CN103073645B

CN103073645B - 一种生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103073645B
Application number: CN201210594708.5A
Authority: CN
Inventors: 肖云; 唐睿康
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103073645A

Abstract

本发明公开了一种生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用，该生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒通过如下方法制备：向DMEM培养基中加入胰岛素蛋白和可溶性钙盐，混合均匀后在含CO₂环境下进行孵育，制得生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒；生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的粒径为32~450nm，其中胰岛素蛋白的质量分数为8%~15%。本发明还提供了所述生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的制备方法及其在制备降糖药物中的应用。本发明生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒可被细胞吞入，且吞入效率高，同时对细胞无毒害，具有良好的生物相容性。另外，本发明中生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的制备方法简单易操作，成本廉价，可批量制备。

Description

一种生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，糖尿病的发病率及患病率正在呈逐年上升趋势，糖尿病已成为世界范围内的常见病和多发病，成为继心脑血管疾病和肿瘤之后，又一种危害人类健康的慢性疾病。在世界范围内，仍然没有可以根治糖尿病的有效药。

1999年世界卫生组织（WHO）和国际糖尿病联盟（IDF）规定，根据病因、发病机制和临床表现的不同，糖尿病主要分为由于胰岛β细胞破坏造成胰岛素绝对缺乏的Ⅰ型糖尿病和由于胰岛素抵抗造成胰岛素相对缺乏的Ⅱ型糖尿病。胰岛素抵抗是指正常剂量的胰岛素产生低于其生物学效应的一种病理学状态，表现为胰岛素促进外周组织（包括肌肉和脂肪组织）摄取和利用葡萄糖以及抑制肝糖输出的效应减弱，是引起Ⅱ型糖尿病发生的主要原因。

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激动而分泌的一种蛋白质类激素。胰岛素作为人体内重要的蛋白质类激素，是机体内唯一降低血糖的激素，对碳水化合物代谢的影响，是其最显著的生物学作用。一方面胰岛素通过在葡萄糖转运过程中，增强磷酸化作用从而促进血循环中葡萄糖进入肝细胞、肌细胞、脂肪细胞及其他细胞合成糖原；另一方面胰岛素通过抑制糖原分解和降低糖异生而抑制葡萄糖的产生，其共同后果是使血糖的浓度降低。自1922年胰岛素在临床上被用作治疗糖尿病的药物来，迄今为止仍然是控制糖尿病高血糖的首选药物。通常，胰岛素通过与细胞膜表面的胰岛素受体结合，通过一系列蛋白质磷酸化-去磷酸化的过程，引起细胞内与代谢及生长有关的关键酶的激活从而发挥其对于糖代谢的调节作用，该过程可在数秒至数分钟内完成，因此，外源注射胰岛素的作用时间十分短暂。为了维持一定的疗效需要大剂量反复用药，长期的频繁注射胰岛素不仅增加了病人的痛苦而且易引发一系列副反应。

事实上，除了这种短期作用，胰岛素还具有持续时间更长的中、长期作用，包括调节氨基酸及离子的摄取，控制蛋白质的合成和降解、基因的转录，刺激细胞的生长和分化等作用。研究表明，胰岛素这种中、长期作用可能与其在细胞内的作用密切相关，因此，可以将胰岛素传递至细胞内来延长其生物调控作用，从而达到长期治疗糖尿病的效果。

目前，蛋白质的细胞内传递主要有三种方法，包括传统的物理方法，例如微注射法、电穿孔法等；载体传递法，常用的载体主要有病毒、阳离子化合物、重组蛋白和无机纳米颗粒等；另外，蛋白化学改性也是常用的方法。但是，这些方法修饰后的蛋白质通常存在生物相容性差、成本高、效率低等缺点。

发明内容

本发明提供了一种生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒，可被细胞吞入，吞入率高且具有良好的生物相容性。

一种生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒，通过如下方法制备：

向DMEM培养基中加入胰岛素蛋白和可溶性钙盐，混合均匀后在含CO₂环境下进行孵育，制得生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒；

生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的粒径为32~450nm，其中胰岛素蛋白的质量分数为8~15%。

DMEM培养基作为磷酸根离子来源，通过外加钙离子后可在培养基中原位合成磷酸钙颗粒，在此过程中，胰岛素蛋白作为生物矿化的模板，为磷酸钙的成核和晶体生长提供活性位点，胰岛素蛋白与磷酸钙形成复合结构，同时，由于CO₂的存在，在生物矿化过程中，复合结构中会含有少量的碳酸根离子。碳酸根离子的含量影响颗粒的形貌，并且含有碳酸根的磷酸钙具有更好的降解性，一般，碳酸根离子的质量分数为2~5%。

优选的，生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的粒径为180~280nm。在该粒径范围内，胰岛素蛋白纳米颗粒的粒径更容易被细胞吞入，并且对细胞伤害较小。

所述DMEM培养基采用常规的市售产品即可。

所述胰岛素蛋白可以为人胰岛素。加入胰岛素蛋白时，一般先将其溶解，以溶液的形式加入到DMEM培养基中。

胰岛素蛋白的浓度影响纳米颗粒的形貌和结构，从而影响生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的生物学特性，一般，所述胰岛素蛋白的终浓度为5~55mg/L，优选的，所述胰岛素蛋白的终浓度为20~45mg/L，更优选为40mg/L。

本发明中，所述胰岛素蛋白的终浓度是指加入的胰岛素蛋白在整个生物矿化反应体系中的浓度。

可溶性钙盐可以提供游离的钙离子，所述可溶性钙盐可以为氯化钙、硝酸钙等。

钙离子的浓度影响胰岛素蛋白的生物矿化效率，加入可溶性钙盐后，钙离子的终浓度为1~10mmol/L，优选为2~5mmol/L。其中，钙离子的终浓度是指加入可溶性钙盐后，钙离子在整个生物矿化反应体系中的浓度。

所述孵育的温度为25~45℃，优选为30~40℃，更优选为37℃。

所述孵育的时间为0.5~4小时，优选为2~4小时，更优选为4小时。

上述孵育条件有利于胰岛素蛋白与磷酸钙形成稳定的复合结构。

为将生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒从DMEM培养基中分离，可将孵育后的DMEM培养基在离心力为8000g的转速下离心10min。

本发明还提供了所述生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒在制备降糖药物中的应用。

该生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒处理细胞后，细胞中与胰岛素作用相关的蛋白表达水平升高，细胞的糖代谢能力提高，并且对细胞无毒，因此可将其应用于降糖药物的制备。

本发明还提供了一种生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的制备方法，包括：向DMEM培养基中加入胰岛素蛋白和可溶性钙盐，混合均匀后在含CO₂环境下进行孵育，制得生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒可被细胞吞入，且吞入效率高，同时对细胞无毒害，具有良好的生物相容性。另外，该生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的制备方法简单易操作，且成本廉价，可批量制备。

附图说明

图1为生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒（BIP）的形貌表征；

其中，A为矿化前与矿化后胰岛素的高糖DEME溶液的数码照片，

B为BIP的TEM图片，

C为BIP的SEM图片，

D为BIP的粒径分布曲线；

图2a为生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的XRD图谱；

图2b为生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的FTIR曲线；

图2c1为生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的TGA/DSC曲线；

图2c2为磷酸钙的TGA/DSC曲线；

图2c3为胰岛素的TGA/DSC曲线；

图3为BCA试剂盒测定的蛋白标准曲线；

图4a为不同浓度钙离子对胰岛素抵抗Hep-G2细胞活性的影响关系图；

图4b为不同浓度胰岛素对胰岛素抵抗Hep-G2细胞活性的影响关系图；

图4c为不同浓度BIP对胰岛素抵抗Hep-G2细胞活性的影响关系图；

图5为不同处理下胰岛素抵抗Hep-G2细胞的显微镜照片；

其中，A为未矿化的胰岛素处理胰岛素抵抗Hep-G2细胞后的荧光显微镜照片，

B为BIP处理胰岛素抵抗Hep-G2细胞后的荧光显微镜照片，

C为BIP处理胰岛素抵抗Hep-G2细胞后的共聚焦显微镜照片；

图6为BIP处理胰岛素抵抗Hep-G2细胞后的生物切片透射图片；

图7a为不同处理下Hep-G2细胞的糖代谢能力图；

图7b为不同处理下胰岛素抵抗Hep-G2细胞后IRS-1和IRS-2的mRNA表达图；

图7c为不同处理下胰岛素抵抗Hep-G2细胞后Glut-2和Glut-4的mRNA表达图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐释本发明

高糖DMEM培养基购买自美国Invitrogen公司，胎牛血清购买自美国Sigma-Aldrich公司，人胰岛素由徐州万邦金桥制药有限公司惠赠。

实施例1生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒（BIP）的制备与表征

人胰岛素蛋白用Tris-HCl（1.0mol/L，pH7.4）配制，浓度为5mg/mL；

氯化钙用三蒸水配制，终浓度为1.0mmol/L。

依次向1mL高糖DMEM培养基中加入8μL5mg/mL的人胰岛素蛋白溶液和5μL1mmol/L氯化钙溶液，震荡混合均匀后，将上述溶液在37℃，5%CO₂的细胞培养箱中培养4h，于8000g转速离心10min，分离得到生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒。

将得到的生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒通过SEM（扫描电子显微镜）、TEM（透射电子显微镜）、DLS（动态光散射）和TGA/DSC（热重/差示扫描量热分析）、XRD（X射线衍射）和FTIR（傅里叶红外）等技术手段对颗粒进行表征。

从拍摄的矿化前和矿化后胰岛素蛋白的高糖DMEM溶液的数码照片可以看出，矿化并不影响溶液的外观，反映出所形成的生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒尺寸较小，且分散均一，见图1中A。由图1中B和C可知，生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒呈球形，对生物矿化的胰岛素纳米颗粒的粒径进行统计分析，由图1中D可知，BIP的粒径分布在32~450nm，且在180~280nm粒径范围占较大比重。

由图2a可知，所制备的生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒中磷酸钙为无定形相；由图2b可知，胰岛素经生物矿化后既有磷酸钙的吸收峰，又包含胰岛素的吸收峰，说明生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒为磷酸钙与胰岛素的复合物。由图2c1、2c2和2c3可知，生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒在200°C至500°C间出现一个特征的放热峰，而纯胰岛素和纯磷酸钙在该温度范围并没有该峰，说明BIP中胰岛素与磷酸钙并不是简单的结合，而是形成了一个有机-无机的复合结构。同时，由TGA曲线可知，BIP中胰岛素所占的质量百分含量约为8%。

胰岛素的矿化率通过BCA试剂盒进行检测，由BSA蛋白标准得到标准曲线后，分别测定未矿化蛋白溶液和矿化后蛋白溶液中胰岛素蛋白浓度，矿化率定义为，

P = \frac{ΔC}{C_{0}} \times 100 %

其中，C₀是未矿化蛋白溶液中胰岛素蛋白浓度，ΔC是矿化前后胰岛素蛋白的浓度差。

由图3可知，胰岛素蛋白的矿化率大概为11%，即有约11%的胰岛素蛋白与磷酸钙发生复合，形成生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒。

实施例2MTT法检测胰岛素和生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的细胞毒性

利用胰酶消化液将生长状态良好的Hep-G2细胞消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养液分散成单细胞悬液，以5×10³的密度接种于96孔板中，在37°C，5%CO₂条件下培养24小时。待细胞贴壁后，加入含1×10^-6mol/L地塞米松溶液的高糖DMEM培养基诱导60小时后形成胰岛素抵抗细胞模型。

待抵抗模型建立后，弃去培养基，向细胞培养板中分别加入含不同浓度的Ca²⁺和不同浓度的胰岛素蛋白的高糖DMEM培养基。在37°C，5%CO₂条件下培养4小时后，更换为100μL新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基培养48小时。之后每孔中加入10μL5mg/mL MTT溶液，于37°C，5%CO₂条件孵育4小时后，弃去溶液，每孔加入200μLDMSO充分溶解沉淀后，于490nm波长下，在酶标仪上测定各孔的OD值，记录结果。

由图4a、图4b可见，在单独使用0~10mMCa²⁺或0~55mg/L胰岛素蛋白条件下，细胞存活率没有明显差异，说明在该浓度范围内的Ca²⁺或胰岛素蛋白并没有明显的细胞毒性。随后，我们确定Ca²⁺浓度为5mM，在0~55mg/L范围内改变胰岛素的量，以形成不同浓度的生物矿化的胰岛素蛋白颗粒，由图4c可见，在所选胰岛素蛋白的浓度范围内，细胞存活率差异不大，生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒并没有表现出明显的细胞毒性。

实施例3生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒在胰岛素抵抗细胞内的传递

参照实施例2“MTT法检测胰岛素和生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的细胞毒性”中的方法，建立胰岛素抵抗的Hep-G2细胞模型。待抵抗模型建立后，弃去细胞培养板内的培养基，向细胞培养板中加入生物矿化的胰岛素蛋白溶液（胰岛素蛋白用FITC标记），置于37°C、5%CO₂的细胞培养箱中孵育，另外，以同样的方法，加入未矿化的胰岛素（即在DMEM培养基中加入胰岛素蛋白溶液，胰岛素蛋白用FITC标记，终浓度与生物矿化的胰岛素蛋白溶液相同，均为40mg/L）作为对照。

孵育4小时后，吸去细胞培养板内的液体，用PBS缓冲液漂洗两次，并用质量分数为0.03%的EDTA溶液漂洗。对细胞进行荧光显微镜观察和共聚焦显微镜观察。同时，将矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒处理过的细胞进行消化、固定、脱水、浸透、包埋和切片处理后，于透射电镜上观察细胞形貌。

FITC标记胰岛素蛋白方法：

在避光条件下，将FITC(异硫氰酸荧光素)溶解于DMSO中，终浓度为1mg/mL，同时，将胰岛素蛋白溶解于1.0mol/L pH为7.4的Tris-HCl溶液中，终浓度为5mg/mL。按胰岛素蛋白：FITC=1mg：150μg的比例将FITC溶液缓慢加入到胰岛素蛋白溶液中，边加边轻轻晃动使两溶液充分混合均匀，于暗处4°C反应8小时。随后，加入5M的NH₄Cl至终浓度50mM，4°C终止反应2小时。在pH7.4的Tris-HCl溶液中透析至溶液澄清。将标记好的蛋白溶液冷冻干燥，于-20°C长期保存。

由图5可见，蓝色荧光为DAPI染色的细胞核，绿色荧光为FITC标记的胰岛素蛋白，生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒可以成功的导入到胰岛素抵抗的Hep-G2细胞甚至是细胞核内。

由图6的生物切片图中可以看出，生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒存在细胞膜、胞浆、细胞核膜、细胞核内都有分布。

实施例4生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒在细胞内的生物效应

参照实施例3“生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒在胰岛素抵抗细胞内的传递”中的方法，将胰岛素抵抗的Hep-G2细胞分别用矿化前后的胰岛素蛋白处理4小时。

处理完成后，利用葡萄糖氧化酶检测试剂盒（Glucose Oxidase AssayKit）测定细胞的消耗葡萄糖量。同时，通过RT-PCR技术测定细胞中与胰岛素作用相关的蛋白IRS-1、IRS-2、Glut-2和Glut-4的mRNA表达水平，其中RT-PCR所用引物的具体序列见表1。

图7a示出了不同处理下Hep-G2细胞的糖代谢能力，将正常Hep-G2细胞的糖代谢能力定义为100，胰岛素抵抗细胞的糖代谢能力下降为50~60，用单独的胰岛素处理细胞后，细胞的糖代谢能力上升为70，但随着时间的推移，细胞的糖代谢能力又逐渐下降，在处理后48小时后，下降至与未经过处理的胰岛素抵抗细胞相同。而用生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒处理过的细胞，其糖代谢能力逐渐升高，在72小时，糖代谢能力达到112。

表1引物表

由图7b、图7c可知，用BIP处理胰岛素抵抗Hep-G2细胞后，与糖代谢相关的蛋白IRS-1、IRS-2、Glut-2和Glut-4的mRNA表达水平都有所上升，说明生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒处理过的细胞糖代谢能力得到改善。

Claims

1.一种生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒，通过如下方法制备：

所述DMEM培养基为高糖DMEM培养基；

所述胰岛素蛋白的终浓度为5～55mg/L；

加入可溶性钙盐后，钙离子的终浓度为1～10mmol/L；

所述含CO₂环境为5%CO₂的细胞培养箱；

所述孵育的温度为25～45℃；所述孵育的时间为0.5～4小时；

生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒的粒径为32～450nm，其中胰岛素蛋白的质量分数为8～15%。

2.如权利要求1所述的生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述胰岛素蛋白为人胰岛素。

3.如权利要求1所述的生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述可溶性钙盐为氯化钙或硝酸钙。

4.如权利要求1所述的生物矿化的胰岛素蛋白纳米颗粒在制备降糖药物中的应用。