CN113998679B - 一种磷酸锰纳米材料及其快速制备方法和应用 - Google Patents

一种磷酸锰纳米材料及其快速制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磷酸锰纳米材料及其快速制备方法和应用，包括以下步骤：将含锰无机盐溶液加入基础培养基中，25℃‑42℃下矿化反应一定时间；将所得反应液离心，收集洗涤沉淀，得到所述的磷酸锰纳米材料。本发明采用仿生矿化策略制备磷酸锰纳米材料，方法简单且条件安全温和可控，所制备的磷酸锰纳米材料尺寸、形貌均匀，细胞实验证实本发明制备的磷酸锰纳米材料具有良好的生物相容性。

Description

一种磷酸锰纳米材料及其快速制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种磷酸锰纳米材料及其快速制备方法和应用。
背景技术
无机矿物在自然界中广泛存在，如植物、动物等都能够自发的形成矿物(Gower LB.Biomimetic Model Systems for Investigating the Amorphous Precursor Pathwayand Its Role in Biomineralization[J].Journal of Cheminformatics,2009,40(5):4551-4627.)。生物体中在有机物的参与下，有机大分子与无机离子在界面处的相互作用，形成无机矿物的过程，称为生物矿化过程。受生物矿化启发，科学家们设计开发了不同仿生功能的材料，可通过仿生矿化的方式调控无机材料的形成。(Chen W,Wang GH,Yung B.etal.Long-Acting Release Formulation of Exendin-5Based on BiomimeticMineralization for Type 2Diabetes Thetapy[J].ACS Nano,2017,11,5062-5069)。生物矿化作为生物进化过程中的功能性策略，其方法简单，安全性高，为人类通过材料实现对生物有机体的调控提供了借鉴的方向，在肿瘤治疗方面也有着巨大的应用前景。
锰元素是人体必需微量元素之一，锰在体内主要通过参与酶的构成或激活酶来发挥生理作用，在骨形成，氨基酸、胆固醇和碳水化合物代谢，维持脑功能以及神经递质的合成与代谢等诸多方面发挥着重要作用。锰基纳米材料在肿瘤治疗的研究中显示出低毒性和高生物安全性(Zhang R,Wang C,Guan,Y.et al.Manganese Salts Function as PotentAdjuvants[J].Cellular&Molecular Immunology,2021.DOI:10.1038/s41423-021-00669-w)。最近研究显示，含锰纳米材料在肿瘤免疫研究中显示良好作用潜力(Lv M,Chen M,Zhang R,et al.Manganese is Critical for Antitumor Immune Responses via cGAS-STING and Improves The Efficacy of Clinical Immunotherapy[J].Cell Research,2020,30,966-979)，但制备方法繁琐，过程可控性较低。因此，快速稳定温和的制备方法对锰纳米生物材料与肿瘤免疫的研究具有重要意义。
肿瘤免疫治疗已被公认为除传统治疗外的重要肿瘤治疗手段，该治疗方法通过激活身体的免疫系统以对抗癌细胞，极具前景和意义。然而，这种方法也有弊端：一方面，大量分泌细胞因子，极易引发细胞因子风暴，导致正常组织器官受损。另一方面，免疫细胞激活效率低下。因此，一种既能够激活免疫细胞，又能够使机体的免疫反应处于正常范围且不会杀伤正常组织和细胞的纳米材料的研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种磷酸锰纳米材料及其快速制备方法和应用。本发明通过仿生矿化这种简单高效且安全的制备方法，制备形成磷酸锰纳米材料，该方法反应条件温和可控，磷酸锰纳米材料尺寸大小具有良好的可调性，且所制备的材料具有良好的生物相容性。
本发明首先提供了一种快速制备磷酸锰纳米材料的方法，其包括以下步骤：
(1)将含锰无机盐溶液加入至基础培养基中，充分混合均匀，调控矿化反应的温度范围为生理温度，维持反应体系pH值为生理pH值，反应一定时间；
(2)收集步骤(1)所得的反应液离心收集沉淀，清洗，得到所述的磷酸锰纳米材料。
优选的，所述的含锰无机盐为水溶性的锰盐，例如为氯化锰、硝酸锰、硫酸锰，溴化锰、高氯酸锰、醋酸锰等。
优选的，步骤(1)的反应体系中，锰离子的初始浓度为5mM～100mM，更优选的为10mM～100mM，所述含锰无机盐的离子浓度会影响所述的矿化反应的速度，进而影响纳米粒子的尺寸和产量，浓度过大时，产生的纳米粒子尺寸太大，浓度过小时产生的纳米粒子产量太低。
优选的，步骤(1)的反应体系中，所述的基础培养基中均含有磷酸盐(磷酸盐与锰离子进行矿化反应，例如DMEM培养基含磷酸二氢钠)，所述基础培养基用量不影响反应体系，若基础培养基用量过大，则无多余锰离子与之结合进行矿化反应，矿化反应在合成所需尺寸的纳米粒子后结束；若基础培养基用量过小，则有多余锰离子，但通过后处理的离心步骤可去除多余的锰离子，仍不影响材料制备进程，优选的，含锰无机盐溶液的锰离子与基础培养基中的磷酸盐的摩尔比可选择为1:0.01-100。
优选的，步骤(1)的反应体系中，所述的矿化反应时间为10min～24h,反应时间会影响纳米粒子的尺寸和产量，反应时间过长产生的纳米粒子尺寸过大，反应时间过小产生的纳米粒子产量过低。
优选的，步骤(1)的反应体系中，所述的反应体系终pH值为7.0-7.5。所述的矿化反应温度为25℃～42℃。
优选的，所述的步骤(2)中的清洗为：将沉淀先用去离子水清洗再离心，然后再用无水乙醇清洗。
优选的，所述的细胞培养基为DMEM培养基或MEM培养基。这些细胞培养基中均含有磷酸根、磷酸氢根或磷酸二氢根。
本发明还提供了一种上述方法制备得到的磷酸锰纳米材料，所述磷酸锰纳米材料为球状无定型纳米材料，平均直径范围为20nm～200nm。
进一步的，所述磷酸锰纳米材料的平均直径可通过调节步骤(1)的反应时间及含锰无机盐溶液浓度等反应条件进行调控。
本发明还提供了一种上述磷酸锰纳米材料在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明采用仿生矿化的方法，制备方法简单，条件安全可控，所得纳米材料生物相容性好；能够获得尺寸、形貌均匀可控的球状磷酸锰纳米材料；并通过FE-SEM、TEM、XRD、FTIR和TG等表征技术表征其颗粒的性质。本发明选用的基础培养基中所包含的氨基酸成分为矿化提供了有效且稳定的环境，对比例表明PBS(无氨基酸成分)及其他水溶液中难以获得球状磷酸锰纳米材料。本发明所制备的球状磷酸锰纳米材料具有良好的生物相容性，具有低毒性和较高的生物安全性。
附图说明
图1为30nm磷酸锰纳米材料的热场发射扫描电镜(FE-SEM)图；
图2为100nm磷酸锰纳米材料的热场发射扫描电镜(FE-SEM)图；
图3为200nm磷酸锰纳米材料的热场发射扫描电镜(FE-SEM)图；
图4为30nm磷酸锰纳米材料的透射电镜(TEM)图；
图5为100nm磷酸锰纳米材料的透射电镜(TEM)图；
图6为200nm磷酸锰纳米材料的透射电镜(TEM)图；
图7为30nm磷酸锰纳米材料的能谱分析(EDS)图；
图8为100nm磷酸锰纳米材料的能谱分析(EDS)图；
图9为200nm磷酸锰纳米材料的能谱分析(EDS)图；
图10为磷酸锰纳米材料的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图；
图11为磷酸锰纳米材料的热重分析(TG)图；
图12为磷酸锰纳米材料的X射线衍射(XRD)图；
图13为磷酸锰纳米材料的细胞相容性结果图；
图14为非DMEM矿化体系制备的磷酸锰纳米材料的扫描电镜(SEM)图；
图15为以硝酸锰为锰盐制备的磷酸锰纳米材料的粒径分析(DLS)图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
实施例1
1)取250μL浓度为1M的MnCl2溶液加入到4750μL DMEM溶液中进行反应，反应在37℃的环境下进行，反应10min，溶液变成浑浊的反应液。该溶液体系中锰离子理论终浓度为50mM。
2)将步骤1)所得反应液用8000rpm离心10min，沉淀用去离子水和无水乙醇洗涤，重复三次，50℃烘干，得到30nm球状磷酸锰纳米材料。
所得球状磷酸锰纳米材料为实心的非晶体，该颗粒直径为30nm，如图1，图4，图7所示分别为其热场发射扫描电镜(FE-SEM)图、透射电镜(TEM)图和能谱分析(EDS)图，如图1，图4所示，热场发射扫描电镜(FE-SEM)及透射电镜(TEM)观察显示了所得材料为球形、分散性较好的纳米颗粒。能谱分析(EDS)表明这些颗粒由Mn,O,P元素组成(图7所示)。选区电子衍射(图4)及XRD结果(图12)显示这些纳米颗粒为非晶的无定形纳米粒子。红外分析(FT-IR)进一步确证了生成的纳米颗粒为磷酸锰(图10)。其中800cm-1以及1000-1100cm-1为典型的P-O键的弯曲和伸缩振动信号。热重分析(TG)显示在100℃时脱去结晶水附着(图11所示)。综合以上数据，可以证明我们通过仿生矿化的方式制备了尺寸为30nm左右的球形无定形纳米磷酸锰(MnP)颗粒。
实施例2
1)取5mL浓度为1M的MnCl2溶液加入到495mL的DMEM溶液中进行反应，反应在37℃的环境下进行，反应1h后，溶液变成浑浊的反应液。溶液体系中锰离子理论终浓度为10mM。
2)将步骤1)所得反应液用8000rpm离心10min，沉淀用去离子水和无水乙醇洗涤，重复三次，50℃烘干，得到100nm球状磷酸锰纳米材料。
所得球状磷酸锰纳米材料为实心的非晶体，该颗粒直径为100nm，如图2，图5，图8所示分别为其热场发射扫描电镜(FE-SEM)图、透射电镜(TEM)图和能谱分析(EDS)图。如图2，图5所示，热场发射扫描电镜(FE-SEM)及透射电镜(TEM)观察显示了所得材料为球形、分散性较好的纳米颗粒。能谱分析(EDS)表明这些颗粒由Mn,O,P元素组成(图8所示)。选区电子衍射(图5)及XRD结果(图12)显示这些纳米颗粒为非晶的无定形纳米粒子。红外分析(FT-IR)进一步确证了生成的纳米颗粒为磷酸锰(图10)。其中800cm-1以及1000-1100cm-1为典型的P-O键的弯曲和伸缩振动信号。热重分析(TG)显示在100℃时脱去结晶水附着(图11所示)。综合以上数据，可以证明我们通过仿生矿化的方式制备了尺寸为100nm左右的球形无定形纳米磷酸锰(MnP)颗粒。
实施例3
1)取10mL浓度为1M的MnCl2加入到490mL的DMEM溶液中进行反应，反应在37℃环境下进行，反应2h后，溶液变成浑浊的反应液。溶液体系中锰离子理论终浓度为20mM。
2)将步骤1)所得反应液用8000rpm离心10min，沉淀用去离子水和无水乙醇洗涤，重复三次，50℃烘干，得到200nm球状磷酸锰纳米材料。
所得球状磷酸锰纳米材料为实心的非晶体，该颗粒直径为200nm，如图3，图6，图9所示分别为其热场发射扫描电镜(FE-SEM)图、透射电镜(TEM)图和能谱分析(EDS)图。如图3，图6所示，热场发射扫描电镜(FE-SEM)及透射电镜(TEM)观察显示了所得材料为球形、分散性较好的纳米颗粒。能谱分析(EDS)表明这些颗粒由Mn,O,P元素组成(图9所示)。选区电子衍射(图6)及XRD结果(图12)显示这些纳米颗粒为非晶的无定形纳米粒子。红外分析(FT-IR)进一步确证了生成的纳米颗粒为磷酸锰(图10)。其中800cm-1以及1000-1100cm-1为典型的P-O键的弯曲和伸缩振动信号。热重分析(TG)显示在100℃时脱去结晶水附着(图11所示)。综合以上数据，可以证明我们通过仿生矿化的方式制备了尺寸为200nm左右的球形无定形纳米磷酸锰(MnP)颗粒。
实施例4
1)取实施例2所制备的100nm球状矿化磷酸锰纳米材料，置于紫外下灭菌2h，无菌条件下将1mg的100nm球状矿化磷酸锰纳米材料中加入5mL的DMEM培养基超声重悬，使其浓度为200μg/mL。
2)将4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)，以每孔10000个细胞，铺于96孔板中，待细胞进入指数增长期时，加入上述100nm球状矿化磷酸锰纳米材料，设置加入100nm球状矿化磷酸锰纳米材料孔中的终浓度分别为1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL。
3)24h后，每孔加入10mL的cck-8溶液，加入cck-8溶液处理1h后，经酶标仪测试其在450nm处的吸光值。
实验结果如图13所示，从图13可见，细胞毒性的结果显示，实施例2制备的100nm球状磷酸锰纳米材料具有良好生物相容性。
实施例5
1)取5mL浓度为1M的MnCl2溶液加入到495mL的pH为7.4的PBS溶液中进行反应，反应在37℃的环境下进行，反应1h后，溶液变成浑浊的反应液。溶液体系中锰离子理论终浓度为10mM。
2)将步骤1)所得反应液用8000rpm离心10min，沉淀用去离子水和无水乙醇洗涤，重复三次，50℃烘干，得到无规则片状磷酸锰纳米材料。
如图14所示，从图中可见，所得磷酸锰纳米材料为片状无规则磷酸锰纳米材料。本实施例表明PBS及其他水溶液中难以获得球状磷酸锰纳米材料，实施例所采用的DMEM矿化体系为有效且稳定的体系。
实施例6
1)取100μL浓度为1M的Mn(NO3)2加入到9900μL的DMEM溶液中进行反应，反应在37℃环境下进行，反应1h后，溶液变成浑浊的反应液。溶液体系中锰离子理论终浓度为10mM。
2)将步骤1)所得反应液用8000rpm离心10min，沉淀用去离子水和无水乙醇洗涤，重复三次，将所得沉淀保存在无水乙醇中，得到100nm磷酸锰纳米材料。
如图15所示，由DLS粒径分析的结果可以证明，所得的磷酸锰纳米材料为100nm。证明除氯化锰外其他锰盐也能采用本发明的方法制得磷酸锰纳米材料。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种快速制备磷酸锰纳米材料的方法，其特征在于，为以下步骤：
（1）将含锰无机盐溶液加入至基础培养基中，充分混合均匀，调控矿化反应的温度范围为25℃~42 ℃，维持反应体系pH值为7.0~7.5，反应时间为10 min~24 h，所述的含锰无机盐为水溶性的锰盐，所述的基础培养基为DMEM培养基或MEM培养基；
（2）收集步骤（1）所得的反应液离心收集沉淀，清洗，得到所述的磷酸锰纳米材料，所述磷酸锰纳米材料为球状无定型纳米材料，磷酸锰纳米材料的平均直径通过调节步骤（1）的反应时间和/或含锰无机盐溶液浓度进行调控；磷酸锰纳米材料的平均直径范围为20 nm~200 nm，锰离子的终浓度为5 mM~100 mM。
2.根据权利要求1所述的磷酸锰纳米材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的清洗为：将沉淀先用去离子水清洗再离心，然后再用无水乙醇清洗。
3.权利要求1或2所述方法制备得到的磷酸锰纳米材料在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
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