧化钛/红磷纳米棒分散在pH＝7.4的PBS溶液中对肾细胞的安全浓度为不超过20μg/mL。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肾细胞选自肾透明细胞癌细胞OS-RC-2、肾透明细胞癌细胞786-O及人肾小管上皮细胞HK2中的至少一种。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述二氧化钛/红磷纳米棒分散在pH＝7.4的PBS溶液中，经近红外光808nm、光照强度0.85W/cm²、照射时间5min时，产生的热量分别为：TiO₂@RP-25％达到44.1℃；TiO₂@RP-20％达到43.4℃；TiO₂@RP-15％达到39.3℃。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述二氧化钛/红磷纳米棒分散在pH＝7.4的PBS溶液中，经近红外光808nm、光照强度0.85W/cm²、照射时间5min时，单线态氧特异性探针O22的荧光强度可反映产生单线态氧的效率，荧光强度分别约为：TiO₂@RP-25％：41590；TiO₂@RP-20％：43247；TiO₂@RP-15％：46078。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述二氧化钛/红磷纳米棒在以20μg/mL的浓度与肾细胞共同培养24小时候，于近红外光808nm、光照强度0.85W/cm²、照射时间5min时，对细胞的杀伤效率分别为：

TiO₂@RP-25％处理的肾透明细胞癌细胞OS-RC-2和肾透明细胞癌细胞786-O的杀伤效率为50％以上，处理的人肾小管上皮细胞HK2的杀伤效率为24％；

TiO₂@RP-15％处理的肾透明细胞癌细胞OS-RC-2和肾透明细胞癌细胞786-O的杀伤效率为约为36％，处理的人肾小管上皮细胞HK2的杀伤效率为19％。